Автореферат - Институт экологии и генетики микроорганизмов
реклама
На правах рукописи МАКСИМОВА Юлия Геннадьевна ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ КЛЕТОК НИТРИЛГИДРОЛИЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ И ИХ ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ ТРАНСФОРМАЦИИ НИТРИЛОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ 03.02.03 Микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Пермь – 2015 2 Работа выполнена в лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии ФГБУН Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН, Пермь Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор, чл.-корр. РАН Демаков Виталий Алексеевич Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией экобиокатализа кафедры химической энзимологии химического факультета Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова Ефременко Елена Николаевна доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории энзиматической деградации органических соединений ФГБУН Института биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г.К. Скрябина РАН Соляникова Инна Петровна доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией биологически активных веществ ФГБУН Уфимского Института биологии РАН Логинов Олег Николаевич Ведущая организация: Государственный научный центр Российской Федерации ФГУП Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов («ГосНИИгенетика») (117545, г. Москва, 1-й Дорожный проезд, д. 1). Защита диссертации состоится «___» _______ 2016 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081, г. Пермь, ул. Голева, д. 13. Факс: (342) 2809211 Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://vak.ed.gov.ru) и на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и на сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru). Автореферат разослан «___» _____________ 2016 г. Временно исполняющий обязанности ученого секретаря диссертационного совета, доктор биологических наук Куюкина Мария Станиславовна 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы исследования и степень ее разработанности. Биокатализ - высокоэффективный специфичный процесс трансформации органических веществ, который в отличие от химического катализа происходит в «мягких» условиях, при нормальной температуре и давлении. Стадии хемоэнзиматического синтеза органических веществ, широко используемого в химической и фармацевтической промышленности, могут катализироваться микробными клетками, обладающими определенной ферментативной активностью, либо изолированными ферментами. Преимущества применения ферментов как промышленных катализаторов по сравнению с химическим катализом обусловлены экологической безопасностью ферментативных процессов, способностью к осуществлению стерео- и региоселективных трансформаций, возможностью получения органических веществ, не загрязненных продуктами побочных реакций (Dordick et al., 1998; Bull et al., 1999; Rozzell, 1999; Schmid et al., 2001; Zaks, 2001; Thomas et al., 2002; Breuer et al., 2004; Pollard, Woodley 2006). Получение амидов и карбоновых кислот из нитрилов с помощью микробных ферментов нитрилгидратазно-амидазного и нитрилазного пути метаболизма нитрилов является активно развивающейся биокаталитической технологией (Bunch, 1998; Hughes et al., 1998; Martínková, Křen, 2010; Дебабов, Яненко, 2011). Биотехнологическим способом из соответствующих нитрилов могут быть получены такие продукты, как акриламид (Watanabe et al., 1987; Kobayashi et al., 1992; Takashima et al., 1998), акриловая кислота (Nagasawa et al., 1990; Webster et al., 2001; Полтавская и др., 2004; Глинский и др., 2010), никотинамид, никотиновая, изоникотиновая и пиколиновая кислоты (Mathew et al., 1988; Nagasawa et al., 1988; Almatawah, Cowan, 1999; Cantarella et al., 2008, 2012; Cantarella et al., 2010), путем стереоселективного гидролиза – энантиомерно чистые органические вещества, используемые в качестве интермедиатов при получении фармпрепаратов и химикатов различного назначения (Beard, Page, 1998; Kaul et al., 2004; Banerjee et al., 2006; Alonso et al., 2007). Благодаря своим уникальным свойствам нитрилгидролизующие микроорганизмы и ферменты метаболизма нитрилов нашли промышленное применение. Примером успешного внедрения в производство является получение акриламида из акрилонитрила, осуществляемое биотехнологическим путем в Японии, России, Китае и Южной Корее. Наиболее эффективными биокатализаторами на данный момент являются Rhodococcus rhodochrous J1, разработанный университетом Киото и внедренный компанией Nitto Chemical Ltd. (Япония), и R. rhodochrous М33, разработанный ГосНИИгенетики и селекции промышленных микроорганизмов (г. Москва) и внедренный на ряде предприятий России (Дебабов, Яненко, 2011). Производство акриламида только компанией Nitto превышает 20000 тонн/год, синтез никотинамида (Lonza, Китай) – более 3000 тонн/год. Также, по 4 данным 2001 г, компания BASF (Германия) осуществляла гидролиз рацемического нитрила миндальной кислоты до R-миндальной кислоты с помощью фермента нитрилазы, выпуск продукта составлял несколько тонн в год; компания DSM (Дания) осуществляла кинетическую резолюцию рацемических амидов аминокислот с помощью амидазы до непротеиногенных L-аминокислот, выпуск составлял от нескольких тонн до нескольких десятков тонн в год (Schmid et al., 2001). Интенсификация биотехнологических процессов может быть достигнута за счет перехода от гомогенного катализа к гетерогенному. Гетерогенный биокатализ – это ферментативный катализ, протекающий на границе раздела фаз. В качестве катализаторов такого процесса могут выступать иммобилизованные ферменты или целые клетки микроорганизмов. Применение иммобилизованных биокатализаторов имеет ряд несомненных преимуществ, среди которых их стабилизация, возможность внедрения непрерывных технологий, упрощение процедуры выделения и очистки конечных продуктов, снижение количества отходов (Синицын и др., 1994). Несмотря на очевидные преимущества гетерогенного процесса, разработки иммобилизованных биокатализаторов часто остаются на лабораторном уровне, являются трудозатратными и не могут быть масштабированы и внедрены в производственный процесс. Неэффективность процесса создания гетерогенных биокатализаторов нередко связана с лежащим в его основе эмпирическим методом, иначе говоря, методом «проб и ошибок», отсутствием научно обоснованного подхода к их разработке в соответствии с требованиями биокаталитического процесса. Подавляющее большинство исследований гетерогенных биокаталитических процессов выполнено на основе клеток микроорганизмов, включенных в структуру гелей (Fukushima et al., 1988; Walsh, 1995; Brányik, Kuncová, 1998; Lozinsky, Plieva, 1998; Kobayashi, 2000; Park, Chang, 2000; Coradin et al., 2003), тогда как использованию адгезированных клеток в биокатализе уделяется существенно меньше внимания. Это утверждение справедливо и для работ, касающихся иммобилизации клеток нитрилгидролизующих бактерий: основным методом иммобилизации является включение клеток в структуру гелей альгинатов (Graham et al., 2000; Dias et al., 2001; Mustacchi et al., 2005; Guo et al., 2006), каррагинанов (Dias et al., 2000), агара и агарозы (Colby et al., 2000), ПВС (Bauer et al., 1996), ПАА (Hann et al., 1999). Недостаточное внимание, уделяемое адгезированным биокатализаторам, может являться следствием основного недостатка этого метода – не очень высокой прочности взаимодействий, возникающих между клеткой и носителем, что приводит к вымыванию клеток. В то же время, именно иммобилизованные биокатализаторы на основе клеток микроорганизмов, приготовленные методом адгезии, могут быть масштабированы до уровня промышленного производства, т.к. их приготовление требует меньше времени, является несложным и экономически более выгодным. Основным требованием к функционированию гетерогенных 5 биокатализаторов на основе адгезированных клеток сохранение ферментативной активности и микроорганизмов достижение высокой является операционной стабильности, которое происходит, в основном, благодаря правильному подбору носителя. Следовательно, разработка научных основ создания гетерогенного биокатализатора на основе адгезированных клеток остается особенно актуальной. Адгезия микроорганизмов в природной среде является естественным процессом, обусловливающим их существование в прикрепленном состоянии и инициирующим процессы образования биопленки. Исследования, касающиеся прикрепленного состояния бактерий, в настоящее время интенсивно развиваются и затрагивают генетические основы биопленкообразования (Ильина и др., 2004), анализ мРНК и протеомный анализ (Junter et al., 2002, 2004), морфологические и физиологические особенности иммобилизованных клеток (Saucedo, 1989; Verbelen et al., 2006; Verstrepen, Klis, 2006; Landini, 2009), состав и структуру внеклеточного полимерного матрикса (Allison et al., 1998; Ипполитов и др., 2003; Tsuneda et al., 2003). В то же время, остаются невыясненными особенности энергетического состояния адгезированных клеток, наблюдающиеся на стадии инициации образования биопленки при переходе клетки от планктонного способа существования к прикрепленному. Известны лабораторные и промышленные разработки, в которых процессы микробной ферментации для получения спиртов, органических кислот, биогаза катализировались биопленками (Tyagi, Ghose, 1982; Demirci et al., 1993, 1997; Kunduru, Pometto III, 1996; Urbance et al., 2004; Gu et al., 2013; Singh et al., 2013). В то же время, лишь единичные исследования посвящены изучению биопленок как катализаторов процессов трансформаций органических веществ (Li et al., 2006; Gross et al., 2007; Setyawati et al., 2009), тогда как ряд авторов справедливо отмечает, что биопленка может являться самоиммобилизованным и саморегенерируемым катализатором, имеющим преимущества в тех случаях, когда токсичные субстраты и/или продукты ферментативного катализа оказывают неблагоприятное воздействие на жизнеспособность клетки (Rosche et al., 2009; Halan et al., 2012). Иммобилизация ферментов для получения органических веществ имеет длительную историю (Brena, Batista-Viera, 2006), ряд работ посвящен трансформации нитрилов и амидов иммобилизованными нитрилгидролизующими ферментами (Fradet et al., 1985; Mateo et al., 2006; Kaul et al., 2007; Kubáč et al., 2008; Chiyanzu et al., 2010; Kumar et al., 2010). Однако остается не до конца выясненным вопрос целесообразности применения изолированных иммобилизованных ферментов в том случае, когда они являются внутриклеточными, и может быть иммобилизована целая микробная клетка без сложной и дорогостоящей процедуры выделения отдельного фермента. Необходима систематизация знаний, касающихся каталитических свойств иммобилизованных различными способами ферментов метаболизма нитрилов и кинетических параметров катализируемых ими 6 реакций, с целью выбора наиболее предпочтительных способов иммобилизации в зависимости от поставленных целей и особенностей биокаталитического процесса. Изложенные проблемы обусловливают актуальность диссертационной работы, посвященной всестороннему анализу процесса гетерогенной трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот, основанному на иммобилизованных биокатализаторах трех типов: адгезированных бактериальных клетках, самоиммобилизованных, растущих в виде биопленок бактериях, а также иммобилизованных нитрилгидролизующих ферментах. Цель настоящего исследования – выявление закономерностей процессов биокаталитической трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот, протекающих в гетерогенной среде с участием адгезированных бактериальных клеток и биопленок нитрилгидролизующих бактерий, а также иммобилизованных ферментов метаболизма нитрилов, для создания эффективного биокатализатора. Основные задачи исследования: 1. Получение гетерогенного биокатализатора на основе адгезированных клеток нитрилгидролизующих бактерий, изучение процесса адгезии клеток на носителях и взаимодействия с многослойными углеродными нанотрубками, а также гидролиза алифатических и ароматических нитрилов и амидов карбоновых кислот этими биокатализаторами. 2. 3. 4. 