Диагностика вирусных болезней лошадей методом ПЦР
реклама
УДК 619: 616.98:578.8:616-076 Диагностика вирусных болезней лошадей методом ПЦР Введение В настоящее время методы молекулярной диагностики часто применяют в ветеринарной и медицинской практике. Широкое распространение в диагностике вирусных болезней лошадей получил метод ПЦР. Несмотря на некоторые ограничения он, несомненно, незаменим для целей ранней экспресс–диагностики, в частности, таких болезней, как грипп, ринопневмония, вирусный артериит и ряда других инфекций лошадей [12]. Посредством ПЦР можно надежно выявлять однокопийные гены и их варианты в геномах вирусов. Чувствительность метода такова, что амплифицировать в ПЦР и обнаружить целевую последовательность удается даже в том случае, если она встречается однажды в образце из 100000 клеток. Этот метод, как высокочувствительный и специфичный для выявления вирусов, в особенности предпочтителен в начальной стадии заболевания в период виремии и клинически выраженного синдрома заболевания [2]. В отделе вирусологии ВИЭВ в период 2000—2010 гг. проводили исследования по разработке и совершенство6 ванию методов молекулярной биологии на основе ПЦР для диагностики вирусных болезней лошадей [1]. Резуль6 таты собственных исследований и анализ данных лите6 ратурных источников позволили систематизировать по6 лученную информацию. Диагностический подход В основе приведенной таблицы лежит информация о клинических признаках различных вирусных болезней и необходимом для исследования патологическом материале (табл. 1). Все признаки болезней мы условно разделили на 6 групп: 1) респираторный синдром, 2) аборт, 3) кератоконъюнктивит, увеит, хориоретинит; 4) миелоэнцефалопатия, 5) вульвовагинит, баланопостит и 6) ремитирующая лихорадка, истощение, анемичность видимых слизистых оболочек. 1. Диагностика вирусных болезней лошадей методами ПЦР, ОТ-ПЦР Признаки заболевания Респираторный синдром Аборт Кератоконъюнктивит, увеит, хориоретинит Диагностируемые болезни Грипп H3N8, герпес (вирусы 16го, 26го, 46го, 56го типов), вирусный артериит, аденовирусная инфекция (вирус 16го типа), риновирусная инфекция (вирусы А и B типов) Материал для исследования Смывы со слизистой носовой полости, истечения из носовой полости на 1…3 сутки заболевания Паренхиматозные органы Герпес (вирус 16го типа), абортированных плодов вирусный артериит и павших жеребят Герпес (вирусы 16го, 46го типов), Смывы с конъюнктивы вирусный артериит Миелоэнцефалопатия Герпес (вирус 16го типа) Головной и спинной мозг Вульвовагинит, баланопостит Герпес (вирусы 16го, Смывы со слизистой половых 36го типов), вирусный органов, влагалищная слизь, артериит для жеребцов сперма Ремитирующая лихорадка, истощение, Инфекционная анемия анемичность видимых слизистых оболочек Плазма крови, селезёнка Респираторный синдром. Возбудителями респираторных инфекций могут быть вирусы гриппа H3N8, герпеса типов 1, 2, 4, 5 (из них вирусы 1-го и 4-го типа являются возбудителями ринопневмонии), вирус артериита, аденовирус типа 1, риновирусы типов А и В. Для исследования используют смывы со слизистой носовой полости, носовые истечения на 1…3-и сутки заболевания [6]. Наиболее распространены среди лошадей всех возрастов вирусы гриппа во время массовых эпизоотий, герпеса 1-го типа и артериита. Остальные вирусы вызывают заболевания преимущественно у жеребят. Все вирусы этой группы непосредственно связаны с клинически выраженным респираторным синдромом за исключением вируса герпеса 5-го типа (ВГЛ5). Штаммы ВГЛ5 были изолированы от лошадей во время респираторного заболевания только в Австралии и Новой Зеландии, в странах Европы периодически обнаруживают ДНК ВГЛ5 в лейкоцитах периферической крови [7]. В нашей стране распространение ВГЛ5 не изучено, поэтому мы посчитали возможным включить этот вирус в диагностическую панель для респираторных патологий. Для обнаружения некоторых респираторных инфекций