Ускоренный метод определения дрожжей и

№5, 2014
МОЛОЧНАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ
43
УДК 637.1/.3
Ускоренный метод определения дрожжей
и плесеней с использованием петрифильмов
3M™ Petrifilm™ Rapid Yeast and Mold Count Plate
Канд. биол. наук Д.М.СОКОЛОВ,
д-р биол. наук М.С.СОКОЛОВ
ООО «МикроБио»
По данным Продовольственной и
сельскохозяйственной организации
(FAO), ежегодно в мире по разным
причинам пропадает примерно треть
всех произведенных продуктов питания (1,3 млрд т). Только в странах ЕС,
США и Канаде ежегодно выбрасывается от 95 до 115 кг продуктов на душу
населения. Причинами подобного
расточительства являются слишком
большие упаковки, буквальное понимание срока годности продуктов, а
также их относительная дешевизна.
В развивающихся странах из-за
порчи пропадает до 40 % всех продуктов сельского хозяйства. Устаревшее оборудование, недостатки
транспортной инфраструктуры,
отсутствие холодильного оборудования – основные причины потерь [10].
Различают следующие взаимосвязанные между собой виды порчи
продуктов питания: физическую,
химическую (или биохимическую) и
микробиологическую [11]. Механическое повреждение некоторых
пищевых продуктов приводит к активации гидролитических ферментов,
которые катализируют расщепление
белков, углеводов и липидов. Утрата
целостности пищевых продуктов (в
первую очередь овощей и фруктов)
ведет к разрушению клеток, активации гидролитических ферментов,
гидролизу биополимеров с последующей микробной контаминацией.
Микробиологическая порча является
ключевой и проявляется в изменении
органолептических свойств продукта.
В ряде случаев она становится источником опасности из-за накопления в
пище патогенных микроорганизмов,
а также токсических продуктов метаболизма бактерий и грибов, например ботулотоксина, стафилококкового токсина, афлатоксинов и др.
Х
арактер и проявления микробиологической порчи продуктов
зависят как от спектра микроорганизмов, присутствующих в конкретном продукте, так и от характеристик самого продукта, влияющих на
состав и конкурентное взаимодействие
представителей аутохтонной и транзиторной микрофлоры. В свежих продуктах с хорошими условиями для
роста (рН, близкий к нейтральному,
высокое содержание влаги и питательных веществ) бактерии выигрывают
конкурентную борьбу у медленно
растущих дрожжей и плесеней. Поэтому свежее мясо, птица, рыба и молочные продукты редко содержат в значимых количествах дрожжи или плесени,
которые попадают в них из окружающей среды. Однако в более экстремальных условиях (низкие значения
рН, низкое содержание воды, присутствие консервантов), которые создаются в процессе обработки продуктов
для ограничения микробного роста и
увеличения сроков хранения, равновесие сдвигается в сторону грибов.
Грибы по морфологии традиционно
разделяют на одноклеточные – дрожжи
и дрожжеподобные грибы, и гифальные
грибы – плесени, тело которых (таллом)
состоит из переплетающихся ветвящихся нитей – гиф (рис. 1). Плесени, как
правило, аэробны и для их развития
требуется присутствие кислорода, тогда
как дрожжи способны развиваться как
в аэробных, так и в анаэробных условиях. Однако вне зависимости от мор-
фологии все грибы отличаются более
высокой по сравнению с большинством
бактерий устойчивостью к низким значениям рН, высокой осмотической активности среды, микробицидным агентам
и способны использовать более труднодоступные источники углерода.
Поэтому дрожжи и плесени как микроорганизмы порчи приобретают особое
значение как важный показатель качества и безопасности продуктов питания
[ 8 , 9 ] . В с о от в етст в и и с С а н П и Н
2.3.2.1078-01 дрожжи и плесени относят
к микроорганизмам порчи [8]. Кроме
того, некоторые представители грибов
рода Aspergillus (главным образом
A. flavus и A. parasiticus) способны продуцировать афлатоксины. Из всех
известных биологических ядов, обнаруженных на сегодняшний день, афлатоксины являются самыми сильными
гепатоканцерогенами.