5. Трансформация нитрилов и амидов самоиммобилизованными в биопленку нитрилгидролизующими бактериями, выявление особенностей функционирования гетерогенного биокатализатора на основе биопленок, оценка его устойчивости к токсичным субстратам и продуктам ферментативного катализа. Изучение энергетического статуса клеток нитрилгидролизующих бактерий на этапе инициации образования биопленки – стадии необратимой адгезии. Изучение каталитических свойств иммобилизованных ферментных препаратов нитрилгидратазы, нитрилазы и амидазы, определение кинетических параметров трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот, катализируемой свободными и иммобилизованными ферментами. Осуществление стереоселективного гидролиза нитрилов и амидов карбоновых кислот гетерогенным биокатализатором на основе адгезированных клеток бактерий и выделенных иммобилизованных ферментов. Изучение зависимости стереоселективности процесса от способа иммобилизации, типа биокатализатора и используемых носителей. Научная новизна Разработаны научные основы создания гетерогенного биокатализатора трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот, позволяющие на основании ряда характеристик, присущих биологической составляющей процесса, носителю и трансформируемым субстратам предсказать его эффективность. Разработан алгоритм 7 изучения свойств гетерогенного биокатализатора. Обоснован выбор иммобилизованного биокатализатора (адгезированные клетки или иммобилизованные изолированные ферменты) в зависимости от получения целевых продуктов и особенностей биокаталитического процесса, показано, что выделение и иммобилизация фермента предпочтительны для стереоселективной трансформации субстратов. Показана первостепенность гидрофобных взаимодействий, предшествующих адгезии клеток на углеродных носителях, выявлена прямая зависимость между гидрофобностью поверхности клеток различных штаммов нитрилгидролизующих бактерий родов Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter, Rhodococcus и массой адгезированных клеток на гидрофобных углеродных материалах (от r=0,884 до r=0,950, p=0,05). Показана эффективность использования активированных углеродных адсорбентов для получения биокатализатора гидролиза алифатических нитрилов на основе адгезированных бактериальных клеток и, наоборот, предпочтительность использования неактивированных носителей в гетерогенном процессе трансформации ароматических нитрилов. Изучены особенности взаимодействия клеток бактерий родов Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter, Rhodococcus с многослойными углеродными нанотрубками. Впервые показана возможность создания гетерогенных биокатализаторов на основе агрегированных с многослойными углеродными нанотрубками бактериальных клеток, и обоснованы преимущества таких биокатализаторов, заключающиеся, в частности, в легкости их отделения от реакционной среды и высокой клеточной нагрузке. Проведено сравнение кинетических параметров реакции трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот, катализируемых ферментными препаратами нитрилгидратазы, нитрилазы и амидазы, иммобилизованными различными способами (адсорбцией, ковалентной сшивкой с носителем, образованием поперечно-сшитых ферментных агрегатов), а также каталитических свойств этих гетерогенных биокатализаторов. Изучено влияние способа иммобилизации на стереоселективность реакции гидролиза рацемических нитрилов и амидов, а также воздействие различных видов носителей на выход стереоизомеров в процессе гетерогенного биокатализа. Показана предпочтительность создания гетерогенного биокатализатора для стереоселективной трансформации на основе поперечно-сшитых агрегатов ферментов. Разработана методика получения иммобилизованных ферментов гидролиза нитрилов путем ковалентной сшивки белков с гранулами хитозана, активированного 0,1% бензохиноном, и образованием поперечно-сшитых агрегатов фермента при высаливании белка из раствора сульфатом аммония с одновременным воздействием 0,1% раствора глутарового альдегида или бензохинона. Впервые показана возможность создания гетерогенного биокатализатора гидролиза нитрилов на основе биопленок нитрилтрансформирующих бактерий родов Rhodococcus, Pseudomonas, Alcaligenes, полученных в процессе культивирования с носителями, его 8 повышенная устойчивость к токсичным субстратам и продуктам ферментативной реакции по сравнению с суспендированными клетками. Показана эффективность культивирования бактерий в присутствии носителя как способа создания гетерогенного биокатализатора, объединяющего наращивание биомассы микроорганизмов и иммобилизацию в один этап. Определена продуктивность биопленок нитрилгидролизующих бактерий при трансформации алифатических и ароматических нитрилов и амидов. Впервые изучены особенности энергетического статуса клеток бактерий родов Rhodococcus и Pseudomonas при необратимой адгезии на нерастворимом носителе, выражающиеся в значительном снижении концентрации АТФ в клетке при адгезии и в первые часы после переноса адгезированных клеток в свежую питательную среду. Показано, что степень снижения внутриклеточного пула АТФ зависит от свойств носителя, на котором адгезируются клетки. Показана обратная концентрационная зависимость активности гетерогенного биокатализатора, которая наблюдается при невысоких скоростях ферментативной реакции (единицы мкмоль продукта, образуемые 1 мг биокатализатора в минуту) даже при избытке субстрата. Определено, что подобная зависимость не наблюдается при высоких скоростях ферментативной реакции (сотни мкмоль продукта, образуемые 1 мг биокатализатора в минуту). Теоретическая значимость работы Результаты исследований позволили сформулировать концепцию о значимости адгезированной формы существования бактерий для биокаталитических трансформаций. Замена свободносуспендированного состояния бактериальных клеток на адгезированное позволяет получить преимущество в биокаталитическом синтезе амидов и карбоновых кислот из соответствующих нитрилов, выражающееся в повышении ферментативной активности и стабильности в процессе многократных биотрансформаций. Полученные экспериментальные данные расширяют представления о гетерогенном биокатализе нитрилов и амидов карбоновых кислот, осуществляемом как клетками микроорганизмов, так и выделенными ферментами. Экспериментальная адгезия микроорганизмов на нерастворимом носителе рассматривается как модель инициации образования биопленки в природе, связанной с прикреплением клеток к биотической или абиотической поверхности. Изучение самоиммобилизованных в процессе культивирования с носителями нитрилгидролизующих бактерий позволяет получить новые знания о существовании этих микроорганизмов в естественном, биопленочном состоянии. Принимая во внимание, что внутриклеточные ферменты функционируют не в разбавленном растворе, а в сложной гетерогенной среде, изучение каталитических свойств иммобилизованных ферментов и кинетических параметров катализируемых ими реакций 9 дает новые знания о влиянии факторов окружающей среды на фермент, находящийся в прикрепленном состоянии. Полученные результаты, касающиеся энергетического статуса адгезированных бактерий, раскрывают особенности физиологического состояния клеток на этапе инициации образования биопленки – стадии необратимой адгезии, и позволяют провести параллель между этой стадией и лаг-фазой при периодическом культивировании бактерий в жидкой среде. Полученные новые данные о влиянии гетерогенной среды на стереоселективность трансформаций, катализируемых иммобилизованными клетками и ферментами, расширяют представление о стереохимии ферментативных реакций и показывают возможность управления процессом получения стереоизомеров при варьировании используемого носителя для иммобилизации биокатализаторов. Разграничение терминов «адгезированные клетки микроорганизмов» и «биопленки микроорганизмов» в рамках более широкого понятия «иммобилизованные клетки» позволяет внести ясность в понимание гетерогенных биокаталитических процессов. Практическая значимость работы Практическая значимость работы заключается в создании активных и стабильных гетерогенных биокатализаторов процесса трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот для получения химических веществ, значимых в народном хозяйстве, и предшественников фармпрепаратов (акриламид, акриловая кислота, никотинамид, никотиновая, изоникотиновая и пиколиновая кислоты, фенилглицин и др.). Разработанный алгоритм изучения гетерогенного биокатализатора на примере процесса гетерогенного биокатализа нитрилов и амидов карбоновых кислот позволяет перейти от эмпирического подбора носителей для иммобилизации клеток и ферментов к менее трудозатратному способу оценки эффективности процесса, основанному на прогнозировании свойств гетерогенного биокатализатора по ряду признаков, присущих носителю, биологическому объекту и ферментативной реакции. Методология и методы исследования Диссертационная работа выполнена с применением классических и современных микробиологических (культивирование бактерий, поддержание бактериальных культур, определение ростовых характеристик, подсчет жизнеспособных клеток), биохимических (ферментативные трансформации органических веществ, получение препаратов ферментов, определение константы Михаэлиса-Ментен, максимальной скорости ферментативной реакции, константы термоинактивации ферментов, температурной и рН зависимости активности ферментов, энантиомерного избытка стереоизомеров), аналитических (методы спектрофотометрии, ВЭЖХ и ГХ) и микроскопических (фазовоконтрастная и флюоресцентная световая микроскопия, сканирующая электронная микроскопия) методов. Иммобилизация клеток и ферментов выполнена 10 модифицированными методами, известными из научной литературы, а также авторскими запатентованными методами (патент РФ № 2352635; патент РФ № 2500814). Основные положения, выносимые на защиту 1. Гидрофобные взаимодействия являются определяющими при адгезии на углеродсодержащих материалах клеток бактерий родов Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter, Rhodococcus с различной степенью гидрофобности поверхности. Выбор носителя для иммобилизации особенностями биокаталитического трансформируемых веществ. 2. Биопленки нитрилгидролизующих бактериальных процесса бактерий, и клеток обусловлен химической полученные в природы процессе культивирования в присутствии носителей, могут служить гетерогенным биокатализатором трансформации алифатических и ароматических нитрилов и амидов карбоновых кислот. Устойчивость клеток биопленки к токсичному действию субстратов и продуктов реакции трансформации нитрилов повышается по сравнению с суспендированным состоянием. 3. Адгезия бактерий приводит к снижению содержания АТФ в клетках, которое продолжается в первые часы после переноса в свежую питательную среду; уровень снижения концентрации внутриклеточного АТФ зависит от свойств носителя, на котором адгезируются клетки. Изменение энергетического статуса клетки не влияет на активность нитрилгидролизующих ферментов. 4. На каталитические свойства иммобилизованного ферментного препарата, содержащего ферменты метаболизма нитрилов, влияют методы иммобилизации (адсорбция или ковалентная сшивка) и свойства носителей. Адсорбция на неорганических носителях дает преимущества в термостабильности фермента, ковалентная сшивка с органическими носителями – возрастание операционной стабильности и изменение рН профиля активности. 5. На стереоселективность гетерогенного гидролиза рацемических амидов и нитрилов влияет присутствие нерастворимого носителя в реакционной среде; наибольшую стереоселективность проявляют поперечно-сшитые ферментные агрегаты амидазы. Степень достоверности, апробация результатов и публикации Достоверность результатов исследования подтверждается объемом данных, полученных в ходе экспериментальных работ, выполненных с применением современных микробиологических, биохимических и аналитических методов. Получение гетерогенных биокатализаторов на основе клеток бактерий, адгезированных на носителях или выращенных в виде биопленок, подтверждено методами электронной и световой микроскопии; образующиеся в ходе биохимических трансформаций органические вещества проанализированы методами ВЭЖХ и ГХ. Полученные результаты обработаны с помощью лицензионных программ и методов статистического анализа. 11 Основные положения диссертационной работы доложены на 7-й и 8-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века», Пущино, 2003, 2004; Всероссийском симпозиуме с международным участием «Биотехнология микробов», Москва, 2004; Третьем Московском Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития», Москва, 2005; 2-й и 3-й Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал», Пермь – Казань – Пермь, 2005, Пермь – Нижний Новгород – Пермь, 2008; Международной научной конференции «Микробные биотехнологии», Одесса, 2006; Международной научной конференции молодых ученых “Modern problems of microbiology and biotechnology”, Odesa, 2007; VI и VII Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии», Минск, 2008, 2010; 4th and 5th Congress of European Microbiologists (FEMS), Geneva, Switzerland, 2011, Leipzig, Germany, 2013; International Conference “Biofilms 5”, Paris, France, 2012, “Biofilms 6”, Vienna, Austria, 2014. По теме диссертации опубликовано 87 научных работ, в том числе 2 обзора и 18 экспериментальных статей в журналах, входящих в перечень, рекомендованный ВАК Минобрнауки РФ, 13 из которых входят в международные базы цитирования Web of Science/Scopus; получено 2 патента РФ. Связь работы с научными программами Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН и является частью исследований, проводимых по теме «Биохимические и генетические системы трансформации органических соединений у бактерий, перспективных для биотехнологий» (номер государственной регистрации 0120.0406511). Исследования выполнены при поддержке гранта РФФИ № 04-04-97514-р_офи «Фундаментально-прикладные исследования для биотехнологического процесса получения 10-15% гидрогеля полиакриламида высокой чистоты на основе штамма микроорганизмов Rhodococcus ruber», 2004–2006 гг.; программы интеграционных исследований Уральского и Сибирского отделений РАН, 2004–2006 гг.; Программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология», 2009– 2014 гг; аналитической ведомственной целевой программы «Развитие научного потенциала высшей школы, 2009–2010 гг; молодежного гранта по УрО РАН №35, 2004 г.; гранта РФФИ № 07-04-97617-р_офи «Фундаментально-прикладные исследования для создания безотходного биокаталитического процесса получения акриловых мономеров», 2007–2008 гг; ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009–2013 гг., государственный контракт 02.740.11.0078; гранта РФФИ №13-04-96050р_урал_а «Исследование стереоселективной биотрансформации амидов и сложных эфиров почвенными бактериями с применением энзимологических, метагеномных и геномных методов», 2013–2015 гг. 12 Личный вклад автора и благодарности Автору принадлежит выбор проблемы, постановка целей и задач проведенных исследований, планирование экспериментов, выполнение 80% экспериментальной работы или непосредственное руководство экспериментами, анализ, обобщение и интерпретация результатов, подготовка научных публикаций и патентов. Экспериментальные работы по трансформации ароматических нитрилов гетерогенным биокатализатором выполнены совместно с аспирантом ПГНИУ Д.