Протеиназы bacillus intermedius , секретируемые в поздней

УДК 577.156.576.851.5[06]
ПРОТЕИНАЗЫ BACILLUS INTERMEDIUS, СЕКРЕТИРУЕМЫЕ
В ПОЗДНЕЙ СТАЦИОНАРНОЙ ФАЗЕ РОСТА
Н.П. Балабан, А.М. Марданова, М.Р. Шарипова, Л.А. Габдрахманова,
Ю.С. Токмакова, Е.А. Соколова, И.Б. Лещинская
Казанский государственный университет
В поздней стационарной фазе роста культуры Bacillus intermedius обнаружена казеинолитическая активность. С помощью ионообменной хроматографии получены два препарата щелочных протеиназ, которые
идентифицированы как глутамилэндопептидаза и тиолзависимая сериновая протеиназа. Изучены энзиматические свойства ферментов, которые
отличны от таковых для изученных ранее глутамилэндопептидазы и тиолзависимой сериновой протеиназы, секретируемых в начале стационарной фазы роста.
Протеиназы — большой класс гидролитических ферментов, выполняющих в
клетке ряд жизненно важных функций. Бациллы секретируют в начале
стационарной фазы роста большое количество ферментов, в том числе и
щелочные протеиназы. Известно, что у бацилл спорообразование начинается в
конце логарифмической и в начале стационарной фазы роста. Этот период,
называемый переходным периодом, рассматривают как время подготовки клетки
к споруляции; иногда продолжительность этого периода превышает
продолжительность экспоненциальной фазы роста (Msadek et al., 1993). На следующих стадиях споруляции клетка продолжает синтезировать протеиназы и другие ферменты, необходимые не только для ее жизнедеятельности, но и для формирования споры и сложной споровой оболочки. Процесс превращения вегетативной клетки в покоющуюся спору приводит к физиологическим и морфологическим изменениям самой клетки.
В связи с функциональными изменениями в клетке в процессе споруляции
представляло интерес изучение протеолитических ферментов, синтезирующихся
клетками Bacillus intermedius 3–19 на поздних стадиях спорообразования.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектом исследования служил стрептомицинустойчивый штамм Bacillus intermedius 3–19 (В-3833, Всесоюзная коллекция промышленных микроорганизмов). Для культивирования клеток использовали среду следующего состава (г/л):
пептон — 20; CaCl2.2H2O — 0.55; MgSO4.7H2O — 0.3; NaCl — 3.0; MnSO4 — 0.1;
NH4Cl — 0.2; pH 8.5.
Стерильный раствор неорганического фосфата вносили в среду перед посевом
в конечной концентрации 0.3 г/л. Посевным материалом служил 12–15-часовой
инокулят (1% v/v), выращенный на среде со стрептомицином. Прирост биомассы
измеряли нефелометрически на КФК-2 при длине волны 590 нм. Количество биомассы выражали в единицах светопоглощения в кювете толщиной 1 см. При изучении спорообразования в качестве инокулята использовали 50-часовую культу45
ру. Инокулят подвергали кратковременному прогреву при 800С в течение двух
минут. Количество спор рассчитывали в процентах относительно общего количества вегетативных и спорулирующих клеток и свободных спор, которые считали
под микроскопом Carl Zeiss Jena при увеличении в 1600 раз в 5–10 полях зрения и
затем стадии споруляции определяли по Шлегелю (1987). Для подсчета клеток с
проспорами и свободных спор культуру окрашивали по Пешкову (Руководство…,
1983).
Белок определяли спектрофотометрически, считая, что концентрация белка 1
мг/мл соответствует А280=1 оптической единице (оп. ед.) в кювете толщиной 1 см.
Определение протеолитической активности проводили по казеину и по синтетическим хромогенным субстратам Z-Glu-pNA и Z-Ala-Ala-Leu-pNA. Активность
ферментов рассчитывали по методам, описанным в работах (Каверзнева, 1971,
Мосолова и др., 1997, Люблинская и др., 1987). Удельную активность выражали в
ед/мг белка. Активность β-галактозидазы определяли по методу Миллер (1976).