В отечественной нормативно-методической базе существует по меньшей
мере семь методических документов,
регламентирующих определение дрожжей и плесеней в продуктах питания [1–
7]. Главное отличие методик, изложенных в отечественных и международных
документах, заключается в питательных
средах, которые регламентированы для
определения соответствующих показателей. Параметры методик, представленных в нормативно-методической
базе, для выявления дрожжей и плесеней приведены в табл. 1. Кроме того,
есть определенные различия в способах
посева, а также температуре и времени
Рис. 1. Морфология клеток плесневых грибов (слева) и дрожжевых клеток (справа)
Дистрибьютор продукции 3М - ООО "МикроБио"
123060 Москва, 1-Волоколамский проезд, д.10, Тел. (495)221-20-26, [email protected], www.mibio.ru
44
№5, 2014
МОЛОЧНАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ
Таблица 1
Среда инкубирования
рН
Температура, °С
Время, ч
Способ посева
Примечание
ГОСТ 10444.12–88
Среда Сабуро с антибиотиками
Сывороточный агар БФ
с антибиотиками
Сусло-агар
6,5±0,1
4,2±0,2
24±1
24±1
120
120
Глубинный
Глубинный
Для молочных продуктов
3,6±0,1
24±1
120
Глубинный
Для сильно контаминированных продуктов
ГОСТ Р ИСО 21527-1–2010
Агар с дихлораном, бенгальским
розовым и хлорамфениколом (DRBC)
5,6±0,2
25±1
120
Поверхностный
или глубинный*
Инкубация крышками вверх
ГОСТ 28805–90
Жидкая среда с сахаром-рафинадом,
глюкозой и дрожжевым экстрактом
Плотная среда с сахаром-рафинадом,
глюкозой и дрожжевым экстрактом
Сусло-агар с сахарозой
Агар с антибиотиками и сахарозой
5,8±0,1
30±1
168
–
Метод НВЧ
5,8±0,1
30±1
168
Глубинный
3,6±0,1
6,5±0,1
30±1
30±1
168
168
Глубинный
Глубинный
Допускается исследование
по ГОСТ 10444.12–88
Только для сгущенных молочных консервов
Только для сгущенных молочных консервов
ГОСТ Р ИСО 21527-2–2013
Дихлоран глицериновый агар (DG18)
5,6±0,2
25±1
120
Поверхностный
или глубинный*
Инкубация крышками вверх
ГОСТ 30706–00
Сусло-агар
Сывороточный агар БФ
Среда Сабуро
3,5–3,7
4,0–4,5
6,4–6,6
24±1
24±1
24±1
120±5
120±5
120±5
ГОСТ Р 51278–99
Селективный агар с хлорамфениколом (YGC)
6,6
25±1
120
Глубинный
МР № 24 ФЦ /900
Жидкая среда Сабуро 2 % глюкозы
YGC-агар
5,6±0,2
6,6±0,2
30±1
30±1
48±3
72±3
Затем высев на YGC
Поверхностный
Качественный анализ
Качественный анализ
* При условии подтверждения равнозначности способов посева.
инкубации. Такое разнообразие методических документов объясняется прежде всего тем, что показатель «дрожжи
и плесени» включает в себя две группы
грибов, определение которых требует
разных методических подходов.
ОСМОФИЛЬНЫЕ
(ОСМОТОЛЕРАНТНЫЕ)
ДРОЖЖИ И ПЛЕСЕНИ,
ОСОБЕННОСТИ ИХ
КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
И отечественный ГОСТ 28805–90 [2],
и вторая часть стандарта ГОСТ Р ИСО
21527–2013 [6] предназначены для
определения особой группы дрожжей
и плесеней, которые в отечественном
стандарте обозначены как «осмотолерантные», а в стандарте ИСО – как
«осмофильные дрожжи и ксерофильные плесени». Это отдельная группа
санитарно-значимых дрожжей и плесеней как микроорганизмов порчи играет
очень важную роль прежде всего для
продуктов с низким значением активности воды (табл. 2).
Вода в пищевых продуктах обусловливает консистенцию и структуру про-
дукта, а также его устойчивость при
хранении. Однако часто различные
пищевые продукты с одним и тем же
содержанием влаги портятся по-разному. Общая влажность продукта указывает лишь на количество влаги в нем,
но не характеризует ее причастность к
химическим, биохимическим и микробиологическим изменениям в продукте.