М. Васильевым, по иммобилизации и изучению каталитических и стереоселективных свойств изолированной амидазы – с аспирантом ИЭГМ УрО РАН А.Н. Горбуновой. Автор выражает благодарность профессору кафедры материалов, технологий и конструирования машин Пермского национального исследовательского политехнического университета, д.т.н. В.Ф. Олонцеву за предоставленные образцы активных углей; ведущему научному сотруднику Института катализа им. Г.К. Борескова СО РАН д.х.н. Г.А. Коваленко за предоставленные образцы углеродсодержащих носителей и помощь в обсуждении ряда полученных результатов; начальнику лаборатории ОАО «Уральского НИИ композиционных материалов» С.М. Никулину за предоставленные образцы многослойных углеродных нанотрубок; д.г.-м.н., заслуженному деятелю науки РФ, профессору кафедры минералогии и петрографии Пермского государственного национального исследовательского университета Б.М. Осовецкому и сотруднику демонстрационно-методического центра TESCAN (г. Санкт-Петербург) к.ф.-м.н. М.В. Лукашовой за помощь в электронно-микроскопическом анализе образцов; ведущему инженеру лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии ИЭГМ УрО РАН Г.В. Овечкиной за помощь в ВЭЖХ-анализе образцов. Профилометрия адсорбентов была выполнена в лаборатории физики основ прочности в Институте механики сплошных сред УрО РАН (г. Пермь). Автор выражает искреннюю благодарность и признательность научному консультанту, чл.-корр. РАН, профессору, д.м.н. В.А. Демакову за многолетнюю помощь и поддержку. Объем и структура диссертации Работа изложена на 321 странице машинописного текста, содержит 85 рисунков и 31 таблицу, состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов, трех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы, включающего 420 наименований, в том числе 82 на русском и 338 на английском языках. 13 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1 посвящена обзору литературы. Глава 2. Объекты и методы исследования Бактериальные штаммы. Объектами исследования являлись штаммы, изолированные из антропогенно загрязненных почв и селекционированные в лаборатории молекулярной микробиологии и биотехнологии (прежнее название – лаборатория химического мутагенеза) Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН: Rhodococcus ruber gt1 (ИЭГМ 612, Региональная профилированная коллекция алканотрофных микроорганизмов, акроним ИЭГМ, www.iegm.ru/iegmcol/index.html), обладающий высокой нитрилгидратазной активностью и практически неопределяющейся амидазной активностью; Pseudomonas активностью; fluorescens C2 (ВКМ В-2597Д), обладающий нитрилазной R. erythropolis 11-2, R. erythropolis 6-2, R. rhodochrous 4-1, Alcaligenes faecalis 2, Acinetobacter guillouiae 11h, обладающие амидазной активностью в сочетании с низкой нитрилгидратазной активностью. Носители для иммобилизации бактериальных клеток и ферментов. В качестве носителей для иммобилизации бактериальных клеток использовали дробленые, гранулированные и порошкообразные углеродные материалы: уголь активный березовый дробленый БАУ, уголь активный гранулированный ФТД, углеродный материал ФАС на основе фуриловой смолы (Россия), уголь активный дробленый Norit PK 1–3 (Голландия), уголь-сырец, измельченный до порошкообразного состояния с размером частиц 50– 300 мкм, дробленый уголь-сырец с размером частиц 1–6 мм и 3–10 мм; Сибунит (Институт катализа им. Г.К. Борескова СО РАН, Новосибирск, Россия) «Сапропель» (Институт переработки углеводородов СО РАН, Омск, Россия), углеродсодержащий природный минерал Шунгит, пеноуглерод марки ТУМаН (Российский Федеральный Ядерный Центр ВНИИЭФ, Саров, Россия); волокнистые углеродные материалы (пр-ва РУП «Светлогорское «Химволокно», Беларусь): карбонизированные углеродные вискозные волокна Карбопон, карбонизированная углеродная вискозная ткань Урал ТМ–4, активированные вискозные углеродные волокна Карбопон–Β–актив; композиционные углеродные материалы (Институт катализа им. Г.К. Борескова СО РАН, Новосибирск, Россия): керамзит с синтезированным на поверхности слоем каталитического волокнистого углерода (КВУ), керамзит с синтезированным на поверхности слоем графитоподобного углерода, массивный КВУ; углеродные нанотрубки (Институт термохимии, Пермь, Россия). 14 Для адсорбционной иммобилизации ферментов немодифицированные коммерческие оксиды алюминия использовали (производства ОАО «Катализатор», Новосибирск). Для получения углеродсодержащих адсорбентов (С/Al2O3) в Институте катализа им. Г.К. Борескова СО РАН проводили синтез углеродного слоя, в том числе слоя каталитического волокнистого углерода (КВУ-слоя). Культивирование бактерий. Штаммы культивировали на жидкой синтетической минеральной среде N с микроэлементами (Максимов и др., 2003). Источниками углерода (г/л) являлась глюкоза – 1,0, источниками азота NH4Cl – 0,3 (для R. ruber gt1); ацетонитрил – 3,9 (для P. fluorescens C2), 0,39 (для R. erythropolis 11-2, R. erythropolis 6-2, R. rhodochrous 4-1). Для штамма Alcaligenes faecalis 2 и Acinetobacter guillouiae 11h источником и углерода, и азота являлся 0,1 М ацетамид. Культивирование в присутствии носителей осуществляли в 100 мл среды N в конических колбах объемом 250 мл. Среду N предварительно автоклавировали с 1 г углеродсодержащего носителя или с 1 дм2 полиэтилена высокой плотности (полиэтиленовой пленки). В среду асептически добавляли источники углерода и азота и микроэлементы и инокулировали 4 мл бактериальной культуры (ОП540=0,5). Культивирование осуществляли на роторной качалке при постоянном перемешивании со скоростью вращения 90–120 об/мин и температуре 28– 30°С. Нитрилгидратазную, нитрилазную и амидазную активности свободных или иммобилизованных клеток/фермента определяли по концентрации продукта (соответствующих амидов или карбоновой кислоты) реакции трансформации нитрилов и амидов. Удельную активность (ЕД) выражали в мкмоль (ммоль) продукта, образуемого 1 мг (1 г) клеток/фермента за 1 мин (1 ч). Время реакции выбирали экспериментально в зависимости от концентрации биокатализатора и типа ферментативной реакции, реакцию трансформации алифатических нитрилов и амидов останавливали концентрированной HCl до конечной концентрации 5%, ароматических нитрилов и амидов – быстрым замораживанием образца. Трансформацию алифатических нитрилов проводили при 22– 25ºС, алифатических амидов и ароматических нитрилов и амидов – при 30ºС. Реакцию проводили в 0,01 М калий-фосфатном буфере (рН 7,2±0,2) с постоянным перемешиванием при 100 об/мин. Концентрацию продуктов реакции определяли методом ВЭЖХ. Эффективность функционирования иммобилизованной системы (η) определяли как отношение ферментативной активности иммобилизованных клеток к активности свободных клеток (Banerjee et al., 2006). Иммобилизацию клеток бактерий методом адгезии проводили в течение 0,5–2 ч при 22ºС из 10 мл бактериальной суспензии на 0,2–1 г углеродсодержащих носителей или каолина при постоянном перемешивании на шейкере со скоростью вращения 100 об/мин. Массу клеток в мл суспензии определяли взвешиванием на аналитических весах 15 предварительно высушенной до постоянного веса биомассы в известном объеме суспензии. Массу адгезированных бактериальных клеток определяли по формуле: А = m × V × (ОДисх – ОДфильтр) / ОДисх, где: А – масса адгезированных клеток, мг; m – концентрация клеток в суспензии до адгезии, мг/мл; V – объем суспензии, из которого адгезировали клетки, мл; ОД исх – оптическая плотность суспензии клеток до адгезии, измеренная при длине волны 540 нм; ОДфильтр – оптическая плотность суспензии клеток после адгезии. Носитель с адгезированными клетками отмывали 0,01 М калий-фосфатным буфером (рН 7,2±0,2) и хранили в течение 1–3 суток при температуре 4–10ºС. Операционную стабильность биокатализаторов на основе иммобилизованных клеток нитрилгидролизующих бактерий оценивали по сохранению нитрилгидратазной, нитрилазной и амидазной активностей при последовательном проведении реакции трансформации акрилонитрила или акриламида, вносимого в каждом цикле до концентрации 1,3 и 0,1 М соответственно. Для иммобилизованного ферментного препарата концентрация субстратов составила 0,58 и 0,05 М соответственно. Продолжительность нитрилгидратазной реакции – 10–20 минут, нитрилазной и амидазной – 24 ч. После проведения реакционного цикла биокатализаторы однократно отмывали 0,01 М калийфосфатным буфером и использовали в следующем цикле. В качестве контроля определяли операционную стабильность суспендированных клеток. Свободные клетки отделяли центрифугированием в течение 20 мин при 10000 g, ресуспендировали в 0,01 М калийфосфатном буфере, рН 7,2±0,2, повторно центрифугировали и использовали в следующем цикле. Получение белкового препарата, содержащего ферменты метаболизма нитрилов. Нитрилгидратазу выделяли из клеток R. ruber gt1, обладающего высокой нитрилгидратазной активностью, нитрилазу – из клеток P. fluorescens C2, обладающего нитрилазной активностью, амидазу – из R. rhodochrous 4–1, обладающего амидазной активностью. Биомассу центрифугировали 20 мин при 10500 g, отмывали клетки от среды и ресуспендировали в 10 мМ фосфатном буфере, pH 7,4, содержащем 44 мМ бутират натрия. Клетки для выделения нитрилгидратазы и амидазы разрушали десятикратной обработкой ультразвуком (УЗГ8-0,4/22, Россия) по 15 с, нитрилазы - семикратной по 20 с при частоте 22 кГц с охлаждением до 0–4°С. Гомогенат центрифугировали 20 мин при 10500 g и температуре 4°С, затем проводили фракционирование белка сульфатом аммония, последовательно доводя концентрацию до 35 и 60% от насыщающей. Количество белка в пробе определяли по методу Бредфорд. Амидазную и нитрилазную активность оценивали спектрофотометрически при 230 нм по возрастанию оптической плотности раствора в течение 1 мин после добавления субстрата акриламида, нитрилгидратазную - тем же способом с субстратом акрилонитрилом при 260 нм. 16 Адсорбционную иммобилизацию ферментов (нитрилгидратазы и нитрилазы) проводили при контакте раствора белка с носителем (немодифицированные оксиды алюминия и углеродсодержащие адсорбенты на их основе; карбонизированные материалы) в течение 24–168 ч в статических условиях при температуре 4–10ºС. Адсорбцию амидазы на углеродсодержащих носителях Сибуните и СУМС проводили при 22–25°С в течение 2 ч на шейкере со скоростью вращения 100 об/мин. Носитель с адсорбированным ферментным препаратом отмывали 0,01 М фосфатным буфером (pH 7,2±0,2) до исчезновения белка в промывных водах. Количество адсорбированного белка определяли по разности концентрации белка в суспензии до и после сорбции. Ковалентную иммобилизацию ферментов осуществляли методом ковалентной сшивки с активированным хитозаном. Готовили 2%-ный (вес/об.) раствор хитозана средней вязкости (“Sigma”, Япония) в 2%-ной (об./об.) уксусной кислоте и накапывали с помощью шприца для инъекций объемом 5 мл в 1 М раствор KOH. После затвердевания в течение 1 ч гранулы отмывали однократно 0,01 М калий-фосфатным буфером, рН 7,20,2. Полученные гранулы активировали 0,1%-ным раствором бензохинона (“Fluka”, Швейцария) в течение 15 мин в объемном соотношении гранул и активатора 1 : 1. Отмывали 3 раза фосфатным буфером, двукратно превышающим объем раствора бензохинона. Активированные гранулы смешивали с ферментным препаратом в объемном соотношении 2,5 : 1, после 40 мин инкубации при 22–25°С отмывали 3 раза фосфатным буфером, пятикратно превышающим объем раствора белка. Количество белка, связанного с активированным хитозаном, определяли по разности концентрации белка в растворе до и после контакта с носителем. Полученный иммобилизованный препарат хранили при температуре от 0 до +10°C. Поперечно-сшитые агрегаты фермента (ПСАФ) амидазы готовили фракционированием белка, выделенного при разрушении клеток R. rhodochrous 4–1, сульфатом аммония как описано выше, с одновременной обработкой 0,1% раствором глутарового альдегида либо 0,1% раствора бензохинона при температуре 22–25°С. Константу Михаэлиса-Ментен (КМ) и максимальную скорость ферментативной реакции (Vмакс.) вычисляли по графику зависимости активности от концентрации субстрата, построенному в двойных обратных координатах Лайнуивера-Берка. Для определения кинетических параметров реакции, катализируемой нитрилгидратазой, проводили трансформацию растворов НАК в диапазоне концентраций от 0,015 до 1,36 М в 1–5 мл 0,01 М калий-фосфатного буфера (рН 7,20,2) при 25°С в течение 10 мин, реакцию останавливали добавлением концентрированной HCl до конечной концентрации 5%, концентрацию образующегося акриламида определяли методом ВЭЖХ. Для определения кинетических параметров реакции, катализируемой нитрилазой, проводили реакции трансформации