Оценка иммунотропного действия препарата АФЛОГИЛЕКС
advertisement
2 СОДЕРЖАНИЕ ВВЕДЕНИЕ ......................................................................................................................................... 8 1 Материалы и методы ....................................................................................................................... 10 1.1 Тестируемые вещества ............................................................................................................. 10 1.2 Животные .................................................................................................................................. 10 1.2.1 Акклиматизация и отбор животных для исследования ................................................. 10 1.2.2 Распределение по группам ............................................................................................... 11 1.2.3 Идентификация животных ............................................................................................... 11 1.2.4 Содержание животных ...................................................................................................... 11 1.3. Способ введения и выбор доз ................................................................................................. 12 1.4 Методология исследования влияния препарата Афлогилекс на продукцию антител....... 12 1.4.1 Дизайн исследования ........................................................................................................ 12 1.5 Методология исследования влияния препарата Афлогилекс на реакцию гиперчувствительности замедленного типа................................................................................. 14 1.5.1 Дизайн исследования ........................................................................................................ 14 1.6 Методология исследования влияния препарата Афлогилекс на пролиферативную активность Т- и В-лимфоцитов ..................................................................................................... 15 1.6.1 Дизайн исследования ........................................................................................................ 15 1.7 Анализ данных .......................................................................................................................... 17 2 Результаты исследования........................................................................................................ 18 2.1 Оценка влияния препарата Афлогилекс на продукцию антител ......................................... 18 2.2 Оценка влияния препарата Афлогилекс на реакцию гиперчувствительности замедленного типа .......................................................................................................................... 21 2.3 Оценка влияния препарата Афлогилекс на пролиферативную активность Т- и Влимфоцитов ..................................................................................................................................... 23 2.4 Обобщение результатов исследования ................................................................................... 24 ЗАКЛЮЧЕНИЕ................................................................................................................................... 28 ЛИТЕРАТУРА .................................................................................................................................... 29 3 НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ Исследовательская организация следовала требованиям данного утвержденного протокола исследования и стандартным операционным процедурам (СОП) лаборатории. Данное исследование выполнялось в соответствии с: − Национальным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р-53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики»; − Приказом Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 23 августа 2010 г. № 708н "Об утверждении Правил лабораторной практики"; − Руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических лекарственного средства – 2-изд., перераб. и доп. – М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2005. – 832 с.; Руководство по содержанию и использованию лабораторных животных. National − Academy press. –Washington, D.C. 1996. 4 ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ АГ АТ ГЗТ КонА ЛПС ПС ЭБ Ig MHC I/II - антиген - антитело - гиперчувтсвительность замедленного типа - конканавалин А - липополисахарид - полная среда - эритроциты барана - immunoglobulin - иммуноглобулин - major histocompatibility complex I/II – большой комплекс гистосовместимости I/II 5 РЕФЕРАТ Отчет 29 с., 4 рис., 6 табл. «Оценка иммунотропного действия препарата Афлогилекс» Объектом исследования служил препарат Афлогилекс, обладающий противоаллергическим действием. Целью работы являлось определение иммунотропного действия Афлогилекса. Анализ проводился на основании трех тестов (реакция бласттрансформации, продукция антител, реакция гиперчувствительности замедленного типа), оценивающих влияние препарата на пролиферацию Т- и В-лимфоцитов, а также на развитие гуморального и клеточного иммунных ответов, соответственно. Оценка влияния Афлогилекса на пролиферативную активность Т- и В-лимфоцитов проводилась на мышах линии Balb/C. Афлогилекс в дозах 8, 0.8 и 0.08 мг/кг вводили внутримышечно. Введение осуществляли 4-х кратно в течение 3-х суток по схеме: за 3, 2, 1 