В век высоких технологий человечество стремится ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
advertisement
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ В век высоких технологий человечество стремится Актуальность темы. заменить энергоёмкие и вредные для окружающей среды производства процессами, использующими потенциал природы. В то время как человечество делает свои первые шаги, создавая наноматериалы, живая клетка уже давно имеет их в ассортименте. Белки – природные молекулы нанометровой величины, которые выполняют в клетке все необходимые функции, начиная от структурной и заканчивая транспортной и каталитической. Всё большее число современных производителей переходит на использование ферментов в качестве катализаторов, имеющих ряд преимуществ по сравнению с химическим синтезом. Ферментативные реакции отличаются стереоспецифичностью, не требуют высоких температур, и, что более важно, не образуют не встречающихся в природе вредных побочных продуктов – ксенобиотиков. Однако производство ферментных препаратов представляет собой сложный процесс, включающий дорогостоящий этап очистки. Для возможности оптимизации свойств и повторного использования ферменты часто наносят на специальные носители (иммобилизация ферментов), что является одним из вариантов использования иммобилизованных на носителях белков. В научной и прикладной литературе в последнее время все большее внимание привлекает к себе перспектива закрепления белков на поверхности клеток микроорганизмов. Иммобилизация ферментов in vivo имеет ряд преимуществ по сравнению с иммобилизацией на сорбентах. Фермент, продуцируемый клеткой, оказывается связанным с ней сразу после транспортировки его наружу, что сводит трудоемкий процесс очистки белка к простому отделению клеток фильтрацией. Более того, отпадает необходимость как в связывании фермента с сорбентом, так и в сорбенте как таковом. Таким образом, получение клеток-биокатализаторов с экспонированными на поверхности клеток ферментами открывает перспективу новых технологических решений для производственных нужд. Помимо этого, необходимо отметить, что иммобилизация in vivo представляет собой интерес не только для создания клеточных биокатализаторов с закреплёнными на поверхности ферментами. Во-первых, на поверхности клетки рационально вести процессы биотрансформации, особенно если субстрат или продукт реакции являются токсичными для клетки. Во-вторых, можно моделировать проведение нескольких последовательных реакций, закрепив на клетке катализирующие их ферменты. В-третьих, взаимодействие белков на поверхности клеточной стенки происходит в пределах тонкого слоя, что предоставляет возможность сборки полимерных белковых структур образующих мономолекулярный слой. Так как, полифункциональность белковых молекул 1 позволяет им взаимодействовать с молекулами как биологического, так и синтетического происхождения, разумно предположить, что дальнейшее развитие данного направления исследований позволит использовать клеточную стенку в качестве платформы для сборки надмолекулярных полимерных структур разнообразной химической природы. Исходя из этого, перед нами была поставлена задача, заключающаяся в поиске подходов для эффективного экспонирования белков на поверхности клеточной стенки микроорганизмов. В качестве перспективного объекта нами были выбраны дрожжи Yarrowia lipolytica, как реципиент с высоким потенциалом экспрессии и секреции рекомбинантных белков, в качестве модельного белка липаза Y. lipolytica Lip2. Цели и задачи работы. Данная работа посвящена разработке систем для эффективного экспонирования белков на поверхности клеточной стенки дрожжей Y. lipolytica. В связи с этим ставились следующие задачи: 1. Анализ генома дрожжей Y. lipolytica для выявления ранее не охарактеризованных предполагаемых белков клеточной стенки, пригодных для экспонирования белков на поверхности клетки. 