За единицу активности принимали количество фермента, которое вызывало увеличение оптической плотности на одну оптическую единицу при 420 нм на 1 мл
фермента за 1 мин. инкубации при 370С. Для получения клеточного лизата суспензию клеток, находящихся в ледяной бане, разрушали с помощью ультразвука
(УЗДИ-IV 4.2) при частоте 22 кГц (15 раз по 30 с) Удельную активность внеклеточной и внутриклеточной β-галактозидазы рассчитывали на 1 г сырой биомассы.
Выделение щелочных протеиназ из культуральной жидкости проводили на
КМ-целлюлозе и колонке MonoS в системе FPLC, как описано ранее (Лещинская
и др., 1997).
Температурный оптимум ферментов, их термостабильность и оптимум рН
действия на казеине и синтетических субстратах определяли, как описано ранее
(Балабан и др., 1993; Лещинская и др., 1997).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
При культивировании Bacillus intermedius обнаружены 2 пика казеинолитической активности (рис. 1а). Первый пик с максимальной активностью на 24–26 час
роста содержит 80–85% тиолзависимой сериновой протеиназы и 5–10% глутамилэндопептидазы. Эти ферменты ранее выделены в гомогенном состоянии и подробно изучены их физико-химические и каталитические свойства (Балабан и др.,
1993; Лещинская и др., 1997). Второй пик казеинолитической активности обнаружен на 42–48 часы роста.
В процессе культивирования бактерий определяли стадии споруляции, различия между которыми основаны на цитологических изменениях, происходящих
при образовании споры. Подготовительная стадия (стадия 0) начинается в конце
логарифмической — начале стационарной фазы роста, максимальная активность
первого казеинолитического пика приходится на стадию споруляции II. Второй
пик казеинолитической активности соответствует поздним стадиям спорообразования (стадии IV–VI, рис. 1). С помощью биохимического маркера целостности
клеточной мембраны — внутриклеточной β-галактозидазы определяли степень
лизиса культуры в поздней стационарной фазе роста. Изучали активность этого
фермента в культуральной жидкости в процессе роста и спорообразования культуры, а также в лизате клеток на 52 часа роста бактерий. Из рис. 1Б видно, что
активность β-галактозидазы в культуральной жидкости наблюдается на уровне 2–
5 ед. активности в продолжении всего периода роста микроорганизмов, тогда как
в клеточном лизате на 52 час роста эта активность в 70 раз выше и достигает 144
46
ед./г сырой массы клеток. Эти данные подтверждают целостность клеточной оболочки на поздних фазах роста бактерий. Появление свободных спор после 52 часов роста свидетельствует о наступлении VII стадии споруляции, позволяя заключить, что второй казеинолитический пик с максимумом на 46 часов роста представляет собой секретируемый фермент и не накапливается в среде в результате
лизиса клеток.
А
VII
IV-VI
1600
1200
2
8
800
1
4
400
0
0
0
8
16
24
32
40
48
А, мкг/мл
OD590
12
III
II
0
16
56
Часы роста
Б
III
IV-VI
VII
120
100
OD590
12
80
2
8
60
3
40
4
20
4
0
споры,%; А,ед/г
II
0
16
0
0
8
16
24
32
40
48
56
Часы роста
Рис. 1. А – динамика роста и биосинтез протеиназы Bacillus intermedius 3-19;
Б – динамика спорообразования и накопления внеклеточной галактозидазной
активности Bacillus intermedius 3-19;
1 – активность протеиназы, 2 – рост культуры, 3 – количество спор,
4 – активность галактозидазы
Проводили хроматографическое выделение протеиназ, секретируемых на 46
час роста, на КМ-целлюлозе и колонке MonoS в системе FPLC. Были получены
два пика казеинолитической активности. Первый пик имел степень очистки 68 и
47
выход 0.8%, второй пик — 273 и 18%, соответственно (таблица и рис. 2). С помощью синтетических субстратов Z-Glu-pNA и Z-Ala-Ala-Leu-pNA первый пик был
идентифицирован как глутамилэндопептидаза, второй — как тиолзависимая сериновая протеиназа.