сутки и 1 час до забоя животных и забора селезенки. Из селезенок мышей выделяли спленоциты. Клетки стимулировали Т- (конканавалин А) и В-лимфоцит-зависимыми (липополисазарид клеточной стенки бактерий) митогенами с целью индукции пролиферации. Пролиферацию оценивали через 72 ч по интенсивности включения радиоактивной метки (3Н-тимидина) в ДНК. Изучение влияния Афлогилекса в отношении гуморального ответа проводилась на мышах-гибридах первого поколения линий CBA и C57/BL6. Животным однократно внутрибрюшинно вводили суспензию эритроцитов барана (ЭБ) с целью иммунизации организма. Афлогилекс (4 мг/кг) вводили животным один раз в сутки в течение 6 дней, начиная с момента введения ЭБ. На 7-е сутки после иммунизации животных выводили из эксперимента и в сыворотке крови определяли титр антител к ЭБ. Определение титра антител проводилось методом реакции гемагглютинации. Оценка влияния Афлогилекса в отношении клеточного ответа проводилась на аутбредных мышах. Животных однократно подкожно в межлопаточную область иммунизировали эритроцитами барана. На 6-е сутки иммунизации животным вводили вторую (разрешающую) инъекцию антигена в подушечку задней лапы - «опытная лапа». В контралатеральную лапу вводили стерильный физиологический раствор («контрольная лапа»). Через 24 часа животных эвтаназировали. Результаты реакции регистрировали путем определения массы «опытной» и «контрольной» лап. Результаты экспериментальной работы показали, что Афлогилекс не влияет на митоген-индуцированную пролиферацию Т- и В-лимфоцитов и не изменяет содержание антител в сыворотке крови иммунизированных эритроцитами барана мышей. Полученные 6 данные позволяют заключить, что Афлогилекс не имеет активности в отношении пролиферации лимфоцитов и не влияет на формирование гуморального звена иммунитета. При постановке реакции гиперчувствительности замедленного типа установлена фармакологическая активность Афлогилекса. В частности, препарат увеличивал отек лапы мышей почти в 2 раза. Полученные данные свидетельствуют о том, что в тестируемой дозе шестидневное введение препарата оказывает Т-лимфоцит-зависимое иммуностимулирующее действие. иммунотропное Ключевые слова: Афлогилекс, антитела, ГЗТ. действие, бласттрансформация, 7 ВВЕДЕНИЕ Впервые биологически-активные вещества из морских гидробионтов были открыты в 1950 г. Это были С-нуклеозиды, спонгоурин и спонготимидин из каррибской губки Cryptotheca crypt. Было обнаружено, что данные соединения обладают противовирусной активностью. В результате исследований был разработан синтетический аналог этих соединений - цитозинарабинозид (Ara-C), применяющийся в последние 20 лет как противоопухолевый агент, а в комбинации с аденинаробинозидом (Ara-А), как противовирусный агент. Активное систематическое исследование морской среды как источника биологически активных соединений началось только в 1970-е годы. Эти исследования ясно показали, что морская среда содержит широкий спектр БАВ, значительная часть которых принадлежат к совершенно новым химическим классам, не найденным в наземных представителях. Многие выделенные из морских организмов соединения уже прошли или находятся на разных стадиях клинических испытаний, но ни одно еще не используется в качестве химиотерапевтического агента. Так, наиболее известным на сегодняшний день является бриостатин, выделенный из мшанки Bugula neritina. Он был апробирован в более 80 клинических испытаний. Бриостатин-1 – макроциклический лактон с подтвержденной in vitro и in vivo противоопухолевой активностью в отношении меланомы В16, саркомы М5076 и карциномы легкого А549. Препарат оказывает плейотропный эффект на мембранные рецепторы протеинкиназу С. через воздействие Вдобавок на Бриостатин-1 кальциевую обладает и фосфолипидную гемопоэтической и иммуномодулирующей активностью. Не меньший интерес вызывает возможность применения биологически-активных соединений, выделенных из морских организмов, в качестве иммуномодуляторов. Любое заболевание сопровождается развитием иммунной реакции, поэтому лекарственные препараты, способные активировать или подавлять определенные звенья иммунной системы имеют длинный список назначений, включающий иммунодифецитные состояния, инфекционные заболевания бактериальной и вирусной природы, аутоиммунные патологии, злокачественные гиперплазии и др. Примером природного иммуномодулятора является Тинростим СТ. Это уникальный полипептидный комплекс, полученный из нервных клеток морских организмов, обогащенный витамином С. Тинростим-СТ усиливает деятельность иммунной системы, повышает сопротивляемость организма к действию болезнетворных 8 микроорганизмов и ядовитых продуктов, предупреждает развитие тяжелых заболеваний и злокачественных образований. Тинростим–СТ повышает естественную сопротивляемость организма к различным инфекционным заболеваниям бактериального и вирусного происхождения. Усиливает функциональную активность фагоцитов, стимулирует реакции гуморального и клеточного иммунитета. Тинростим–СТ особенно эффективен при использовании с момента начала инфекционного заболевания. При гриппе и других ОРВИ усиливает противовирусный иммунитет и действует непосредственно на возбудитель. Стимулируя определенные функции иммунной системы, обладает онкопрофилирующим действием, устраняет побочные эффекты при лучевой и химио-терапии. Действуя на надсегментарные структуры мозга, улучшает мозговое кровообращение, оказывает антистрессорное действие. Улучшает динамику выздоровления больных с вирусными гепатитами, туберкулезом, герпевирусной инфекцией, гонореей (Еляков Г.