2. Изучение способности ранее охарактеризованного белка клеточной стенки Y. lipolytica YlPir1 закреплять белки на поверхности клетки на примере красного флуоресцентного белка. 3. Изучение основных способов экспонирования белков на поверхности клеточной стенки для in vivo иммобилизации липазы Y. lipolytica Lip2. Сравнение способности раннее охарактеризованных и найденных предполагаемых белков клеточной стенки закреплять липазу на поверхности клеток дрожжей. 4. Изучение свойств клеточно-связанной липазы. 5. Получение штаммов-продуцентов клеточно-связанной липазы. Научная новизна. В работе разработаны подходы для экспонирования белков на поверхности клеточной стенки дрожжей Y. lipolytica. Посредством анализа генома найден ряд новых предполагаемых белков клеточной стенки. Было показано, что добавление их аминокислотной последовательности к аминокислотной последовательности фермента липазы приводит к эффективному закреплению полученного рекомбинантного комплекса на поверхности клеток. В представленной работе были в дрожжах Y. lipolytica изучены два основных способа экспонирования липазы. В первом случае закрепление осуществлялось с помощью С-концевых участков (доменов) белков клеточной стенки, обладающих сигналом прикрепления гликозилфосфатидилинозитола (GPI), что обусловливает ковалентное связывание с β-1,6-гликанами клеточной стенки. Были проанализированы С-домены шести новых предполагаемых белков 2 клеточной стенки, а также ранее охарактеризованного белка Ylcwp1 на способность экспонировать липазу Lip2 на поверхности клетки. Второй способ – присоединение белка клеточной стенки или его N-домена к N-концу фермента. Белок YlPir1, который связывается через дисульфидные мостики с гликопротеинами клеточной стенки, а также N-домен выявленного предполагаемого гликопротеина YALI0C09031p, участвующего в адгезии, впервые были использованы для изучения второго способа экспонирования липазы. Следует отметить, что проведённое исследование позволило среди проанализированных вариантов выбрать лучшую систему для in vivo иммобилизации. Полученные штаммы обладают высокой активностью клеточносвязанной липазы, варьирующей от 3200 до 18800 ед/г сух веса, в зависимости от используемой для иммобилизации аминокислотной последовательности белков клеточной стенки. Практическая значимость. Липаза – фермент, относящийся к классу гидролаз, катализирует расщепление сложноэфирных связей в липидах. Липазы используются для гидролиза молекулы триацилглицеридов с образованием диглицеридов, моноглицеридов, жирных кислот и глицерина. Помимо этого, липаза способна катализировать этерификацию и переэтерификацию. Эта многофункциональность делает липазу весьма привлекательной для практического использования в пищевой, фармацевтической, кожевенной, текстильной, косметической промышленностях, в производстве ПАВ и бумаги и других отраслях промышленности. Закрепление такого промышленно-важного фермента как липаза на поверхности клеточной стенки дрожжей является актуальным направлением в современной биотехнологии. Однако, несмотря на большой интерес получения подобных клеток-биокатализаторов, достигаемые до настоящего времени уровни активности клеточно-связанной липазы были недостаточно высоки для их промышленного применения. В представленной работе получены штаммы, наибольшая активность клеточно-связанной липазы у которых составляет 18800 ед/г сух веса, что соответствует экспонированию 1,2×106 молекул на поверхности каждой клетки. Достигнутые уровни сопоставимы с уровнем продукции секретируемого фермента штаммом-продуцентом липазы (примерно 0,1 г/л при ферментации в пробирках) и в 70 раз превышают лучшие ранее опубликованные результаты. Клеточносвязанная липаза обладает значительно более высокой термостабильностью, чем свободная форма фермента, сохраняя 57% активности при инкубации на протяжении 6 часов при 450С, тогда как свободная липаза полностью теряет каталитическую активность в этих условиях. Полученные клетки-биокатализаторы с экспонированной на поверхности липазой