растворов НАК в диапазоне концентраций от 0,06 до 1,3 М в 1–5 мл 0,01 М калий-фосфатного буфера (рН 7,20,2) при 25°С в течение 40 мин, реакцию останавливали, 17 как описано выше. Для определения кинетических параметров реакции, катализируемой амидазой, проводили трансформацию раствора акриламида в диапазоне концентраций от 0,01 до 0,8 М в 1–5 мл калий-фосфатного буфера (рН 7,2 ± 0,2) при 25°С в течение 60 мин, реакцию останавливали, как описано выше. Термостабильность фермента определяли следующим образом: иммобилизованную и нативную нитрилгидратазу в 0,01 М калий-фосфатном буфере (рН 7,20,2) прогревали при 40, 50 и 60°С в течение 15, 30, 45 и 60 мин, резко охлаждали на ледяной бане и проводили реакцию трансформации 0,58 М раствора НАК при 22°С. Иммобилизованную и нативную амидазу в 0,01 М калий-фосфатном буфере (рН 7,2±0,2) прогревали при 50, 60 и 70°С в течение 15, 30, 45 и 60 мин, охлаждали на ледяной бане и проводили реакцию трансформации 0,05 М раствора акриламида при 25°С. Определяли нитрилгидратазную и амидазную активность, как описано выше. Константы термоинактивации фермента (Кин) вычисляли по графику зависимости натурального логарифма активности от времени экспозиции при данной температуре и выражали в обратных минутах (мин -1): Кин = tgα, где α – угол наклона прямой к оси X. Определение концентрации АТФ в клетках бактерий, адгезированных на углеродсодержащих адсорбентах. Экстракцию АТФ из суспендированных и иммобилизованных бактериальных клеток грамположительных и грамотрицательных бактерий проводили диметилсульфоксидом (ДМСО) (Ефременко, 2009). Для определения концентрации АТФ в адгезированных клетках к 200 мг углеродсодержащих носителей с клетками добавляли 2 мл ДМСО, через 15 мин экспозиции на льду жидкую фазу центрифугировали 2 мин при 15400 g и замораживали надосадочную жидкость. В качестве контроля концентрацию АТФ определяли в клетках суспензии. Для определения концентрации АТФ в клетках, находящихся в суспензии, 1 мл образца центрифугировали 5 мин при 15400 g, удаляли надосадочную жидкость и разрушали клетки 1 мл 90%-ного ДМСО в течение 15 мин на льду. Образцы замораживали и хранили при –18°С. Использовали стандартный набор реактивов ATP Bioluminescent Assay Kit (“Sigma”, США), образцы разводили в 10 раз, смешивали с люциферин-люциферазным реагентом в соотношении 1 : 1 и измеряли интенсивность свечения на планшетном ридере Tecan Infinite M200 pro (“Tecan”, Швейцария). Оценка биопленкообразования. В лунки полистерольного плоскодонного 96луночного планшета вносили среду N (150 мкл) и инокулировали суспензией нитрилутилизирующих бактерий (10 мкл, 2,0±0,2 x 108 КОЕ/мл). После 1–7 суток инкубации в термостате при 30°С планктонные клетки удаляли из лунок декантацией, отмывали биопленку 200 мкл калий-фосфатного буфера дважды и определяли биопленкообразование по методу окраски с кристаллическим фиолетовым с модификацией (Reisner et al., 2006; Peeters et al., 2008; O'Toole, 2011). Биопленку окрашивали 0,1% кристаллическим фиолетовым в течение 40 мин в темноте, удаляли 18 краситель, отмывали окрашенную биопленку 1 раз калий-фосфатным буфером и экстрагировали краситель 96% спиртом (200 мкл). Биопленкообразование оценивали по оптической плотности раствора красителя при 540 нм на планшетном ридере Tecan Infinite M200 pro (“Tecan”, Швейцария). Высокоэффективная жидкостная и газовая хроматография. Концентрацию алифатических нитрилов и амидов определяли методом ВЭЖХ на хроматографе LC-10 (“Shimadzu”, Япония) с колонкой Synergi 4u Hydro–RP 80A (250 × 4,6 мм). В качестве подвижной фазы использовали 25 мМ NaH2PO4, скорость потока составляла 0,75 мл/мин при 25°C, детекцию проводили при длине волны 200 нм. Также концентрацию алифатических нитрилов и амидов определяли методом ГХ на хроматографе GC-2014 (“Shimadzu”, Япония), оснащенном пламенно-ионизационным детектором. Хроматографическая колонка длиной 1 м и внутренним диаметром 3 мм была заполнена твердым носителем полисорб-1, фракция 0,25–0,5 мм (“Реахим”, Россия). Газ-носитель азот подавался с объемным расходом 35 см3/мин. Температура термостата составляла 1903С, температура испарителя 22010С. Концентрацию ароматических нитрилов и амидов определяли методом ВЭЖХ на колонке Luna 5u C 18(2) 100A (250 × 4,6 мм). В качестве подвижной фазы использовали 10 мМ KH2PO4 и 25% ацетонитрила, скорость потока составляла 0,5 мл/мин при температуре 25°C, детекцию проводили при длине волны 200 нм. Концентрацию фенилгилицинонитрила и D-, L-фенилглицина определяли на колонке CROWNPAK® CR(-). В качестве элюента использовали раствор HClO4 (pH 2,0) и 10% метанола, скорость потока составляла 0,300 мл/мин при 30°C, детекцию проводили при длине волны 210 нм. Статистический анализ проводили с помощью стандартных пакетов лицензионных программ MS Excel 2003 и Statistica. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ Глава 3. Биокатализ нитрилов и амидов карбоновых кислот адгезированными бактериальными клетками Глава 3 посвящена изучению свойств гетерогенных биокатализаторов гидролиза нитрилов и амидов карбоновых кислот на основе клеток нитрилгидролизующих бактерий, адгезированных на углеродсодержащих материалах и каолине. Изучен процесс адгезии бактериальных клеток с различным строением и гидрофобно-гидрофильными характеристиками клеточной стенки на носителях, различающихся пористостью, дисперсностью, гидрофобностью и шероховатостью поверхности. Адгезия клеток к углеродсодержащим носителям визуализирована в электронном сканирующем микроскопе (Рисунок 1). 19 а а Рисунок 1- Адгезия клеток R. erythropolis 11–2 на БАУ (а) и угле-сырце (б) б На первом этапе изучали зависимость массы адгезированных клеток от концентрации клеток в суспензии. Следует отметить, что родококки адгезировались на всех изученных углеродных материалах, вне зависимости от степени гидрофобности носителя, оцененной по адсорбции нафталина. Исходя из данных адсорбции гидрофобного нафталина на изученных носителях, наиболее гидрофобной является активированная углеродная ткань Карбопон-В-актив и активный уголь Norit PK 1-3, не адсорбирует нафталин массивный КВУ, а минимальная адсорбция этого вещества наблюдается на пеностекле со слоем каталитического волокнистого углерода. Корреляционный анализ (n=14) выявил статистически значимую положительную связь между гидрофобностью адсорбента и величиной адсорбции клеток родококков, имеющих гидрофобную клеточную стенку (r=0,679; p=0,05). Корреляция в данном случае может быть оценена как умеренная. Таблица 1 - Масса адгезированных клеток штаммов, различающихся гидрофобностью клеточной стенки, на углеродсодержащих носителях (M±m) Штаммы Pseudomonas fluorescens C2 Acinetobacter guillouiae 11h Alcaligenes faecalis 2 Rhodococcus erythropolis 11-2 гидрофобность клеток, % 5,9±1,8 4,8±2,3 18,5±4,5 41,1±8,2 носители гидрофобность носителей, % БАУ Norit PK1-3 ФТД ФАС 65,9±4,5 91,9±6,0 60,4±4,4 54,6±8,9 1,74±0,30 3,26±0,40 0,03±0,02 1,60±0,32 2,29±0,48 0,12±0,03 3,48±0,30 0,62±0,13 3,86±0,92 2,87±0,55 3,48±0,06 2,37±0,79 7,92±0,50 14,45±0,81 8,10±1,12 12,93±0,36 СУМС Сибунит «Сапропель» 36,5±6,2 46,0±2,2 20,8±1,0 4,77±0,17 9,25±0,78 11,55±0,07 1,07±0,27 6,00±0,28 9,68±0,04 3,65±0,25 12,95±0,49 15,15±0,78 15,20±0,80 36,55±0,42 37,30±0,64 Масса адгезированных клеток, мг/г Примечание: концентрация исходной клеточной суспензии 0,8–1 мг/мл 20 Изучали корреляцию массы адгезированных клеток Pseudomonas fluorescens C2 (гидрофобность поверхности, определенная по BACH-тесту, 5,9%), Acinetobacter guillouiae 11h (4,8%), Alcaligenes faecalis 2 (18,5%), Rhodococcus erythropolis 11-2 (41,1%) с гидрофобностью носителей. Так, для штамма Pseudomonas fluorescens C2, поверхность клеток которого была оценена как гидрофильная, отмечали умеренную отрицательную связь между массой адгезированных клеток и гидрофобностью носителей (r= –0,664; p=0,05), что может быть объяснено тем, что все носители в той или иной мере были гидрофобны (от 20 до 92%). В то же время, для других штаммов распределение признаков было отличным от нормального, а корреляция была недостоверной. Это может быть связано с тем, что на адгезию влияют и другие свойства носителей, а именно дисперсность, удельная поверхность и размер макропор. Однако, при оценке зависимости массы адгезированных клеток изученных штаммов, отличающихся гидрофобностью поверхности, на каждом из изученных углеродсодержащих носителей, была выявлена сильная положительная связь от r=0,884 до r=0,950 (p=0,05). Это может свидетельствовать о том, что масса адгезированных клеток на гидрофобном носителе тем выше, чем больше гидрофобность их поверхности. Корреляционный анализ (n=14) выявил слабую положительную связь между массой адгезированных клеток и дисперсностью носителей (r=0,220; p=0,05), что говорит о том, что эта характеристика не является определяющей для адгезии клеток. Только при сравнении носителей одной марки, но разной дисперсности (порошкообразный и дробленый уголь сырец) можно утверждать, что на материале с более высокой дисперсностью адгезируется больше клеток (в среднем 12,5 и 7,38 мг сухих клеток / г носителя соответственно). На основании того, что неспецифическая адсорбция предшествует адгезии бактериальных клеток, зависимость количества адгезированных клеток от их концентрации в суспензии была представлена в виде изотерм адсорбции. Изотермы адсорбции клеток родококков на композиционных углерод-минеральных и волокнистых углеродных носителях имели вид изотерм Лэнгмюра, что подтверждало образование монослоя на поверхности носителя (Рисунок 2, а); на активном угле БАУ – вид изотерм Брунауэра, Эммета, Теллера (БЭТ), что предполагало формирование полислоя клеток на поверхности носителя (Рисунок 2, б). 21 Масса адгезированных клеток, мг/г 2 16 12 8 70 1 3 4 Масса адгезированных клеток, мг/г (а) 20 (б) 60 50 40 30 20 10 0 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 Концентрация клеток в суспензии, мг/мл 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4 4,5 Концентрация клеток в суспензии, мг/мл Рисунок 2 – Изотермы адсорбции клеток R. ruber gt1 (а) на углеродных волокнистых материалах: 1 – Карбопон–B–актив, 2 – Карбопон, 3 – Урал ТМ–4 и R. erythropolis 11-2 (б) на БАУ Определена эффективность иммобилизованной системы (η), выраженная как отношение ферментативной активности адгезированных клеток к активности клеток в суспензии (Таблица 2). Показано, что в подавляющем большинстве случаев при конверсии алифатического субстрата η была больше 1. Это означает, что активность иммобилизованных клеток не только сохранялась, но и увеличивалась по сравнению с интактными. Отмечено, что только для носителей Карбопон-В-актив, Керамзит/графитоподобный слой и Шунгит η была меньше 1. По убыванию показателей η и n составлен интегративный ряд от наиболее к наименее предпочтительному адсорбенту в данном процессе: Керамзит/КВУ (6,47% С) > уголь-сырец > БАУ > ФТД > Norit PK 1-3 > «Сапропель» > Керамзит/КВУ (3,63% С) > Сибунит = ФАС > Карбопон > Урал ТМ4 > КВУ массивный > Карбопон-В-актив > Керамзит/графитоподобный слой. Шунгит вследствие низкой активности адгезированных на нем клеток не учитывали при составлении интегративного ряда. Таким образом, наилучшим адсорбентом, сочетающим в себе максимальные значения η и n, был керамзит с синтезированным на поверхности слоем КВУ с содержанием С до 6,47 вес%. Такие адсорбенты, как активные угли БАУ, Norit PK 1-3, ФТД и неактивированный порошкообразный уголь-сырец как по значению η, так и по значению n занимали промежуточное положение, что, наряду с анализом массы адгезированных клеток, подтверждает эффективность их использования в качестве носителей клеток, обладающих гидрофобной клеточной стенкой. Наихудшие результаты, как по значению η, так и по значению n были получены для керамзита с синтезированным на поверхности гладким графитоподобным слоем, что, в свою очередь, указывает на неэффективность такого адсорбента, по-видимому, обусловленную гладкой поверхностью и отсутствием макропор. 22 Таблица 2 – Эффективность функционирования иммобилизованной системы (η) и стабильность гетерогенных биокатализаторов на основе клеток R. ruber gt1, адгезированных на углеродсодержащих носителях Носитель [S], M η n БАУ Norit PK 1-3 ФТД 1,04 1,63 0,97 1,41 1,35 1,42 8 8 7 уголь-сырец Урал ТМ-4 0,77 1,25 1,43 1,15 8 7 Карбопон Карбопон-В-актив 0,97 1,13 1,28 0,81 7 5 ФАС 1,21 1,42 7 Массивный КВУ 0,86 1,23 7 Керамзит/графитоподобный слой 1,30 0,57 2 Керамзит/КВУ-слой (6,47 вес%) 0,90 2,28 8 Керамзит/КВУ-слой (2,84 – 3,63 вес%) 0,90 1,84 6 Сибунит 1,13 2,35 2 «Сапропель» 0,05 2,85 3 Шунгит 1,30 0,11 10 Примечание: [S] – концентрация раствора акрилонитрила, при которой наблюдается максимальная активность адгезированных клеток; n – количество циклов, в которых сохраняется 50% активности гетерогенного биокатализатора; η суспензии клеток принято за 1. Было отмечено, что нитрилазная активность штамма P. fluorescens С2, как и нитрилгидратазная R. ruber gt 1, возрастала у адгезированных клеток по сравнению с суспендированными. В зависимости от носителя активность возрастала: при адгезии на углеродной ткани Урал ТМ-4 – в 7,4 раза (до 2,6 мкмоль/мг/мин), на Карбопон-В-актив – в 2 раза (до 0,7 мкмоль/мг/мин) при исходной активности суспендированных клеток 0,35 мкмоль/мг/мин. Такое увеличение ферментативной активности наблюдалось лишь при высоких концентрациях вносимого субстрата (9–10 об.