Б., Козловская Э.П., Рассказов В.А. и др, 2000). Целью проведенного исследования являлось изучение иммунотропного действия нового лекарственного препарата Афлогилекс, выделенного из печени рыб семейства тресковых. Анализ проводился на основании трех тестов (реакция бласттрансформации, продукция антител, реакция гиперчувствительности замедленного типа у мышей), оценивающих влияние препарата на пролиферацию Т- и В-лимфоцитов, а также на развитие гуморального и клеточного иммунных ответов, соответственно. 9 1 Материалы и методы 1.1 Тестируемые вещества Название: Афлогилекс Серия: №6 Дата выпуска: 09.2010 г Срок годности: 09.2012 г Производитель: ЗАО “Санкт-Петербургский институт фармации” Лекарственная форма: 0,1% инъекционный раствор для внутримышечного или подкожного введения 1.2 Животные Эксперименты выполнялись на аутбредных и инбредных мышах линии balb/c и гибридов первого поколения линий CBA и C57/BL6. Выбор животных сделан на основании указаний по оценке иммунотропной активности фармакологических веществ (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2005). Животные поступили из питомника РАМН «Рапполово», Ленинградской области. Возраст животных к началу исследования 7-10 недель. Вет. свидетельство “Рапполово” 247№ 0043415 от 14 октября 2010 года Вет. свидетельство “Рапполово” 247№ 0043418 от 18 октября 2010 года Вет. свидетельство “Рапполово” 247№ 0043433 от 25 октября 2010 года 1.2.1 Акклиматизация и отбор животных для исследования Лабораторные животные до начала исследования содержались 14 дней для адаптации при групповом содержании в клетках. Во время этого периода у животных каждый день контролировали клиническое состояние путем визуального осмотра. Животные с обнаруженными в ходе осмотра отклонениями в экспериментальные группы включены не были. Перед началом исследования животные, отвечающие критериям включения в эксперимент, были распределены на группы. 10 1.2.2 Распределение по группам В экспериментальные группы были отобраны животные без признаков отклонений внешнего вида, случайным образом, так, чтобы индивидуальное значение массы не отклонялось от среднего значения более чем на 10%. 1.2.3 Идентификация животных Маркировка клетки кодировала пол животных, породу, дату индукции патологии, дату начала введения препаратов, название группы. Каждому отобранному в исследование животному был присвоен индивидуальный номер. 1.2.4 Содержание животных Животные содержались в стандартных условиях в соответствии с правилами, утвержденным МЗ СССР 06.07.73 г., по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) и ГОСТ Р 53434-2009.. В период акклиматизации и эксперимента животные были размещены в поликарбонатных клетках фирмы BENEX a.s., со стальными решетчатыми крышками с кормовым углублением. В каждой клетке размещалось по 6-12 шт (площадь пола на 1 животное составила 130-260 см2). Уборка клеток и смена подстила производилась минимум 2 раза в неделю. В период акклиматизации животных кормили комбикормом «Корм для содержания лабораторных животных» ПК-120-1, приготовленным по ГОСТ Р 50258-92 в соответствии с нормами, утвержденными приказом МЗ СССР №755 от 12.08.77 г. Животные получали воду, соответствующую СОП № ОЖ-Х-3v1. Корм и вода давались ad libitum в кормовое углубление стальной решетчатой крышки клетки. В качестве подстила использовали древесные гранулы (ООО «Биосфера», СанктПетербург, Россия). Животные содержались в контролируемых условиях окружающей среды (20-26°C и относительной влажности воздуха 50-70%). Световой режим составлял 12 часов света и 12 часов темноты. Устанавливали режим проветривания, обеспечивающий около 15 объемов помещения в час, концентрацию CO2 не более 0,15 объемных %, аммиака — не более 0,001 мг/л. Температура и влажность воздуха регистрировались ежедневно. Никаких существенных отклонений этих параметров в период акклиматизации и в ходе эксперимента не произошло. 11 1.3. Способ введения и выбор доз Метод введения субстанций животным – внутримышечный, являющийся аналогом инъекционного способа применения для человека, выбран в соответствии с предполагаемым для клинического применения Афлогилекса. Терапевтическая доза Афлогилекса (0.1%-ый раствор) для собак мелких пород - 4 мл в сутки. В соответствие с этим собаки массой тела до 10 кг получают препарат в дозе 4/10=0,4 мл/кг=0,4 мг/кг С учетом метаболических коэффициентов (для собаки массой 10 кг – 21,6, и мыши массой 22 г – 3,1) терапевтическая доза Афлогилекса для мыши: 0,4 x 21,6/3,1= 2,78 мг/кг Терапевтическая доза Афлогилекса (0.1%-ый раствор) для собак крупных пород 10 мл в сутки. В соответствие с этим собаки массой тела более 10 кг получают препарат в дозе 10/10=1 мл/кг=1 мг/кг С учетом метаболических коэффициентов (для собаки массой 11 кг – 22,2, и мыши массой 22 г – 3,1) терапевтическая доза Афлогилекса для мыши: 1 x 22,2/3,1= 7,16 мг/кг В соответствии с выше сказанным, расчетная терапевтическая доза Афлогилекса для мыши варьирует в зависимости от того, с какого животного её пересчитывать, поэтому в качестве терапевтической дозы было выбрано среднее значение – 4 мг/кг. 1.4 Методология исследования влияния препарата Афлогилекс на продукцию антител 1.4.1 Дизайн исследования Мышам-гибридам первого поколения линий CBA и C57BL/6 однократно внутрибрюшинно вводили суспензию эритроцитов барана (ЭБ) в субоптимальной дозе (25×107 ЭБ/мышь) с целью иммунизации организма. Афлогилекс вводили животным внутримышечно в дозе 4 мг/кг один раз в сутки в течение 6 дней, начиная с момента введения ЭБ. На 7-е сутки после иммунизации животных выводили из эксперимента, собирали кровь, выделяли сыворотку и определяли в ней титр антител к ЭБ (Табл. 2). Определение титра антител проводилось методом реакции гемагглютинации. Таблица 2 – Дизайн исследования Сутки исследования Манипуляции c мышами 1 Введение ЭБ + 2 3 4 5 6 7 12 Введение Афлогилекса (4 мг/кг) Забор крови + + + + + + + 1.4.2 Определение титра антител В 96-луночных круглодонных планшетах для иммунологических реакций (“Медполимер”) готовили двукратные разведения исследуемой сыворотки в объеме 100 мкл (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32, 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024, 1:2048). В контрольную лунку вносили 100 мкл физиологического раствора. Ко всем лункам добавляли 100 мкл 1%-го раствора эритроцитов барана, приготовленного на стерильном физиологическом растворе (ОАО НПК “Аском”, Россия). Учет реакции проводили после инкубации планшетов в термостате в течение 2 ч при 37ْ С. При положительном результате эритроциты оседали на дне лунки планшета в виде зонтика, при отрицательном в виде пуговки. За титр принимали то последнее разведение, при котором еще наблюдается положительный результат (рис. 1). Расчет производили по формуле: Титр антител = log2N, где N - номер последнего разведения сыворотки крови, при котором происходит гемагглютинация эритроцитов. Разведения образцов сыворотки Образцы сыворотки 1:32 1:64 Максимальное разведение, при котором реакция гемагглютинации положительна 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 контроль №1 №2 №3 13 Рис. 1. Определение титра антител в сыворотке крови методом реакции гемагглютинации. Методология 1.5 исследования влияния препарата Афлогилекс на реакцию гиперчувствительности замедленного типа 1.5.1 Дизайн исследования Аутбредных мышей однократно подкожно в межлопаточную область иммунизировали (200 мкл) эритроцитами барана в дозе 2×108/мышь. На 6-е сутки иммунизации животным вводили вторую (разрешающую) инъекцию антигена (2×108/мышь) в объеме 20 мкл в подушечку задней лапы - «опытная лапа». В контралатеральную лапу вводили 20 мкл стерильного физиологического раствора («контрольная лапа»). Через 24 часа животных эвтаназировали. Результаты реакции регистрировали путем определения массы «опытной» и «контрольной» лап. Индекс реакции для каждого животного определяли по формуле: Ир = Моп − Мк • 100% , Мк где Моп и Мк – масса «опытной» и «контрольной» лап. Афлогилекс вводили животным внутримышечно в дозе 4 мг/кг ежедневно, где стартовой точкой являлось введение сенсибилизирующей дозы антигена, конечной – введение разрешающей дозы антигена. Опытные и контрольные группы животных включали по 10 животных (табл. 3). Таблица 3 – Дизайн исследования Манипуляции Сенсибилизирующая доза ЭБ Введение Афлогилекса (4 мг/кг) Разрешающая доза ЭБ Определение массы «опытной» и «контрольной» лап Сутки исследования 1 2 3 4 5 6 + + + + + 7 + + + + 14 1.6 Методология Афлогилекс на исследования пролиферативную влияния препарата активность Т- и В- лимфоцитов 1.6.1 Дизайн исследования После акклиматизационного периода были сформированы группы животных соответственно дизайну эксперимента. Афлогилекс разводили стерильным физиологическим раствором (ОАО НПК “Аском”, Россия) до концентрации 0.01% и 0.001%. Препарат и полученные растворы вводили самцам мышей линии Balb/C внутримышечно (по 0.2 мл), в результате животные получали дозы 8 мг/кг, 0,8 мг/кг и 0,08 мг/кг. Введение проводили 4х-кратно в течение 3-х суток по схеме: за 3, 2, 1 сутки и 1 час до забоя животных и забора селезенки. Отрицательным контролем служил физиологический раствор. Опытные и контрольные группы включали по 12 животных. Для постановки реакции бласттрансформации спленоциты, выделенные из селезенки мышей, пулировались по принципу 3 селезенки в один пул. В результате пролиферативная активность спленоцитов оценивалась в 4 пулах на группу (n=4) (Табл. 1). Группа Афлогилекс (0,08 мг/кг) Афлогилекс (0,8 мг/кг) Таблица 1 – Дизайн исследования № мыши Схема Пулирование введения селезенок субстанции (№ пула) 1 2 1 3 4 5 2 За 3, 2, 1 сутки и 6 1 час до забоя 7 животных 3 8 9 10 11 4 12 1 1 2 3 За 3, 2, 1 сутки и 4 1 час до забоя животных 5 2 6 7 3 Индуктор пролиферации Физ. раствор Кон А ЛПС Физ. раствор Кон А ЛПС Физ. раствор Кон А ЛПС Физ. раствор Кон А ЛПС Физ. раствор Кон А ЛПС Физ. раствор Кон А ЛПС Физ. раствор 15 Афлогилекс (8 мг/кг) 8 9 10 11 12 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 4 1 За 3, 2, 1 сутки и 1 час до забоя животных 2 3 4 Кон А ЛПС Физ. раствор Кон А ЛПС Физ. раствор Кон А ЛПС Физ. раствор Кон А ЛПС Физ. раствор Кон А ЛПС Физ. раствор Кон А ЛПС 1.6.2 Выделение спленоцитов, реакция бласттрансформации Селезенки забирали от мышей асептически, измельчали ножницами, ре- суспендировали в среде RPMI-1640 (Sigma, USA) с добавлением 2 мМ L-глутамина (Sigma, USA), 40 мг/л гентамицина (KRKA, Словения) и 50 мкМ 2-меркаптоэтанола (Amresco, USA) (полная среда, ПС), гомогенизировали пропусканием через иглу диаметром 1 мм и фильтровали через 3 слоя стерильной марли. Клеточную взвесь центрифугировали (10 минут, 1000 об/мин), супернатант сливали. Эритроциты в осадке лизировали добавлением 100 мкл 