Tаблица
Выделение щелочных протеиназ из культуральной жидкости
Bacillus intermedius
Стадии очистки
Культуральная жидкость
Хроматография
на КМ-целлюлозе
Хроматография на колонке МоноS
пик 1
пик 2
Объем,
мл
Общий
белок,
ст. ед
Общая
активность,
мкМ
Удельная
активность,
ед/мг
Степень Выход,
очист%
ки
142
2343
213000
91
1
100
2,8
2,8
55412
19790
217
21,3
1,8
3,0
0,27
1,56
1679
38640
6219
24769
68,4
273
0,8
18,2
Изучали энзиматические свойства полученных ферментов. Глутамилэндопептидаза имеет один оптимум рН 8.5 на субстрате Z-Glu-pNA и два рНоптимума на белковом субстрате — рН 7.2 и 9.5 как глутамилэндопептидазы из
других продуцентов. Эти значения сдвинуты в щелочную сторону по сравнению с
таковыми для глутамилэндопептидазы, секретируемой в начале стационарной
фазы роста и изученной нами ранее (Лещинскаяи др., 1997). рН-оптимум для тиолзивисимой сериновой протеиназы равен 8.5, что также отличается от такового
для этого фермента, секретируемого в начале стационарной фазы роста (Балабан
и др., 1993).
Температурный оптимум глутамилэндопептидазы в отсутствии ионов Ca2+ равен 500, в присутствии ионов Са2+ он смещается к 550 с увеличением удельной
активности на 30%, наблюдаемое увеличение активности фермента поздней стационарной фазы в 3 раза меньше, чем для глутамилэндопептидазы, секретируемой в начале стационарной фазы роста. Температурный оптимум тиолзависимой
сериновой протеиназы равен 550, присутствие ионов Са2+ увеличивает активность
фермента на 15% Предварительный прогрев глутамилэндопептидазы и тиолзависимой сериновой протеиназы в течение 2 часов при 50o в присутствии ионов Са2+
приводит к незначительной потере активности (10% и 35%, соответственно), в
отсутствии ионов Са2+ наблюдается резкое снижение активности (55% и 75%, соответственно). Увеличение температуры предварительного прогрева на 5–100
приводит к практически полной потере активности ферментов. Эти результаты
подтверждают стабилизирующую роль ионов Са2+.
48
А 280
0,6
NaCl, M
0,3
2
0,5
0,25
0,4
0,2
0,3
0,15
1
0,2
0,1
II
I
0,1
0,05
0
0
0
2
4
6
8
10
12
мл
Рис. 2. Хроматография глутамилэндопептидазы
B.intermedius на колонке МоноS I – A280; II – градиент NaCl (0-0,5 M) в 15 мМ Naацетатном буфере, рН 6,3, содержащем 0,5 мМ CaCl2. 1 – протеиназа, активная
на субстрате Z-Glu-pNA, 2 – протеиназа, активная на субстрате Z-Ala-Ala-Leu-pNA
Полученные данные позволили установить, что на поздних стадиях спорообразования Bacillus intermedius 3–19 секретируют в среду модифицированные глутамилэндопептидазу и тиолзависимую сериновую протеиназу с некоторыми измененными энзиматическими свойствами.
ЛИТЕРАТУРА
Балабан Н.П., Шарипова М.Р., Усманова А.М. и др. // Биохимия. 1993. Т. 58. № 12.
С. 1923–1928.
Каверзнева Е.Д. // Прикл. биохимия и микробиология. 1971. Т. 7. № 5. С. 225–228.
Лещинская И.Б., Шакиров Е.В., Ицкович Е.Л. и др. // Биохимия. 1997. Т. 62. № 8.
С. 1052–1059.
Люблинская Л.А., Хайду И., Баландина Г.Н. // Биоорг. химия. 1987. Т. 13. № 6.
С. 748–753.
49
Миллер Д.Ж. Эксперименты в молекулярной генетике. М.: Мир, 1976.
Мосолова О.В., Руденская Г.Н., Степанов В.М., Ходова О.М., Цаплина И.А. // Биохимия. 1997. Т. 52. № 3. С. 414–422.
Руководство к практическим занятиям по микробиологии / Под ред. проф. Н.С. Егорова. М.: Изд-во МГУ, 1983.
Шлегель Г. Общая микробиология. М.: Мир. 1987.
Msadek T., Kunst F., Rapoport G. In: Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria.
1993. P. 729–745.
50