%), значительно превышающих технологические концентрации (2%), разработанные для проведения синтеза карбоновых кислот и амидов суспендированной биомассой. Показано, что при адгезии на различных фракциях угля-сырца клеток P. fluorescens C2, обладающих нитрилазой, и R. erythropolis 11-2 с амидазной активностью существует 23 обратная зависимость между массой адгезированных клеток и удельной активностью внутриклеточного фермента. Так, отмечена сильная отрицательная связь между этими показателями (R = –0,886; p = 0,02). Подобной зависимости не наблюдается при адгезии клеток R. ruber gt1, нитрилгидратаза которых обладает активностью, на порядок и более превышающей нитрилазную и амидазную активность. 250 40 200 30 150 20 100 10 50 0 0 ПС ФрС1 ФрС2 1 800 (б) 12 700 2 600 10 500 8 400 6 300 4 200 2 100 0 Удельная нитрилазная активность, ммоль/г/ч 300 2 Удельная амидазная активность, ммоль/г/ч Масса адгезированных клеток, мг/г 50 14 350 1 Масса адгезированных клеток, мг/г (а) 60 0 ПС ФрС1 ФрС2 Рисунок 3 – Зависимость удельной амидазной активности R. erythropolis 11-2 (а) и удельной нитрилазной активности P. fluorescens C2 (б) от массы адгезированных на различных фракциях угля-сырца (ПС – порошкообразный, ФрС1 – фракция с размером частиц 1–6 мм, ФрС2 – фракция с размером частиц 3–10 мм) клеток: 1 – масса адгезированных клеток, 2 – активность Операционную стабильность гетерогенных биокатализаторов на основе адгезированных клеток R. ruber gt1 сравнивали с таковой суспензии клеток. Показано, что 50% первоначальной активности терялось уже во 2 цикле трансформации 1,3 М раствора НАК, а к 7 циклу оставалась не более 3% нитрилгидратазной активности. Следовательно, гетерогенный процесс значительно стабилизирует ферментативную активность и дает возможность многократного использования биокатализатора. Изучено взаимодействие бактериальных клеток с нанообъектами – многослойными углеродными нанотрубками (МУНТ). Методом сканирующей электронной микроскопии показано, что в присутствии МУНТ бактериальные клетки образуют агрегаты, а углеродные нанотрубки адсорбируются на поверхности отдельных клеток и их агрегатов (Рисунок 4). Характер взаимодействия не зависит от типа клеточной стенки и одинаков как для грамположительных (R. ruber gt1, R. erythropolis 11–2), так и для грамотрицательных (A. faecalis 2) бактерий. Экспериментально подтверждено, что агрегаты клеток бактерий с нанотрубками представляют собой гетерогенный биокатализатор и легко отделяются от реакционной среды фильтрованием через бумажный фильтр «красная лента». Определена концентрация бактериальных клеток, сорбируемая неочищенными и очищенными нанотрубками. Показано, что как грамположительные (R. ruber gt1, R. erythropolis 11–2), так и грамотрицательные (P. fluorescens C2, A. faecalis 2) бактерии лучше связываются неочищенными нанотрубками, причем процент связывания наиболее высок для клеток R. 24 erythropolis 11–2 – 94 и 88% соответственно, и ниже для P. fluorescens C2 – 58 и 37% соответственно (Рисунок 5). а б 1 а а 3 Концентрация клеток, мг/г 2 500 450 400 350 300 250 200 150 100 50 0 Рисунок 5 – Концентрация клеток (мг/г), сорбируемая очищенными (1) и неочищенными (2) углеродными нанотрубками 2 1 P.fluorescens C2 Рисунок 4 – Агрегация клеток R. erythropolis 11–2 (а) и A. faecalis 2 (б) в присутствии нанотрубок: 1 – МУНТ, 2 – клеточные агрегаты, 3 – отдельные клетки, покрытые нанотрубками A. faecalis 2 R. ruber gt1 R. erythropolis 11-2 Показано, что при трансформации акрилонитрила до акриламида у клеток R. ruber gt1, агрегированных с очищенными МУНТ, нитрилгидратазная активность незначительно снижается по сравнению с активностью суспензии, тогда как у клеток, агрегированных с неочищенными МУНТ, падает и составляет не более 2% от исходной активности. При конверсии 3-цианопиридина до никотинамида агрегаты клеток с очищенными МУНТ проявляют активность, равную активности суспензии, а при связывании с неочищенными МУНТ сохраняется 33% первоначальной активности интактных клеток. При трансформации 0,1 М раствора акриламида до акриловой кислоты клетками R. erythropolis 11-2, агрегированными с очищенными и неочищенными МУНТ, удельная амидазная активность составляет 55 и 14% исходной активности интактных клеток соответственно. У A. faecalis 2 активность агрегатов клеток с очищенными МУНТ достигает активности интактных клеток, а с неочищенными нанотрубками снижается в 10 раз. Таким образом, для получения гетерогенного биокатализатора на основе бактериальных клеток носителями могут служить не только адсорбенты, дисперсность которых превышает размеры бактерий, но и наноматериалы. В этом случае характер взаимодействия клетка–носитель качественно иной – клетки не адгезируются к поверхности носителя, а формируют агрегаты, покрытые наноразмерными объектами. Несмотря на то, что с неочищенными МУНТ связывается больше клеток, чем с 25 очищенными, для создания гетерогенного биокатализатора нанотрубок от примесей катализатора. Необходимость требуется очистки очистка обусловливается значительным снижением ферментативной активности клеточных агрегатов, которая обнаружена и при функционировании различных ферментов (нитрилгидратаза R. ruber gt1 и амидаза R. erythropolis 11-2 и A. faecalis 2), и при трансформации различных субстратов (алифатический акрилонитрил ферментативной активности и ароматический может являться 3-цианопиридин). следствием Снижение нарушения либо жизнеспособности клетки в целом, либо транспортной системы, ассоциированной с клеточными мембранами, а также происходить в результате затруднения массообмена клетки с окружающей средой, создаваемого адгезированными к клеточной поверхности нанотрубками. Установленный факт отрицательного влияния на бактериальные клетки технологических примесей в составе наноматериалов согласуется с литературными данными (Дерябин и др., 2010). Изучена конверсия ароматических нитрильных соединений – цианопиридинов адгезированными клетками нитрилгидролизующих бактерий. Активность гомогенного и гетерогенного биокатализаторов показана в таблице 3. Динамика трансформации ароматических нитрильных соединений – 2, 3, 4-цианопиридинов клетками R. ruber gt1, адгезированными на активированных (БАУ, Карбопон-В-актив и активированный «Сапропель») и неактивированных (уголь-сырец и Урал ТМ-4) углеродных адсорбентах показала, что к 120 мин реакции, катализируемой иммобилизованными на активированных носителях клетками, 3-цианопиридин практически полностью удаляется из среды, но при этом не происходит эквимолярной конверсии субстрата в продукт за счет адсорбции большей части продукта на активированных носителях. Таблица 3 – Активность свободносуспендированных и адгезированных клеток нитрилгидролизующих бактерий по отношению к 2- и 4-цианопиридину, ммоль/г/ч 2-цианопиридин 4-цианопиридин R. ruber gt1, нитрилгидратазная активность суспензия клетки, адгезированные на угле-сырце 887,70±106,43 803,70±53,51 460,20±84,74 702,40±25,49 P. fluorescens C2, нитрилазная активность суспензия клетки, адгезированные на каолине 8,81±1,18 19,63±1,65 5,35±1,37 21,53±3,32 Изучена стереоселективная трансформация нитрилов и амидов адгезированными клетками нитрилгидролизующих бактерий. Клетки P. fluorescens С2, адгезированные на 26 углеродсодержащих носителях Сибунит и «Сапропель», конвертировали 10 мМ раствор фенилглицинонитрила в D- и L-фенилглицин (Рисунок 6). Активность нитрилазы суспендированных и адгезированных на Сибуните и «Сапропеле» клеток при конверсии этого субстрата составила 1,57±0,42; 0,86±0,55 и 3,14±1,82 ммоль/г/ч соответственно. Показано, что при часовой конверсии фенилглицинонитрила клетками, иммобилизованными на Сибуните, энантиомерный избыток (ee) L-изомера составляет 54%, тогда как при продолжительности реакции 20 ч увеличивается до 96%. В случае клеток псевдомонад, адгезированных на «Сапропеле», при часовой конверсии ee Lизомера составляет 30%, но при увеличении времени протекания реакции до 20 ч смещается в сторону выхода D-изомера, ee которого к этому времени достигает 78%. В качестве контроля реакцию проводили суспендированными клетками, и в этом случае стереоселективность реакции мало изменялась во времени, а ee L-фенилглицина составлял 50–68%. Такое изменение энантиомерного избытка одного из образующихся изомеров может быть связано с природой носителя, используемого для адгезии клеток. Выдвинута гипотеза, по которой изменение рН в микроокружении адсорбента может влиять на взаимопревращения уже образовавшихся изомеров. Этим может объясняться влияние длительности реакции (длительности контакта реакционной среды с носителем) на энантиомерный избыток одного из стереоизомеров фенилглицина. "Сапропель", 1 ч Сибунит, 1 ч D Суспензия, 1 ч D D (65±2)% (77±7)% L L L "Сапропель", 20 ч Сибунит, 20 ч D L (89±1)% (98±2)% L (75±10)% D Суспензия, 20 ч D (84±2)% L Рисунок 6 – Соотношение изомеров D- и L-фенилглицина при гидролизе фенилглицинонитрила суспендированными и адгезированными на Сибуните и «Сапропеле» клетками P. fluorescens С2 27 Для того, чтобы оценить влияние адгезии стереоселективность амидазы, проводили реакцию клеток родококков трансформации на рацемического лактамида. Суспендированные клетки R. erythropolis 6–2 и R. rhodochrous 4–1 гидролизовали лактамид до D- и L-молочной кислоты с соотношением энантиомеров 76 к 24% и 62 к 38% соответственно. При иммобилизации клеток R. erythropolis 6–2 на БАУ мольная доля D-изомера составляла 70%, тогда как адгезированные клетки R. rhodochrous 4–1 гидролизовали лактамид без стереоселективности. В данном случае причина снижения оптической чистоты образующейся молочной кислоты при гидролизе адгезированными клетками, по-видимому, была связана не с изменением скорости образования изомеров, а с присутствием носителя, приводящем к рацемизации. Действительно, контакт с БАУ D- и L-изомеров молочной кислоты в соотношении 4:1 в течение 1 ч при 22ºС приводил к смещению этого соотношения в сторону преобладания L-изомера. Глава 4. Биокатализ нитрилов и амидов биопленками нитрилутилизирующих бактерий Глава 4 посвящена изучению свойств гетерогенного биокатализатора гидролиза нитрилов и амидов на основе биопленок нитрилутилизирующих бактерий, полученного в процессе культивирования клеток в присутствии нерастворимых материалов. В качестве носителей для получения биопленок бактерий были выбраны углеродные волокнистые материалы, такие как карбонизированная ткань Урал ТМ-4, нетканый волокнистый материал Карбопон (Рисунок 7), активированный нетканый материал Карбопон-В-актив и полиэтиленовая пленка. б 2 1 Рисунок 7 биопленка P. fluorescens С2 (а) и R. ruber gt1 (б) на Карбопоне: 1 - биопленка, 2 - волокно Чтобы оценить влияние адгезии клеток на содержание в них АТФ, клетки R. ruber gt1 и P. fluorescens C2 были выращены в суспензии до стационарной фазы и инкубированы с углеродсодержащими носителями. Показано, что концентрация АТФ в клетках после адгезии в подавляющем большинстве случаев снижается на порядок и более (Таблица 4). 28 Таблица 4 – Влияние адгезии на углеродсодержащих носителях на концентрацию АТФ в клетках R. ruber gt1 и P. fluorescens C2 Rhodococcus ruber gt1 Марка носителей суспендированные клетки Pseudomonas fluorescens C2 адгезированные клетки суспендированные клетки адгезированные клетки [АТФ], нМ/мг Урал ТМ-4 1,071 ± 0,484 0,049 ± 0,035 0,144 ± 0,018 0,105 ± 0,044 БАУ 1,071 ± 0,484 0,020 ± 0,011 0,144 ± 0,018 0,039 ± 0,011 Сибунит 1,071 ± 0,484 0,003 ± 0,001 0,144 ± 0,018 0,032 ± 0,006 «Сапропель» 1,071 ± 0,484 0,002 ± 0,001 0,144 ± 0,018 0,006 ± 0,004 Сравнивали продуктивность биопленок, выращенных на различных носителях, при трансформации НАК и 3-цианопиридина. Показано, что наибольшее количество продукта (АК, НК, АА, НА) синтезируют биопленки P. fluorescens C2 и R. ruber gt1, выращенные на полиэтилене (Таблица 5). Также от этих значений достоверно не отличается продуктивность выращенных на носителе Урал ТМ-4 биопленок P. fluorescens C2 при синтезе АК и биопленок R. ruber gt1 при синтезе НА. Минимальные количества продукта получены при использовании в качестве биокатализатора биопленок нитрилгидролизующих бактерий, выращенных на носителе Карбопон-В-актив, что, возможно, связано с его адсорбцией на этом активированном носителе. Таблица 5 – Образование продуктов трансформации акрилонитрила и 3-цианопиридина биопленками нитрилгидролизующих бактерий, выращенными на носителях P. fluorescens C2 Носители t, мин R. ruber gt1 продукт, мг/г(дм2)* АК НК 1440 487,6±82,0 126,3±6,2 1440 532,1±17,2 68,4±5,6 Карбопон-Вактив 1440 362,2±40,1 Карбопон 1440 413,2±128,4 Полиэтилен Урал ТМ-4 t, мин продукт, мг/г(дм2)* АА НА 120 1046,8±113,0 186,8±58,6 120 519,5±8,7 213,3±7,6 50,6±8,0 120 317,2±82,7 81,8±18,1 87,6±10,7 120 614,2±86,6 130,5±15,0 Примечание: *количество образуемого продукта при катализе биопленкой, выращенной на полиэтилене, рассчитано на дм2 29 Изучено влияние акрилонитрила (НАК), акриламида (АА) и акриловой кислоты (АК) на клетки четырехсуточной культуры R. ruber gt1 и P. fluorescens C2, находящиеся в суспензии и в биопленке. Показано, что при 20-минутном воздействии 1,7 М раствора АА на планктонные клетки R. ruber gt1 происходит падение содержания АТФ в клетках более чем в половину от контроля, тогда как концентрация АТФ в клетках биопленки достоверно возрастает (Рисунок 8, а). Раствор НАК в концентрации 1,3 М не приводит к достоверному снижению содержания АТФ в клетках планктона, тогда как в клетках биопленки оно значительно (более чем в 2 раза) возрастает. Падение содержания АТФ в планктонных клетках при воздействии высоких концентраций АА может быть связано со снижением их жизнеспособности, тогда как возрастание в клетках биопленки может свидетельствовать о большей адаптивной способности, которая проявляется в стрессовом состоянии. При воздействии НАК на клетки следует учитывать, что одновременно начинается его гидролиз, сопровождающийся накоплением АА, таким образом, воздействие становится многофакторным, включающим влияние токсичного субстрата и продукта. (а) контроль 6 (б) АА 1,7 М НАК 1,3 М 10 8 6 4 2 0 планктон биопленка Концентрация АТФ, пикоМ/лунку Концентрация АТФ, пикоМ/лунку 12 5 контроль НАК 1,3 М АК 1,3 М 4 3 2 1 0 планктон биопленка Рисунок 8 - Влияние 20-минутного воздействия 1,7 М раствора акриламида (АА) / 1,3 М раствора акриловой кислоты (АК) и 1,3 М раствора акрилонитрила (НАК) на содержание АТФ в клетках планктона и биопленки R. ruber gt1 (а) и P. fluorescens C2 (б) При воздействии 1,3 М раствора АК происходит резкое падение концентрации АТФ как в клетках планктона, так и в клетках биопленки P. fluorescens C2, вероятно, связанное с закислением среды, которое приводит к гибели клеток (Рисунок 8, б). НАК в концентрации 1,3 М приводит к 50%-му снижению содержания АТФ в планктонных клетках, тогда как в клетках биопленки оно не изменяется по сравнению с контролем. Следовательно, физиологическое состояние клеток биопленок нитрилгидролизующих бактерий существенно отличается от планктонного состояния. Биопленки как R. ruber gt1, так и P. fluorescens C2 более устойчивы к воздействию высоких концентраций токсичных субстратов и продуктов и обладают большими адаптивными способностями, чем планктонные клетки. 