0,83% хлорида аммония. Далее клетки дважды отмывали в ПС, подсчитывали количество в камере Горяева (ЛПО “Красногвардеец”) с использованием микроскопа “Микромемед И” (ООО “Оптика и фото”) и ресуспендировали в концентрации 5•106/мл в полной среде, содержащей 20% фетальной эмбриональной сыворотки (Sigma, USA) и вносили (по 100 мкл) в лунки 96-луночной плоскодонной платы для культуральных работ. Стимуляцию спленоцитов проводили добавлением раствора Конканавалина А (КонА, Sigma) или раствора ЛПС (Sigma) в конечной концентрации 0.4 мкг/мл и 0.1 мкг/мл, соответственно. Далее платы помещали в CO2-инкубатор (37°С, 5% СО2) и выдерживали 72 часа. За 20 часов до окончания инкубации во все лунки вносили по 20 мкл раствора 3Н-тимидина в полной среде с концентрацией 5 мкКю/мл. После окончания инкубации клетки переносили на стекловолоконные фильтры типа GF/C (Whatman) с помощью полуавтоматического клеточного харвестера (Flow Laboratories). Интенсивность включения метки определяли на жидкостном сцинтилляционном β-счетчике (Delta 300, Searle Analytic Inc.). Результаты 16 выражали в количестве импульсов в минуту (cpm), а также в индексах стимуляции, рассчитанных как отношение интенсивности включения метки в лунках, содержащих митоген, к интенсивности включения метки в лунках, не содержащих митогена. 1.7 Анализ данных Статистический анализ выполняли с помощью программного обеспечения Статистика 6.0. Для всех данных была применена описательная статистика: данные проверены на нормальность распределения. Тип распределения определялся критерием Шапиро-Уилка. Межгрупповые различия анализировали параметрическими методами, так как тип распределения был нормальным. В качестве параметрического критерия использовали критерий Стьюдента для независимых переменных. Различия были определены при 0.05 уровне значимости. 17 2 Результаты исследования 2.1 Оценка влияния препарата Афлогилекс на продукцию антител Основой гуморального иммунного ответа является активация В-лимфоцитов и их дифференцировка в антителообразующие клетки - плазматические клетки. Этому предшествует цепь событий (рис. 2). Попадая в организм, антиген захватывается макрофагами, перерабатывается и в виде отдельных пептидов выносится на клеточную поверхность в комплексе с молекулами II класса гистосовместимости (МНС-II). Презентировавший на своей поверхности антиген, макрофаг перемещается во вторичные фолликулы лимфоидной ткани, где иммуногенный комплекс распознается антигенспецифическими хелперными Т-лимфоцитами 2-го типа (Тх2). После этого под действием цитокинов происходит митоз Тx2 и наработка пула соответствующих иммунных клеток. В процессе дифференцировки Т-лимфоцит экспрессирует в надлежащем количестве мембранные молекулы и цитокины, необходимые для взаимодействия с Влимфоцитами. В Т-зависимых зонах периферических лимфоидных органов происходит взаимодействие с активированными антигеном В-лимфоцитами. Провзаимодействовавшие с антигеном и с Т-лимфоцитами В-лимфоциты либо сразу дифференцируются в плазмоциты, продуцирующие ранние, суммарно низкоаффинные антитела IgM класса, либо перемещаются в первичный фолликул, образуя центры размножения. В процесс активации на периферии фолликула вступает несколько клонов В-клеток, имеющих близкие по специфичности антигенраспознающие рецепторы. Параллельно отбору на степень сродства антигенраспознающих рецепторов Вклеток к тому или иному антигену синтез антител переключается с одного изотипа на другой. Процесс переключения реализуется при участии цитокинов, продуцируемых, в основном, хелперными Т-клетками. При этом индукция одного из изотипов происходит при одновременной ингибиции других, так что в данный конкретный момент развития иммунного ответа секретируется только один из возможных вариантов. Клетки этих клонов, переместившиеся в центры размножения, подвергаются отбору по признаку высокой аффинности их рецепторов. Фактором отбора выступает антиген, экспрессирующийся на поверхности антиген-презинтирующих клеток. В-клетки, не прошедшие отбора на высокую аффинность антигенраспознающих рецепторов, погибают. Клетки, обладающие высокой рецепторной аффинностью, дифференцируются либо в плазмоциты, либо в клетки памяти. 18 Рис. 2. Упрощенная схема формирования гуморального иммунного ответа. Примечания: Мф-макрофаг, ТХ2 - Т-лимфоциты-хелпер-2, В-лф – В-лимфоцит. Плазмоциты продуцируют антитела, выполняющие три основные задачи: Вопервых, они нейтрализуют антиген. Эта способность антител особенно важна при обезвреживании бактериальных токсинов. Во-вторых, антитела выступают в качестве опсонинов. Взаимодействуя специфически с антигенными эпитопами бактериальной стенки, антитела создают условия для лучшего захвата патогена фагоцитирующими клетками, которые несут на своей поверхности рецепторы к Fc-фрагменту иммуноглобулинов. И, в-третьих, комплекс антигена с антителом активирует белки системы комплемента, которые в свою очередь выполняют несколько функций: - неспецифически опсонизируют антиген, - формируют поры в клеточной стенке корпускулярных антигенов, определяя их гибель, - выступают в качестве хемоаттрактантов, привлекая в зону проникновения патогена клетки воспаления. 