Взаимодействие бактерий и дрожжей

Взаимодействие бактерий и дрожжей
Влияние на Яблочно-Молочное Брожение
М
ногочисленные научные программы исследовали зависимость и взаимоотношения между дрожжами и Яблочно‐Молочным Брожением (ЯМБ). Отношения между дрожжами и молочнокислыми бактериями могут быть стимулирующими, ингибирующими или не иметь никакого эффекта, в зависимости от пары бактерия‐дрожжи. После нескольких лет исследований и испытаний, Lallemand теперь в состоянии категоризировать дрожжи по ЯМБ‐совместимости. В зависимости от типа вина и сорта, были определены самые эффективные комбинации бактерий и дрожжей, следуя винодельческим протоколам. Этот выпуск Winemaking Update посвящен взаимодействиям при ЯМБ исосредотачивается на лучших парах бактерий и дрожжей согласно типу вина. 1. Взаимодействия между Saccharomyces cerevisiae и Oenococcus oeni 1.1 Ингибиция молочных бактерий дрожжами Этанол, производимый дрожжами во время алкогольного брожения (АБ), влияет на способность молочных бактерий к росту. Диоксид серы(SO2) является доминирующим фактором в торможении ЯМБ (Henick‐Kling и Park 1994). Его концентрация в вине ‐ результат добавления SO2 в сусло и производство SO2 Saccharomyces cerevisiae. Хотя большинство штаммов дрожжей производит менее 30 мг/л SO2, некоторые вырабатывают более 100 мг/л (Rankine and Pocock 1969, Eschenbruch 1974, Dott et al. 1976, and Suzzi et al. 1985)! Исследование Lallemand‐ICV (Institut Coopératif du Vin) дало возможность выделить три группы дрожжей, согласно их уровню производства SO2: низко, средне и высоко (см. Рисунок 1). Дрожжи, которые являются высоким производителем SO2 , не будут позволять инициировать ЯМБ. Рисунки 2A и 2B показывают результаты на большом количестве того же самого сусла, привитого параллельно с Дрожжами 1 (благоприятными в отношении ЯМБ) и Дрожжами 2 (неблагоприятными в отношении ЯМБ). В конце АБ вина были иннокулированы одним и тем же штаммом бактерий MBR®. Процесс ЯМБ был закончен через 10 дней в партии, сброженной с Дрожжами 1, но не начинался в партии, сброженной с Дрожжами 2. В этой партии исследователи также наблюдали резкое снижение численности бактерий (от 1x106 cfu/мл до 5x104 cfu/мл). Интересно отметить, что после обработки перекисью водорода (чтобы уменьшить уровень SO2),в партии, которая была привита с Дрожжами 2, ЯМБ было закончено через 14 дней – очень близко к 10 дням ЯМБ в партии, сброженной с Дрожжами 1. Таким образом, эта обработка удалила эффект ингибиции SO2. Средней длины цепи жирные кислоты ядовиты и по отношению к дрожжам и к молочнокислым бактериям. Они ограничивают бактериальный рост и могут значительно уменьшить способность бактерий усвоить яблочную кислоту. Пептиды или производство антибактериального белка. Dick et al. 1992 и Comitini et al. 2005 показали существование антибактериальной природы белка S. cerevisiae. В 2007, Osborne et al. идентифицировал ингибирующий пептид дрожжей в 5,9 kDa, который действует совместно с SO2 при высокой концентрации. Nehme (2008) также описал два пептида дрожжей ЯМБ‐ингибиции между 5 и 10 kDa. Рисунок 1. ВыработкаSO2 различными штаммами винных дрожжей (Lallemand‐ICV) Рисунки 2A и 2B. Ход процесса ЯМБ в двух винах, сброженных дрожжами 1 или 2 (Lallemand R&D) Дефицит аминокислот. Использование питательных веществ Saccharomyces может привести к дефициту, влекущему за собой ингибицию ЯМБ. Селекционированные Lallemand дрожжи были категоризированы (см. Рисунок 3) на шесть групп (с потребностями азота, которые изменяются от «чрезвычайно низко» до «чрезвычайно высоко»). Свободные аминокислоты и малые пептиды ‐ самые частые источники азота для молочных бактерий. В зависимости от штамма у Oenococcus oeni есть различные потребности в аминокислотах: каждая аминокислота может быть существенной, несущественной или не оказывать никакого эффекта. Глутаминовая кислота является существенной для O. oeni, которые не способны к её синтезированию. Однако, отсутствие пролина, глицина и аланина имеет небольшой эффект на рост. Валин, лейцин, триптофан, изолейцин, гистидин, лизин и аргинин несущественны, хотя их присутствие значительно улучшает рост. Оглигопептиды от 0,5 до 10 kDa также могут стимулировать рост O. oeni. Они транспортируются в ячейку, где они гидролизируются (Remize et al. 2006). Некоторые соединения ароматического ряда, такие как β‐фенилэтанол или янтарная кислота были также описаны как ингибиторы ЯМБ (Lonvaud‐ Funel et al. 1988, Caridi and Corte 1997). 