лошадей, возбудителями которых являются вирусы герпеса 2-го, 5-го типов и риновирус А типа, диагностические методы на основе ПЦР являются единственно возможными или имеют приоритет в сравнении с изоляцией вирусов в культуре клеток, поскольку у этих вирусов часто встречаются не цитопатогенные штаммы [6]. Особенное значение в диагностике респираторных инфекций имеет диагностика гриппа. Модификация ПЦР — метод ОТ–ПЦР — более чувствительный в сравнении с изоляцией вируса в куриных эмбрио- 37 РВЖ • МДЖ • № 3/2011 Ключевые слова: вирусный артериит, грипп, ИНАН, лошади, ПЦР, ринопневмония Сокращения: ВГЛ1 — вирус герпеса лошадей 1-го типа, ВГЛ3 — вирус герпеса лошадей 3-го типа, ВГЛ4 — вирус герпеса лошадей 4-го типа, ВГЛ5 — вирус герпеса лошадей 5-го типа, ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота, ИНАН — инфекционная анемия, ИФА — иммуноферментный анализ, ОT-ПЦР — полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией, ПЦР — полимеразная цепная реакция, РДП — реакция диффузионной преципитации, РСК — реакция связывания комплемента, ЦНС — центральная нервная система ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА С.В. Алексеенкова, Г.К. Юров, К.П. Юров, ГНУ «Всероссийский научно(исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ)» РАСХН (Москва) С.В. Алексеенкова, Г.К. Юров, К.П. Юров нах, культуре клеток линии MDCK и обнаружением вирусного нуклеопротеина посредством РСК или ИФА [15]. Преимущество метода — возможность амплифицировать фрагмент комплементарной ДНК вируса в количестве, достаточном для его прямого секвенирования. Это позволяет сравнивать расшифрованные последовательности анализируемых генов и их белковых продуктов с уже известными в международной базе данных. Полученная информация о структуре генома и антигенных вариациях вируса гриппа лошадей, выделенного в период эпизоотии, может быть полезна при планировании противоэпизоотических мероприятий (подборе эффективных вакцин) в других регионах, где есть угроза вспышки гриппа [5]. Аборты. Следующая группа заболеваний — это аборты. Причиной абортов у лошадей могут быть вирус герпеса 1-го типа и вирус артериита. Для исследования используют паренхиматозные органы абортированных плодов и павших жеребят. Для диагностики вирусного артериита дополнительно можно исследовать ткани плаценты. Часто причиной абортов является вирус герпеса 1-го типа. Аборты, связанные с вирусом артериита, обычно бывают вызваны только высоковирулентными штаммами возбудителя [8]. Кератоконъюнктивит, увеит, хориоретинит. При заболеваниях глаз на исследование отправляют смывы с конъюнктивы. Причиной кератоконъюнктивитов могут быть вирус герпеса 2-го типа и реже вирус артериита, причиной увеитов и хориоретинитов — вирус герпеса 1-го типа. Кератоконъюнктивит, вызванный вирусом герпеса 2-го типа, встречается как самостоятельные заболевание. Увеиты и хориоретиниты, связанные с вирусом герпеса 1-го типа, часто ассоциированы с признаками поражения ЦНС при нервной форме ринопневмонии. Жеребята, у которых матери перенесли инфекцию, ассоциированную с ВГЛ1 миелоэнцефалопатией, подвержены заболеванию глаз в наибольшей степени. В настоящее время неизвестно, являются ли увеиты и хориоретиниты сопутствующими признаками нервной формы ринопневмонии или развиваются как одно из осложнений первичной инфекции. Предполагают, что ВГЛ1 способен вызывать поражение глаз даже в тех случаях, когда отсутствуют неврологические нарушения [13]. Миелоэнцефалопатия. Встречается при нервной форме ринопневмонии, которую может вызвать вирус герпеса 1-го типа. Для исследования используют головной и спинной мозг. При латентной инфекции вирус можно обнаружить в лимфоцитах периферической крови и тройничном ганглии. Нервная форма инфекции может наблюдаться как самостоятельное заболевание или в сочетании с признаками поражения респираторного тракта; в большинстве случаев нервная форма регистрируется у кобыл после