сохраняют 86-98% активности после 3 трёх повторных раундов использования, что в разы превосходит уровень остаточной активности фермента, иммобилизованного на сорбентах. листах машинописного Структура работы. Диссертация изложена на рисунка и таблиц. Работа состоит из введения, обзора текста, включая литературы, описания материалов и методов, изложения и обсуждения результатов, работ заключения, выводов и списка литературы. Список литературы включает отечественных и зарубежных авторов. Апробация работы. Материалы исследования по теме диссертации опубликованы в четырёх печатных работах, в том числе одной статье и одном патенте. Диссертационная работа была изложена на международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» и семинаре секции «Генетика микроорганизмов» Учёного Совета ФГУП «ГосНИИгенетика». СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Выявление новых потенциальных белков клеточной стенки В дрожжах Y. lipolytica на настоящий момент охарактеризовано несколько белков клеточной стенки, среди которых только для двух Ylcwp1 и YlPir1 известен механизм закрепления на поверхности клетки. Ylcwp1 (cell wall protein) является гликопротеином, на С-концевой части которого расположен сайт прикрепления гликозилфосфатидилинозитола (GPI), что обеспечивает ковалентное прикрепление к β-1,6-гликанами клеточной стенки. Его С-домен размером 110 аминокислот ранее использовался для экспонирования на поверхности клетки зелёного флуоресцентного белка EGFP, гемолизина Vibrio harveyi, щелочной протеазы Aureobasidium pullulans и кислой протеазы Saccharomycopsis fibuligera. Белок клеточной стенки YlPir1, хотя и является гомологом белка клеточной стенки Saccharomyces cerevisiae Pir1p, не обладает внутренними повторами PIR (protein internal repeats) и прикреплён не к β-1,3-гликанам клеточной стенки (как группа белков S. cerevisiae Pir-CWPs), а связан дисульфидными мостиками с гликопротеинами клеточной стенки дрожжей Y. lipolytica. Одной из задач данной работы было осуществление эффективной иммобилизации липазы Lip2 на поверхности клеточной стенки Y. lipolytica. Активный центр липазы находится на С-конце, поэтому использование наиболее изученного способа – присоединение С-домена белков клеточной стенки, может нарушить работу фермента. В настоящей работе мы постарались решить данную проблему двумя способами. С одной стороны, впервые в дрожжах Y. lipolytica разработать систему N-концевого способа закрепления на поверхности клетки с 4 помощью охарактеризованного белка YlPir1 и N-домена нового выявленного гликопротеина, участвующего в процессе адгезии. С другой стороны, внедрить синтетический глицин-серинового мотив (спейсер) GSSGGSGGSGGSGS между липазой Lip2 и С-доменом белка клеточной стенки. Данный мотив обеспечивает пластичное соединение двух функциональных доменов в иммобилизованном ферменте. Из литературных данных, приведённых для S. cerevisiae, известно, что не все С-домены белков клеточной стенки одинаково эффективно экспонируют белки на поверхности клетки. Вследствие этого мы изучали способность белка Ylcwp1 и шести выявленных предполагаемых гликопротеинов иммобилизовать липазу с целью выбрать лучший вариант и получить наибольшую активность клеточно-связанного фермента. 1.1. Выявление гомологов белка клеточной стенки дрожжей Y. lipolytica Ylcwp1 С помощью компьютерной программы BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) по гомологии к белку клеточной стенки Y. lipolytica Ylcwp1 были выявлены белки YALI0C22836p, YALI0D27214p, YALI0E11517p, YALI0E31108p и YALI0F18788p. Эти белки обладают гидрофобной С-терминальной частью, в которой расположен предполагаемый сайт GPI-прикрепления – аминокислотный мотив NGA (Рис. 1). Помимо этого, четыре белка из пяти выявленных (YALI0C22836p, YALI0D27214p, YALI0E31108p и YALI0F18788p) также имеют в составе С-домена аминокислотный мотив VSQIG(N)DGQIQA. Эта особенность была ранее показана и для белка Ylcwp1. Данный