1.2 Стимуляция молочнокислых бактерий дрожжами Концентрации различных составов азота в вине изменяются согласно сорту, зрелости винограда, усваиваемости азота виноградной лозой, и дрожжам. Автолитическая деятельность в дрожжах в конце АБ изменяет концентрацию аминокислот, пептидов и белков в вине. Высвобождаются глюканы и маннопротеины. Уровни зависят от штамма дрожжей (Rosi et al. 1999, Escot et al. 2001) и методов виноделия. Маннопротеины стимулируют бактерии двумя механизмами: • адсорбция средней цепи жирных кислот → детоксификация среды • ферментативный гидролиз O. oeni → источник питательных веществ азота. Витамины, нуклеотиды и длинной цепи жирные кислоты могут также поощрять рост бактерий. 2. Исследование взаимодействия бактерий и дрожжей Каждый год Lallemand выполнял испытания с парами бактерий и дрожжей на реальном сусле в лабораторном масштабе (1,1 л ферментёр), экспериментальном масштабе (1 Гл) или на винных заводах на различных сортах и в различных странах. Основываясь на характеристике дрожжей, результатах лабораторий и испытаниях на винных заводах, Lallemand определил критерий ЯМБ‐совместимости, который делит дрожжи на пять групп. 1. Дрожжи, которые запрещают ЯМБ (те, которые имеют очень высокое производство SO2 или ингибируют ЯМБ). 2. Дрожжи, неблагоприятные для ЯМБ (большие потребности в питательных веществах или высокое производство SO2). 3. Дрожжи, которые может оказывать положительное или негативное воздействие на ЯМБ в зависимости от условий: • высокая потребность в питательных веществах и ранний автолиз • низкая или средняя потребность в питательных веществах и среднее производство SO2 или другого ингибитора. 4. Дрожжи, благоприятные для ЯМБ. 5. Дрожжи, которые очень благоприятны для ЯМБ (низкая питательная потребность, нет производства ингибиторов, или с быстрым автолизом). Рисунок 3. Классификация дрожжей Lallemand по потребности в азоте (Lallemand R&D) Выбор времени иннокуляции также влияет не только на взаимодействие дрожжей/бактерий, но и на популярные ароматы в готовом вине. Несколько исследований сообщают, что cо‐
привитые вина являются более фруктовыми, менее молочными/масляными, более структурированными и более сложными, без чрезмерного производства уксусной кислоты (Bartowsky et al. 2002, Henick‐Kling 1993, Jussier et al. 2006, и Krieger 2006). R&D исследования были выполнены на суслах и фруктовых белых винах (Тип Рислинг), фруктовых красных винах и primeurs, и на сортах, которые являются трудными для яблочно‐
молочного брожения (ЯМБ), таких как Merlot и Chardonnay. Лабораторное исследование определило лучшие приспособленные комбинации дрожжей/бактерий, и в определенных случаях лучший выбор времени для прививки. Крупномасштабные испытания в подвалах винніх хозяйств утвердили эти результаты. Результаты описаны в данной статье Winemaking Update. Фруктовые и ароматные белые вина Одна из целей исследования ‐ создание вина из винограда типа Рислинг, при этом необходимо уменьшить кислотность и резкость яблочной кислоты, сохраняя ароматическую свежесть, которая часто маскируется сильными молочными и масляными тонами после ЯМБ. Шесть пар дрожжей/бактерий были оценены на немецком винограде Рислинг (pH фактор 3.17, TVAP 11.3 %/vol., яблочная кислота 4.7 г/л, свободный SO2 2 мг/л). Во всех случаях АБ заняло восемь дней. ЯМБ длилось 13 дней с дрожжами Y2, 15 дней с Y1 и не началось с Y3 на 25 день после прививки. В случае Y3 две бактерии дали те же самые результаты (Рисунок 4). Эти результаты демонстрируют важность воздействия дрожжей. Здесь, ингибитор ЯМБ ‐ вероятно SO2 (общая SO2 вин, сброженных с дрожжами Y3 на 60% больше по отношению к Y1 и Y2). Совместимость штамма дрожжей с ЯМБ ‐ первичный критерий, когда желателен процесс ЯМБ. Локальные испытания были выполнены с лучшими парами дрожжей/бактерий. Во время испытания Riesling (2005) от Rheinland‐Pfalz с парой Y2B2 было показано, что ЯМБ было закончено через 60 дней в партии, отобранной после алкогольного брожения (АБ), по сравнению с 40 днями в случае cо‐привитой партии – на 20 дней меньше! На сенсорном уровне группа 22 дегустаторов предпочла cо‐привитый образец вина, которое было более фруктовым и более сложным. Лучшая пара дрожжей/бактерий была выбрана для Duo Riesling™ ‐ комбинации для ароматических фруктовых белых вин. Рисунок 4. Длительность ЯМБ в испытании на Riesling, cо‐привитого шестью парами дрожжей/бактерий (для Y3B1 и Y3B2 процесс ЯМБ не начался