недостатки традиционного метода определения аффинности антител и их устранение

Реклама
експериментальні роботи
УДК 577.27
недостатки традиционного метода определения
аффинности антител и их устранение
С. А. БОБРОВНИК, М. А. ДЕМЧЕНКО, С. В. КОМИСАРЕНКО
Институт биохимии им. А. В. Палладина НАН Украины, Киев;
e-mail: [email protected]
Показано, что применение традиционного метода определения аффинности антител может
привести к получению неточных результатов и далеко неполной информации об обследуемом образце
антител, особенно если данный образец содержит два и более видов антител различной аффинности.
Для решения подобной проблемы нами предложено использовать иной подход, который позволяет определить, что исследуемый образец содержит более одного типа антител разной аффинности. В случае
обнаружения в исследуемом образце двух типов антител различной аффинности для их характеристики следует применять метод, разработанный нами ранее.
К л ю ч е в ы е с л о в а: реакция антиген-антитело, аффинность, математическое моделирование.
А
ффинность взаимодействия является
одной из наиболее важных характеристик любого лиганд-рецепторного
взаимодействия, в том числе взаимодействия
антиген-антитело. В связи с этим для определения аффинности взаимодействия антиген-антитело разработаны различные методы,
среди которых методы, основанные на применении ELISA, являются одними из самых
простых и надежных, к тому же не требующих
значительных количеств антител и антигена,
а также их очистки. Одним из наиболее популярных методов определения аффинности
антител является метод, первоначально предложенный Фриге и др. (1985), а впоследствии
скорректированный Стивенсом (1987). Предложенный авторами процесс линеаризации
кривых зависимости концентрации свободных
антител в их смеси с антигеном от обратной
концентрации последнего почти всегда дает
возможность получить прямую линию, даже в
том случае, когда фактически рассматриваемая
взаимосвязь не является линейной.
Вместе с тем, получение в эксперименте
кажущейся линейной зависимости служит для
исследователя подтверждением того, что его
эксперимент якобы выполнен верно и полученные экспериментальные результаты позволяют определить истинную аффинность взаи­
модействия. В этом и заключается ошибка,
которую трудно заметить, используя традиционный метод определения аффинности антител. Нами обнаружено, что во многих случаях упомянутый подход не позволяет выявить
тот факт, что в исследуемом образце антител
66
может находиться примесь антител низкой аффинности. Отметим, что присутствие таких
антител сказывается на точности определения аффинности высокоаффинных антител. К
тому же информация о присутствии подобных
антител может быть существенной для характеристики биологических свойств данного образца антител.
В связи с вышеизложенным, весьма желательным является определение истинных
характеристик исследуемых образцов антител, а не только приблизительная оценка аффинности высокоаффинных антител, как это
позволяет осуществить традиционный метод,
предложенный Фриге и др. и скорректированный Стивенсом. В настоящей статье рассмотрены примеры решения подобной проблемы с
помощью использования уравнения, предложенного нами ранее для оценки аффинности
двухвалентных антител при помощи ELISA
[2]. Несмотря на то, что предложенное нами
уравнение выглядит более сложным, чем традиционно используемое уравнение Стивенса,
преимущества использования нашего подхода
являются очевидными, поскольку он позволяет получить дополнительно важную информацию о свойствах характеризуемого образца
антител. В настоящей статье приводятся как
экспериментальные, так и теоретические данные, которые убедительно демонстрируют преимущества предложенного нами уравнения
по сравнению с традиционным подходом, по­
скольку предложенный нами метод позволяет
получить более точные характеристики, а также значительно больше информации о свойст­
вах исследуемых образцов антител.
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 3
С. А. БОБРОВНИК, М. А. ДЕМЧЕНКО, С. В. КОМИСАРЕНКО
Теория
Согласно закону действия масс, между аффинностью взаимодействия двух реагентов, их
концентрациями и концентрацией комплекса
этих реагентов в реакционной смеси существует соотношение, описываемое следующим
уравнением:
c
K
, (1)
(1)
(l c)(nr0 c)
c
где KK – константа
(2) равновесия или аффинl
(
nr
0 c)
ность взаимодействия,
c – концентрация ли1
1
1
ганд-рецепторного
комплекса при достижении
(3)
состояния
между свободными и
c nfK равновесия
n
a
связанными
реагентами,
l – полная конценc
K (nr0 c) r(4) – полная концентрация
трация лиганда,
0
f
рецептора, n – валентность рецептора. Тогда
K
0
(l–c) –Aэто
свободного лиганда,
1+ d (5)
=концентрация
A0 -Ai это концентрация
li
а (nr0 –c) –
свободных сайтов
рецептора.
A0 Ai 1
A0 Ai ·
1 §
¸l >>
(6) c, то уравu c
u ¨1что
если
Важно
K A0 отметить,
l i K d ¨©(1)
A0 ¸¹
c)(nr0 упростить
c)
нение (1)(lможно
и тогда получим:
A0
c i (7)
1 Kl
KAi
. (2)
(2)
l (nr0 c)
r0 Kli
1
1
(8)
c1i
Для
между эксперименталь(3)
1 того
Kli чтобы
c
c
nfK
n
a
но измеряемыми
величинами
c и f = l–c по(1)
K
r0 ci 1 2 Kli
(l c)(nr0 cзависимость,
)(9)
c линейную
лучить
Клотц в 1946
c) i (4)
r K (nr10 Kl
году преобразовал
уравнение (1) следующим
c
f 0
(2)
K
A0 1[3]:
2 Kl
образом
A0 l (nr0 i cK) d1 Kli (10)
1
=
+
(5)
( 1 1Kli ) 1l
1AA0i-A
i
i
A. (3) A A A
(3)
cA 2l2nfK
K
i2aKl1i un 01 i§ 0A0 i Ai ·0 (11)
0 i A
¸¸ (6)
u
Ai u ¨¨1 Ai
c A
A0 название
0K ( nr l i c(3)
dполучило
¹
©2
) K (4)
Уравнение
уравне0
f A
§ A0 Ai · что,
A
A0 Aпостроив
00
i
i
ние Клотца.
Очевидно,
данную
Kli (12)
1 Kli¨K(7)
¸ dA
A0 зависимость,
Ai
линейную
используя
найденные
AA
i (5) ¹
i i = 1 +©
A0 -Aiзначения
l
в опыте
c
и
f,
можно
легко
опредеi
2
r0 Kli
§(8)
A
A0 обратной
Ai ·§ A0 величине
Ai ·
in,
лить cA
равное
отрезка,
0
i
A0 1A
i1¨ 1 ¸ A0 Ai ¸
i Kl
¨
uпрямой
отсекаемого
Ai
Ai uна
¸ (6) Значение
©2 KlK
¹¨1 осиAAi ординат.
A
l
r
c
1
0
0
i
d
¹ угол накло© поскольку
0
iлегко найти,
i
K также
(9)
2
2
§
A
r
1
Kl
§A
§ таким
§ A Ai
0 00 Ai ·
A
A Ai прямой
i 0 Ai · образом
на полученной
¨ A0 Ai равен
1 Kl
ic
(7)
0
¨ 0
¨
¸
¨
¸
(1)
K
обратной
величине
константы
равновесия
A
1
2
Kl
¨
i
Ai
Ai
i
© 0 A(il c¹)(i nr©0 1cA)Kl
¹
©K, Ai
© n.
i (10) величину
умноженной
на
обратную
r
Kl
)(8)
ciAi ( 1 0 Klci i Скетчард
Позднее
в 1949 г. [4], используя
K 1 Kli
A(2)
A0 Ai
2 2l ( nr §
0 Ai
· ваc
)
l
Kl
u
2
02 (11) иной
идеюKКлотца,
предложил
несколько
0
r0 A
0i ci Ai1 i ¨2 A
Kl0 iAiAi § AA0i Ai · A0 Ai ¸ u Kl (14)
¨
¸
i
(9) уравнения
1
1
риант1 преобразования
¸
Ai 1¨ Kl (3)
A
Ai ¹ (1),Ai а имен2 ©
i i
но: cA r0nfK
©
¹
A a § nA A · A Ai
A00 11 i 2Kli¨ 0 Ai ¸ 0
Kli (12)
c A
(15)Ai
1nr0 )©1c) 1.Ai(4)Kli ¹i (10)
A ( i1K(Kl
(4)
i
i
A0 A2 i
f Kl
i
§KAA
· A0 0AA
A0A
2 2 Ai
0AA
i i
i i A
K
l0уравнении
21Kl
0 (11) уравнениA
d0 d
i 0=
i¨u K
¸ названном
В
(4),
+
(5)
(16)
=
+
1
A
A
A
A
A
i
i
i-A
i
i
©
¹
A
-A
l
l
A
0
i
i
ем Скетчарда,
представлена
линейная зави0
i
i
2
2 §
2
§ с, тангенс
симость
между
величинами
с/f
·
§
A
A
A
A
A
A
A
A
A
(1
2
l
K
)
1
1
0
i
0
i
0
i
0
i
i
01 ·
§AA0 A
§i A0 uA
· A0 Ai·¸ Klи
§ A Ai
Ai
¨
i
i 1
(6)
u
(17)
¨i A0 (12)
¨
¸
i
2
¨ 0
¸
¨
угла наклона
равен
K. Следовательно,
¨ Ai0 (1 ¸ llкоторой
¨ A
¸
AAiA
¨
0
ii©K ) KidA ¹©
¹
A
A
i
i
i
©
¹ ©
¹также i позволяет
© Ai
уравнение
Скетчарда
легко
A0 A01 (1 2li K1 ) A2 02 (1 2li K 2 ) ©
Ai0 A
1i Kli§ (7)
A A · A0 Ai2 (18)
(1 li¨K10) 2 i ¸ (1
li K 2 ) 2
Ai
§
·
A
Ai A ¹біохім.
i A · 2009,
© A0Укр.
§ A0Aжурн.,
ISSN 0201
A0i r—Kl
Ai 8470.
A0 т.