Принято считать, что решающим для
устойчивости продуктов при хранении
является соотношение свободной и связанной влаги. Взаимоотношение этих
характеристик отражает интегральный
показатель – «активность воды» (аw).
Таблица 2
Продукт
Фрукты
Яйца
Мясо
Хлеб
Сыр
Джем
Мед
Карамель
Печенье
Шоколад
Сахар
Влажность, %
аw
90–95
70–80
60–70
40–50
40
30–35
10–15
7–8
6–9
5–7
0–0,15
0,97
0,97
0,97
0,95
0,92–0,96
0,82–0,94
0,75
0,65
0,60
0,40
0,10
Чем ниже активность воды, тем меньше ее доступность для микроорганизмов
и продукт меньше подвержен порче, так
как очень немногие микроорганизмы
способны выживать в таких условиях
[9]. Только осмо(ксеро)фильные микроорганизмы (прежде всего отдельные
виды дрожжей и плесеней) способны
существовать при низких значениях аw.
У них хорошо развиты механизмы регуляции водного обмена и приспособления
к сохранению воды в клетке. Предельные значения аw для роста микроорганизмов, встречающихся в пищевых продуктах, приведены в табл. 3.
При выделении осмофильных грибов
из продуктов с низкой активностью воды
важно прежде всего избежать развития
у них осмотического шока, который возникнет при культивировании на традиционных изоосмолярных средах с
аw>0,95. Это учтено в соответствующих
отечественной [2] и международной [6]
методиках. Культивирование осмофильных дрожжей и плесеней осуществляется на специальных средах
с высокой осмотической активностью
(см. табл. 1).
Дистрибьютор продукции 3М - ООО "МикроБио"
123060 Москва, 1-Волоколамский проезд, д.10, Тел. (495)221-20-26, [email protected], www.mibio.ru
№5, 2014
МОЛОЧНАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ
Таблица 3
aw
Бактерии
0,97
Pseudomonas aeruginosa
0,95
Bacillus cereus, Clostridium
botulinum, Escherichia coli,
Clostridium perfringens,
Lactobacillus viridescens,
Salmonella spp.
0,94
Enterobacter aerogenes
0,93
Micrococcus lysodekticus
0,92
Дрожжи
Rhizopus nigricans
Rhodotorula mucilaginosa
0,90
Bacillus subtilis
Saccharomyces cerevisiae
0,88–0,86
Staphylococcus aureus
Candida, Torulopsis,
Debariomyces
0,84–0,81
0,78–0,75
0,62–0,61
Менее 0,60
Плесени
Mucor plumbeus
Paecilomyces variotti,
Penicillium chrysogenum,
Aspergillus fumigatus,
Penicillium glabrum
Halobacterium halobium
Aspergillus flavus,
Aspergillus niger
Zygasaccharomyces rouxii
Xeromyces bisporus
Отсутствие роста
МЕТОДИКИ ИССЛЕДОВАНИЯ
ПРОДУКТОВ С ВЫСОКОЙ
АКТИВНОСТЬЮ ВОДЫ
При определении дрожжей и плесеней в таких продуктах отечественные
методики регламентируют использование целого ряда сред и ингибирующих
добавок [1, 3, 4]. Это, с одной стороны,
отрицательно отражается на стандартизации условий определения показателя, но, с другой стороны, делает методики более гибкими, позволяющими
скорректировать условия анализа в
зависимости от особенностей исследуемого объекта. Немаловажно, что
методика ГОСТ 10444.12–88 рекомендует использовать коммерческие хромогенные среды [1].
Как и в методике определения осмотолерантных грибов, отечественные
методики [1, 3, 7] не предусматривают
биологического контроля питательных
сред, и только ГОСТ 10444.12–88 регламентирует проведение контроля стерильности среды [1]. ГОСТ Р на базе
стандарта ИСО [5] предусматривает
использование только одной среды:
агара с дихлораном, бенгальским розовым и хлорамфениколом (DRBC), в которую дополнительно могут быть внесены
добавки тетрациклина, микроэлементов
или тергитола. Перед применением регламентируется проведение количественного биологического контроля среды.