19 Поэтому стандартным показателем активации гуморального иммунитета в ответ на введение антигена является продукция B-лимфоцитами антител. В проведенном исследовании иммунизацию мышей осуществляли внутрибрюшинным введением модельного для иммунологических исследований антигена – эритроцитов барана (ЭБ). На 7-10-ые сутки после иммунизации в крови наблюдается максимум IgG, специфичным к вводимым эритроцитам. В соответствии с этим, анализ титра антител в сыворотке крови проводился на 7-ые сутки после иммунизации. Оценка осуществлялась методом реакции гемагглютинации. Афлогилекс вводили мышам 6-ти кратно внутримышечно в терапевтической дозе (4 мг/кг). Группе плацебо инъецировали стерильный физиологический раствор. Результаты проведенного исследования представлены в таблице 4. Таблица 4 - Влияние препарата Афлогилекс на титр антител у мышей, иммунизированных эритроцитами барана (M±m, n=8) Количество Титр антител в сыворотке крови на 7-е Препарат животных в сутки иммунизации мышей ЭБ группе Интактные n=8 0,0±0,0 Плацебо (физ. раствор) n=8 8,5±0,3* Афлогилекс n=8 7,3±0,4* (4 мг/кг) Примечание: *- статистически значимо отличается от интактных по критерию Стьюдента при p<0.05 Из таблицы 4 видно, что однократное внутрибрюшинное введение эритроцитов барана мышам-гибридам первого поколения линий CBA и C57BL/6 индуцировало у них формирование антител к введенному антигену. В частности, на 7-е сутки после иммунизации титр антител у контрольных животных, получавших в качестве лечения физиологический раствор (плацебо), составил 8,5±0,3. Шестидневное внутримышечное введение препарата Афлогилекс в дозе 4 мг/кг не изменяло значения титра антител в сыворотке крови экспериментальных животных. Поставленная реакция является главным показателем формирования гуморального иммунного ответа, в соответствие с этим полученные результаты позволяют заключить, что Афлогилекс не оказывает влияния на гуморальный иммунный ответ. 20 2.2 Оценка влияния препарата Афлогилекс на реакцию гиперчувствительности замедленного типа Для оценки влияния препарата на клеточный иммунный ответ руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ рекомендует использовать реакцию гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) (Руководство экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2005). Данный метод подразумевает подкожное введение животным антигена, как правило, эритроцитов барана, с целью активации иммунного ответа. При постановке реакции ГЗТ эритроциты барана вводят двукратно – для сенсибилизации и разрешения. На стадии сенсибилизации происходит два важных события: презентирование антигена и образование клона антигенспецифических Т-лимфоцитов-хелперов-1 (Tx1). Презентирование антигена посредством рецепторов MHC класса I осуществляют макрофаги, поглотившие и переработавшие вводимые на этой стадии эритроциты барана. Лимфоциты своими рецепторами взаимодействуют с MHCI и отвечают образованием Тклеток памяти, несущих информацию об антигене. На эффекторной стадии при повторной встрече с антигеном происходит взаимодействие Т-лимфоцитов памяти и макрофагов. Последующая за этим продукция различных провоспалительных цитокинов лимфоцитами и макрофагами вызывает дальнейшее привлечение клеток специфической и неспецифической защиты. Разрешающая доза антигена вводится подкожно, под апоневроз задней конечности, на месте инъекции развивается воспалительная реакция, интенсивность которой легко измерить. Схематическое изображение описанных событий представлено на рисунке 3. 21 Рис. 3. Упрощенная схема событий, происходящих в реакции гиперчувствительности замедленного типа. Примечания: Мф-макрофаг, ТХ1- Т-лимфоциты-хелперы-1, ИЛ-3/-8 – интерлейкин-3/-8, ФНОа – фактор некроза опухолей-альфа, ИФНg – интерферон-гамма, ГМ-КСФ – гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор. Таким образом, на стадии сенсибилизации эритроцитами барана происходит образование клона антигенспецифических Т-лимфоцитов, на стадии разрешения – продукция лимфоцитами провоспалительных цитокинов. В соответствии с этим оценку влияния препарата целесообразно осуществлять как на стадию сенсибилизации, так и разрешения - это позволяет сделать вывод о действии препарата на разные стадии клеточного иммунного ответа. Однако поскольку проведенное исследование являлось скрининговым, т.е. было нацелено на выявление фармакологически активных субстанций, а не на описание механизма их действия, тестируемые вещества вводили на протяжении всего периода развития реакции (начиная с момента введения сенсибилизирующей дозы антигена и заканчивая моментом введения разрешающей дозы антигена). Результаты проведенного исследования представлены в таблице 5. 22 Таблица 5 - Реакция гиперчувствительности замедленного типа у инбредных мышей при внутримышечном введении препарата Афлогилекс мышам (M±m, n=10) Препарат Количество животных в группе Индекс реакции Интактные n=10 0,4±0,03 Плацебо (физ. раствор) n=10 6,9±0,9* Афлогилекс n=10 12,9±1,5*** (4 мг/кг) Примечание: *- статистически значимо отличается от интактных по критерию Стьюдента при p<0.05, ** - статистически значимо отличается от плацебо по критерию Стьюдента при p<0.05. Из таблицы 5 видно, что Афлогилекс оказал влияние на развитие реакции замедленного типа, усилив её в 2 раза. Полученные данные свидетельствуют о том, что шестидневное введение препарата оказывает иммуностимулирующее действие. 