Ai ¸81, № 3
i
i
¨
0
i
u Kli (14)
¸ §
(8)
ci A
2 2¨
2 ¨
A
A
Ai A ¸ § A A
i AKl
i
iA A ¹
©
1
§
·
A
A
A
A
§AA
·
§
·
A
A
A
A
i
00
i i
i ¹
i
© 0 0 i ¸i 0 0 i i ¨ 0
¨ 0
¨r c 1¸ ¨2¨Kl
¸
¨
A
A
A
A
A
A
A
A
0
i
i
i
i
i
©
¹
i
i
i
i
i
© 1
¹ ©
¹
©
A
(9)
i
©
(15)
1 1 1Kl
r0
i
Kli
A0 Ai
определить константу равновесия K, причем в
некоторых случаях это уравнение даже более
удобно в применении, чем уравнение Клотца,
в частности, когда необходимо определить аффинность двух видов рецепторов, находящихся
в смеси и имеющих разные аффинности. Отметим, что в обоих случаях для определения
аффинности взаимодействия необходимо экс­
периментально определять концентрацию образовавшегося комплекса, а не концентрацию
свободного рецептора
или лиганда.
c
K того,c чтобы (1)
Для
уравнения (3) и (4) можK (l c)(nr0 c) (1)
c)(nr0 c)
но было(l использовать
для определения афc
c
(2) методом ELISA, определяя
K
финности
антител
K l (nr0 c) (2)
в эксперименте
l (nr0 c) не концентрации комплекса
1
1
1
антиген-антитело,
1
1 1 (3)а концентрации свободных
c вnfK
n с(3)антигеном, Фриге и соавт. в
антител
смеси
c nfK aa n
1985 г.,
c преобразовали уравнения Клотца (3) и
c K ((4)
nr0 c) (4)
Скетчарда
образом [5]:
c) (4)
f K (nr0 следующим
f
A0
K
A0 = 1+ K dd (5)
(5)
1
=
+
A0 -Ai
l i (5)
A0 -Ai
li
A0 Ai 1
A A ·
1 §
A0 Ai u 1
1 u §¨1 A00 Aii ·¸ (6)
¨
1
u
u
(6)
A0
l i K d ¨©
A0 ¸¸¹ , (6)
A0
li K d ©
A0 ¹
A0
A 1 Kli (7)
диссоциации комплекса
где KAd0i –1 константа
Kli (7)
Ai
антиген-антитело,
равная
обратной величиr Kl
ci r00 Klii (8)
не константы
равновесия,
т.е.
Kd = 1/K; A 0 и
ci 1 Kli (8)
Ai представляют
собой измеряемые методом
1 Kli
r0 окраски
c 1 2 Kl
i
ELISA
лунок,
r0 cii 1 2 Kl
(9) которые должны быть
i
r0
1 Kli (9)
пропорциональны
r0
1 Kli концентрации свободных
антител
в
исследуемых
растворах в отсутсA0 1 2 Kli A0 1 2 Kli (т.е.
1 равна
Kli (10) A , при l = 0) или в
твие антигена
Ai ( 1 Kli ) 1 Kli (10) 0
Ai ( 1 Kliантигена
)
присутствии
(т.е. равна Ai, при l = li)
A0 Ai A0 Ai
2 2
соответственно
после
A A 0 (11)состояния
K 2li 2 2 Kli u A0 Ai достижения
K li 2реакции
Kli u Ai антиген-антитело.
0 Ai i 0 (11)
равновесия
Ai
Ai
2
Важно также
отметить,
Фриге и соавт.
2
§ A0 Ai · A0 что
A0 Ai
A
§¨ A0 уравнения
A0 Ai свои
Ai ·¸ A0 Aii (5)Kl
(12)при ус[5] получили
и (6)
Klii (12)
Ai ¨© c A
¸¹ Ai
i следовательно,
c
ловии,
что
l
>>
и,
l
–
c ≈ l.
Ai
© Ai ¹(1)
K Ai
2
Нами
было
показано
[2,
6],
что
Фриге
и
(l c)(§nr0 c) · 2
A0 A·i
A0 Ai
A0 Ai
2
§
·
соавт.
значительно
усложнили
проблему
вывоA
A
A
A
A
A
· A0 0 Ai ¸i c ¨ 0
i ¸
0
i
A
Ai
(2)
K Ai u Kl©¨i (13)
iими
¸дапредложенных
¹¸ уравнений
(5) и (6). Не
A
A
A
¸
i l ( nr0 ©c )
i
i
¹
¹толькоAi полученные
ими2 уравнения§ (5) и (6), но
¹ 2
§1 A0 1Ai · 2 1§ A0 Ai · 2 A0 Ai §¨ A0 Ai
§ A0 Ai
еще как
семь
уравне§¨ A0 минимум
· аналогичных
§
Ai ·¸ §¨ A(3)
A0 A
0 Ai ¸ A0 Ai
i ¨ A0 Ai
¨
¨ более
Ai
Ai прос¨©c AnfK
¸¹ n¨© Ai значительно
¸¹
¨© Ai
aполучить
ний можно
i
¨
A
A
A
A
©
i
i
i
©c i ¹ ©
¹
© Ai
©
тым путем,
используя не уравнения
Клотца
K (nr0 c) (4)
(3) и fСкетчарда
§ (4), а исходное 22уравнение
· (2),
§
·
A
A
A
A
A
A
A
A
§
·
представляющее
собой
закон
действия
масс.
Aii §¨ A00 Aii ·¸ A00 Aii ¸¸ u KlК
(14)
AA000 =Aii1+¨¨KAd00 (5)
Aiиспользуя
¨© Ai (2),
Klii (14)
¨ Ai уравнение
примеру,
можно
Ai ¸ uлег¸¹
A0 -AAi i
¨© l i Ai
¸
A
A
¹
i
i
©
¹
ко получить [6]
© следующее уравнение, которое
¹
·
§
A0 1 A
A
A
1
1
A
является
более
простым
и
более
удобным
для
0
i
i
i¨
¸
(6)
1 1u 1 Aui ¨1 (15)
¸
(15)
1
1
Kl
работы,
чем
уравнения
(5)
и
(6):
A
l i KAd0 ©Ai
A0 ¹
Kl0ii
A0 Ai
2
A0 A0 ·
Kd
· A0 AAi 1¸ =
(7)
Kl1i +.(7)
K d (16)
0 u Kl
¸ AiA0 -A
i+(13)
=
1
li (16)
¸
i
A
iA0 -Ai
¹
l
r¹0 Kl(1i 2l Ki )
01
i
(8)
cAi A
A Kl
(1 2li K ) (17)
(17)
Aii 1 01
(1 i li K ) 22
(1
)
li K
67
r0 cA
1
2
Kl
i
(1 2li Ki 1 ) (9)A02 (1 2li K 2 )
2
l
K
)
A
(1
2
l
K
)
(18)
Ai r A·01
2
01 (1
i
1
02
i
2
2
(1 li K 2 ) 22 (18)
i
1li KKl
· A0Ai 0Ai ¸(1
1 )2
)
(1 li K 2 )
Kllii K(13)
u
1
¸ A0 1 ¸(1
2 Kli A
i
1 Kli 2 (10)
¹
¹
AA0i (1Ai Kli )§ A0 Ai · 2 A0 Ai
A0 Ai §¨ A0 Ai ·¸ A0 Ai
2
· 2 A0 ·¸ A0 ¸¹ Ai
Ai
¹
експериментальні роботи
Главное преимущество предложенного
нами уравнения (7) в сравнении с уравнениями (5) и (6) состоит даже не в его простоте,
а в том, что справа в уравнении (7) используется концентрация конкурирующего антигена
li, а не ее обратная величина, как это было в
уравнениях (5) и (6). Это важное преимущество уравнения (7), поскольку известно, что использование линейных зависимостей от обратных концентраций реагентов может привести
к существенному снижению точности определения искомых величин.
Еще одним существенным недостатком
уравнений (5) и (6) является то, что, как отметил позднее Стивенс [7], эти уравнения, строго говоря, математически не точны, как не является точным и уравнение (7), по­скольку все
эти уравнения не учитывают того, что IgGантитела являются двухвалентными. Проблема состоит в том, что уравнения (5), (6), (7)
описывают соотношение между количеством
свободных и связанных с лигандом моновалентных рецепторов в смеси лиганда и рецептора. Следовательно, в случае с антителами
эти уравнения описывают соотношения между
концентрациями свободных и связавших антиген паратопов антител, а не молекул антител.
Поскольку IgG-антитела являются двухвалентными, то в их смеси с антигеном существуют
три варианта связанных с антигеном антител,
а именно: 1) антитела, у которых оба паратопа
свободны; 2) антитела, у которых один паратоп свободен, а второй блокирован антигеном;
3) антитела, у которых оба паратопа заняты
антигеном (рис. 1).
Очевидно, что, используя ELISA, в эксперименте мы определяем не часть свободных
паратопов антител в их смеси с антигеном,
а ту часть антител, у которых свободны или
один, или оба паратопа. Это связано с тем, что
именно такие антитела способны связываться с сорбированным на плашке антигеном и,
следовательно, именно они будут регистрированы в эксперименте, как «свободные» антитела. Очевидно, что часть свободных паратопов
антител и часть антител, у которых хотя бы
один паратоп свободен, не равны между собой,
а значит, строго говоря, неверны и уравнения
(5) и (6), предложенные Фриге и соавт. (1985).
Чтобы устранить эту неточность, Стивенс
в 1987 г. предположил, что уравнение (5) будет
верным, если из левой части уравнения вычислять корень квадратный [7]. Если это предположение Стивенса верно, тогда теоретические
расчеты показывают, что данное изменение
в уравнении (5) позволяет получать значения
68
1
2
3
Рис. 1. Двухвалентные антитела, которые находятся в смеси с антигеном, могут быть в одном
из следующих состояний: (1) оба паратопа антитела свободны; (2) один из паратопов антитела
может быть заблокирован антигеном, а второй
быть свободным; (3) оба паратопа антитела могут быть заблокированы антигеном.
Связаться с антигеном, сорбированным на иммунологических платах, могут только антитела
(1) или (2), у которых один или оба паратопа
свободны и, следовательно, именно они будут
выявлены с помощью ELISA, как «свободные»
антитела
константы равновесия, которые примерно в
два раза выше, чем при помощи исходного
уравнения (5). К сожалению, Стивенс не представил строгого математического доказательства своего предположения. Позднее нами было
найдено следующее решение этой проблемы.
Найти соотношение между концентрацией свободных паратопов (т.е. паратопов, не
заблокированных антигеном) и концентрацией антител (рис. 1), у которых или один, или
оба паратопа свободны, можно следующим
образом. Пусть после достижения равновесия
в смеси антиген-антитело концентрация паратопов, связавших антиген, равна ci. Тогда концентрация свободных паратопов будет равна
r 0-ci, где r 0 – полная концентрация паратопов
в исследуемой смеси.
Следовательно, вероятность того, что
данный паратоп антитела заблокирован антигеном, равна ci /r 0, а вероятность того, что он
свободен, равна 1-ci /r 0 = (r 0-ci)/r 0. В соответст­
вии с биномиальным распределением, вероятность того, что оба паратопа двухвалентного
антитела одновременно связали антиген, будет
равна квадрату вероятности связывания антигена каждым из паратопов, т.е. равна ci2/r 02.
Отсюда следует, что вероятность того, что хотя
бы один из паратопов антитела не связал антиген (т.е. антитело является «свободным»), будет
равна 1-ci 2/r 02 = (r 02-ci 2)/r 02.