аминокислотный мотив является частью внутренних повторов PIR, которые характеризуют некоторые белки клеточной стенки S. cerevisiae – Cwp1, Cwp2, Srp1, а также группу белков Pir-CWPs. Ylcwp1 YALI0C22836p YALI0D27214p YALI0E11517p YALI0E31108p YALI0F18282p Ylcwp1 YALI0C22836p YALI0D27214p YALI0E11517p YALI0E31108p YALI0F18282p ----------------GAVVTQIGDGQIQAPPSAPPA-------APEQANGAVSVGVSAA ----------------TAVVTQIGDGQIQAPPST----------AAAQANGAAALGVSAA VAAPKSEAAAGAHATAGAIVSQINDGQIQAPHSTGPAQAPKASAPPAQANGAATLGVSAV ----------------TGEPSQP--AQATEPTTG-----------PAQANGAAAFGVSVA TAAAASPAPAPAKTTPGAIVSQIGDGQIQAPPST----------QPAQANGAAAMGVSAV ------TAAPAPGSNNGAVVSQIGDGQIQAPPSA----------APEQANGAAALGVSAA . :* .* * : . *****.:.***.. ALGVAAAALLI 221 AAGVVVVAALF 66 AG-AVAVAMLF 252 AAGVAAAALLI 224 AGVVVAAAMLF 236 AAGVVAAAMLF 234 * ....* *: 210 55 242 213 225 223 Рис. 1 Фрагмент (С-концевой участок) множественного выравнивания выявленных предполагаемых гликопротеинов и белка клеточной стенки Ylcwp1. Выравнивание проводили с помощью программы ClustalW (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). Черным цветом обозначен сайт узнавания GPI, серым цветом обозначен мотив внутренних повторов PIR. 5 Длина предполагаемого белка клеточной стенки YALI0C22836p составляет всего 66 аминокислот. Он состоит из предполагаемой сигнальной последовательности, частичного PIR мотива, предполагаемого сайта прикрепления GPI и 19-ти гидрофобных С-концевых аминокислот. Белок YALI0C22836p характеризуется 25% гомологией к белку клеточной стенки S. cerevisiae Cwp2, вместе с которым включен в группу гликопротеинов, участвующих в поддержании устойчивости клеточной стенки к низким значениям рН (http://www.genolevures.org/fam/GL3C3785). Поэтому данный белок YALI0C22836p был обозначен как Ylcwp2. Гликопротеины YALI0D27214p, YALI0E11517p, YALI0E31108p и YALI0F18282p вместе с белком Ylcwp1 составляют группу белков клеточной стенки, гомологичных гликопротеину S. cerevisiae Cwp1. Эти белки были обозначены как Ylcwp3, Ylcwp4, Ylcwp5 и Ylcwp6, соответственно. Аминокислотное выравнивание пяти новых предполагаемых белков клеточной стенки с уже охарактеризованным Ylcwp1 показало, что белки Ylcwp2, Ylcwp3, Ylcwp4, Ylcwp5 и Ylcwp6 обладают к нему гомологией, равной 16,7%, 31,5%, 32,9%, 30,1% и 37,3%, соответственно. Анализ распределения гидрофобных/гидрофильных аминокислот в гликопротеинах Ylcwp1, Ylcwp2, Ylcwp3, Ylcwp4, Ylcwp5 и Ylcwp6 проводили, используя разработанную для этих целей программу «The Kyte-Doolittle plot» Исходя из (http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.cgi?rm=misc1). полученных результатов, были выбраны последовательности С-доменов белков Ylcwp1, Ylcwp2, Ylcwp3, Ylcwp4, Ylcwp5 и Ylcwp6 размером 94, 34, 121, 129, 168 и 139 аминокислот, соответственно (Рис. 2). 1.2. Выявление ближайшего гомолога белка клеточной стенки S. cerevisiae Flo1p в дрожжах Y. lipolytica С помощью компьютерной программы BLASTp (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) по гомологии к белку клеточной стенки S. cerevisiae Flo1p (гликопротеин, ответственный за флоккуляцию) был выявлен ряд белков Y. lipolytica, среди которых только один белок YALI0C09031p обладал наибольшей гомологией, равной 20%. YALI0C09031p входит в группу гликопротеинов, участвующих в процессе адгезии (http://www.genolevures.org/fam/GL3M4590). Он состоит из 1347 аминокислот и обладает предполагаемым сайтом GPI-прикрепления – аминокислотный мотив NSA. Исходя из распределения гидрофобных/гидрофильных аминокислот, была выбрана последовательность Сдомена данного гликопротеина размером 667 аминокислот (Рис. 2). N-домен белка YALI0C09031p в своём составе имеет множество аминокислотных повторов: 7 повторов аминокислотного мотива PTTSEEP, 9 повторов SVEPT, которые вместе образуют 3 повтора мотива PTTSEEPTSSVEPTTSEEP. Мы предположили, что по аналогии с N-доменом Flo1p, 6 аминокислотные повторы которого обусловливают функцию белка, отвечающую