2.3 Оценка влияния препарата Афлогилекс на пролиферативную активность Т- и В-лимфоцитов Одной из ступеней развития гуморального и клеточного иммунного ответа является формирование вследствие митоза клона антигенспецифичных Т- и В-лимфоцитов (рис. 23), поэтому одним из показателей иммунотропного действия фармакологической субстанции является влияние на пролиферацию иммунокомпетентных клеток. Оценка пролиферативной активности Т- и В-лимфоцитов проводится с помощью реакции бласттрансформации. Этот метод основан на способности некоторых лектинов вызывать поликлональную активацию и пролиферацию лимфоцитов, которая оценивается радиометрически по интенсивности включения в клетки 3Н-тимидина. Как правило, для активации Т-лимфоцитов используют конканавалин А (Кон А), для активации Влимфоцитов – липополисахарид клеточных стенок бактерий (ЛПС) (Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ, 2005). Реакцию бластрансформации ставили на спленоцитах мышей линии Balb/c после 4-х кратного внутримышечного введения мышам препарата Афлогилекс в дозах 0.08, 0.8 и 8 мг/кг. Группе плацебо вводили стерильный физиологический раствор. Результаты исследования представлены в таблице 6. 23 Таблица 6 - Индекс стимуляции спленоцитов мышей после 4-х кратного введения препарата Афлогилекс (M±m) Индекс стимуляции Доза Препарат препарата КонА ЛПС Плацебо (физ. раствор) 2,1±0,3 2,9±0,02 0,08 мг/кг, n=4 1,5±0,2 2,4±0,5 Афлогилекс 0,8 мг/кг, n=4 1,8±0,4 2,3±0,3 8 мг/кг, n=4 1,8±0,1 2,9±0,1 Из таблицы 6 видно, что внутримышечное введение препарата Афлогилекс в дозах 0,08, 0,8 и 8 мг/кг в течение 4-х суток не оказывает влияния на КонА- и ЛПС- индуцированную пролиферацию спленоцитов мыши. Статистически значимых отличий с группой плацебо для всех экспериментальных групп обнаружено не было. Полученные данные позволяют заключить, что Афлогилекс не влияет на пролиферативный ответ Т- и В-лимфоцитов. Это дает основание предположить, что установленное влияние препарата на формирование клеточного иммунного ответа обусловлено механизмами не связанными с действием на формирование клона антигенспецифичных лимфоцитов. 2.4 Обобщение результатов исследования Иммунный ответ — это сложная многокомпонентная, кооперативная реакция иммунной системы организма, индуцированная антигеном и направленная на его элиминацию. В процессе эволюции свойства микроорганизмов постоянно совершенствовались – это привело к появлению различных видов иммунитета. Во-первых, различают специфический и неспецифический иммунный ответ. Неспецифический иммунный ответ - это первый этап борьбы с инфекцией, он запускается сразу после попадания микроба в организм. В его реализации задействованы система комплимента, лизоцим, тканевые макрофаги. Неспецифический иммунный ответ практически одинаков для всех типов микробов и подразумевает первичное разрушение микроба и формирование очага воспаления. Воспалительная реакция это универсальный защитный процесс, который направлен на предотвращение распространения микроба. Неспецифический иммунитет определяет общую сопротивляемость организма. Люди с ослабленным иммунитетом чаще болеют различными заболеваниями. Специфический иммунитет это вторая фаза защитной реакции организма. Основной характеристикой специфического иммунного ответа является распознавание патогена и выработка факторов защиты направленных специально против него. Процессы неспецифического и специфического иммунного ответа пересекаются и во многом дополняют друг друга. Во время неспецифического иммунного ответа часть микробов 24 разрушается, а их фрагменты выставляются на поверхности так называемых антигенпрезинтирующих клеток (АПК, например, макрофагов). Во второй фазе иммунного ответа клетки иммунной системы (лимфоциты) распознают фрагменты патогена, выставленные на мембране АПК в комплексе с МНС I/II, и запускают специфический иммунный ответ как таковой. Специфический иммунный ответ может быть двух типов: клеточный и гуморальный. Клеточный иммунный ответ подразумевает формирование клона Т-цитотоксических лимфоцитов, способных разрушать клетки мишени, мембраны которых содержат чужеродные материалы (например, вирусные белки). Клеточный иммунитет задействован в ликвидации вирусной инфекции, а также таких типов бактериальных инфекций как туберкулез, проказа, риносклерома. Раковые клетки тоже разрушаются активированными лимфоцитами. Гуморальный иммунный ответ опосредован В-лимфоцитами, которые после распознавания микроба начинают активно синтезировать антитела по принципу один тип антигена – один тип антитела. На поверхности одного микроба может быть множество различных антигенов, поэтому обычно вырабатывается целая серия антител, каждое из которых при этом направлено на определенный антиген. Антитела (иммуноглобулины, Ig) – это молекулы белков, способные прилипать к определенной структуре микроорганизма, вызывая его разрушение или скорейшее выведение из организма. В проведенном исследовании, иммунотропное действие препарата Афлогилекс оценивали в отношении обоих вариантов иммунного ответа: клеточного и гуморального. Оценка клеточного иммунитета производилась методом реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ), вызванной двукратным введением эритроцитов барана мышам. Реакция характеризовалась формированием отека в месте повторного введения антигена животным. Выраженность гуморального иммунитета оценивалась методом определения в сыворотке крови титра антител, вырабатываемых в ответ на однократное введение эритроцитов барана мышам. Таким образом, поставленные тесты были направлены на оценку “конечного продукта” реализации клеточного и гуморального иммунных ответов. Дополнительно, оценивалось влияние Афлогилекса на митоген-индуцированную пролиферацию T- и Влимфоцитов (реакция бласттрансформации). Поставленный тест позволяет оценить действие препарата на формирование антигенспецифических клонов лимфоцитов, как одну из ступеней клеточного и гуморального иммунных ответов. 