В рассматриваемых методиках также
нет единообразия в способах посева,
температуре и сроках инкубации
(см. табл. 1). Особенно это заметно в
отечественных методиках. Зарубежные
методики [4, 5, 6], несмотря на различия
исследуемых объектов, регламентируют
унифицированные условия культивирования: 25±1 °С в течение 120 ч (5 сут).
В отечественных методиках [1, 3] регламентирована температура 24±1 °С,
тогда как в [2, 7] – 30±1 °С; время инкубации согласно [1, 3, 7] составляет 120 ч
(5 сут), тогда как в [2] – 7 сут.
ХАРАКТЕРИСТИКА
СПОСОБОВ ПОСЕВА
В рамках отечественных методик
используется только глубинный посев,
тогда как в зарубежных основным
является поверхностный посев, а глубинный допускается только в том случае, если экспериментально доказано,
что он по эффективности не уступает
поверхностному.
У обоих способов посева имеются
преимущества и недостатки, что подробно рассмотрено в [5, 6]. Поверхностный способ посева обладает большей чувствительностью благодаря
прежде всего лучшему доступу кислорода, кроме того, предотвращается термическая инактивация части вегетативных клеток. Безусловно, эти параметры
будут варьировать, поскольку зависят
от видового состава грибов в исследуемом объекте. При поверхностном посеве дифференциация колоний дрожжей
и плесеней не вызывает затруднений в
отличие от глубинного посева, при кото-
45
ром большинство колоний находятся в
толще питательной среды. К недостаткам поверхностного посева можно
отнести значительное разрастание
колоний быстрорастущих (мукоровых)
плесеней, что зачастую делает невозможным учет результата. Кроме того,
перемещение чашек с такими посевами
должно быть крайне аккуратным, так
как сотрясение зрелых колоний плесеней приводит к рассеиванию спор и
появлению вторичных колоний, искажающих результат. Подобные посевы
являются серьезным источником контаминации окружающей среды, оборудования и персонала, поэтому работа
поверхностным методом требует усиленных мер биологической безопасности.
Для преодоления недостатков поверхностного способа посева в состав
питательных сред [5, 6] вводят дихлоран
и бенгальский розовый [5], которые
ограничивают бурное развитие быстрорастущих плесеней.
3M™ PETRIFILM™ RAPID YEAST
AND MOLD COUNT PLATE (RYM)
К альтернативным способам посева,
сочетающим преимущества обоих традиционных способов, относятся среды
на подложках – петрифильмы 3М™
Petrifilm™ Y&M. При их использовании
культивирование происходит в тонком
слое среды, что ограничивает разрастание колоний плесеней, не затрудняя
их идентификацию. Немаловажно, что
среды на подложках безопасны в плане
контаминации спорами окружающей
среды, так как посев сверху прикрыт
прозрачной полимерной пленкой.
В 2013 г. компания 3М разработала
тест-систему 3M™ Petrifilm™ Rapid
Yeast and Mold Count Plate (RYM) [12]
Рис. 2. Петрифильмы 3M™ Petrifilm™ Rapid
Yeast and Mold Count Plate для ускоренного
определения дрожжей и плесневых грибов
Дистрибьютор продукции 3М - ООО "МикроБио"
123060 Москва, 1-Волоколамский проезд, д.10, Тел. (495)221-20-26, [email protected], www.mibio.ru
46
МОЛОЧНАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ
для ускоренного определения дрожжей
и плесеней бактериологическим методом (рис. 2). При изготовлении данной
тест-системы использованы инновационные разработки, позволившие преодолеть главный недостаток бактериологического метода при определении
дрожжей и плесеней – продолжительность. Новая тест-система позволяет
получить результат анализа через 48–
60 ч (2–2,5 сут) против 5–7 сут при
исследовании традиционными методами, что особенно важно при оценке скоропортящихся продуктов с ограниченными сроками годности.
Тест-система 3M™ Petrifilm™ (RYM)
является универсальной, так как содержит среду, которая подходит для культивирования как обычных, так и осмотолерантных дрожжей и плесеней.
Кроме того, среда является хромогенной, благодаря чему колонии дрожжей
и плесеней приобретают голубую окраску, что облегчает их учет (рис. 3).
