МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ

Министерство образования и науки Российской Федерации
Федеральное агентство по образованию
Саратовский государственный технический университет
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БЕЛКОВ
В ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТАХ
Методические указания
к выполнению лабораторной работы
по курсу «Технология пищевых производств»
для студентов направления 260600
Электронное издание локального распространения
Одобрено
редакционно-издательским советом
Саратовского государственного
технического университета
Саратов 2006
Цель работы: изучение методов определения белковых веществ в
пищевых продуктах.
ОСНОВНЫЕ ПОНЯТИЯ
Среди азотистых веществ, входящих в состав пищевых продуктов,
важнейшая роль принадлежит белкам. Их основное значение заключается
в незаменимости другими компонентами пищи. Белки составляют основу
процессов жизнедеятельности организма. Необходимость их постоянного
обновления лежит в основе обмена веществ.
Белки в организме выполняют структурную (построение тканей и
клеточных компонентов) и функциональную (ферменты, гормоны,
дыхательные пигменты и др.) роль.
Дефицит белка в пищевом рационе повышает восприимчивость
организма к инфекционным заболеваниям, нарушает процессы
«кроветворения, обмен липидов, витаминов и др. У детей при белковой
недостаточности замедляются рост и умственное развитие.
Длительный избыток белка в питании также отрицательно
сказывается на жизнедеятельности организма, вызывая перевозбудимость
нервной системы, нарушение обменных процессов, перегрузку печени и
почек.
В ежедневном рационе взрослого человека белки должны составлять
около 14% общей калорийности, сочетаясь в определенном соотношении с
другими пищевыми веществами.
Известно, что растительные белки усваиваются организмом не
полностью по сравнению с животными. Так, белки молока и яиц
усваиваются на 96%, белки рыбы и мяса - на 95%, белки хлеба из муки
пшеничной I и II сортов — на 85%, белки картофеля, хлеба из обойной
муки, бобовых — на 70%. Учитывая, что растительные белки менее
полноценны по составу незаменимых аминокислот, чем животные,
потребление определенного количества животных белков совершенно
необходимо. Для взрослого человека доля животных белков в среднем
должна составлять около 55% общего количества белка в рационе.
Наиболее важными технологическими свойствами белков являются
денатурация, набухание, способность образовывать пены и др.
Денатурация – это изменение пространственной ориентации
белковой молекулы, не сопровождающееся разрывом ковалентных связей.
Денатурация может вызываться повышением температуры, механическим
и химическим воздействием, ультразвуком, ионизирующим облучением и
другими факторами. Денатурация может вызываться повышением
температуры, механическим и химическим воздействием, ультразвуком,
ионизирующим облучением и другими факторами. Денатурация белков
2
играет важную роль в технологических процессах, связанных с
образованием структурных систем полуфабрикатов и готовых продуктов
(хлеба, макаронных, кондитерских и других изделий).
Набухание обусловлено способностью белков, относящихся к
гидрофильным веществам, поглощать воду и при определенных условиях
образовывать растворы, называемые студнями. Набухший в воде белок
пшеничной муки образует клейковину. Студни и клейковина обладают
свойствами упругости и эластичности, пластичности и ползучести, т.е.
свойствами твердого и жидкого тела. Свойство набухания играет большую
роль в технологии (набухание зерна при замочке, муки при замесе теста).
Пенообразование – способность белков образовывать эмульсии в
системе жидкость-газ, называемые пенами. Белки как пенообразователи
широко используются при изготовлении многих кондитерских изделий.
Массовую долю, белка в пищевых продуктах определяют по
количеству общего азота методом Кьельдаля. С развитием фото- и
спектрофотометрии были разработаны методы количественного
определения белка, основанные на его способности давать окрашенные
соединения с некоторыми реагентами. Среди них следует отметить метод
Лоури, биуретовый метод. Находят применение также физико-химические
методы, в основу которых полажены специфические свойства белка:
образование различной степени помутнения в зависимости от
концентрации
белка
в
растворе
сульфосалициловой
кислоты
(нефелометрический метод), способность белка адсорбировать некоторые
красители и другие свойства белка.