за флоккуляцию клеток, повторы в YALI0C09031p также обеспечивают способность последнего к нековалентному связыванию с клетками посредством адгезии. Для построения вектора для экспонирования белков на поверхности клеточной стенки был выбран N-домен Flo1p гомолога размером 662 аминокислоты. Рис. 2 Распределение гидрофобных/гидрофильных аминокислот в (предполагаемых) гликопротеинах клеточной стенки («The Kyte-Doolittle plot») 7 2. Экспонирование красного флуоресцентного белка TurboFP635 на поверхности клеток дрожжей Y. lipolytica На примере красного флуоресцентного белка TurboFP635 была разработана система для иммобилизации in vivo на поверхности клетки с помощью N-концевого присоединения белка клеточной стенки YlPir1. Для этого был сконструирован вектор pY-YlPIR1-TurboFP635 (Рис. 3), содержащий находящиеся в рамке считывания ген YlPIR1 (без стоп кодона) и нуклеотидную последовательность, кодирующую красный флуоресцентный белок. Экспрессионный вектор также содержал участки транспозонных повторов zeta для негомологичной рекомбинации, синтетический промотор hp4d, терминатор гена XPR2 и дефектный маркер ura3d4 для отбора трансформантов с многокопийной интеграцией в геном, фланкированный сайтами Рис. 3 Экспрессионный вектор узнавания рекомбиназы Cre фага pY-YlPIR1-TurboFP635 для экспонирования P1 (lox66 и lox71). Полученный обрабатывали красного флуоресцентного белка на вектор эндонуклеазами рестрикции CpoI и поверхности клеток дрожжей Y. lipolytica PstI, высвобождая экспрессионную кассету Y-YlPIR1-TurboFP635, которую использовали для трансформации штамма Po1f (Leu+). Трансформанты отбирали на агаризованной среде YNBD – минимальная дрожжевая среда YNB с добавлением глюкозы (2%) по комплементации ауксотрофности по урацилу. Примерно половина трансформантов приобретала красное окрашивание после 5-ти дневного хранения при 40С. Длины волн, при которых белок TurboFP635 поглощает и испускает излучение, составляют 588 нм и 635 нм, соответственно, и находятся в диапазоне видимого света. Вероятно, накопление избытка данного белка приводит к красному окрашиванию культуры (Рис. 4). Разный уровень экспрессии белка, вследствие использования вектора для многокопийной трансформации, может объяснить наличие или отсутствие окраски культуры разных трансформантов. Флуоресцентная микроскопия данного штамма показала неравномерное распределение красного флуоресцентного белка (Рис. 5). Однако оставалось неясным, располагался ли избыток красного флуоресцентного белка локусами на поверхности клетки или же накапливался внутриклеточно. 8 Рис. 4 Фенотипы штамма, экспрессирующего клеточносвязанный красный флуоресцентный белок (а), и контрольного штамма Po1f (Leu+Ura+) (b) Рис. 5 Фазово-контрастная (a) и флуоресцентная (b) микроскопия штамма, содержащего конструкцию YlPir1-TurboFP635 Рис. 8 Локализация белка клеточной стенки S. cerevisiae Pir1p по данным Sumita T. et al. CFW - окрашивание клетки калькофлуором белым; Pir1pmRFP - флуоресценция клетки, экспрессирующей Pir1p-mRFP; Merged - совмещённая фотография. 9 Для выяснения локализации избытка красного флуоресцентного белка была измерена внутриклеточная флуоресценция. Для этого клетки разрушали стеклянными шариками, клеточный дебрис отделяли центрифугированием и измеряли флюоресценцию в образованном лизате. Как видно из Рисунка 6, внутриклеточная флуоресценция составляет всего 5% от общего уровня. Рис. 6 Флуоресценция суспензии клеток и в клеточном лизате, образованном в результате разрушения клеток и отделения клеточного дебриса Было изучено влияние обработки клеточной суспензии протеиназой К. При инкубации суспензии клеток с протеиназой К на протяжении 4 ч при 370C флуоресценция практически полностью исчезает (Рис. 7). В качестве контроля использовали такую же суспензию клеток в таких же условиях, к которой вместо фермента добавляли воду. Рис. 7 Обработка клеточной суспензии протеиназой К Эти данные являются аргументом в пользу того, что