аборта или предшествует выкидышу [3]. При этом неврологические нарушения, обусловленные ВГЛ1, 38 представляют собой скорее рецидив инфекции, чем первичное заражение. Большинство исследователей едины во мнении, что причина нервной формы инфекции — исключительно ВГЛ1. Другие считают, что ВГЛ4 в редких случаях может быть связан с миелоэнцефалопатией у лошадей. Респираторную форму инфекции и аборты, обусловленные ВГЛ1, регистрируют во многих странах мира, однако, миелоэнцефалопатия, вызванная вирусом, встречается значительно реже. По мнению некоторых авторов, это косвенное доказательство того, что только некоторые штаммы ВГЛ1 обладают нейропатогенностью. В настоящее время это предположение подтверждено экспериментально, поскольку для идентификации таких штаммов определены генетические маркеры [14]. Вульвовагинит, баланопостит. Причиной данных заболеваний могут быть вирусы герпеса 1-го и 3го типов. Для исследования используют смывы со слизистой половых органов, влагалищную слизь, сперму. Заболевание, вызванное вирусом герпеса 3-го, типа известно как коитальная экзантема лошадей. Коитальная экзантема — острое заболевание, при котором наблюдают пустулезные поражения на слизистой оболочке влагалища, преддверия влагалища, у жеребцов — препуция и пениса. Поражения генитальных органов у кобыл, вызванных ВГЛ3, следует отличать от сходного по клиническому проявлению заболевания, вызываемого ВГЛ1. Половая экзантема как самостоятельная форма герпетической инфекции лошадей, вызванной ВГЛ1, встречается в неблагополучных хозяйствах в период случной кампании [3]. При вирусном артериите у жеребцов клинические признаки не всегда выражены, но у вирусоносителей в сперме обнаруживают в большом количестве инфекционный вирус, который они могут передать кобылам при случке [11]. ИНАН (острая, подострая или хроническая формы). Модификацию метода на основе ОТ–ПЦР с вложенной парой праймеров используют в ряде случаев в качестве альтернативного метода диагностики. Это чувствительный метод, с помощью которого обнаруживают в крови больных животных приблизительно 10 геномных копий вируса. В качестве материала для выявления вируса ИНАН в ОТ–ПЦР отбирают паренхиматозные органы (селезенку), а также лейкоцитарную фракцию крови. Однако, чувствительность метода ниже, чем у принятого стандартного теста (РДП — тест Коггинса). По данным J.L. Langemeier и др.[10], из 71 лошадей, положительно реагирующих на ИНАН в РДП, только 63 были положительны в ОТ–ПЦР. Преимущество метода ОТ–ПЦР заключается в том, что вирус ИНАН может быть выявлен уже на 3-и сутки после заражения, в то время как специфические антитела в РДП выявляют только на 15…23-и сутки [4, 9]. Прямое обнаружение вируса желательно в ряде случаев. Так, все иммунологические методы исследования ИНАН Диагностика вирусных болезней лошадей методом ПЦР имеют определенные недостатки. Например, зарегистрированы случаи иммунодефицитного состояния лошадей, зараженных вирусом ИНАН, при котором вирусспецифические антитела образуются в количестве, недостаточном для их обнаружения серологическим методом, при этом больные лошади являются вирусоносителями. В этих случаях результаты, полученные при использовании стандартных методов, будут интерпретированы как ложноотрицательные. Метод ОТ–ПЦР можно рекомендовать для выявления больных жеребят или, напротив, для реабилитации жеребят, которые были рождены от больных кобыл и получили от своих матерей колостральные антитела [10]. Таким образом, ОТ–ПЦР является удобным альтернативным методом диагностики ИНАН, который в определенных случаях может быть использован в комплексе противоэпизоотических мероприятий при ИНАН, основывающихся на выявлении инфицированных лошадей в РДП (тест Коггинса). Заключение Благодаря развитию методов молекулярной диагностики удалось значительно улучшить существующую лабораторную технологию, основанную на изоляции вирусов и их идентификации в серологических