Таким образом, отношение между концентрацией «свободных» антител в смеси с антигеном и концентрацией свободных паратоISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 3
(3)
0
1
1
1c K
(3) Ad (2) 1
KA0 = A
A Ai ·
1 §
c nfK
n 010+
¸ (6)
c)l i u (5)
u ¨¨1 0
A0a-Ali (nr
i
A
li K d ©
A0 ¸¹
K (nr0 c) (4)
c
1
1 c01
KK
) 1(4) (3)
A(0nr0 AicA
1 §(1) A0 Ai ·
0 n
¸ (6)
¨(7)
1 С. В. КОМИСАРЕНКО
u
f
c М.
nfK
Kl
ДЕМЧЕНКО,
ac )(
(l А.
nr10 c )u
i ¨
A0
K d С. А. БОБРОВНИК,
A
l
K
A0 ¸¹
0
i
d
A
©
= 1+
(5)
A0 c
K dci
A0 -Ai
li
=0 1+K (nr
cr)Kl
(4)
A
0 (5)
K
0 (2)
i
(7)
lci Kl
A0 -Ai f l1(nr
(8)
i i c )
0
·
§
A0 Ai 1
A
A
1
A
0
i
Kl
1
i
i
2
2
2
¸
¨
(6)
1
u
u
A
K
Очевидно,
тангенс
пов будет равно (r 0 -ci )/r 0 : (r 0-ci)/r 0 = (r 0+ci)/r¨0.
A Ai · угла наклона этой
d§
1 1что
A
li K d ©
AA0 0 ¸¹A1i u0 1r01=Kl
¸¸ (6) константе рав¨11(5)
r10i +
(8)
cu
20Kli равен
i ¨(3)
линейной
зависимости
Это значит, что концентрация0 «свободных»
c
A
-A
l
i
A0 c 0 lnfK
K d ni ©
A0 (9)
ii
¹
a
Klir0следовательно,
1 Kli
новесия 1K и,
построив данную
антител в смеси с антигеномA0превышает
1 Kli (7) кон§
A
A
A
1
1
c
A
0 c i 1 2 Kl
0 Ai ·
0
Ai
линейную
зависимость,
угол нацентрацию свободных паратопов
в (r 0+ci)/r 0
(6)
u0 1c)2i Kl
nr
(4)iu ¨¨1 можно ¸¸найти
KlKii ((7)
1r
A
0 (9) 1 KlA (10)
li KlKопределить
f rAа0 значит,
Ai
d
¹
©
i 0 величину
клона,
K, т.е.
раз. Поскольку методом ELISA исследователи
1
r0 Kli
0
Ai ( 1 iKli )
(8)
ci свободных
A0i
Kd
r0AKl
аффинность
взаимодействия
антител
с
антиопределяют
неc концентрации
пара0
(1)
K
1 Kli
A0 1 1(8)
(7)1 (5)
1+
=
ci
2 Kl
A(10)
A0 Ai
2 ii 2
0 Ai
(l c)(nr0 c)
Kl
геном.
топов, а концентрации
«свободных» антител в
A
-A
l
2
0
(11)
K
l
Kl
u
1
Kl
i
0
i
i
i
i
r0 ci 1 2 Kli
Ai i ( 1i Kli )
c учета этого факта
Ai
Ai (12) можно
Полученное
нами уравнение
образцах,
тоc для
значения(9)Ai
(1)
K
r
c
1 r02Kl
Kl
A
1 A§ AA0 A2 Ai ·
0
i
K (l c)(nr (2)c)
0 A
i i i 1 (8)
r
1
Kl
A
(9)
c
i
0
¸
¨
2
2
(6) уравнение,
u uтак,
u i¨1 0 получить
0 чтобы
i
преобразовать
в уравнениях
l (nr0 (5),
c)0 (6) или (7) необходимо разде2Kl
l1i 1Kl
§ A0 Ai A· A¸00 (11)
r0 Ki A
AKl
Ai
i Ai K
i0il
0
i ранее
Ai ¸ 0 ¹ (1987).
Ad i ¨ © Стивенсом
Kli Для
(12)
c
предложенное
лить на величину
(r 0+ci)/r 0. A0 1 2 Kli 1
1
1 (2)
1 Kli (10) A 1 rA02Klci 1 Ai2 Kli © Ai ¹
K
Ai
0
i
этого
обе
части
уравнения
(12)
на
Следует
обратить
внимание,
2
0умножим
Ai ( 1 что
Kli )значение
l (nr0 c) (3)
(9)
1
Kl
(10)
1 Kli§ (7)
c nfK
n использовать для коррекции
A
A0ii Ai · A0 2Ai
a
r0i A
1 Kl
0Kl
i
A
(
1
)
(r 0+ci)/r
неудобно
A
i
Kl
(12)
i
0
A0 Ai A0 Ai
1
1
1
2 2
A0 ¨ Ai A § ¸A0 Ai A· A0 iAi
c
li (6)
2 Klиi u(7),
0 (11)
Ai (3)уравненийK(5),
полученных
по­
2 Kl
величину
и тогда
© Ai i A¨0 ¹ Ai ¸i A0 i
r0 Kl
2 2 A0 1
K (nr0ранее
c) (4)
A
A
c nfK
n
c
1 Kl
Ai 0¹ (11) Ai
i
i K li a
ci 2 Kli u i A(8)
i 2 (10)
i
©
скольку
выражение
содержит неизвест(1)
Kf данное
A
2
·Ai A0 A2i
c A экспериментатора
AAi (1A Kli )§i A0 A
(l c)(nr0 c)
2i
ное для
значение
A0 Ai ci,§ которое
A0 Ai · A0 получим:
Ai r 0 c i §1A¨2Kl
c)d (4)
AAA· A A § A A
0 K ( nr0 K
2 · A¸§ A
A
§ A Ai ·
2 (12) 0
= 1c+ в этих
(5) уравнениях i
Kl
0 2A
i0i
0A0 Ai i
0
i
i
f
A
¨ 0
¨
¸
il i i
§
·
не содержится
и
величина
A
A
A
A
A
K
Kl
u
2
(9)
i
i ¸ 0 (11)
©
¹
¨ 0
0
i
0
i
0
i
i
i
A0 -Ai
l i (2)
¨
¸
¨
¸
Ai
A
A
K
Kl
(12)
i
i
© а, зна¹
A i
¨ Ai
¸ A
r0 ¨ © 1 AKl
Ai
которого
в эксперименте,
© 2 Ai ¹
A0 l не
(nr0измеряется
ccK) d
Ai
A2 i i ¹i ¹ i ©Ai2 Ai i ¹
§
©
©
1
=
+
(5)
2
A0 Ai 1 неизвестной.
A Ai ·
1 §
§ A01A2i Kl
· § A0 Ai2· A0 Ai ¨ A0 Ai
§ A Ai · A0 чит, K
остается
обойти
§ A0 Aэту
· A0 Ai ¨A
1 0 Чтобы
A0 ¸¸ A(6)
1A0 -A(i l1uc)(nr
1l i c)u ¨¨(1)
· A0 Ai
¨ 0
A00 Ai ¸ i§ A
i
i
¨ 012AKl
¸ i i ¸(10)
(3)
A
l
K
A
0
¨
Kl
(12)
¨
¸
проблему,
можно
об· Ai A
Ai2
A
Ai
A0 A©iAi ( A
A
0 следующим
i
dпоступить
¹
©
¸0 ¹ Ai Ai
i
i§
i
1
Kl
©
¹
0¹i)¨A©
i
§
·
A
A
A
cA0 0nfK
n
·
§
A
A
A
A
A
A
1уравнение
i
i
© полу¹
i ¨
0
i ac 1
i i можно
A©0 ¸Ai i ¨¹AA0 Ai i § A0 © Ai · A0 Ai ¸
разом.
Используя
(2),
¸
¨
A
(6)
1
u
u
A
A
(2) ¨
K0 1 Kll (7)K
u Kli (14)
Ai ¨
i
© i A
¹ A iA ¸ 2
2
A0 ¸¹
ii c )
§2li 2 2 Kli uAi § 0 ¨i 2 A2i0
0 ·(11)
чить, cA A0lK
d
©
(nr
Ai ¹
Ai ¸
(nr
c) (4)
0 0
©
§ A0 Ai · § A0 Ai · A0 Ai K
·
A
A
A
A
A
A
§
·
A
A
A
A
A
A
2
i
2
2
2
0
i
0
i
0
i
A
A
§ 0
· (13) ¹
0¨
i
i
·
f0
Kl . (13)
0 0i §Ai iA· ¸ u
¨
¸ ¨
¸ § A0 A¨iA·0 A§i A0¨¨ AA¨0i · iAi©¸A0¸§ A
Ai · A0 Ai ¸
1A
1
i
¸ AAi 0i A§i A¸0uKl
Ai ¹ © Ai ¹
Ai A¸i Ai¨ 1© ©A¸i A
Ai ¸0 1r01KlKl
(14)
i i (7) (3)
2 ¹¨ AAi ¨
u
i
©
i
¹
¨
¨
¸
Kd
ccAi A0 nfK ,(8)
(8)
¨ iA0 1A
¹i
· A©iA0 iAiA¨i (15)
Ai © ¸ Ai ¹
¹
Ai ¸
i 1 =Kl
§A
i Ai 1
¹A
(5)
© Ai A0© ¹AAi i ©
a1 + n
Kl
(12)
i
©
¹
2 ¨
2
¹
¸ 2A0 Ai ©
i
Kl
A0 -Air Kl l i
i
Отсюда
§ AA
·следует,
· AA0i Ai §¨ A0 Ai
§ A0 Ai · A0 © § AA0i AA¹что
0 i Ai
i
1i (8)
2cKl
crc0i cKi 0 (nr
2
i (4)
)
1
§
·
¸
¨
¸
откуда
A
A AA· A
1A
§ A A · ¨ AA0i §1A¸¹i ¸A10¨© Ai i 2K
i Kl0i1 что
1 (9)§
A Ai
¨ ·Ai
Ai
f 0rследует,
2Ai
© Ai ¹
(16)
+·A¹ d (15)
1§
u1 Kli u ¨¨1 0 i ¸¸0 (6)i ¨ 0
(14)
¨ 0 Ai ¸©AA
Kl
Kl=
u
0
A
§
A
A
A
i 0A
·
©
A
A
A
A
A
A
i
i
0
i
0
i
0
i
0
i
0 A¸0 -A
ii
0 li
i
0
i ¸
¨
¨
r0 AA0 c0 i 1 l i 2KKl
K
A
A
A
A
A
i d
0
u Kli . (14)
¹ i
i (9)
i
© i ¹
(14)
¨ ¨¸
¸ A0 1 =2 Kl
(9)©
1+ic d1 .(5)
©
Ai AAi 0 ¨ A¹i© AKAd(1i © 2¹l K
Ai ) A
Ai ¸
i
Kl(1)
¹
K
1 Kl
A00r-A
i (10)
l
01
i
i
0 i
2
(16)
=
+
1
© i §
¹
i
·
(17) ·
Ai ( 1(1
(7)
Kl
l Kl
c)(
Ai
1
i i)nr
0 c)
iAA
2 ¨ A(1
2
A0 -A
§ A0 Ai ¸ u(14)
i разделив
0li 0 Ai уравнения
)·22 § Aчасти
AliiA
Kобе
A
1 A2 Kl1i 1 §
(15) 1 Теперь,
1
1
Kl
0
i
·
§
·
§
§A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
A
Ai · A0 ¨
¸
i 0 (14)
Следовательно,
в
уравнениях
(5),
(6)
или
A
A
A
02 2 i c
0 Ai Kl
i
i 0
0
i
i
0
i
0
i ¸
1
Kl
(10)
¨
A
A
0
0
i
¨
¸¸0i (11)
AAi (1¹ 2l K A)i ¨
(6)
величину
uKl)i u (2) u ¨¨i 1
2¨l(A
i
0
(1¸ KA
)-A
¨ 1 AAi 1 ¸ KA l(i 1r
2Kl
i (15)
на
Kl
2)/A
l ¸K,©)получим:
i01
Kl
0 A (17)
i i i1
¨ i 2Ai (18)
можно
разделить
(7) значения
¹ © Ai ¹
Kli ©Ai Ai 01A¹i A©0 iA
A(1
Ai
A02i
AiA0 ¹A не на трудно
di ©
ci iA0l (0nr0i ilAi c(8)
©
¹
i ) KA
2 i i
2
2
K
(1 li K )(1 li K1 )
(1 li K© 2 )
d
A0 Ai 2 A0(r0+c
Ai i)/r 00, а=на
определяемую
равную
2 21 Kli величину
(16)
+
1
A
1
A
K A0 1 0 li 112Kl
K
Kli§u1(7)
0-A(11)
(15)
li
li K1 ) i A02.(1(15)
2li K 2 )
· AA
A
A)/(1+Kl
AВi A0этом
= 1A+011(1d 21(16)
ей величину
(1+2Kl
случае,
к
i
i A0 (3)
rA
0 ii).