30 Глава 5. Гетерогенные биокатализаторы трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот на основе иммобилизованных бактериальных ферментов метаболизма нитрилов Глава 5 посвящена изучению каталитических свойств адсорбированных и ковалентно присоединенных к носителю ферментов метаболизма нитрилов, выделенных из клеток нитрилгидролизующих бактерий. Нитрилгидратаза, выделенная из R. ruber gt1, была иммобилизована на немодифицированных оксидах алюминия и углеродсодержащих адсорбентах, в том числе на углеродном носителе Сибуните. Изучена активность и операционная стабильность адсорбированной нитрилгидратазы в реакции трансформации акрилонитрила в акриламид. Установлено, что величина адсорбции белка на углеродсодержащих носителях выше, чем на немодифицированных оксидах алюминия. Очевидно, что присутствие углерода в составе адсорбента увеличивает его способность связывать фермент. Максимальная величина адсорбции составляет 8–9 мг/г. Определена ферментативная активность иммобилизованной нитрилгидратазы. Было обнаружено, что при иммобилизации на углеродсодержащих адсорбентах С/Al2O3-I, II, III нитрилгидратаза сохраняла не более 2% от первоначальной активности фермента в растворе, равной 300 мкмоль/мг/мин, тогда как на носителях без углерода фермент сохранял 6–10% исходной активности. Это может быть объяснено либо менее плотным строением адсорбционного слоя на исходных оксидах алюминия по сравнению с углеродсодержащими носителями, либо меньшей деформацией молекулы фермента при взаимодействии с полярной гидрофильной поверхностью Al2O3. Таким образом, при выборе адсорбента для иммобилизации нитрилгидратазы важно придерживаться оптимальной массовой доли углерода в составе неорганического носителя, поскольку повышение содержания углерода приводит к возрастанию количества адсорбированного фермента, но одновременно и к снижению его активности. Также была изучена термостабильность иммобилизованной нитрилгидратазы. Иммобилизованная нитрилгидратаза проявляла максимальную активность при 30–40°С. При 70°С нитрилгидратаза в растворе и в иммобилизованном состоянии на немодифицированных и углеродсодержащих оксидах алюминия сохраняла соответственно 2,7; 30 и 17,5% максимальной активности. Следовательно, адсорбция на неорганических носителях повышает термостабильность нитрилгидратазы на порядок. Исследованы каталитические свойства нитрилгидратазы, изолированной из штамма R. ruber gt1 и иммобилизованной методом ковалентной сшивки с хитозаном, активированным 0,1%-ным раствором бензохинона. Определено, что с активированным хитозаном за 20 мин контакта связывается до 70% нативного белка. Определены кинетические параметры реакции гидратации акрилонитрила, катализируемой иммобилизованной нитрилгидратазой и ферментом в растворе. 31 Определены константы термоинактивации иммобилизованной нитрилгидратазы и фермента в растворе (Таблица 6). Показано, что ковалентно иммобилизованная нитрилгидратаза более термостабильна, чем находящаяся в растворе. Наиболее вероятно, что увеличение термостабильности связано с тем, что ковалентная сшивка фермента с носителем предотвращает диссоциацию фермента на субъединицы, происходящую при повышении температуры, а также усиливает общую жесткость молекулы фермента, приводя к его стабилизации. Таблица 6 – Каталитические свойства свободной и иммобилизованной нитрилгидратазы Кин, мин-1 Нитрилгидратаза КМ, моль/л Vмакс., мкмоль/ мг/мин В растворе 0,410,15 50 6,6 х 10-3 2,7 х 10-2 1,4 х 10-1 Иммобилизованная 0,420,05 50 2,2 х 10-3 2,4 х 10-2 1,0 х 10-1 40°С 50°С 60°С Показано, что нитрилгидратаза, иммобилизованная на хитозане, проявляет активность при более низких значениях рН, чем фермент в растворе, который инактивируется при рН<4,0 (Рисунок 9, а). Оптимум рН для нитрилгидратазы в растворе более узкий и находится в нейтральной области, тогда как ковалентно связанный фермент проявляет активность, близкую к максимальной, в более широком диапазоне рН – от 5,0 до 7,0. В щелочном диапазоне рН>10,0 инактивируется и свободный, и иммобилизованный фермент. Подобный эффект влияния рН на активность иммобилизованной нитрилгидратазы можно объяснить природой носителя – хитозана. В данном случае рН в макроокружении фермента, где происходят измерения, отличается от рН микроокружения фермента, на которое оказывает воздействие носитель. Большое количество свободных аминогрупп в молекуле хитозана определяет его свойство связывать ионы водорода и приобретать избыточный положительный заряд (Krajewska, 2004; Ковалева и др., 2010). Т.к. поликатионы обычно отталкивают протоны, то вблизи фермента рН будет выше, чем в свободном растворе, следовательно, рН-диапазон работы фермента расширится в сторону более низких значений. При проведении последовательных циклов конверсии акрилонитрила была выявлена высокая операционная стабильность иммобилизованной нитрилгидратазы (Рисунок 9, б). Во втором и нескольких последующих (до 6) циклах реакции было отмечено возрастание нитрилгидратазной активности в 18 раз по сравнению с первым циклом, затем постепенное снижение активности, которая в 50 цикле была в 3,5 раза выше, чем в первом. Стабильность иммобилизованного фермента при повторном многократном использовании можно объяснить жестким фиксированием его молекулы на носителе, предотвращающим 32 диссоциацию фермента гетеромера из носителя и также потерю структуры не происходило субъединиц. благодаря Вымывание ковалентным связям, образованным между его молекулой, бифункциональным реагентом и хитозаном. Для объяснения эффекта возрастания нитрилгидратазной активности были проведены эксперименты по адсорбции продукта реакции – акриламида на активированном хитозане с иммобилизованным на нем белком. Определено, что из 1%-ного (вес/об.) раствора акриламида адсорбируется 25% вещества. Из этого можно сделать вывод, что повышение концентрации акриламида во втором цикле реакции связано не только с повышением активности, но и со снижением величины адсорбции продукта за счет взаимодействия с амидом части реакционноспособных групп хитозана в предыдущем цикле. Т.к. для объяснения 18-кратного возрастания активности с 1 по 6 цикл этого недостаточно, можно высказать предположение, что дробное введение субстрата в реакционную среду вызывало (а) Удельная нитрилгидратазная активность, мкмоль/мг/мин Сохранение активности, % адаптацию каталитического центра фермента к данному субстрату, приводя к увеличению скорости фермент-субстратных взаимодействий. 100 80 1 60 40 2 20 0 2 3 4 5 6 рН 7 8 9 10 11 (б) 160 120 80 1 40 0 1 5 9 13 17 21 25 29 33 37 41 45 49 53 Циклы Рисунок 9 - Влияние рН на активность нитрилгидратазы, ковалентно связанной с активированным хитозаном (а), и ее операционная стабильность (б): 1 иммобилизованный фермент, 2 - фермент в растворе. 100% - максимальная активность иммобилизованной и свободной нитрилгидратазы соответственно Из клеток P. fluorescens C2 был получен частично очищенный препарат нитрилазы, который иммобилизовали методом адсорбции на углеродном носителе «Сапропель». Была определена величина адсорбции нитрилазы на этом носителе. Установлено, что величина адсорбции белка на «Сапропеле» возрастает с увеличением его концентрации в среде. Так, при исходной концентрации белка 0,55 мг/мл адсорбировалось 2,11 мг белка на 1 г носителя, а при 9 мг/мл – 16 мг/г соответственно. При этом концентрация белка в растворе выше 9 мг/мл приводила к резкому повышению величины адсорбции, что свидетельствует о процессах полислойной адсорбции молекул фермента при достижении данных концентраций. По своему типу изотерма адсорбции была близка к изотерме БЭТ. При проведении трансформации 0,59 М раствора НАК при различной температуре (10–80˚С) в течение 40 мин максимальная активность нитрилазы в растворе была отмечена 33 при 50˚С, а к 70˚С происходила полная инактивация фермента (Рисунок 10, а). Активность фермента, иммобилизованного на «Сапропеле», достигала максимума при 60˚С, при этом нитрилаза сохраняла около 20% активности даже при 80˚С. Нитрилазы так же, как нитрилгидратазы, имеют субъединичную структуру, но в отличие от последних представляют собой гомоолигомультимеры. Первым этапом инактивации также является диссоциация на субъединицы, которая увеличивается при повышении температуры. В этом случае адсорбция на нерастворимом носителе оказывает защитное действие на фермент, Сохранение активности, % стабилизирует его структуру и позволяет ферменту функционировать при более высоких температурах. (а) 100 1 80 2 60 40 20 0 10 20 30 40 50 60 Температура, ºС 70 80 Рисунок 10 - Влияние температуры (а) и рН (б) на активность нитрилазы в растворе (1) и адсорбированной на Сапропеле (2). 100% - максимальная активность иммобилизованной и свободной нитрилазы соответственно При изучении зависимости активности нитрилазы от рН реакционной среды отмечено, что нитрилаза в растворе при рН 3 была неактивна, а максимум активности наблюдался при рН 10. Нитрилаза, адсорбированная на «Сапропеле», сохраняла 15% активности при рН 3, а максимум активности приходился на рН 8. В сильнощелочной реакционной среде при рН выше 12,5 активность и растворенной, и иммобилизованной нитрилазы была минимальной (Рисунок 10, б). Сдвиг активности иммобилизованной нитрилазы в кислую сторону, возможно, связан с разницей рН микро- и макроокружения фермента. Можно выдвинуть предположение, что носитель «Сапропель», являющийся карбонизированными органическими иловыми осадками пресных озер, защелачивает микроокружение, в котором находится адсорбированный фермент, за счет присутствия ионов Na+ , Mg2+, Ca2+ в составе носителя, в результате чего сдвиг рН макроокружения в кислую сторону не оказывает ингибирующего воздействия на нитрилазу. Изучена активность препарата нитрилазы, иммобилизованного на активированных и немодифицированных хитозановых гранулах, в реакции трансформации акрилонитрила. Показано, что при иммобилизации на хитозане наблюдается снижение нитрилазной активности. 