Все перечисленные методы могут быть отнесены к ускоренным. При
относительно небольших затратах времени они характеризуются
достаточно высокой точностью и простотой определения. В настоящем
руководстве изложены три метода количественного определения белка:
биуретовый, нефелометрический и Лоури.
МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ БЕЛКА МЕТОДОМ
КЬЕЛЬДАЛЯ
Метод основан на минерализации навески продукта при нагревании
с концентрированной серной кислотой в присутствии катализаторов. При
этом углерод и водород органических соединений окисляются до диоксида
углерода и воды, азот, освобождаемый в виде аммиака, соединяется в
колбе с серной кислотой, образуя сульфат аммония. Схематично
происходящие реакции могут быть представлены следующим образом:
3
RCHNH2COOH +H2SO4 =СО2+ SO2 + H2O + NH3.
2NH3+ H2SO4—(NH4)2SO4.
На последующей стадии дистилляции раствор сульфата аммония
обрабатывают концентрированным раствором гидроксила натрия, при
этом аммиак освобождается и улавливается титрованным раствором
серной кислоты. Избыток серной кислоты оттитровывают раствором
гидроксида натрия. Метод Кьельдаля применяют в нескольких
модификациях, отличающихся в основном условиями минерализации. Для
ускорения процесса вводят различные катализаторы: оксид меди, селен,
свинец и другие, повышают температуру кипения серной кислоты
добавлением солей, сульфата калия или натрия, сочетают добавление
катализатора и солей при сжигании навески.
Методом Кьельдаля в любой модификации определяется количество
общего азота. Массовая доля белка вычисляется умножением полученной
величины общего азота на переводной коэффициент 6,25, исходя из того,
что в белках в среднем содержится 16% азота. Условность полученных
результатов при таком пересчете очевидна, так как не весь азот пищевого
продукта находится в форме белка и, кроме того, процентное содержание
азота в белках подвержено колебаниям как в сторону повышения, так и в
сторону понижения от 16%. В некоторых продуктах азотистые вещества
небелкового характера достигают значительных количеств (мышечная
ткань рыбы—15%, мясо животных—10— 16% от общего количества
азотистых веществ).
Следовательно, для получения более точных результатов необходимо либо при пересчете общего азота на белок использовать
различные коэффициенты в зависимости от процентного содержания азота
в белках отдельных продуктов: мясо и овощи — 6,25; пшеница, рожь,
горох и др. — 5,7; гречиха, рис — 6,0; молоко — 6,37 и т. д., либо
белковый азот определять отдельно специальными методами.
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ БЕЛКА БИУРЕТОВЫМ
МЕТОДОМ
Специфической реакцией на содержание белка является биуретовая
реакция, так как ее дают полипептидные связи. Она получила свое
название от производного мочевины — биурета, который образует в
щелочном растворе медного купороса окрашенное комплексное
соединение. Интенсивность окрашивания пропорциональна содержанию
пептидных связей, а, следовательно, и концентрации белка в растворе.
Биуретовую реакцию дают все белки, пептоны и полипептиды,
4
начиная с тетрапептидов.
Эта реакция длительное время использовалась как качественная
реакция на белок. В дальнейшем она стала применяться для
количественного определения белка в различных объектах. Биуретовый
метод применяют в различных модификациях, различающихся условиями
экстрагирования белка, способами внесения биуретового реактива и
техникой колориметрирования.
Ниже приводится биуретовый метод определения массовой доли
белка в муке в модификации Дженнингса, экспериментальная проверка
которого выявила ряд его преимуществ перед другими модификациями.
Биуретовый
реактив— 15 см3 10 н. раствора КОН и 25 г
сегнетовой соли, взятой с погрешностью ±0,01 г, растворяют примерно в
900 см3 дистиллированной воды в мерной колбе вместимостью 1000 см3.
Медленно добавляют при постоянном перемешивании 30 см3 4 %-ного
раствора CuSO4, отмеренных цилиндром, и доводят объем колбы до метки
дистиллированной водой.
ТЕХНИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Взвешивают около 1,5 г муки с погрешностью ±0,001 г и помещают
в сухую коническую колбу вместимостью 250—300 см3, снабженную
пробкой. Отмеривают цилиндром с ценой деления 0,1 см3 под тягой 2 см3
четыреххлористого углерода для извлечения жира из образца, добавляют
пипеткой 100 см3 биуретового реактива. Закрытую пробкой колбу
встряхивают на механическом встряхивателе в течение 60 мин. Далее
вытяжку центрифугируют в течение 10 мин при частоте вращения 4500
мин-1.
Прозрачный
центрифугат
помещают
в
кюветы
фотоэлектроколориметра с толщиной слоя раствора 5 мм. Измерение
оптической плотности производят при длине волны 550 нм.
По величине оптической плотности белковой вытяжки определяют
содержание белка в навеске (мг) с помощью калибровочной кривой (рис.
1). Рассчитывают массовую долю белка (в %) на сухие вещества муки.
ЗАПИСЬ В ЛАБОРАТОРНОМ ЖУРНАЛЕ
Масса муки (m)……………………………………..г
Величина оптической плотности (D)
Содержание белка в навеске муки
(по калибровочной кривой)(n/1000)………………г
Массовая доля белка в муке (M1)………………….. %
Массовая доля белка в 100 г сухих веществ(М)..%
Заключение
5
Масса белка в навеске муки, мг
Построение калибровочной кривой - для построения калибровочной
кривой подбирают образцы муки с различной массовой долей белка в
диапазоне, встречающемся в реальных условиях (от 8 до 20%). Интервал в
содержании белка образцов должен находиться в пределах не более 1%.
Количество образцов не должно быть менее 10. С увеличением их числа
точность определений возрастает.
Затем приведенным выше методом Дженнингса определяют
оптическую плотность белковых вытяжек всех образцов.
При построении кривой на оси абсцисс откладывают величины
оптической плотности, а на оси ординат - содержание белка в навеске в мг.
105
95
85
75
65
55
45
0,15
0,31
0,39
0,23
Оптическая плотность
Рис.1 Калибровочная кривая (биуретовый метод).
ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ БЕЛКА
НЕФЕЛОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ
Метод основан на измерении интенсивности светового потока,
рассеянного твердыми или коллоидными частицами, находящимися в
растворе во взвешенном состоянии. По интенсивности светорассеяния,
определяемой нефелометром, судят о концентрации исследуемого
вещества.
В настоящее время находят широкое использование фотоэлектрические нефелометры.
Растворы высокомолекулярных соединений, например растворы
белков, способны при определенных условиях в присутствии некоторых
6
химических реагентов опалесцировать. Одним из таких реагентов является
сульфосалициловая кислота. Концентрация белка в этом случае может
быть определена по интенсивности опалесценции.
Продукты гидролиза белка—пептоны, аминокислоты и другие
азотсодержащие вещества — не опалесцируют.
Экспериментальной проверкой установлено, что нефелометрический
метод с использованием сульфосалициловой кислоты отличается
быстротой, высокой точностью, простотой и хорошей корреляцией с
методом Кьельдаля.
ТЕХНИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ
Около 0,5 г исследуемой муки взвешивают с погрешностью ±0,001 и
помещают в коническую колбу вместимостью 250—300 ом3, снабженную
пробкой. В колбу добавляют из бюретки 50 см 0,05 н. раствора гидроксида
натрия. Закрытую пробкой колбу встряхивают на механическом встряхивателе в течение 15 мин. Затем вытяжку центрифугируют 10 мин при
частоте вращения 6000 мин-1. 5 см3 прозрачного центрифуга-та пипеткой
переносят в мерную колбу на 50 см3 и содержимое колбы доводят до
метки сульфосалициловой кислотой.
При нефелометрическом анализе получение правильных результатов
в значительной мере зависит от методики получения суспензии, в
частности от порядка смешивания растворов, скорости смешивания.