i i 1 2 Kl
i Ai ii
(18)
A
Kl
A00i cnfK
Kl
(12)
i
l
A
-A
(9)
c
n
i
§
·
¨
¸
2A0 Ai
i
2 2 2
0
i
i
a
примеру,
A01 (1 2li K )
A (1
A li¨KAA
A Ai ¸
Ai
1 )0 A§i A (1
rAi rиз
1уравнения
© KliAi ¹ 2 (7) получим:
·2 )Ai A·0 §AAli0K
0
i
(17)
Ai
01 (10A0 2liA
Ai0
u Kli (14)
K
c 0 0 A
A
2
0 Kli § A A ·
d ¨ 0 ¨ i ¸(15)
¸значение
A0 A
Заменив
уравнении
i K )в
i
0
i
i
(8)
cA
¨
(1
)
l
K
Ai =2 1A+ (17)
Ai (16) A© Ai ¹ A Ai ¸K на
nr
Ai
Kl0 i¨ c) (4) ¸2 Kli (12)
i
Ai 0 11K
(2Kl
i
i и ¹выполнив
i
©
обратную
ей
величину
K
арифме2
©
¹
§
·
f 0 Ai Ai i © A01Ai AKl
l
A
A0 Ai Ai A (1 2l K (10)
li Ki )
d
i ¹i .(10)
A02 (1 2li K 2 ) A(10A0 -A
§ A0 i под
)¨
Aдействия
Ai · знаком
A0 Ai корня, получим
01
i 1)
¸ i
тические
(18)
A
r0AAiA(0i1ci Kl
1i©2KKl
i
A
1
A
A
A
(1
2
l
K
)
A
(1
2
l
2
2
i
A
(1
2
l
K
)
¨
¸
2
d i (9)
i
¹
01
i K2 )
01 i 1
i 02 i
(1
)
(1
)
K
l
K
l
Ai Ai 1 2 ©1выражение:
Ai (17)
A2i
Ai (18)
i 1
i окончательное
A
A= 11+§ Kl
AA(5)
AA·i AA
AA
¹ (15)
2
A002r-A
(1Kl
ili·K(11 ) li K ) 2 A(10 lAi K
K
l0i 2 i i 2простых
Kl2 i¨ul i 0i 0 i ¸алгебраических
2 0 0 i i 0 (11)
2
i 2)
После
преобра§
§AAA
· © § AA0A
AAA
i
0 i A
i A
i 0i Ai
¹§i · Aполучим
¨ A0 Ai § A20 Ai · A0 AAi A¸01u(1Kl 2l(13)
K ) A (1 2li K 2 )
зований
уравнения
Ai2i Kl
¨A00 1 ¸ 1i ¨ 11 Kl(10),
¸(10) 0 AAi ·¸ A¨ квадратное
§ A0 A¨i · A A0 ¸ 2Ai AAi 0 ¸ = 1i+ iK22d1 . (16)02
(18)
¨
2
i
(6)
1
u
u
(16)
A
A
A
A
0
i
2
2
2
i
i
i
i
i
i
©AAiA
¹
©
¹
©
¹
§
·
¸
¨
уравнение
относительно
искомой
величины
K:
( 1 i Kl·il)§ A
li K
¸A A ·A0 AAiAA0 -A§¹i(1
A ¹ © A ¨ A
·li A0 (1Ai li K 2 )
K0 dAi A·©i · A0A
A
A
A
1)
§A
§ 0A
§
0 00AA
0 i AA
0
i
i i
0
i
0
i
0
i
0
i
Ai ¨i (12)
¨¸ u Kli (13)
i Kl
© A
¸ ¸ i ¨ ¹
¸ ¨A 2A2
¸ ¨ ¨ AA
¸
i
Ai
¨ Ai
Ai ¹ Ai Ai A©¸01 (1Ai 2li ¹K )
i i 2 Kl
iA
©u© 0 iAi A¹i ¹ A0 AA
0
(11)
i
©K0 liA
¹
©
.
(11)
i
2
1 Kli § (7) A
(17)
Ai
Таким
образом,
предположение,
высказан2 ©
¹
·
2
A
§
·
i
i
2
A0 AСтивенсом
A0 оказалось
Ai
§ A A · A Ai ¸
AA A
A A
i(1 li KA)0 Ai (1987),
верным.
¨
A0i 0 Ai i §¨ A00 Aii ·2 ¨A0 0 Ai i ¸ 0
u Kli (14) ное ранее
¸
i ¨§§¨ что
©A такое
¸
Ai A01 (1 ©2lсi KA
ri0 Kl
A02 учета
(1 A2i li Kдвухвалентности
A
A
A
A
¸
Отметим,
точно
2же уравнение
Действительно,
целью
¹
·
1i )
2)
A
A
A
A
A
i
i
i
¹
·
ci 0AAi iA ©©(8)A0 Ai Ai ¹ § A0 A
(18)
Ai
Ai ¸¹
Ai · Kli A (12)
¨¨ 0
¸
i
0 i соответствующих
(11) будет
Kl
(1 коррекции
(1 уравнения
li K 2 ) 2
li K1 ) 2
(5), следует
A0i1 получено
u Kli (14) антител, для
i
Ai iи¹ после
Ai i ¸ 0
¨
©
2 ¨
2
2
¸
Ai деления
1
Aт.е.
Ai A¹ на
A
§
·
преобразований,
величину
вычислять
корень
квадратный
из
левой
части
i
i
©
r§0A0 cAi i A1i 1· ©21§Kl
Ai0 Ai2· (15)
A0 Ai i ¨ A0 Ai ¹ § A0 Ai · A0 Ai ¸
(9)
(13)использовать
Kl
u
2
Kl
A
A
(1+2Kl
),
уравнений
(5)
или
(6).
Решение
уравнения
(5),
т.е.
вместо
уравне¨Ai0)/(1+Kl
¸
¨
¸
¨
¸
§
·
i
A
A
A
A
A
i
i
0
i
0 Ai
Kl
¨ Ai
§ A Ai · A0 Ai
AA0i A¸i
¹1i ¨ позволяет
i i ¸ ¹
i
© r10 Ai i (11)
© 0i AA
© Ai ¹ния (5)
уравнения
получить
уравнение
© выражение,
¹ ¨ 0 (16).
(15)
1
1
A AA
¸ K
A
A
0
d
i
i
i
©
¹
1i 2=Kl1i + 1собой
Ai мы видим,
Ai
0Kl
(16)
A0 Kl
Ai (10)
© Ai ¹уравнение
представляющее
линейную зависимость
Как
(12) и уравнеi 2
A(01-Ai Kl2 ) li
2
§
·
A
2
между
величиной
алгебраического
выражения,
ние A(16)
– это фактически одно и то же уравi A A ·i § §K
·
§ AA
·
§
·
A
A
A
A
A
A
A
A
A
d0 A i
0 0 A
i
0 A i· ¨ A0 Ai
0
i
i ¸
2¨A
liи
) (16)
=
1¨+
0 просто
u Kli (13)
i¸ 0 i
0
i ¸ u lKl
01 (1
¨A 2 02Aслева,
¸ §¨0A0 A
¨, а (14) ¸нение,
стоящего
концентрацией
представленное разными алAK
Ai(17)
антигена
0 i A
i
i i A
¸
¨
¸
l
A
-A
A
A
A
A
A
i
2
K
l
Kl
u
2
0
(11)
0i A
i i ¹ i ¨ © iA i
i
i
i
i
©
¹
©
¹
¸
A
A
(1
)
l
K
i
i
именно: i
© A i ¹ ©
гебраическими
выражениями.
Следовательно,
¹
i
A
¹
i
A (1 ©2li K ) i
можно
ожидать,
что
для
оценки
аффинности
(1
2
l
K
)
A
(1
2
l
K
)
(17)
Ai A01
i 2
i · 2 02 A A
(18)
A 1 01 l§§KA)i 221 AA
2 2
двухвалентных
антител
в
принципе
можно ис·
i
0
i
0
i
(15)
1
1
Ai0A Ai(1
(1
§Ali0K2 )Ai · Kli A.0 (12)
1 )0 Ai ¸ (1
Ai ¸ (12)
Ai li¨¨KA
A
©2li K
Ai02 (1
A2i li K 2¸) Kl
u Kli (14) пользовать любое из них. При этом уравнение
A0ii A01 (1
AA
¨
1i )0 ¹
Ai Ai
¨ 2Ai © Ai 2 ¹ (18) Ai ¸¹
)d
A0 (1 li©K1K
22 (1 li K 2 )
· A
A
A0 A
A(16)
A A
A00A
A
Ai = 1§§+A
i ·
00 Aii
¨¨ 0li Ai i ¸¸ 10 -Aii Aii —18470.
Ai ¹біохім.
Aжурн.,
(15)A
©1 Укр.