34 Изучено влияние температуры на активность нитрилазы, связанной с хитозаном, и фермента в растворе. Показано, что как иммобилизованная нитрилаза, так и фермент в растворе имеет максимум активности при 60ºС (Рисунок 11, а). При температуре 70ºС наблюдается снижение активности у неиммобилизованного фермента на 73%, у связанного с активированным и неактивированным хитозаном – на 36 и 60% соответственно. Ковалентная сшивка с активированным хитозаном обеспечивает бóльшую стабильность фермента при воздействии высоких температур, предотвращая диссоциацию на субъединицы, тогда как адсорбция на неактивированном хитозане обеспечивает меньшую термостабильность фермента, чем ковалентная сшивка, но бóльшую, чем в растворе. (б) 200 80 60 Сохранение активности, % Сохранение активности, % 250 (а) 100 150 2 1 40 20 100 3 2 50 3 0 0 10 20 30 40 50 60 Температура, ºС 70 80 1 2 3 4 5 6 Циклы 7 8 9 10 Рисунок 11 – Влияние температуры на активность нитрилазы (а) и операционная стабильность нитрилазы (б): в растворе (1), иммобилизованной на активированном (2) и неактивированном (3) хитозане; 100% – максимальная активность для каждого биокатализатора (а) и активность в 1-м цикле реакции (б) Оценивали операционную стабильность биокатализатора на основе иммобилизованной нитрилазы. Показано, что нитрилаза, ковалентно связанная с активированным хитозаном, более стабильна, чем адсорбированная на немодифицированном носителе (Рисунок 11, б). В целом, за 312 ч работы биокатализатора, 2 мг ферментного препарата, иммобилизованного на активированном и неактивированном хитозане, при многоцикловой конверсии НАК образуют 136,5 и 37,5 мг акриловой кислоты соответственно. К 11-му циклу реакции активность иммобилизованной нитрилазы падает. Получены препараты амидазы Rhodococcus rhodochrous 4–1, иммобилизованной методом ковалентной сшивки с хитозаном, физической адсорбции на углеродсодержащих носителях и методом поперечно-сшитых агрегатов фермента (ПСАФ) в отсутствии носителя. Проведен сравнительный анализ некоторых каталитических свойств свободной и иммобилизованной на активированном хитозане амидазы. Исследовано влияние методов иммобилизации на стереоселективные свойства амидазы в модельной трансформации рацемического лактамида до D- и L-молочной кислоты. реакции 35 Изучена зависимость амидазной активности от температуры и определены константы термоинактивации свободной и иммобилизованной амидазы. Определено, что для фермента в растворе температурный оптимум трансформации акриламида находился в пределах 40–50˚С, для иммобилизованного – 45–55˚С. Показано, что при воздействии повышенной температуры иммобилизованный фермент более стабилен, чем находящийся в растворе (Таблица 7). Таблица 7 – Термоинактивация свободной и иммобилизованной амидазы Кин, мин-1 Амидаза 50°С 60°С 70°С В растворе 6,1 × 10-3 2,9 × 10-2 1,2 × 10-1 Иммобилизованная 2,3 × 10-3 2,3 × 10-2 1,0 × 10-1 Изучена операционная стабильность амидазы, ковалентно присоединенной к активированному хитозану. При проведении последовательных циклов конверсии акриламида установлено, что иммобилизованный ферментный препарат сохраняет около 20% активности, измеренной в первом цикле, при 5-кратной трансформации. За 144 ч при последовательной конверсии 0,05 М раствора акриламида 0,84 мг фермента катализировали синтез 32 мг акриловой кислоты. Стереоселективные свойства свободной и иммобилизованной амидазы R. rhodochrous 4-1 изучали в модельной реакции гидролиза рацемического лактамида до Dи L-изомеров молочной кислоты. Отмечено, что при ковалентной сшивке фермента с активированным хитозаном стереоселективность реакции снижается. Так, соотношение Dи L- энантиомеров молочной кислоты в реакции, катализируемой ферментом в растворе, составило 89 и 11%, тогда как в реакции, катализируемой ковалентно присоединенной к хитозану амидазой – 59 и 41%. Было изучено влияние адсорбционной иммобилизации на углеродсодержащих носителях на активность и стереоселективность амидазы. Установлено, что при адсорбции амидаза сохраняет лишь 18% активности нативного фермента. Показано, что фермент, иммобилизованный на СУМС, гидролизовал лактамид до D- и L-молочной кислоты с соотношением энантиомеров 60 к 40%, тогда как фермент, адсорбированный на Сибуните, гидролизовал лактамид без стереоселективности, а адсорбция амидазы на «Сапропеле» приводила к сдвигу соотношения стереоизомеров в сторону D-лактата. Были получены поперечно-сшитые агрегаты фермента (ПСАФ) при высаливании сульфатом аммония с одновременной сшивкой бифункциональными реагентами – глутаровым альдегидом и бензохиноном. Установлено, что при сшивании молекул амидазы бензохиноном сохраняется около 9% исходной активности фермента, глутаровым альдегидом – около 30% активности. Было показано, что иммобилизованная амидаза, полученная данным методом, проявляет более высокую D-стереоселективность, 36 чем фермент в растворе. Так, биокатализатор, полученный сшивкой глутаровым альдегидом, катализировал гидролиз D,L-лактамида с энантиомерным избытком D-изомера до 94%. Максимальный ее у ПСАФ амидазы, полученных сшивкой глутаровым альдегидом, наблюдался при 40–60°С, у свободного фермента – при 40°С. Температура ниже 20°С и выше 60°С приводила к снижению энантиоселективности. Гетерогенный биокаталитический процесс Носитель Биологический объект с каталитической активностью Изолированный фермент Бактериальная клетка Гидрофобная поверхность Мезопористый Макропористый Шероховатая поверхность Гидрофильная поверхность Гладкая поверхность Гидрофильный Химическая природа субстратов и продуктов реакции Алифатические субстраты и продукты Гидрофобный Активированный Ароматические субстраты и продукты Неактивированный Рисунок 12 – Схема взаимодействия компонентов гетерогенного биокаталитического процесса, основанного на адгезированных бактериальных клетках и адсорбированных ферментах Основываясь на полученных в диссертационной работе результатах, в Заключении составлена схема взаимодействия компонентов гетерогенного биокаталитического процесса (Рисунок 12) и предложен алгоритм изучения свойств гетерогенного биокатализатора (Рисунок 13). Показано, что для адгезии бактериальных клеток предпочтительны макропористые носители с шероховатой поверхностью, совпадающие по степени гидрофобности с поверхностью клетки, для адсорбции ферментов метаболизма нитрилов – мезопористые материалы преимущественно с гидрофильной поверхностью; 37 для конверсии алифатических субстратов – активированные адсорбенты, ароматических – неактивированные. Связывание/адсорбция фермента (адгезия клеток микроорганизмов) на носителе нет есть Ферментативная активность возрастает ингибируется сохраняется Динамика трансформации органического вещества эквимолярная Операционная стабильность высокая Адсорбция субстратов и продуктов реакции не эквимолярная есть низкая повышается нет / минимальна Стереоселективность реакции (если необходимо) остается без изменений снижается Эффективный гетерогенный биокатализатор Рисунок 13 – Алгоритм изучения свойств гетерогенного биокатализатора Перспективы дальнейшей разработки темы затрагивают анализ протеома клеток нитрилгидролизующих бактерий в адгезированном состоянии и в состоянии биопленки на различных этапах ее формирования, что позволит углубить знания об экспрессии генов и физиологических изменениях бактериальных клеток при первичной адгезии и росте в виде 38 биопленки. Практическими перспективами работы являются создание биофильтров для очистки воды от нитрильных загрязнений на основе адгезированных клеток и биопленок нитрилтрансформирующих бактерий, а также разработка биореакторов для осуществления непрерывного биокаталитического процесса трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот до соответствующих продуктов, которые могут найти применение в химической и фармацевтической промышленности. 1. ВЫВОДЫ Установлено, что на адгезию бактериальных клеток на углеродных материалах наибольшее влияние оказывают гидрофобно-гидрофильные характеристики поверхностей клетки и носителя. Показана умеренная положительная связь (r=0,679; p=0,05) между гидрофобностью углеродных носителей и массой адгезированных клеток R. ruber gt1, обладающих гидрофобной клеточной стенкой (48–52% по BACH-тесту), а также сильная положительная связь между 2. гидрофобностью поверхности клеток различных штаммов бактерий родов Pseudomonas, Alcaligenes, Acinetobacter, Rhodococcus и их адгезией на гидрофобных углеродных материалах: от r=0,884 до r=0,950 (p=0,05). На основании анализа эффективности функционирования иммобилизованной системы (η) и операционной стабильности биокатализатора (n), изученных в процессе гидролиза акрилонитрила, выстроен интегративный ряд углеродных 3. 4. носителей, используемых для адгезии клеток R. ruber gt1, по убыванию этих характеристик: Керамзит/КВУ (6,47% С) > уголь-сырец порошкообразный > БАУ > ФТД > Norit PK 1-3 > «Сапропель» > Керамзит/КВУ (3,63% С) > Сибунит = ФАС > Карбопон > Урал ТМ-4 > КВУ массивный > Карбопон-В-актив > Керамзит/графитоподобный слой. Показано, что при выборе носителя для создания эффективного гетерогенного биокатализатора на основе адгезированных клеток необходимо учитывать адсорбцию продуктов трансформации материалом носителя: для гидролиза алифатических нитрилов и амидов адгезию бактериальных клеток предпочтительно осуществлять на активированных углеродных материалах, тогда как для гидролиза ароматических субстратов – на неактивированных. Показано, что гетерогенный биокатализатор трансформации нитрилов и амидов карбоновых кислот может быть получен агрегацией клеток нитрилгидролизующих бактерий с многослойными углеродными нанотрубками. Агрегация родококков с неочищенными нанотрубками достоверно выше, чем грамотрицательных бактерий родов Pseudomonas и Alcaligenes, и составляет 415– 440 мг сухой биомассы на 1 г носителя. Установлено, что ферментативная активность клеток, агрегированных с неочищенными нанотрубками, в 4–45 раз 39 ниже, чем с очищенными, что обусловливает необходимость очистки углеродных нанотрубок от технологических примесей. 5. Показано, что биопленки нитрилгидролизующих бактерий, полученные при культивировании в присутствии носителей, являются гетерогенным биокатализатором, проявляющим повышенную устойчивость к токсичным субстратам и продуктам трансформации нитрилов. Максимальное количество акриламида (1047±113 мг) получено при 20-минутной конверсии 1,3 М раствора акрилонитрила, никотиновой кислоты (126±6 мг) – при 24 ч конверсии 200 мМ раствора 3-цианопиридина выращенными на 1 дм2 полиэтилена высокой плотности биопленками R. ruber gt1 и P. fluorescens C2 соответственно. 6. Установлено, что стадия инициации образования биопленки – необратимая адгезия – характеризуется снижением пула АТФ в клетке, причем уровень снижения зависит от свойств носителя. Отмечено, что наибольшее снижение концентрации внутриклеточного АТФ происходит при адгезии R. ruber gt1 и 7. P. fluorescens C2 на носителе «Сапропель» – от 1,071 до 0,002 нМ/мг и от 0,144 до 0,006 нМ/мг соответственно. Определено, что адсорбция нитрилгидролизующих ферментов на углеродсодержащих носителях приводит к снижению их активности, но увеличивает их устойчивость к высоким температурам. Ковалентная сшивка ферментов с хитозаном, активированным бензохиноном, повышает 8. термостабильность, расширяет рН оптимум активности и увеличивает кислотоустойчивость, а также дает возможность многоциклового использования. Установлено, что стереоселективность гидролиза рацемических нитрилов и амидов карбоновых кислот в гетерогенном процессе зависит от характеристик носителя, присутствующего в реакционной среде: 24-часовая трансформация фенилглицинонитрила клетками P. fluorescens C2, адгезированными на носителе «Сапропель», приводила к накоплению в среде D-фенилглицина (ee=78%), на носителе Сибунит – L-фенилглицина (ee=96%). Определено, что наибольшую стереоселективность при гидролизе лактамида проявили поперечно-сшитые глутаровым альдегидом агрегаты амидазы, стабилизированные без носителя. 40 Список научных работ, опубликованных по теме диссертации Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ Обзоры 1. Демаков В.А., Максимова Ю.Г., Максимов А.Ю. Иммобилизация клеток микроорганизмов: биотехнологические аспекты // Биотехнология. – 2008. – № 2. – С. 30–45. 2. Максимова Ю.Г. Микробные биопленки в биотехнологических процессах // Биотехнология. – 2013. – № 4. – С. 9–23. Экспериментальные статьи 3. Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Овечкина Г.В., Козлов С.В., Максимова Ю.Г., Демаков В.А. Влияние нитрилов и амидов на рост и нитрилгидратазную активность штамма Rhodococcus sp. gt 1 // Прикладная биохимия и микробиология. – Т.39, №1. – 2003. – С.63–68. 4. Максимов А.Ю., Максимова Ю.Г., Кузнецова М.В., Олонцев В.Ф., Демаков В.А. Иммобилизация на углеродных сорбентах клеток штамма Rhodococcus ruber gt1, обладающего нитрилгидратазной активностью // Прикладная биохимия и микробиология. – Т.43, №2. – 2007. – С. 193–198. 5. Демаков В.А., Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Овечкина Г.В., Ремезовская Н.Б., Максимова Ю.Г. Биологическое разнообразие нитрилметаболизирующих бактерий антропогенно-измененных почв Пермского края // Экология. – №3. – 2007. – С. 1–6. 6. Максимова Ю.Г., Коваленко Г.А., Максимов А.Ю., Демаков В.А., Чуенко Т.В., Рудина Н.А. Иммобилизованные нерастущие клетки Rhodococcus ruber как гетерогенные биокатализаторы для процесса гидратации акрилонитрила в акриламид // Катализ в промышленности. – № 1. – 2008. – С. 44–50. 7. Коваленко Г.А., Чуенко Т.В., Рудина Н.А., Скрипник О.В., Максимова Ю.Г., Максимов А.Ю. Приготовление и характеристика носителей с синтезированным слоем каталитического волокнистого углерода: IV. Синтез углеродных нановолокон на Co/Al2O3 катализаторе // Кинетика и катализ. – 2009. – Т. 50, № 6. – С. 899–906. 8. Максимова Ю.Г., Демаков В.А., Максимов А.Ю., Овечкина Г.В., Коваленко Г.А. Каталитические свойства нитрилгидратазы, иммобилизованной на оксидах алюминия и углеродсодержащих адсорбентах // Прикладная биохимия и микробиология. – 2010. – Т. 46, № 4. – С. 416–421. 9. Максимова Ю.Г., Максимов А.Ю., Демаков В.А., Козлов С.В., Овечкина Г.В., Олонцев В.Ф. Гидролиз акрилонитрила клетками нитрилконвертирующих бактерий, иммобилизованными на волокнистых углеродных адсорбентах // Биотехнология. – 2010. – № 4. – С. 51–58. 10. Максимова Ю.Г., Демаков В.А., Овечкина Г.В. Биокаталитический синтез акриловой кислоты клетками Pseudomonas fluorescens C2, иммобилизованными на каолине // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии имени Ю.А. Овчинникова. – 2011. – Т. 7, № 2. – С. 5–10. 11. Васильев Д.М., Максимова Ю.Г., Демаков В.А. Динамика трансформации 3-цианопиридина иммобилизованными и свободными клетками Rhodococcus ruber GT1 // Вестник Уральской медицинской академической науки. – № 4/1 (38). – 2011. – С. 191–192. 12. Оленева М.А., Максимова 41 Ю.