после 25 дней) Рисунок 5. Влияние времени инокуляции на длительность ЯМБ. Виноград Gamay Фруктовые красные вина и primeurs Cо‐прививка ‐ техника, которая используется все больше в этих типах вин. Это экономит время и помогает управлять риском микробиологических отклонений и окисления, позволяя рано провести сульфитацию. Несколько пар дрожжей/бактерий были изучены, чтобы предложить решения. Испытание было выполнено на Gamay(Gaillac), сусло: pH фактор 3.08, TVAP 12.66 %/vol., яблочная кислота 3.88 г/л, свободная SO2 2 мг/л. В образцах с бактериями спустя 24 часа после прививания с дрожжами (cо‐прививка) не было нарушено АБ. Кинетика была ускорена. Однако, это действительно сокращало продолжительность ЯМБ наполовину, по сравнению с отбором после АБ (15 дней вместо 30) (Рисунок 5). Уровни летучих кислот в конце ЯМБ были до 0.2 г/л в пересчете на H2SO4 во всех испытаниях. После этих испытаний экспериментальные проекты были выполнены в INRA в Montpellier, подтверждая интерес для этого типа вина в отобранной комбинации (Red‐Y‐Fruit ™), использованной в cо‐прививке, спустя 24 часа после инокуляции дрожжей. Сорта, которые являются трудными для ЯМБ, такие как Merlot Вина, сделанные из винограда Merlot, как известно, являются не очень способствующими развитию яблочно‐молочных бактерий, на данный момент без очевидной причины. Несколько факторов могут поспособствовать этому, такие как полифенолы, этанол, нехватка определенных аминокислот или мацерация перед брожением. Несколько комбинаций дрожжей/бактерий были оценены на Merlot (Languedoc): pH фактор 3.56, TVAP 14 %/vol., яблочная кислота 1.45 г/г, доступный азот 171 мг/л. После оценки одна пара дрожжей/бактерий была оценена за «гладкое» ЯМБ и за поддержку сенсорного профиля этого сортового винограда. Локальные испытания были выполнены в Италии, Испании, Соединенных Штатах, Франции и Чили и подтвердили селекцию пары дрожжи/бактерии, используемой и в 24‐
часовой cо‐прививке, и в ранней прививке (плотность 1020‐1010), и в последовательной прививке. Результаты показаны на Рисунке 6. * Остановившееся ЯМБ, 2 г/л яблочной к‐ты ** Без ЯМБ Рисунок 6. ЯМБ в винах Merlot разных стран Мы можем разделить эти испытания на три группы: 1. Первая группа включает вина Merlot, которые не представляли трудности для развития бактерий. Дело обстоит так для испытаний, выполненных в Италии и Франции. Даже без отбора, ЯМБ было завершено менее чем через 20 дней. В испытании во Франции Duo Merlot™ комбинация использовалась в 24‐часовой cо‐прививке, которая позволяет бактериям вытеснять местную флору, таким образом избегая нежелательных отклонений. В итальянском испытании, летучие кислоты в конце ЯМБ были выше (+50 %) в контрольной партии, не отобранной с бактериями по сравнению с партией, отобранной с Duo Merlot™. 2. Вторая группа включает испытания в Испании и Чили. В этой промежуточной группе вин, использовании Duo Merlot™ давало большой выигрыш во времени по сравнению с непосредственным ЯМБ, начало которого остается зоной риска. 3. Третья группа включает испытания в Германии и Соединенных Штатах, и посев должен был дать решение, когда ЯМБ не может быть проведено. Действительно, ЯМБ не происходило даже когда использовались высеянные бактери из других сравнительных испытаний. Это группа из вин, стойких к ЯМБ, и чаще всего имеют место вина, сделанные из винограда Merlot. Однако, Duo Merlot™ комбинация была в состоянии решить эту проблему, создавая оптимальные условия для бактерий, особенно с дрожжами, благоприятными в отношении ЯМБ. В заключение... Основываясь на нашем опыте в производстве и характеризации дрожжей и яблочно‐молочных бактерий, Lallemand использует в своих интересах накопленные данные по нашим микроорганизмам, чтобы изучить из взаимодействия и предложить дрожжи/бактерии, соединяющиеся для определенных целей. Это способствовало предложению следующих комплектов пар дрожжей/бактерий: 1. Duo Riesling™ комплект особенно хорошо приспособлен к использованию в ароматических белых винах в cо‐
прививке для сохранения сортовых ароматов. 2. Red‐Y‐Fruit™ комплект является эффективным решением для быстрого ЯМБ в красном вине primeurs или для быстрого выпуска вин на рынок. 3. Duo Merlot™ комплект является инновационным решением, ответом на трудности, выполняя ЯМБ в определенных винах, сделанных с этим сортом. Эта пара дрожжей/бактерий может быть использована в cо‐
прививке или последовательной прививке, согласно типу желательного вина.