2
A
A
i
ISSN 0201
2009, т. 81, № 3
69
A Kl
A (1 ©§2Al KA)i A¹·Ai A0 i Ai
Ai0 i i01 2 ¨ i02 0 i (17)
2
·
(1 · li©K§)KAAi A¸¹ · 2 AAi A § A A
§ AA
§ A0 Ai · A0 Ai ¸
i
0A
i
0
i
0
i
0 Ai
d0
¨
u Kli (13)
(16)
=
+
1
¨
¸
¨
¸
¨
¸
A01 (1 2li K
) A (1 2A
li K 2 ) ¨ A
Ai ¸
i i ¹
i
©Ai A0A-A
© l2i 1 Ai ¹02
© Ai ¹
(18) i
2
©
¹
(1(1
(1 li K 2 )
li K
A01
2l1i)K )
c
c
f
nfK a
n
i
i
A0 -Ai
= 1+
li
(5)
A0 Ai 1
A Ai ·
1 §
¸ (6)
u
u ¨1 0
A0
l i K d ¨©
A0 ¸¹
експериментальні
роботи
A0
1 Kli (7)
Ai
r0 Kli
(8)
ci
(16) является
1 Kli cболее простым, чем уравнение
(12) иK по этой причине
(1) кажется более предr0 c(il 1c)(
nr
2 Kl
0 i c )использования.
почтительным
для
Однако на
(9)
c1 Kl
0
i
самомK rделе
все
оказываться
далеко
не
так, по­
(2)
A0 1вl(nr
2 Kl
скольку
уравнении
(16) рассматривается лиc)
0 i 1 Kli (10)
нейная
величины, стоящей слева,
1Ai (зависимость
1 1Kli ) 1
(3)
концентрации
от обратной
Далее в
c nfK
n A Ai A0 Aантигена.
i
K 2li 2 2aстатье
Kli u 0 будут
продемонстрированы
0 (11)
настоящей
c
Ai
Ai
важные преимущества
использования
уравнеK (nr0 c) (4)
f в сравнении с2 уравнением (16).
ния (12)
§
·
A0 Ai
A Ai
A0 Ai
¨K 0
Kli также,
(12)
К Aвышеизложенному
что
¸ добавим
A0i = 1+© d Ai (5) ¹
Ai
болееAсложной
задачей
является
проблема
оп-A
l
0
i
i
2
ределения
аффинности
двух
видов
антител
одA0 AAii 1§ A0 1 Ai ·§ AA00 AAi i ·
u ¨
¸¸ (6)
ной специфичности,
в смеси. Тем
uнаходящихся
¸¨¨1
Ai0
Aid ¹©
Ai 0 ¹
K
не менее,
этаl i©задача
ранее Aбыла
решена нами
2 сходным 2 со способом
A0
[2] способом,
Клотца§
§ A0 1A
· i (7)
§ A0 Ai · A0 Ai ¨ A0 Ai
§ A0 Ai
i Kl
Ханстона,
предложенных
для слу¨Ai
¸ ¨
¸ авторами
¨
¨
Ai ¹
Aиi одногоAi лиганда
© Ari Kl
¹ © рецепторов
© Ai
чая смеси
двух
©
0
i
(8)
c
[8]. Позд­нее
нами был предложен иной, более
i
1 Kli
простой и удобный
метод, а главное
более· точ2
r0 A
0ci Ai1определения
§¨2 A
Kl0 i Ai
§ A0 Ai · Aравновесия
0 Ai ¸
ный способ
(9) ¨ констант
u Kli (14)
¸ r0 Ai 1метода
¨ Kli Ai нелинейной
Ai ¸ [9,
при помощи
© Ai ¹ регрессии
©
¹
10]. Строго
говоря,
метод нелинейной регресA0 1 2 Kl
i
1применен
Kl
Ai i (10) и для оценки аф1
сии может
быть
(15)
1 i ) 1 Ai ( 1 Kl
Kli одного Aвида
финности
0 Ai антител. Его суть соA
A
A
2
0 Ai
i
стоитKв2lA
(10) следует,
2 Kli u K0 Из
уравнения
0 (11)
iследующем.
0
dA
Ai
i (16)
= 1+
что
li
A0 -Ai
2
§
·
A0 A
A
Ai01(1 ¨2li0K) Ai ¸ A0 Ai Kli (12)
. (17)
(17)
Ai A
Ai
i (1 l ©K ) 2Ai
¹
i
2
A01 (1 §2Ali K1 )A получив
iK
2)
·A02 (1A0 2lA
A0 A
Следовательно,
i
0
i
iэксперименталь(18)
A
i
2
2
¨
¸
(1 liA
ную кривую
i K1 ) A
Ai (1 lзависимости
AKii 2 )от концентрации
i
©
¹
конкурирующего антигена li, а затем при по2
2
§
мощи§AAметода
· §нелинейной
§ A0 A A·i2· A A0регрессии
§ A Ai
Ai
A Ai ¨ A0 отыскав
0AAi
A
0
i
0
i
0
i
¨ 0
¸ ¨ ¨ K, при
¸ котором ¨эксперимен
такое¨ значение
¸
Ai
© AAi ¹ © © Ai Ai ¹ ¹
© Ai
A Ai
©
тальная iкривая
наилучшим iспособом
совпадает с теоретической кривой, описываемой урав2
§
·
нениемA (17),
мы
§ A0 искомое
A0 получим
Ai
Ai · A0 значение
Ai ¸
0 Ai
¨
u Kli (14)
аффинности
антител. ¨
¸
¨ Ai
A
Ai ¹
Ai ¸
©
Ранееi нами
было
показано,
что
в
отли©
¹
чие от уравнений (12), (16) или (17), в которых
Ai
1
(15)
1 взаимоотношения
1
представлены
между значеi
0 Aодного
ниямиKl
K,i li, A 0 и AiAдля
вида двухвалент­
K
A0
ных антител,
взаимоотношения
между этими
= 1 + d (16)
параметрами
связывания
для
двух
видов двухli
A0 -Ai
валентных антител с константами равновесия
A01 (1 2li K )
(17)
Ai2 представлено
K1 и K
следующим уравнением:
(1 li K ) 2
A01 (1 2li K1 ) A02 (1 2li K 2 )
,(18)
(18)
Ai
(1 li K1 ) 2
(1 li K 2 ) 2
где A 01 и A 02 – окраски2 лунок, которые пропор§ A Ai · A0 соответствующего
циональны
A0 Ai концентрациям
Ai
¨ 0
¸ вида антител
и
полученные
методом ELISA
Ai
A
A
i
i
©
¹
для случая, когда концентрация конкурирующего антигена в смеси с антителами равна
70
нулю. Подробный вывод уравнения (18) представлен нами ранее [2].
Таким образом, относительно простым и
точным способом определения аффинности
двух видов антител, находящихся в смеси, является следующий способ. Получив экспериментальную кривую зависимости Ai от концентрации конкурирующего антигена li, необходимо
с помощью метода нелинейной регрессии подогнать ее к теоретической кривой, описываемой уравнением (18) и, следовательно, таким
способом найти значения искомых величин
K 1, K 2, A 01 и A 02, которые наилучшим способом
позволяют экспериментальной кривой совпасть с теоретической кривой. Это дает воз2
можность
· определить не только аффинность
· A0 Ai ¸
видов
т.е. значения K 1 и K 2, но
u Klантител,
¸обоих
i (13)
¸
¹такжеAiи соотношение
между концентрациями
¹
этих антител в исследуемом образце, которое
равно величине соотношения между найденными величинами A 01 и A 02.
Материалы и методы
В качестве антигена в настоящей работе
использовали альбумин куриных яиц (овальбумин), а также бычий сывороточный альбумин (БСА). В качестве антител использовали
мышиные моноклональные антитела (мАт) к
яичному альбумину, а также меченную пероксидазой хрена козью антисыворотку к мышиным иммуноглобулинам IgG класса, которые
являлись продуктом фирмы Sigma (США).
Овальбумин иммобилизовали на плоскодон2
·
иммунологических платах,
·ныхA096-ячеечных
Ai ¸
(13)
Kl
u
инкубируя
его
раствор
(30 мкг/мл) в 1%-м
¸
i
Ai ¸+ 0,01%-м NaN при 4 °С в течение
¹NH HCO
4
3¹
3
20–24 час. Непосредственно перед использованием плат раствор овальбумина удаляли, и
платы трижды отмывали забуференным физиологическим раствором (рН 7,2) + 0,1%-й
Твин 20 (ТБФ).
Чтобы определить разведение мАт, пригодное для проведения экспериментов, исходный
(коммерческий) раствор мАт разводили сначала в 25 000 раз в ТБФ+1% БСА, затем последовательно делали разведения этого раствора в
2 раза в ТБФ + 1% БСА, вносили полученные
образцы в лунки плат с иммобилизованным
овальбумином и определяли зависимость количества связавшихся антител от степени разведения методом ELISA. Для экспериментов
брали такое разведение мАт, при котором их
дальнейшее разведение в два раза приводит к
двукратному уменьшению окраски лунок, получаемых методом ELISA, иными словами, к
двукратному уменьшению количества связав-
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 3
С. А. БОБРОВНИК, М. А. ДЕМЧЕНКО, С. В. КОМИСАРЕНКО
шихся с платой антител. В настоящих экспериментах таким разведением исходного пула
коммерческих мАт, специфичных к овальбумину, было разведение 1 : 250 000 и выше.
1 микролитр исходного раствора коммерческих мАт смешивали с 1 мл сыворотки неиммунных мышей и полученную смесь
использовали для определения аффинности
связывания мышиных IgG-антител с овальбумином. Для этого полученную смесь мАт и сыворотки мыши разводили 1 : 125 в ТБФ + 1%
БСА и к 0,2 мл полученного раствора добавляли 0,2 мл овальбумина различной концентрации, предварительно разведенного в ТБФ + 1%
БСА. Таким образом, разведение мАт в смеси с разными концентрациями овальбумина
было равно 1:250000. Этот образец антител
смешивали 1 : 1 с образцами антигена различной концентрации. Максимальная концентрация овальбумина в этих образцах была равна
1,0×10-6 М, а в последующих образцах концентрация овальбумина снижалась в 2, 4, 8 и т.д.
раз. Контрольный
образец антител не содерc
(1)
K овальбумина.
жал
(l c)(nr0 c)
Полученные таким образом образцы смеc
си
K антител с(2)антигеном инкубировали в теl
(
nr
чение ночи
0 c ) при комнатной температуре (для
достижения
1
1
1 равновесия в реакции антиген-ан(3)
титело),
c nfK a наn следующий день по 100 мкл каждого образца вносили в четырех повторностях
c
K (nr0плат
c) (4)
в лунки
с сорбированным овальбумином
иf инкубировали 1 час при непрерывном переA0
K
мешивании.
плашку обрабатывали ме= 1+ d Затем
(5)
A0 -Ai
li
ченной
пероксидазой
хрена антисывороткой
против
IgG-мыши.