Г. Гетерофазное культивирование Rhodococcus ruber GT1 как способ получения иммобилизованного биокатализатора гидролиза нитрилов // Вестник Уральской медицинской академической науки. – № 4/1 (38). – 2011. – С. 200–201. 13. Максимова Ю.Г., Рогожникова Т.А., Овечкина Г.В., Максимов А.Ю., Демаков В.А. Каталитические свойства нитрилгидратазы, иммобилизованной на активированном хитозане // Прикладная биохимия и микробиология. – 2012. – Т. 48, № 5. – С. 484–489. 14. Максимова Ю.Г., Васильев Д.М., Овечкина Г.В., Демаков В.А. Биокаталитическая трансформация 3-цианопиридина иммобилизованными и суспендированными клетками нитрилутилизирующих бактерий // Вестник биотехнологии и физико-химической биологии им. Ю.А. Овчинникова. – 2012. – Т. 8., № 2. – С. 54–58. 15. Максимова Ю.Г., Васильев Д.М., Овечкина Г.В., Максимов А.Ю., Демаков В.А. Трансформация 2- и 4-цианопиридинов свободными и иммобилизованными клетками нитрилгидролизующих бактерий // Прикладная биохимия и микробиология. – 2013. – Т. 49, № 4. – С. 358–363. 16. Максимова Ю.Г., Демаков В.А. Изменение концентрации внутриклеточного АТФ при адгезии клеток Rhodococcus ruber gt1 и Pseudomonas fluorescens C2 на углеродных носителях // Известия РАН. Серия биологическая. – 2014. – № 5. – С. 456–462. 17. Максимова Ю.Г., Горбунова А.Н., Зорина А.С., Максимов А.Ю., Овечкина Г.В., Демаков В.А. Трансформация амидов адгезированными клетками родококков, обладающими амидазной активностью // Прикладная биохимия и микробиология. – 2015. – Т. 51, № 1. – С. 53–58. 18. Демаков В.А., Васильев Д.М., Максимова Ю.Г., Павлова Ю.А., Овечкина Г.В., Максимов А.Ю. Бактерии активного ила биологических очистных сооружений, трансформирующие цианопиридины и амиды пиридинкарбоновых кислот // Микробиология. – 2015. – Т. 84, № 3. – С. 369–378. 19. Горбунова А.Н., Максимова Ю.Г., Овечкина Г.В., Максимов А.Ю. Каталитические и стереоселективные свойства иммобилизованной амидазы Rhodococcus rhodochrous 4–1 // Прикладная биохимия и микробиология. – 2015. – Т. 51, № 5. – С. 482–489. 20. Максимова Ю.Г., Максимов А.Ю., Демаков В.А. Биопленки нитрилгидролизующих бактерий: динамика роста, устойчивость к токсичным веществам и биотехнологический потенциал // Биотехнология. – 2015. – № 4. – С. 39–51. Патенты 21. Максимов А.Ю., Демаков В.А., Максимова Ю.Г., Олонцев В.Ф. Способ получения иммобилизованного биокатализатора и способ получения водных растворов амидов с использованием этого биокатализатора. Патент на изобретение № 2352635. Дата приоритета 22.03.2007. Зарегистр. в Гос.реестре изобр. 20.04.2009 22. Демаков В.А., Максимов А.Ю., Максимова Ю.Г., Рогожникова Т.А. Способ получения иммобилизованного биокатализатора для синтеза водных растворов амидов. Патент на изобретение № 2500814. Дата приоритета 19.08.2011. Зарегистр. в Гос.реестре изобр. 10.12.2013 42 Статьи в других журналах и сборниках 23. Максимова Ю.Г., Ремезовская Н.Б., Максимов А.Ю. Иммобилизация клеток бактерий рода Rhodococcus, обладающих нитрилгидратазной активностью // Материалы XI конференции «Экология: проблемы и пути решения». – Пермь: ПГУ, 2003. – С. 124–127. 24. Максимова Ю.Г., Кузнецова М.В., Козлов С.В., Максимов А.Ю. Влияние различных способов иммобилизации на нитрилгидратазную активность штамма Rhodococcus sp. gt1 // Современные проблемы экологии, микробиологии и иммунологии. – Пермь, 2004. – С. 93– 101. 25. Максимова Ю.Г., Кузнецова М.В., Козлов С.В., Максимов А.Ю., Олонцев В.Ф., Демаков В.А. Углеродные сорбенты как носители для иммобилизации бактерий – продуцентов нитрилгидратаз // Материалы Всероссийской научной конференции с международным участием «Сорбенты как фактор качества жизни и здоровья». – Москва-Белгород, 2004. – С. 93–96. 26. Demakov V.A., Maksimov A.Yu., Kuznetsova M.V., Kozlov S.V., Ovechkina G.V., Remezovskaya N.V., Maksimova Yu.G., Gusev V.A. Nitrile bioconversion by strains producing nitrile hydrolyzing enzymes // Biotechnology and Industry. – 2004. – P. 1–7. 27. Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Ремезовская Н.Б., Максимова Ю.Г., Демаков В.А. Биотрансформация нитрилов и эфиров карбоновых кислот // Материалы Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». – Минск, 2006. – С. 362–365. 28. Максимова Ю.Г., Демаков В.А. Иммобилизованные клетки бактерий рода Rhodococcus, гидратирующие акрилонитрил // Материалы V Международной конференции «Экология и научно-технический прогресс». – Пермь, 2006. – С. 268–273. 29. Максимова Ю.Г., Овечкина Г.В. Оценка различных способов иммобилизации с целью создания биокатализатора для трансформации нитрилов // Материалы XV Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Экология: проблемы и пути решения» – Пермь, 2007. – С. 77–79. 30. Максимова Ю.Г., Максимов А.Ю., Демаков В.А. Иммобилизованный биокатализатор гидратации нитрилов: приготовление и свойства // Материалы VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». – Минск, 2008. – Т. 2. – С. 189–191. 31. Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Максимова Ю.Г. Бактериальные ферменты для биотрансформации производных карбоновых кислот // Материалы VI Международной научной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». – Минск, 2008. – Т. 2. – С. 161–163. 32. Максимов А.Ю., Кузнецова М.В., Максимова Ю.Г. Штаммы Rhodococcus для биокаталитического синтеза карбоновых кислот // Материалы международной научной конференции «Генетика и биотехнология XXI века. Фундаментальные и прикладные аспекты». – Минск, 2008. – С. 250–253. 33. Максимова Ю.Г. Трансформация нитрилов иммобилизованными клетками актинобактерий рода Rhodococcus // Приложение к журналу «Известия национальной академии наук 43 Белоруссии», часть 1. Серия биологических наук, серия медицинских наук. – Минск: Белорусская наука, 2008. – С. 170–173. 34. Максимов А.Ю., Максимова Ю.Г., Демаков В.А. Гидролиз акрилонитрила клетками нитрилутилизирующих бактерий Rhodococcus ruber gt1 и Pseudomonas fluorescens С2, иммобилизованными в структуре геля агарозы // Вестник Пермского университета. Серия «Биология». – 2009. – Вып. 10(36). – С. 115–118. 35. Максимова Ю.Г., Максимов А.Ю., Демаков В.А., Овечкина Г.В. Гидролиз нитрилов иммобилизованными клетками Pseudomonas fluorescens и иммобилизованной нитрилазой // Материалы VII Международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». – Минск, 2010. – С. 128–131. 36. Максимов А.Ю., Максимова Ю.Г., Демаков В.А. Биотрансформация ароматических производных карбоновых кислот // Материалы VII Международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии». – Минск, 2010. – С. 126–128. 37. Максимова Ю.Г., Максимов А.Ю., Демаков В.А., Будников В.И. Влияние гидрогелей полиакриламида на микрофлору почвы // Вестник Пермского университета. Серия «Биология». – 2010. – Вып. 1(1). – С. 45–49. 38. Максимова Ю.Г. Гетерогенный биокатализ акрилонитрила клетками бактерий и изолированными ферментами // Материалы международной научной конференции «Синтез знаний в естественных науках. Рудник будущего: проекты, технологии, оборудование». – Пермь, 2011. – Т.2. – С. 310–314. 39. Демаков В.А., Максимова Ю.Г. Гетерогенный биокатализ органических соединений // Вестник Пермского научного центра. – 2012. – № 2. – С.11–18. 40. Оленева М.А., Максимова Ю.Г. Устойчивость биопленок Pseudomonas fluorescens C2 и Rhodococcus ruber gt1 к токсичным субстратам и продуктам гидролиза нитрилов // Российский иммунологический журнал. – 2015. – Т. 9(18), № 2(1). – С. 651–652. 41. Васильев Д.М., Оленева М.А., Максимова Ю.Г. Оптимизация сред культивирования нитрилутилизирующих бактерий // Российский иммунологический журнал. – 2015. – Т. 9(18), № 2(1). – С. 724–726. 42. Горбунова А.Н., Максимова Ю.Г., Максимов А.Ю. Экспресс-метод определения стереоселективности бактериальных амидаз // Российский иммунологический журнал. – 2015. – Т. 9(18), № 2(1). – С. 726–728. 43. Зорина А.С., Максимова Ю.Г. Иммобилизованные нитрилгидролизующие бактерии для систем биофильтрации // Российский иммунологический журнал. – 2015. – Т. 9(18), № 2(1). – С. 733–735. Избранные тезисы докладов и стендовых сообщений 44. Максимова Ю.Г., Олонцев В.Ф., Кузнецова М.В., Максимов А.Ю., Демаков В.А. Оптимизация биокаталитического получения акриламида путем иммобилизации клеток штамма Rhodococcus sp. gt1 // Вторая международная научная конференция «Биотехнология – охране окружающей среды». – Москва, 2004. – С. 204. 45. Максимова Ю.Г., Коваленко Г.А., Максимов А.Ю., Овечкина Г.В., Демаков В.А. Иммобилизация клеток Rhodococcus ruber gt1, обладающих нитрилгидратазной активностью, на углеродсодержащих носителях 44 // Материалы третьего Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». (Дополнение) – Москва, 2005. – С. 13. 46. Максимова Ю.Г., Максимов А.Ю., Демаков В.А. Иммобилизация клеток штамма-продуцента нитрилгидратазы методом ковалентной сшивки // Материалы третьего съезда биотехнологов России имени Ю.А. Овчинникова. – Москва, 2005. – С.174–175. 47. Максимова Ю.Г., Максимов А.Ю., Демаков В.А. Влияние различных способов иммобилизации на нитрилгидратазную активность штамма Rhodococcus ruber gt1 // Тезисы докладов II Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал». – Пермь-Казань-Пермь, 2005. – С. 61–62. 48. Максимова Ю.Г., Максимов А.Ю., Демаков В.А. Иммобилизация бактерий, гидратирующих нитрилы // Материалы Международной научной конференции «Микробные биотехнологии». – Одесса, 2006. – С. 194. 49. Maksimova Y., Maksimov A., Demakov V. Nitrile transformation biocatalysts on the base of immobilized Rhodococcus cells and immobilized nitrile hydratase // Materials of the young scientists and students international scientific conference “Modern problems of microbiology and biotechnology”. – Odesa, 2007. – P. 123. 50. Максимова Ю.Г., Максимов А.Ю., Демаков В.А. Биокатализатор гидратации нитрилов на основе иммобилизованных клеток родококков и иммобилизованной нитрилгидратазы // Тезисы докладов III международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал». – Пермь, 2008. – С. 67–68. 51. Максимова Ю.Г., Максимов А.Ю., Демаков В.А., Овечкина Г.В., Козлов С.В. Трансформация акрилонитрила в акриловую кислоту иммобилизованными клетками Pseudomonas fluorescens // Материалы Всероссийского симпозиума с международным участием «Современные проблемы физиологии, экологии и биотехнологии микроорганизмов». – Москва, 2009. – С. 117. 52. Maksimova Y., Maksimov A., Ovechkina G., Demakov V. Immobilization of nitrile hydrolyzing bacterial cells and enzymes of nitrile metabolism // 4th Congress of European Microbiologists, Geneva, Switzerland, June 26-30 2011, FEMS 2011 – Congress Abstracts, 1220pdf [Электронный ресурс]. 53. Васильев Д.М., Максимова Ю.Г., Овечкина Г.В., Демаков В.А. Динамика трансформации 2и 4-цианопиридина клетками штамма Pseudomonas fluorescens C2 // Материалы Международной Интернет-Конференции «Биотехнология. Взгляд в будущее» – Казань, 2012. – С. 51–53. 54. Максимова Ю.Г. Гетерогенный биокатализ: современное состояние вопроса // Материалы международной конференции «Биология – наука XXI века». – М.: МАКС Пресс, 2012. – С. 532–534. 55. Maksimova Y.G., Oleneva M.A., Maksimov A.Y., Demakov V.A. Biofilms of nitrile utilizing bacteria and their biotechnological potential // International conference “Biofilms 5”, 10-12 December 2012, Paris. Program & Abstracts. – P. 182. 45 56. Maksimova Y., Vasiliev D., Ovechkina G., Demakov V. Heterogeneous biocatalytic microbial transformation of aromatic nitriles // 5th Congress of European Microbiologists, Leipzig, Germany, July 21-25 2013, FEMS 2013 – Congress Abstracts, 619pdf [Электронный ресурс]. 57. Maksimova Y., Maksimov A., Oleneva M., Demakov V. Determination of ATP as an indicator of the physiological state of biofilm cells of nitrile utilizing bacteria // International Conference on Microbial Biofilms “Biofilms 6”, 11-13 May 2014, Vienna, Austria – P. 60–61. 58. Maksimov A., Vasiliev D., Pavlova Y., Maksimova Y., Demakov V. Community of nitrile utilizing bacteria of active sludge flocs in biological treatment facilities // International Conference on Microbial Biofilms “Biofilms 6”, 11-13 May 2014, Vienna, Austria – P. 136–137. СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ НАК АА АК 2-, 3-, 4-ЦП ПА ПК НА НК ИНА ИНК ПАА ВЭЖХ ГХ ОП АСБ LB – – – – – – – – – – – – – – – – нитрил акриловой кислоты (акрилонитрил) акриламид акриловая кислота 2-,3-,4-цианопиридин соответственно пиколинамид пиколиновая кислота никотинамид никотиновая кислота изоникотинамид изоникотиновая кислота полиакриламид высокоэффективная жидкостная хроматография газовая хроматография оптическая плотность абсолютно сухая биомасса среда Луриа-Бертани КВУ МУНТ АТФ ДМСО ПСАФ CLEAs ее – – – – – – – каталитический волокнистый углерод многослойные углеродные нанотрубки аденозинтрифосфорная кислота диметилсульфоксид поперечно-сшитые агрегаты фермента cross-linked enzyme aggregates энантиомерный избыток (enantiomeric excess) 46 МАКСИМОВА Юлия Геннадьевна ГЕТЕРОГЕННЫЕ БИОКАТАЛИЗАТОРЫ НА ОСНОВЕ КЛЕТОК НИТРИЛГИДРОЛИЗУЮЩИХ БАКТЕРИЙ И ИХ ФЕРМЕНТОВ ДЛЯ ТРАНСФОРМАЦИИ НИТРИЛОВ И АМИДОВ КАРБОНОВЫХ КИСЛОТ 03.02.03 Микробиология Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук Подписано в печать __.__.____. Формат 60×90/16. Усл. печ. л. 2. Тираж 120 экз. Заказ Набор компьютерный Отпечатано в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте экологии и генетики микроорганизмов Уральского отделения Российской академии наук 614081, г. Пермь, ул. Голева, 13