Поэтому после добавления сульфосалициловой кислоты колбу быстро
переворачивают 2—3 раза (не более), раствор наливают в кювету с
толщиной слоя 5 мм и измеряют величину оптической
плотности
раствора
при длине волны 550нм. Замеры следует производить сразу
после добавления кислоты, так как частицы белка быстро агрегируют.
Массовую долю белка определяют по калибровочной кривой (рис.2).
Построение ее ведут так же, как и при биуретовом методе.
Запись в лабораторном журнале аналогична записи, данной к
биуретовому методу. По полученным данным делают заключение.
7
Масса белка в навесвке муки, мг
255
240
225
210
195
180
165
150
135
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
0,4
Оптическая плотность раствора
Рис. 2. Калибровочная кривая (нефелометрический метод).
РЕФРАКТОМЕТРИЧЕСКИЙ МЕТОД
Метод основан на установлении разности показателей преломления
исследуемого вещества и раствора, полученного после осаждения белков
раствором хлористого кальция при кипячении.
ТЕХНИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ
отмеривают пипеткой 5мл исследуемого вещества (молока) в
пробирку, добавляют 5-6 капель 4%-ного раствора хлористого кальция.
Пробирку закрывают пробкой и помещают в баню с кипящей водой на 10
мин. Затем содержимое фильтруют через складчатый фильтр. В
прозрачном фильтрате, а также в исходном молоке определяют на
рефрактометре показатель преломления при 200С. Содержание белка в
молоке (в %) рассчитывают по формуле
n D20  n D20
a
,
0,002045
где а – содержание белка, %
n D20 - показатель преломления молока при 200С;
M
C
M
n D20C
- показатель преломления фильтрата при 200С;
8
0,002045 – коэффициент, позволяющий выразить полученную
разность показателей преломления, % от общего белка.
СОДЕРЖАНИЕ И ОФОРМЛЕНИЕ ОТЧЕТА ПО РАБОТЕ
Отчет о лабораторной работе оформляется каждым студентом. Текст
пишется темными чернилами, эскизы могут выполняться карандашом,
графики результатов экспериментов строятся в масштабе.
Содержание отчета излагается в порядке, указанном в работе, и
должно включать:
- название работы, цель работы, краткое содержание;
- краткие выводы по работе.
Законченные и оформленные отчеты студенты предъявляют
преподавателю, до начала выполнения следующей работы.
ВОПРОСЫ ДЛЯ САМОПРОВЕРКИ
1.Каково значение белков для организма человека. Классификация белков?
2.Свойства белков?
3.Каков принцип определения, белка по методу Кьельдаля и каковы его
достоинства и недостатки?
4.В чем заключается принцип биуретового метода определения белка?
5.В чем заключается принцип нефелометрического метода определения
белка?
6.В чем заключается принцип нефелометрического метода определения
белка?
7. В чем заключается принцип рефрактометрического метода определения
белка?
ЛИТЕРАТУРА
1.
2.
3.
Фалунина З.И. Лабораторный практикум по общей
технологии пищевых продуктов/ З.И. Фалунина. М.:
Пищевая промышленность, 1978. 271с.
Назаров Н.И. Общая технология пищевых производств/
Н.И. Назаров. М.: Легкая и пищевая технология, 1981.с. 19.
Лабораторный практикум по общей технологии пищевых
производств/ под ред. Л.П. Ковальской, М.: Агропромиздат,
1991. 335с.
9
4.
Руководство по методам анализа качества и безопасности
пищевых продуктов/под ред. И.М. Скурихина, В.А.
Тутельяна, М.: Брандес, Медицина. 1998.340с.
10
Все права на размножение и распространение в любой форме остаются за
разработчиком.
Нелегальное копирование и использование данного продукта запрещено.
Составители: Рамазаева Людмила Федоровна, Пачина Ольга Владимировна
Под редакцией Л.Ф. Рамазаевой
Рецензент
А.Н. Суркова
410054, г. Саратов, ул. Политехническая, 77
Научно-техническая библиотека СГТУ
Тел. 52-63-81, 52-56-01
http://lib.sstu.ru
Регистрационный номер: 060340Э
Саратовский государственный технический
университет, 2006
11