В
качестве
субстрата для
A0 Ai 1
A Ai ·
1 §
¸¸ смесь
(6)
u
u ¨¨1 0
пероксидазы
использовали
ортофениA0
li K d ©
A0 ¹
лендиамина
и пероксида
водорода. После разA0
вития
иммуноферментную реакцию
Kli (7)
1 окраски
Ai
останавливали,
добавляя по 50 мкл 2 М серной кислоты
на 1 лунку, образцы спектрофоr0 Kli
(8)
ci
тометрировали
и вычисляли среднее значение
1 Kli
плотности окраски лунок для каждого образr0 ci 1 2 Kli
ца,
которая была
(9) пропорциональна концентраr0 «свободных»
1 Kli
ции
антител в исходных образцах
A0 1 2антител
Kli смеси
с антигеном.
1 Kli (10)
усредненные экспериментальAi ( 1Найденные
Kli )
ные значения
A
из 3–4 измере0
A Ai и AA0i (среднее
A
2 Kli u 0
0 (11)
K 2li 2 использовали
для iвычисления
ний)
значений
Ai
Ai
2
A0
§ A Ai · A0 Ai
A0 Ai
¨ 0
Kli (12)
или
, кото¸ A0 - Ai
Ai
Ai
© Ai ¹
li или обратной величине 1/li в соответствии
с уравнениями (12) и (16). Согласно представленной выше теории, в случае наличия в исследуемых образцах одного вида антител, получаемые графики должны быть представлены
прямыми линиями, тангенс угла которых равен величине константы равновесия при использовании уравнения (12) или же обратной
величине константы равновесия при использовании уравнения (16).
Чтобы определить величины K 1, K 2, A 01 и
A 02, которые наилучшим способом позволяют
подогнать экспериментальную кривую зависимости Ai от концентрации конкурирующего антигена к теоретической кривой, описываемой
уравнением (18), использовали компьютерную
программу Origin 75. В случае определения
аффинности одного вида антител в растворе,
экспериментальную кривую сравнивали с тео­
ретической кривой, описываемой уравнением
(17).
Результаты и их обсуждение
На рис. 2, А представлены три различные
зависимости значений Ai (пропорциональные
концентрациям «свободных» антител в смесях с антигеном) от концентрации антигена.
Образец антител № 1 содержал только мАт к
овальбумину и антиген (овальбумин), а два
других образца содержали смесь тех же мАт с
сывороткой мыши и тот же антиген. Как видно
из рисунка, во всех трех случаях получены типичные кривые снижения концентрации «свободных» антител с увеличением концентрации
конкурирующего антигена в смеси. При сравнении этих кривых заметно, что в вариантах
№ 2 и № 3, где присутствовали сывороточные
иммуноглобулины мыши, снижение кривых
менее выражено при высоких концентрациях
антигена, чем в варианте № 1, что может свидетельствовать о присутствии в образцах № 2
и № 3 низкоаффинных антител к овальбумину. Тем не менее, вид полученных экспериментальных кривых не позволяет сделать об этом
однозначный вывод без проведения соответ­
ствующего анализа.
В табл. 1 представлены усредненные значения A 0 и Ai для этого эксперимента. Используя эти значения, построим вначале линейные
зависимости значений
A0
A0 - Ai
от 1/li (рис. 2,
Б) в соответствии с уравнением (16). Такой
метод, как правило, используется для определения аффинности антител методом ELISA
с тех · пор, как Стивенс [7] внес свои предлоA0 Ai ¸
u Kli (13)
Ai ¸
¹
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 3
71
2
§ A0 Ai · A0 Ai
A0 Ai
рые,
в свою
¨ очередь,
¸ использовали для постA
Ai
i
© Ai ¹ зависимости
роения
графиков
этих величин
от концентрации
антигена 2
2
2конкурирующего
§ A0 Ai · § A0 Ai · A0 Ai §¨ A0 Ai
§ A Ai ·
¨ 0
¨
¸ ¨
¸ ¸ ¨
Ai
Ai
© Ai ¹ © Ai ¹
© Ai ¹
©
A0 Ai
Ai
2
§
¨ A0 Ai § A0 Ai · A0 Ai
¨
¸
¨ Ai
Ai
© Ai ¹
©
·
¸ u Kl (14)
i
¸
¹
c
(2)
l (nr0 c)
1
1
1
(3)
експериментальні
роботи
c nfK a n
c
K (nr0 c) (4)
f
женияA относительно
коррекции уравнения,
Kd
0
= 1+ Фриге
(5) и соавт. [5]. Как видно
предложенного
A0 -Ai
l
из рис. 2,
Б, всеi три полученные зависимости
A0 Aiблизкими
A Ai ·
1
1 §к линейным,
являются
¸¸ (6) причем их
u
u ¨¨1 0
углы наклона
собой. ОпA0
l i также
K d близки
A0между
¹
©
ределив
A0 значения тангенсов углов наклона поKli (7) находим, что аффинности
лученных1 прямых,
Ai
исследуемых образцов антител № 1, № 2 и № 3,
r0 Klпри
i
найденных
(8)помощи уравнения (16), равны
ci
7 1 Kl
7
5,98×10 , 5,09×10
и 4,78×107 М-1 соответственно.
i
r0 ci иной
1 2 Kl
Никакой
информации
о данных образi
(9)
цах антител
анализ, являющийся
r0
1 подобный
Kli
традиционным,
A 1 2 Kl не позволяет получить.
1 Kli (10)точно те же исходные
А 0теперь,i используя
Ai ( 1 Kli )
экспериментальные
данные A i от li, представA0 1,Aiпостроим
A Ai в соответствии
2 в
2 таблице
ленные
K li 2 Kli u
0
0 (11)
с уравнением (12) A
графики
Ai зависимости значеi
K
2.5
2.5
2.5
2,5
OD490
OD490
OD490
2
22
2,0
OD490
1
11
1,0
0.5
0.5
0.5
0,5
0
00
00
00
0
72
0,781
2,17
2,15
2,26
1,56
3,13
1,82
1,89
2,07
1,37
1,56
1,77
6,25
0,89
1,34
1,45
12,5
0,53
1,09
1,19
25
0,29
0,92
1,03
50
0,16
0,81
0,92
100
0,078
0,71
0,81
0.4
0.4
0.4
0,4
0.6
0.8
6
0.6
0.6
0.8
0,6
l , M (u 100.8
)0,8
i
6
1
11
1,0
li, M(×106)li i , M (u10 )
4
ʋ1
ʋ
ʋ211
ʋ
444
Б
ʋ
ʋ322
ʋ
ʋ
ʋ33
3
Y22 Y2
Y
Y
2
значенийA0 Ai от Kконцентрации
конкурирующего
= 1 + d (16)
антигена
в
смеси
с
исследуемыми
образцами анli
A0 -Ai
тител. № 1 – раствор мАт к овальбумину; № 2
A01 (1 2li K )
и №A
3i – два
образца(17)
смеси мАт к овальбумину
(1 контрольных
li K ) 2
и сыворотки
(неиммунных) мышей
A01 (1 2li K1 ) A02 (1 2li K 2 )
BALB/c
(18)
Ai
(1 li K1 ) 2
(1 li K 2 ) 2
Значения Ai для трех
Концентрация
2 образцов антител:
антигена
§ A Ai · A0 Ai
A0 Ai
¨ 0
(×10-8 М)
¸ 1
№
№3
Ai
Ai № 2
© Ai ¹
0
2,37
2,32
2,43
0.2
0.2
0.2
0,2
l , M (u 10 )6
Y1 YY11 Y1
2
А
ʋ
ʋ322
ʋ
ʋ
ʋ33
1.5
1.5
1.5
1,5
333
§ A Ai · A0 Ai
A0 Ai
2
от
¨ 0
Klili (рис.
(12) 2, В).
¸ 2
2
Ai
A
A
i
i
©
¹
2
1
Как видим графики,
с помощью
§ A0 Ai · полученные
A0 Ai
A0 Ai
1
1
уравнения (12)
№ 2 и № 3, яв¨ для образцов
¸ A
A
A
i
i
i
©
¹
ляются нелинейными, в отличие от графиков,
0
2
полученных с2 помощью2уравнения§ (16). Однако
0000
§ A0 Ai · § A0 Ai · A0 Ai ¨ A0 Ai
§ A Ai · A0000 Ai
график
№ 1,
только
¨
¨ 0
¨ для ¸образца
¸ содержащего
¸ ¨ Ai
Ai ¹ © Ai является
Ai линейным
Ai
¹
© Ai ¹
мАт ©к овальбумину,
как
©
в координатах, соответствующих уравнению
(16), так и в координатах
уравнения
(12).· При
2
16
§
16
§ A0в образце
A0 Ai ¨ A0 антител
Ai
Ai · A0 №
Ai 1,
этом аффинность
¸ u оп16
16
¨
Kli (14)
¸
ределенная
уравнения
(16),
Ai с ¨помощью
Ai
Ai ¹
Ai ¸равна
©
©
¹
12
12
12
12
Ai
1
(15)
1 1
A0 Ai
Т а б л иKlцi а 1. Зависимость
экспериментальных
ний
ʋ1
ʋ
ʋ211
ʋ
40
60
80
100
·20
20
40
60
20
40
60 -1 80
806
100
40
60
80
100
¸20
u Kli (13) 1/l i , M (u 10 ) 100
¸
-1-1
66
1/l
1/li ,ii,M
M
10) ) 6)
1/l
M(u-1(u10
(×10
¹
120
120
120
120
140
140
140
140
В
ʋ1
ʋ
ʋ211
ʋ
ʋ
ʋ322
ʋ
ʋ
ʋ33
8
88
4
44
0
0000
00
0.2
0,2
0.2
0.2
0.4
0,4
0.4
0.4
0.6
0,6
6
0.6
lli ,, M
(u 10 )0.6
6
M(×10
66 )
l lii ,i ,M
M(u(u10
10) )
0.8
0,8
0.8
0.8
1
1,0
11
Рис.
2. Аȼɥɢɹɧɢɟ
– Влияние
концентрации
конкурируюɊɢɫ.
2. (Ⱥ)
ɤɨɧɰɟɧɬɪɚɰɢɢ
ɤɨɧɤɭɪɢɪɭɸɳɟɝɨ
ɚɧɬɢɝɟɧɚ ɧɚ ɤɨɥɢ
Ɋɢɫ.
2.2.(Ⱥ)
ȼɥɢɹɧɢɟ
ɚɧɬɢɝɟɧɚ
ɧɚ
Ɋɢɫ.