реакциях, за счет повышения чувствительности и специфичности, а также сокращения времени на исследования (от нескольких дней до 6…8 ч). В настоящее время разработаны тест-системы на основе ПЦР для экспресс-диагностики ряда вирусных болезней лошадей, которые используются как рутинные методы для индикации вирусов герпеса 1-го и 4-го типов, артериита, гриппа H3N8. Метод ПЦР не может заменить стандартные методы диагностики вирусных болезней, поскольку за рамками остается ряд существенных показателей инфекционного процесса, но дополнительная информация о возбудителе, которую легко получить посредством ПЦР, ускоряет постановку диагноза, позволяет выбирать меры борьбы и предотвращать распространение новых штаммов возбудителей. Библиография 8. Holyoak G.R., Balasuriya U.B., Broaddus C.C., Timoney P.J. Equine viral arteritis: current status and prevention // Theriogenology, 2008; 70 (3): 403—414. 9. Issel C.J., Cook R.F. A review of techniques for the serologic diagnosis of equine infectious anemia // J Vet Diagn Invest ,1993; 5: 137—141. 10. Langemeier J.L., Cook S.J., Cook R.F., Rushlow K.E., Montelaro R.S., Issel C.J. Detection of Equine Infectious Anemia Viral RNA in Plasma Samples from Recently Infected and Long-Term Inapparent Carrier Animals by PCR // Journal of Clinical Microbiology, 1996; 34 (6): 1481—1487. 11. Metcalf E.S. The role of international transport of equine semen on disease transmission // Anim Reprod Sci, 2001; 68 (3): 229—237. 12. Office International des Epizooties. Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, 2010 (www.oie.int) 13. Slater J.D., Gibson J.S., Barnet K.C., Field H.J. Chorioretinopathy associated with neuropathology following infection with equine herpesvirus — 1 // Vet Res, 1992; 131 (11): 237—239. 14. Studdert M.J., Hartley C.A., Dynon K., Sandy J.R., Slocombe R.F., Charles J.A., Mine M.E., Clarke A.F., El–Hage C. Outbreak of equine herpesvirus type 1 myeloencephalitis: new insights from virus identification by PCR and the application of an EHV-1 specific antibody detection ELISA // Vet Res, 2003; 153 (14): 417—423. 15. Yurov K.P. Efficacy of control in equine influenza epizootology // Proc.10th International Congress of World Equine Veterinary Association. — Moscow, 2008. SUMMARY S.V. Alexeyenkova, G.K. Yurov, K.P. Yurov. Diagnostic of equine viral diseases by PCR. In this article the exam6 ples of diagnostic of equine viral diseases such as influenza, herpesvirus infections 1…5, viral arteritis, infectious ane6 mia by PCR are described. 39 РВЖ • МДЖ • № 3/2011 1. Алексеенкова С.В., Юров Г.К., Юров К.П. ПЦР как метод ранней экспресс–диагностики вирусных респираторных болезней лошадей // Материалы 11 Международной научно-практической конференции «Болезни лошадей: диагностика, профилактика, лечение» — Москва, 2010. 2. Юров К.П., Заблоцкий В.Т. Унификация методов исследований и совершенствование профилактики заразных болезней лошадей // Материалы научно-практической конференции «Болезни лошадей». — Новосибирск, 2006. 3. Юров К.П. Инфекционные болезни лошадей. — М.: Грааль, 2000. 4. Юров К.П., Поздняков А.А., Кычкин А.А., Крюков Н.Н. Биология культурального вируса инфекционной анемии лошадей // Ветеринария, 1980; 6: 30 — 31. 5. Daly J.M., Newton J.R., Mumford J.A. Current perspectives on control of equine influenza // Vet Res 2004; 35: 411—423. 6. Dynon K., Varrasso A., Ficorilli N., Holloway C.A., Reubel G.H., Li F., Hartley C.A., Studdert M.J., Drummer H.E. Identification of equine herpesvirus 3 (equine coital exanthema virus), equine gammaherpesviruses 2 and 5, equine adenoviruses 1 and 2, equine arteritis virus and equine rhinitis A virus by polymerase chain reaction // Aust Vet J, 2001; 79 (10): 695—702. 7. Holloway S.A., Lindquester G.J., Studdert M.J., Drummer H.E. Identification and characterisation of equine herpesvirus 5 glycoprotein B // Arch Virol, 1999; 144: 287—307.