Использование петрифильмов 3M™
Petrifilm™ (RYM) – крайне простая процедура. Подготовленная проба в объеме
1 мл наносится на поверхность сухой
среды под покровную полимерную пленку и при помощи специального устройства-спредера распределяется по всей
площади среды.
За счет содержащейся в пробе влаги
происходит активация питательной
среды. Метоксилпектин, находящийся
в среде, полимеризуется, образуя плотный гель, внутри которого находится
материал пробы. Такой способ посева
предотвращает быстрое распространение колоний плесеней и появление
дочерних колоний из-за распространения созревших спор. Кроме того,
покровная полимерная пленка предотвращает контаминацию спорами окружающей среды и персонала.
Примечательно, что питательная
среда в петрифильмах 3M™ Petrifilm™
(RYM) в отличие от большинства традиционных сред для культивирования
дрожжей и плесеней не требует коррекции рН в процессе приготовления.
Посевы инкубируются при 25 или 28 °С
в течение 48 ч. При необходимости для
уточнения результата посевы оставляют
в термостате еще на 12 ч. Результат
учитывают простым подсчетом колоний,
окрашенных в голубой цвет. Помимо
контроля пищевых продуктов петрифильмы 3M™ Petrifilm™ (RYM) можно
использовать при исследовании объектов окружающей среды (воздух, отпечатки с поверхности, смывы).
№5, 2014
Рис. 3. Рост дрожжей (слева) и плесеней (справа) на петрифильмах 3M™ Petrifilm™ Rapid
Yeast and Mold Count Plate
Инновационные тесты 3M™ Petrifilm™ (RYM) обладают преимуществами, которые позволяют увеличить
эффективность и производительность
работы:
˜ быстрое получение надежного результата (в 2–3 раза быстрее по сравнению
с классическими методами);
˜ исключаются этапы приготовления, стерилизации и разливки питательных сред;
˜ нет необходимости в подготовке посуды;
˜ процедура посева значительно упрощена;
˜ занимают мало места при инкубации,
хранении и утилизации;
˜ сроки хранения не уступают срокам
хранения сухих сред;
˜ упрощение процедуры посева, стандартизация процесса учета результата
позволяют снижать субъективные ошибки и высвобождать высококвалифицированный персонал для выполнения
других задач.
Специалисты компании 3M провели
сравнительные испытания метода
петрифильмов 3M™ Petrifilm™ (RYM) с
референсным методом ISO 21527: Parts
1&2 [5, 6]. В рамках этих исследований
было проведено сравнение ростовых
свойств петрифильмов 3M™ Petrifilm™
(RYM) с традиционными средами: DRBC
и картофельно-декстрозным агаром на
чистых культурах дрожжей и плесеней.
В качестве тестовых культур были
использованы 19 штаммов дрожжей и
21 изолят плесеней. Эффективность
сред сравнивалась при 25 и 28 °С, а
также через 48 и 60 ч инкубации. На
втором этапе были выполнены сравнительные исследования 42 образцов
пищевых продуктов, часть которых подвергалась искусственному заражению
эталонными штаммами дрожжей и плесеней. На третьем этапе сравнивалась
эффективность петрифильмов 3M™
Petrifilm™ (RYM) при проведении исследований объектов окружающей среды.
Исследования продемонстрировали
отсутствие достоверных различий
результатов, полученных методом 3M™
Petrifilm™ (RYM) и референсным методом. На всех этапах исследования
петрифильмы 3M™ Petrifilm™ (RYM) не
уступали в эффективности традиционным средам, но при этом позволяли
получить результат в 2–3 раза быстрее!
Ускоренный метод подсчета дрожжей
и плесеней с использованием петрифильмов 3M™ Petrifilm™ Rapid Yeast
and Mold Count Plate (RYM) сертифицирован международной организацией
AOAC (Association of Analytical Communities), сертификат № 121301.