(Ⱥ)
ȼɥɢɹɧɢɟ
ɤɨɧɰɟɧɬɪɚɰɢɢ
ɤɨɧɤɭɪɢɪɭɸɳɟɝɨ
ɚɧɬɢɝɟɧɚ
ɧɚɤɨɥɢ
ɤɨɥɢ
ɚɧɬɢɬɟɥ
ɜ ɢɯ
ɫɦɟɫɢ
ɫ ɚɧɬɢɝɟɧɨɦ.ɤɨɧɤɭɪɢɪɭɸɳɟɝɨ
(Ȼ) Ⱦɚɧɧɵɟ ɪɢɫ.2Ⱥ,
ɩɪɟɞɫɬɚɜɥɟɧ
щего
антигена
наɤɨɧɰɟɧɬɪɚɰɢɢ
количество
«свободных»
антиɚɧɬɢɬɟɥ
ɜ
ɢɯ
ɫɦɟɫɢ
ɫ
ɚɧɬɢɝɟɧɨɦ.
(Ȼ)
Ⱦɚɧɧɵɟ
ɪɢɫ.2Ⱥ,
ɩɪɟɞɫɬɚɜɥɟɧ
ɚɧɬɢɬɟɥ
ɜ
ɢɯ
ɫɦɟɫɢ
ɫ
ɚɧɬɢɝɟɧɨɦ.
(Ȼ)
Ⱦɚɧɧɵɟ
ɪɢɫ.2Ⱥ,
ɩɪɟɞɫɬɚɜɥɟ
смеси с антигеном; Б – данные рис. 2,
тел в Aих
0
(16)). (ȼ
Y1
AA0 0A ɩɪɨɬɢɜ 1/li (ɜ ɫɨɨɬɜɟɬɫɬɜɢɢ ɫ ɭɪɚɜɧɟɧɢɟɦ
A0
A
1/l
(ɜ
ɫɨɨɬɜɟɬɫɬɜɢɢ
ɫ
ɭɪɚɜɧɟɧɢɟɦ
(16)).
YY1А,
0
i ɩɪɨɬɢɜ
i
ɩɪɨɬɢɜ
1/l
(ɜ
ɫɨɨɬɜɟɬɫɬɜɢɢ
ɫ
ɭɪɚɜɧɟɧɢɟɦ
(16)). (ȼ
(
Y
представлены
в
координатах
i
1
1
AA0 0AAi i
A0 2 Ai
§ A0 Ai · 2 2 A0 Ai
A0 Ai
A0
2
ɩɪɟɞɫɬɚɜɥɟɧɧɵɟ
ɤɨɨɪɞɢɧɚɬɚɯ
против 1/lY1i вɜ соответствии
сAуравнением
AA0 0A
AA0 A
AAi · ɩɪɨɬɢɜ
· § A
Ai i ¨§A§A
A00AA
AAi i¸·(16);
A ©¨в¨0 координаɩɪɟɞɫɬɚɜɥɟɧɧɵɟ
ɜɜɤɨɨɪɞɢɧɚɬɚɯ
i
i i ¹
Aɤɨɨɪɞɢɧɚɬɚɯ
A
ɩɪɟɞɫɬɚɜɥɟɧɧɵɟ
ɩɪɨɬɢɜ
¸¸ ¨ 0 0Ai i i¸ ɩɪɨɬɢɜ
0
02,
i представлены
В – данные рис.
А,
AAi i
AAi i ¹¹
AAi i
©
A
A
Ai
©
i
i
ɭɪɚɜɧɟɧɢɟɦ (12)).
©
¹
2
§
·
A
A
A
A
A
A
ɭɪɚɜɧɟɧɢɟɦ
(12)).
ɭɪɚɜɧɟɧɢɟɦ (12)).
0
i
i
0
i
¨ 0
тах Y2 =
против li в
¸ Ai
Ai
© Ai ¹
соот­ветствии с уравнением (12)
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 3
С. А. БОБРОВНИК, М. А. ДЕМЧЕНКО, С. В. КОМИСАРЕНКО
5,81×107 М-1, т.е. близка к значению аффинности, определенному с помощью уравнения (16).
Нелинейность полученных графиков для
образцов № 2 и № 3 указывает на то, что в данных образцах, по-видимому, имеются антитела
по крайней мере двух видов, а, именно, высоко- и низкоаффинные антитела, специфичные
к данному антигену. Чтобы определить аффинность обоих видов антител в данном образце,
можно использовать предложенный нами ранее метод, основанный на применении метода
нелинейной регрессии для подгонки полученных экспериментальных кривых к теоретической кривой, описываемой уравнением (17).
Зная, что образцы № 2 и № 3 содержат
высоко- и низкоафффинные антитела, можно
определить константы равновесия для обоих
видов антител в исследуемых образцах, применив описанный нами ранее подход, основанный на использовании метода нелинейной
регрессии для сравнения теоретической и экспериментальной кривой [9, 10]. Этот же подход
можно применить и для оценки одного вида
антител в образце № 1, однако в этом случае
для определения аффинности реакции антиген-антитело нужно использовать уравнение
(17), тогда как для оценки аффинности антител в образцах № 2 и № 3 необходимо использовать уравнение (18). Значения найденных
таким способом параметров взаимодействия
антител с антигеном для исследуемых образцов представлены в табл. 2.
Из табл. 2 видно, что константа равновесия для высокоаффинных антител во всех
трех образцах примерно одинакова и близка к
6,0×107 М-1. Это свидетельствует о том, что во
всех трех случаях измерялась аффинность мАт,
добавленных к мышиным сывороткам. Помимо этого, в образцах № 2 и № 3 обнаружены
также низкоаффинные антитела, являющиеся, по-видимому, нормальными антителами
к овальбумину, которые всегда присутствуют
в сыворотках животных и человека. Аффинность этих антител оказалась равной 5,80×105
и 5,86×105 М-1 соответственно. Соотношение
между коцентрациями высоко- и низкоаффинных антител в исследуемых образцах можно также легко вычислить, как соотношение
между найденными величинами A 01 и A 02. Для
образца № 2 оно равно 2,16, а для образца № 3
равно 1,86.
Несмотря на то, что проведенный нами
анализ взаимодействия антител с антигеном
и методов оценки параметров этого взаимодействия кажется логичным и убедительным,
все же желательно получить бесспорные подтверждения правильности подобного анализа.
Чтобы сделать это, проведем математическое
моделирование реакции взаимодействия одного или двух видов антител с антигеном и,
получив теоретические кривые зависимости
концентрации «свободных» антител от концентрации конкурирующего антигена, затем
используем три метода, рассмотренные выше,
для определения аффинности взаимодействия
антител с антигеном.
Теоретические значения Ai для одного
вида антител или же для смеси двух антител
разной аффинности при различных концентрациях конкурирующего антигена li можно
легко вычислить, используя уравнения (17) и
(18) соответственно. Найденные таким способом значения Ai представлены в табл. 3. Теперь,
используя теоретические найденные значения
Ai, можно легко определить, какие результаты дает применение каждого из упомянутых
выше методов при отыскании параметров связывания антител с антигеном.
Вначале используем традиционный подход
и уравнение (16), согласно которому должна
быть линейная зависимость между величинами
A0
и 1/li (рис. 3, Б). Как видно из рисунка,
A0 - Ai
Т а б л и ц а 2. Значения параметров связывания овальбумина, найденные при помощи метода нелинейной регрессии для высоко- и низкоаффинных антител в трех исследуемых образцах
Параметры антител
Образцы:
№1
K1
(5,92 ± 0,02)×10
A 01
2,37 ± 0,003
K2
–
A 02
–
A 01/A 02
–
№2
7
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 3
№3
(5,80 ± 0,09)×10
7
1,58 ± 0,01
1,58 ± 0,05
(4,70 ± 0,43)×10
5
0,73 ± 0,01
2,16
(5,86 ± 0,06)×107
(5,16 ± 0,24)×106
0,85 ± 0,05
1,86
73
експериментальні роботи
Т а б л и ц а 3 . Теоретические значения Ai для одного или двух видов антител, вычисленные по уравнениям [18]
Концентрация
конкурирующего
антигена, М (×108)
Значения Ai для одного
вида антител
Значения Ai для двух
видов антител
0
1
1,250
0,0625
0,997
1,247
0,125
0,988
1,238
0,25
0,960
1,210
0,5
0,889
1,139
1
0,750
1,000
2
0,556
0,805
4
0,360
0,610
8
0,210
0,459
16
0,114
0,359
32
0,060
0,295
64
0,031
0,242
Для расчета теоретических значений Аi были выбраны следующие параметры взаимодействия: К 1 = 1,0×108 М-1
и К 2 = 1,0×106 М-1, во второй колонке представлены значения Ai для случая, когда низкоаффинные антитела
отсутствовали, а в третьей колонке представлены значения Ai для случая, когда предполагаемые образцы
антител содержали 1,0×10 -10 М высокоаффинных и 0,25×10 -10 М низкоаффинных антител
как для варианта с одним видом антител, так и
для смеси двух антител, аффинность которых
различается на два порядка, использование
уравнения (16) позволяет получить прямые линии, наклон которых незначительно отличается друг от друга. При этом константа равновесия для одного типа антител, вычисленная
этим способом, равна 1,0×108 М-1, а для смеси
антител найденная таким способом «усредненная» аффинность, равна 0,89×108 М-1. Следовательно, в случае использования уравнения (16)
можно определить аффинность только в том
случае, когда имеется один вид антител. Присутствие в исследуемом образце низко- и высокоаффинных антител обнаружить не удается.
При этом значение «усредненной» константы
равновесия является несколько заниженным
по сравнению с истинной аффинностью высокоаффинных антител.
А теперь, используя теоретические данные
таблицы 3, построим графики зависимости величин от li в соответствии с уравнением (12)
(рис. 3, В). Как видно из рисунка, для образца, содержащего один вид антител мы опять
получили линейную зависимость, тангенс угла
которой равен 1,0×108 М-1. Однако для теоретических значений Ai, представляющих собой
образец смеси высоко- и низкоаффинных антител, получена выпуклая кривая, в точности
74
напоминающая экспериментальные кривые
для смеси моноклональных антител с сывороткой мыши (рис. 2, В). Следовательно, применение уравнения (12) действительно позволяет
выявить наличие смеси антител разной аффинности, тогда как традиционно используемое уравнение (16) не позволяет этого сделать.
Теперь, зная, что данный образец антител
содержит высоко- и низкоаффинные антитела, их аффинность, а также соотношение их
концентраций в исследуемом растворе можно
определить с помощью метода нелинейной
регрессии, сравнивая имеющуюся зависимость
Ai от li с теоретической кривой, описываемой
уравнением (18). Применение этого метода позволяет найти точно такие же значения
K 1, K 2, A 01 и A 02, какие были взяты нами для
расчета теоретических значений Ai (табл. 3), а
именно, A 01 = 1,0; K 1 = 1,0×108 М-1; A 02 = 0,25;
K 2 = 1,0×106 М-1.