красный флуоресцентный белок не накапливается во внутриклеточных органеллах, а неравномерно иммобилизуется на поверхности клетки. Полученные результаты согласуются с литературными данными по изучению локализации гомолога YlPir1 в дрожжах S. cerevisiae Pir1p. Было 10 показано, что Pir1p располагается внутри хитиновых колец точек почкования, а не распределён равномерно по поверхности клеточной стенки (Рис. 8). Далее локализация YlPir1на поверхности клетки была подтверждена сшивкой с липазой Lip2 и измерением активности фермента, ассоциированного с клетками 3. Экспонирование липазы Lip2 на поверхности клеточной стенки дрожжей Y. lipolytica с помощью N-концевого способа закрепления Для изучения иммобилизации липазы на поверхности клеточной стенки с помощью N-концевого способа прикрепления нами были выбраны две аминокислотные последовательности – белка клеточной стенки YlPir1 и N-домена Flo1p гомолога YALI0C09031p. На примере красного флуоресцентного белка TurboFP635 мы показали, что YlPir1 может быть использован для закрепления белков на поверхности клеточной стенки дрожжей Y. lipolytica. Мы предположили, что, как и гликопротеин клеточной стенки S. cerevisiae Flo1p, его найденный гомолог YALI0C09031p обладает двумя доменами прикрепления к клеточной стенке. С помощью С-домена данный белок сам ковалентно связывается с клеточной стенкой, а N-домен же способствует нековалентному связыванию с другими клетками, образуя клеточные агрегаты (Рис. 9). Вероятно, рекомбинантный комплекс Ndom-Lip2 сначала может секретироваться в среду культивирования, а потом связываться с клеткой с помощью механизма адгезии. На Рисунке 9 представлено схематическое изображение рекомбинантных комплексов, сконструированных для in vivo иммобилизации липазы Lip2 с помощью N-концевого способа закрепления, и экспонирование их на поверхности клеточной стенки. 11 Рис. 9 Схематическое изображение рекомбинантных белковых комплексов, сконструированных для иммобилизации липазы in vivo с помощью N-концевого способа закрепления (А), и экспонирование их на поверхности клеточной стенки (Б). Предположительная экспозиция и функция потенциального гликопротеина гомолога Flo1p YALI0C09031p (В). 3.1. Скрининг полученных трансформантов Для экспонирования липазы Lip2 на поверхности клеточной стенки с помощью белка YlPir1 и N-домена гомолога Flo1p были сконструированы экспрессионные вектора pY-YlPIR1-LIP2 и pY-Ndom-LIP2, соответственно (Рис. 10). Данные вектора обрабатывали эндонуклеазами рестрикции MunI и XbaI, полученные кассеты Y-YlPIR1-LIP2 и Y-Ndom-LIP2 использовали для трансформации штамма Po1f (Leu+). Рис. 10 Экспрессионные вектора для иммобилизации липазы на поверхности клетки с помощью N-концевого способа прикрепления Трансформанты отбирали на среде YNBD по комплементации ауксотрофности по урацилу. Для эффективной экспрессии в настоящей работе мы использовали вектор, обладающий дефектным маркером ura3d4. Данная система позволяет отбирать трансформанты с разным числом копий, встраиваемых в геном, поэтому мы всегда проверяли по 20 трансформантов для каждой изучаемой конструкции и наблюдали разные уровни активности липазы. В дополнение к разному числу копий, разброс величин активностей можно объяснить также влиянием так называемого «эффекта положения» - достаточно вероятностным встраиванием части копий в неудачный, «молчащий» участок генома. Ферментацию трансформантов проводили в среде YNBDO – минимальная дрожжевая среда YNB с добавлением глюкозы (5%) и оливкового масла (5%) в 12 пробирках (50 мл) с рабочим объёмом 10 мл при 300C и постоянном перемешивании (250 об/мин). Во время культивирования контролировали рН среды, если рН опускался ниже значения 4.5, добавляли мел в концентрации 10 г/л. В качестве контроля использовали дикий штамм Po1f (Leu+Ura+), а также штаммпродуцент секретируемой липазы Y-3260. Штамм Y-3260 был получен путём трансформации штамма Po1f(Leu+) экспрессионной кассетой Z-ura3d4-hp4d-LIP2, аналогичной