25 На упрощенной схеме гуморального и клеточного иммунных ответов пунктиром выделены показатели, выбранные для оценки иммунотропного действия Афлогилекса (рис. 4). Черным цветом отмечены показатели, на которые препарат не оказал влияния (пролиферация Т- и В-лимфоцитов, продукция антител), синим цветом отмечен показатель, изменяющийся под действием Афлогилекса (отек лапы). Аллергонет Рис. 4. Упрощенная схема гуморального и клеточного (на примере реакции ГЗТ) иммунных ответов. Примечания: Пунктиром выделены показатели, выбранные для оценки иммунотропного действия препарата Афлогилекс. Черным цветом отмечены показатели, на которые Афлогилекс не оказал влияния (пролиферация Т- и В-лимфоцитов, продукция антител), синим цветом отмечен показатель, который изменялся под действием препарата. - активация ЭБ – эритроциты барана, АТ – антитела, Мф-макрофаг, MHC I/II – главный комплекс гистосовместимости I/II, ТХ1/2 - Т-лимфоциты-хелперы-1/-2, В-лф – В-лимфоцит, ИЛ-3/-8 – интерлейкин-3/-8, ФНОа – фактор некроза опухолей-альфа, ИФНg – интерферон-гамма, ГМ-КСФ – гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор. Проведенное исследование позволило установить, что Афлогилекс не влияет на формирование антител, индуцированное эритроцитами барана. На основании этого можно заключить, что тестируемые субстанции не действуют на гумморальный иммунный ответ. 26 При постановки реакции ГЗТ установлено, что Афлогилекс усиливают реакцию. Из этого можно заключить, что препарат оказывает стимулирующее действие в отношении клеточного иммунитета. Определение влияния Афлогилекса на пролиферативную активность лимфоцитов показало отсутствие активности препарата в отношении данного показателя. При реализации иммунного ответа пролиферация лимфоцитов производится после распознавания антигена на поверхности антигенпрезентирующей клетки. Из этого следует, что иммунотропное действие Афлогилекса вряд ли обусловлено влиянием на формирование клона активированных Т-лимфоцитов. Вероятнее всего препарат оказывают влияние на продукцию провоспалительных цитокинов лимфоцитами и макрофагами, увеличивая её. Эта стадия является решающей для формирования реакции ГЗТ, так как именно цитокины привлекают клетки (лимфоциты, макрофаги) в очаг воспаления и активируют макрофаги для элиминации антигена. Однако для проверки предложенной гипотезы необходимо соответствующее исследование. 27 ЗАКЛЮЧЕНИЕ Целью проведенного исследования являлось определение иммунотропного действия препарата Афлогилекс. Анализ проводился на основании трех тестов (продукция антител, реакция гиперчувствительности замедленного типа, реакция бласттрансформации), оценивающих влияние Афлогилекса на развитие гуморального и клеточного иммунных ответов, а также на пролиферацию Т- и В-лимфоцитов. Исследование проводилось на мышах, препарат вводили внутримышечно в 1-3 дозах (0,04, 0,4, 4 и 8 мг/кг) в зависимости от эксперимента, из которых 4 мг/кг - терапевтическая. Результаты экспериментальной работы показали, что Афлогилекс не влияет на митоген-индуцированную пролиферацию Т- и В-лимфоцитов и не изменяет содержание антител в сыворотке крови иммунизированных эритроцитами барана мышей. Полученные данные позволяют заключить, что Афлогилекс не имеет активности в отношении пролиферации лимфоцитов и не влияет на формирование гуморального звена иммунитета. При постановке реакции гиперчувствительности замедленного типа установлена фармакологическая активность Афлогилекса. В частности, препарат увеличивал отек лапы мышей почти в 2 раза. Полученные данные свидетельствуют о том, что в терапевтичекой дозе шестидневное введение препарата оказывает Т-лимфоцит-зависимое иммуностимулирующее действие (4 мг/кг). Это позволяет заключить о перспективности дальнейшего изучения иммунотропных свойств Афлогилекса. В клинике клеточный иммунитет играет двоякую роль в зависимости от нозологии. В частности, при инфекционных заболеваниях он оказывает защитное действие, в то время как при аутоиммунных патологиях (ревматоидный артрит, контактный дерматит, рассеянный склероз, системная красная волчанка и т.д.) и при болезни “трансплантат против хозяина” инфекционных – наоборот заболеваний иммуностимуляторы, при разрушительное в качестве терапии действие. Поэтому вспомогательной аутоиммунных при лечении терапии используют заболеваний назначают иммуносупрессоры. Следуя этой логике и полученным результатам, можно предположить, что Афлогилекс будет иметь эффект при инфекционных заболеваниях. Однако для формирования окончательных выводов необходимо проведение соответствующих исследований. 28 ЛИТЕРАТУРА 1. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ/ Под общей редакцией члена-корреспондента РАМН, проф. Р.У. Хабриева. – 2 изд., перераб. и доп. - М.: ОАО “Издательство “Медицина”, 2005. – 832 c.: ил. 2. Еляков Г.Б., Козловская Э.П., Рассказов В.А. и др. Биологически активные добавки и лекарственные препараты на основе природных соединений из океанического растительного и марикультурного сырья // Новейшие технологии в системе интегральных процессов территорий стран АТР: Сб. инвестиционных предложений I международного инвестиционного конгресса территорий стран АТР. Владивосток. 2000. С. 276. 29