Следовательно, нами продемонстрировано,
что применение предложенного нами подхода,
основанного на использовании уравнения (12)
позволяет не только определить аффинность
одного вида исследуемых антител, но в случае
наличия двух типов антител в смеси (низко- и
высокоаффинных) позволяет установить этот
факт и, следовательно, попытаться найти аффинность обоих антител иными способами. К
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 3
С. А. БОБРОВНИК, М. А. ДЕМЧЕНКО, С. В. КОМИСАРЕНКО
А
1.25
1,25
11
1
1
22
2
2
20
Y1
Y1 Y1
недоліки традиційного методу
визначення афінності та їх
усунення
33
4
4
3
47
3
(u107 4) 7)
ll ,i , M
M(×10
l ii, M (u10 ) 7
l i , M (u10 )
55
5
5
66
6
6
77
7
7
15
1
112
1
2
2
2
15
15
15
10
1010
Показано, що використання традиційного методу визначення афінності антитіл за
допомогою ELISA може призвести до одержання неточних результатів і неповної інформації
щодо досліджуваного зразка антитіл, особливо якщо досліджується суміш двох чи більше
видів антитіл різної афінності. Для вирішення
такої проблеми нами розроблено інший підхід. Він дозволяє визначити, що досліджуваний зразок антитіл має два чи більше типів
антитіл різної афінності і, відповідно, вибрати метод для вимірювання цього параметра.
Таким чином наш метод дозволяє визначити
афінність двох і більше типів антитіл.
5
55
0
0
00
00
Y2
Y2 Y2
32
32
32
32
Y2
80
40
40
40
40
80
80
80
1/l i , M -1 (u10 -7 )
1/l i , M -1-1-1(u10 -77)-7
i1/l i , M (u10 )
1/l , M (×10 )
120
160
160
160
160
120
120
120
В
1
1
21
2
2
24
24
24
24
16
16
16
16
К л ю ч о в і с л о в а: реакція антиген-антитіло, афінність, математичне моделювання.
8
8
88
0
0
00
0
00
С. О. Бобровник, М. О. Демченко,
С. В. Комісаренко
Інститут біохімії ім. О. В. Палладіна
НАН України, Київ;
e-mail: [email protected]
Б
20
20
20
Y1
в исследуемом образце можно определить или
при помощи метода нелинейной регрессии [9,
10], или же иным путем, например с помощью
метода, описанного нами ранее [2].
1
1
21
2
2
Ai
A i AAi i
1.25
1.25
1,001
1
1
0.75
0,75
0.75
0.75
0.5
0,50
0.5
0.5
0.25
0,25
0.25
0.25
0
0
00
0
0
0
8
8
8
8
16
16
16
16
24
24
24
24
32
40
48
32
40
48
32
408
48
32
40
48
l i , M (u108 )
l i , M (u10 ) 8
l
i , M (u10 8)
l , M(×10 )
56
56
56
56
64
64
64
64
i
Shortcomings of traditional
method for determining
affinity and their removal
Ɋɢɫ. 3. (Ⱥ) Ɍɟɨɪɟɬɢɱɟɫɤɢɟ ɡɧɚɱɟɧɢɹ ɡɚɜɢɫɢɦɨɫɬɢ ɤɨɥɢɱɟɫɬɜɨ «ɫɜɨɛɨɞɧɵɯ» ɚɧɬɢɬɟɥ ɜ ɢɯ ɫɦɟɫɢ ɫ
Ɋɢɫ.
3. (Ⱥ) Ɍɟɨɪɟɬɢɱɟɫɤɢɟ
ɡɧɚɱɟɧɢɹ
ɡɚɜɢɫɢɦɨɫɬɢ
ɤɨɥɢɱɟɫɬɜɨ
«ɫɜɨɛɨɞɧɵɯ»
ɚɧɬɢɬɟɥ
ɢɯ ɫɦɟɫɢ
ɫ
ɚɧɬɢɝɟɧɨɦ
ɤɨɧɰɟɧɬɪɚɰɢɢ
ɚɧɬɢɝɟɧɚ.
(Ȼ)
Ⱦɚɧɧɵɟ
ɪɢɫ.2Ⱥ,
ɩɪɟɞɫɬɚɜɥɟɧɧɵɟ
ɜ ɜɤɨɨɪɞɢɧɚɬɚɯ
Bobrovnik,
M. A. Demchenko,
Ɋɢɫ.
3. (Ⱥ)
Ɍɟɨɪɟɬɢɱɟɫɤɢɟ
ɡɧɚɱɟɧɢɹ
ɡɚɜɢɫɢɦɨɫɬɢ
ɤɨɥɢɱɟɫɬɜɨ
«ɫɜɨɛɨɞɧɵɯ»
ɚɧɬɢɬɟɥ
ɜS.
ɢɯA.
ɫɦɟɫɢ
ɫ
Рис.
3.ɨɬɨɬ
А ɤɨɧɰɟɧɬɪɚɰɢɢ
– Теоретические
значения
зависимосɚɧɬɢɝɟɧɨɦ
ɚɧɬɢɝɟɧɚ. (Ȼ)
Ⱦɚɧɧɵɟ ɪɢɫ.2Ⱥ,
ɩɪɟɞɫɬɚɜɥɟɧɧɵɟ ɜ ɤɨɨɪɞɢɧɚɬɚɯ
ɚɧɬɢɝɟɧɨɦ
ɨɬ
ɤɨɧɰɟɧɬɪɚɰɢɢ
ɚɧɬɢɝɟɧɚ.
(Ȼ)
Ⱦɚɧɧɵɟ
ɪɢɫ.2Ⱥ,
ɩɪɟɞɫɬɚɜɥɟɧɧɵɟ
ɜ
ɤɨɨɪɞɢɧɚɬɚɯ
A0
S. V. Komisarenko
количества
«свободных»
антител
в их смеси
ɩɪɨɬɢɜ 1/l
ɫ ɭɪɚɜɧɟɧɢɟɦ
(16)). (ȼ) Ⱦɚɧɧɵɟ ɪɢɫ.2Ⱥ,
Yти
i (ɜ ɫɨɨɬɜɟɬɫɬɜɢɢ
A
1
A0 0A0Ai ɩɪɨɬɢɜ 1/li (ɜ ɫɨɨɬɜɟɬɫɬɜɢɢ ɫ ɭɪɚɜɧɟɧɢɟɦ (16)). (ȼ) Ⱦɚɧɧɵɟ ɪɢɫ.2Ⱥ,
Y1
1/li концентрации
(ɜ ɫɨɨɬɜɟɬɫɬɜɢɢ ɫантигена;
ɭɪɚɜɧɟɧɢɟɦ Б –
(16)). (ȼ) Ⱦɚɧɧɵɟ ɪɢɫ.2Ⱥ,
Yс1 антигеном
A0 Ai ɩɪɨɬɢɜ от
A0 Ai
2
Palladin Institute of Biochemistry, National
§
·
A
A
A
A
A
A
2
данные рис. 2, А представлены в координатах
ɩɪɟɞɫɬɚɜɥɟɧɧɵɟ ɜ ɤɨɨɪɞɢɧɚɬɚɯ Y2 A0 0 Ai i §¨A0 0 Ai i·¸ 2A0 0 Ai i ɩɪɨɬɢɜ li (ɜ ɫɨɨɬɜɟɬɫɬɜɢɢ
ɫ
Academy
of Sciences of Ukraine, Kiev;
A0Ai Ai ¨©§ A0Ai A¸i¹· A0Ai Ai ɩɪɨɬɢɜ li (ɜ ɫɨɨɬɜɟɬɫɬɜɢɢ
ɩɪɟɞɫɬɚɜɥɟɧɧɵɟ ɜ ɤɨɨɪɞɢɧɚɬɚɯ Y2
ɫ
ɩɪɟɞɫɬɚɜɥɟɧɧɵɟ
A0 ɜ ɤɨɨɪɞɢɧɚɬɚɯ Y2 AiA © ¨ AiA ¹ ¸ AiA ɩɪɨɬɢɜ li (ɜ ɫɨɨɬɜɟɬɫɬɜɢɢ ɫ e-mail: [email protected]
ɭɪɚɜɧɟɧɢɟɦ
(12)). против 1/l в соответствии
i
i
i
©
¹ с уравY1
Ai 0
ɭɪɚɜɧɟɧɢɟɦ
A(12)).
Ai
ɭɪɚɜɧɟɧɢɟɦ
0 (12)).
Y
Summary
1
A02 рис.
Ai 2, А представлены
нением (16); В – данные
§ A0 Ai · A0 Ai
A0 Ai
2
¨
Y2
§ A0 Ai · A0 Ai
A0 ¸ A
i
A
A
A
в координатах
i
© Y2 i ¹
i¨
¸ Ai
Ai
© Ai ¹
против li в соответствии с уравнением (12)
примеру, получив с помощью уравнения (12)
информацию о том, что исследуемый образец
содержит низко- и высокоаффинные антитела,
сродство обоих видов антител к данному антигену, а также соотношение их концентраций
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 3
It was shown that application of the traditional­
method for antibody affinity determination may
give not exact and non complete information about
the characteristics of studied antibodies especially
if studying specimens contain two or more species
of antibodies with different affinity.
In order to avoid this problem it is recommended to use another approach, suggested by us
earlier.
Our approach allows elucidating that studying­
specimens contain more than one kind of antibodies­
and this allows applying a proper method for an-
75
експериментальні роботи
tibody affinity evaluation. Such method, which
allows determining the affinity of two antibodies
in a mixture that have different affinity, is also
described.
K e y w o r d s: antigen-antibody reaction,
affinity, mathematical modeling.
1. Bobrovnik S. A. // Укр. біохім. журн. –
2000. – 72, № 3. – С. 133–141.
2. Bobrovnik S. A. Determination of antibody
affinity by ELISA. Theory. J. Biochem. Biophys.
Methods // 2003. – 57. – Р. 213–236.
3. Klotz I. M. // Arch. Biochem. – 1946. – 9. –
Р. 109–116.
4. Scatchard G. // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 1949. –
51. – Р. 660–672.
76
5. Friguet B., Chaffotte A. F., Djavadi-Ohanian­
ce L., Goldberg M. E. // J. Immunol.
Methods. – 1985. – 77. – Р. 305–319.
6. Bobrovnik S. A., Komisarenko S. V., Ilyina L. V.
// Укр. біохім. журн. – 2005. – 77, № 2. –
P. 170–174.
7. Stevens F. // Molec. Immunol. –1987. – 24. –
Р. 1055–1060.
8. Klotz I. M., Huston D. L. // Biochemistry. –
1971. – 10. – Р. 3065–3069.
9. Бобровник С. А. // Укр. біохім. журн. –
2005. – 77, № 3. – С. 155–161.
10. Stevens F. J., Bobrovnik S. A. // J. Immunol.
Methods. – 2007. – 328. – Р. 53–58.
Получено 08.12.2008
ISSN 0201 — 8470. Укр. біохім. журн., 2009, т. 81, № 3
Скачать