кассетам для иммобилизации липазы in vivo, однако не содержащей нуклеотидной последовательности, кодирующей фрагмент или весь белок клеточной стенки. Активность липазы измеряли на 5 сутки ферментации методом, основанным на гидролизе п-нитрофенилбутирата с образованием бутирата и п-нитрофенола. Суспензию клеток (400 мкл) осаждали центрифугированием, промывали дважды изотоническим раствором и разводили в 100–10000 раз, в зависимости от активности. Для определения сухой биомассы клеток 1 мл суспензии клеток осаждали центрифугированием и лиофилизировали в сушильном шкафу. На Рисунке 11 представлена активность клеточно-связанной липазы, закреплённой на поверхности клетки с помощью белка YlPir1 и N-домена гомолога Flo1p. Следует отметить, что у всех трансформантов активность фермента, ассоциированного с клетками, намного превышала таковую контрольных штаммов. Активность липазы, иммобилизованной с помощью YlPir1, варьировала от 1400 до 17200 ед/г сухого веса. Активность липазы, экспонированной на поверхности клеточной стенки с помощью N-домена YALI0C09031p, находилась в диапазоне 1300 – 9170 ед/г сухого веса. Клеточно-связанная активность липазы штаммов Po1f (Leu+Ura+) и Y-3260 составляла 25 и 667 ед/г сухого веса, соответственно. Рис. 11 Скрининг трансформантов, продуцирующих клеточно-связанную липазу, закреплённую на поверхности клетки с помощью белка клеточной стенки YlPir1 и N-домена гомолога Flo1p (YALI0C09031p) 13 Для дальнейшего изучения были выбраны трансформанты, обладающие наибольшим уровнем активности клеточно-связанной липазы, и депонированы в коллекции ВКПМ под номерами Y-3600 и Y-3601. 3.2. Ферментация лучших штаммов Ферментацию штаммов Y-3600 и Y-3601, продуцирующих клеточносвязанную липазу, закреплённую на поверхности клетки с помощью YlPir1 и Nдомена YALI0C09031p, соответственно, проводили в трёх повторностях в среде YNBDO в пробирках (50 мл) с рабочим объёмом 10 мл. Для поддержания рН добавляли мел (10 г/л). Активность клеточно-связанной липазы определяли на 3, 4 и 5 сутки культивирования, как описано выше. Активность секретируемой формы липазы измеряли аналогично. Как видно из Рисунка 12, наибольшее наблюдаемое значение активности клеточно-связанной липазы, иммобилизованной с помощью белка клеточной стенки YlPir1 достигалось на 5 сутки культивирования и составляло 17200 ед/г сухого веса (1050 ед/мл). При этом около 84% липазной активности обнаружено в закреплённой на клетках форме. Активность липазы в среде культивирования была равной 200 ед/мл. Полученный результат соответствует экспонированию 1×106 молекул фермента на поверхности одной клетки. Следует отметить, что активность секретируемой липазы штаммапродуцента Y-3260 в аналогичных условиях составляет 1200 ед/мл , что характеризует продукцию равную 0,1 г/л фермента [РосПатент 2355754]. Рис. 12 Ферментация штамма Y-3600, продуцирующего липазу Lip2, закреплённую на поверхности клетки с помощью YlPir1 14 При использовании N-домена белка клеточной стенки YALI0C09031p для иммобилизации липазы наибольшая активность клеточно-связанного фермента составляла 9200 ед/г сухого веса (Рис. 13), что соответствует экспонированию 6×105 молекул на поверхности одной клетки. В среде культивирования было обнаружено около 37% от общей активности (300 ед/мл). Рис. 13 Ферментация штамма Y-3601, продуцирующего липазу Lip2, закреплённую на поверхности клеточной стенки с помощью N-домена YALI0C09031p 4. Экспонирование липазы Lip2 на поверхности клеточной стенки дрожжей Y. lipolytica с помощью С-доменов белков клеточной стенки С целью изучения способности С-доменов ранее охарактеризованного гликопротеина Ylcwp1 и выявленных предполагаемых белков клеточной стенки гомолога Flo1p (YALI0C09031p), Ylcwp2, Ylcwp3, Ylcwp4, Ylcwp5 и Ylcwp6 иммобилизовать липазу Lip2 на поверхности клетки был получен ряд рекомбинантных белковых комплексов, в которых липаза Lip2 присоединена своим С-концом к N-концу С-доменов изучаемых гликопротеинов. На Рисунке 14 представлено схематическое изображение полученных рекомбинантных белковых комплексов и их экспозиция на поверхности клеток дрожжей. Были сконструированы экспрессионные вектора для микробиологической иммобилизации pY-LIP2-Cdom, pY-LIP2-YlCWP1-94, pY-LIP2-YlCWP2-34, pYLIP2-YlCWP3-121, pY-LIP2-YlCWP4-129, pY-LIP2-YlCWP5-168 и pY-LIP2YlCWP6-139, соответственно (Рис. 15). 