Выбор методики определения грибов
зависит от природы исследуемого объекта и прежде всего от параметра
активности воды (аw), поскольку для
культивирования осмотолерантных грибов требуются среды с более низким
значением аw. Традиционные способы
посева, используемые в отечественных
и международных методиках, имеют
ряд преимуществ и недостатков. Поверх ност ный способ обеспечивает
большую чувствительность этих методик, но делает посевы потенциальным
источником контаминации окружающей
среды спорами плесеней, а результаты
могут искажаться появлением вторичных колоний из-за рассеивания зрелых
спор при малейшем сотрясении чашки
с посевом. Кроме того, колонии быстрорастущих плесеней часто делают
невозможным учет результата. Глубинный способ посева более безопасный в плане контаминации окружающей
среды, предотвращает разрастание
колоний быстрорастущих грибов и
появление вторичных колоний плесеней
из-за распространения спор. Однако
Дистрибьютор продукции 3М - ООО "МикроБио"
123060 Москва, 1-Волоколамский проезд, д.10, Тел. (495)221-20-26, [email protected], www.mibio.ru
№5, 2014
его чувствительность по сравнению с
поверхностным посевом часто ниже изза ухудшения доступа кислорода и
частичной инактивации вегетативных
клеток в горячей среде.
Инновационная тест-система с использованием петрифильмов 3M™
Petrifilm™ Rapid Yeast and Mold Count
Plate (RYM) для определения дрожжей
и плесеней сочетает преимущества глубинного и поверхностного способов
посева, позволяет исследовать продукты как с высокой, так и с низкой активностью воды. Петрифильмы содержат
хромогенную среду, облегчающую учет
результатов. Определение дрожжей и
плесеней на петрифильмах осуществляется в 2–3 раза быстрее по сравнению
Микробиология,
контроль гигиены,
химический анализ воды
ООО «МикроБио»
123060, Москва,
1-й Волоколамский проезд, 10
Тел.: (495) 221-20-26,
www.mibio.ru, [email protected]
МОЛОЧНАЯ ПРОМЫШЛЕННОСТЬ
с классическим методом, что позволяет
считать петрифильмы 3M™ Petrifilm™
Rapid Yeast and Mold Count Plate (RYM)
привлекательным инструментом для
санитарного контроля пищевых продуктов и сырья.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. ГОСТ 10444.12–88 «Продукты пищевые.
Метод определения дрожжей и плесневых
грибов».
2. ГОСТ 28805–90 «Продукты пищевые.
Методы выявления и определения количества осмотолерантных дрожжей и плесневых
грибов».
3. ГОСТ 30706–2000 «Продукты молочные
для детского питания. Метод определения
количества дрожжей и плесневых грибов».
4. ГОСТ Р 51278–99 (ИСО 7698–90) «Зерновые, бобовые и продукты их переработки.
Определение количества бактерий, дрожжевых и плесневых грибов».
5. ГОСТ Р ИСО 21527-1–2010 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для
животных. Метод подсчета дрожжевых и
плесневых грибов. Часть 1. Методика подсчета колоний в продуктах, активность воды
в которых больше 0,95».
47
6. ГОСТ Р ИСO 21527-2–2013 «Микробиология пищевых продуктов и кормов для
животных. Метод подсчета дрожжевых и
плесневых грибов. Часть 2. Методика подсчета колоний в продуктах, активность воды
в которых меньше или равна 0,95».
7. Методы выявления дрожжей и плесневых грибов в пищевых продуктах: методические рекомендации № 24 ФЦ /900. –
М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора
Минздрава России, 2004.
8. СанПиН 2.3.2.1078-01 «Гигиенические
требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов».
9. Современная пищевая микробиология /
Дж. М. Джейм; М.Дж. Лесснер, Д.А. Гольден. – М.: Бином, 2012.
10. Global food losses and food waste: extent,
causes and prevention / J. Gustavsson [et al.]. –
Rome: FAO, 2011. – 38 p.
11. J Huis In't Veld, J.H. Microbial and biochemical spoilage of foods: an overview //
International Journal of Food Microbiology. 1996. –
Vol. 33, № 1. – P. 1–18.
12. 3М Продукция для пищевой индустрии.
Тест-пластина 3MTM PetrifilmTM для быстрого
подсчета дрожжевых и плесневых грибов.
Инструкция по применению и интерпретации
результатов. Компания 3М, 2013.
Дистрибьютор продукции 3М - ООО "МикроБио"
123060 Москва, 1-Волоколамский проезд, д.10, Тел. (495)221-20-26, [email protected], www.mibio.ru