15 Рис. 14 Схематическое изображение рекомбинантных белковых комплексов, сконструированных для иммобилизации липазы in vivo с помощью С-доменов белков клеточной стенки (А), и экспонирование их на поверхности клеточной стенки (Б) С-домены белков клеточной стенки Плазмиды YlCWP1- 94аа pY-LIP2-YlCWP1-94 YlCWP2- 34аа pY-LIP2-YlCWP2-34 YlCWP3- 121аа pY-LIP2-YlCWP3-121 YlCWP4- 129аа pY-LIP2-YlCWP4-129 YlCWP5- 168аа pY-LIP2-YlCWP5-168 YlCWP6- 139аа pY-LIP2-YlCWP6-139 Flo1p homolog (YALI0C09031g)- 667аа ApaI XmaJI spacer xprT MunI zeta LIP2 hp4d pY-LIP2-Cdom pY-exp lox71 ura3d4 lox66 zeta XbaI Рис. 15 Конструкция экспрессионных векторов для экспонирования липазы Lip2 на поверхности клеток с помощью С-доменов гликопротеинов клеточной стенки 16 4.1. Скрининг полученных трансформантов В работе было проверено 7 пулов по 20 трансформантов, полученных в результате введения в геном штамма Po1f (Leu+) экспрессионных кассет для иммобилизации липазы с помощью С-доменов белков клеточной стенки (Y-LIP2YlCWP1-94, Y-LIP2-YlCWP2-34, Y-LIP2-YlCWP3-121, Y-LIP2-YlCWP4-129, YLIP2-YlCWP5-168, Y-LIP2-YlCWP6-139 и Y-LIP2-Cdom). Ферментацию и измерение липазной активности проводили, как описано выше для N-концевого способа микробиологической иммобилизации. Как для N-концевого способа экспонирования липазы, в случае использования С-доменов для иммобилизации in vivo наблюдался разброс величин активностей клеточно-связанной липазы в пределах одной выборки трансформантов, связанный с разным уровнем экспрессии белка (Рис. 16). Рис. 16 Скрининг трансформантов, продуцирующих клеточно-связанную липазу, иммобилизованную с помощью С-доменов гликопротеинов клеточной стенки Все изучаемые С-концевые последовательности гликопротеинов были способны экспонировать липазу на поверхности клетки. Однако следует отметить, что использование разных С-доменов приводило к получению разных активностей клеточно-связанного фермента, что согласуется с ранее опубликованными результатами, полученными для дрожжей S. cerevisiae. Возможно, данный феномен связан с разным предельным количеством молекул гликопротеинов клеточной стенки, которое потенциально может быть экспонировано на поверхности клетки. При использовании С-домена гомолога Flo1p (YALI0C09031p) наибольшая наблюдаемая активность иммобилизованной липазы составляла 3200 ед/г сухого веса, что соответствует экспонированию 2×105 молекул фермента на поверхности одной клетки. Активность клеточно-связанной липазы, закреплённой с помощью С-домена Ylcwp4, у лучшего клона составляла 7854 ед/г сухого веса (экспонирование 5×105 молекул/клетку). Относительно большие активности равные 13100 и 13360 ед/г сухого веса были получены при использовании С17 доменов гликопротеинов Ylcwp2 и Ylcwp5, соответственно. Эти результаты указывают на экспонирование около 9×105 молекул/клетку. Однако лучшие наблюдаемые значения активности клеточно-связанной липазы были достигнуты с использованием С-доменов Ylcwp1, Ylcwp3, и Ylcwp6 и составляли 16300, 18800 и 17700 ед/г сухого веса, соответственно (экспонирование 1–1,2×106 молекул/клетку). 4.2. Ферментация лучших штаммов В ходе проведённого скрининга были отобраны лучшие трансформанты, продуцирующие клеточно-связанную липазу, иммобилизованную с помощью С-доменов Ylcwp1, Ylcwp3 и Ylcwp6 (Рис. 16). Данные штаммы заложены в коллекцию ВКПМ под номерами Y-3592, Y-3593 и Y-3594, соответственно. Ферментацию штаммов Y-3592, Y-3593 и Y-3594 проводили в трёх повторностях, как описано выше для штаммов Y-3600 и Y-3601. Как видно из Рисунка 17, активность клеточно-связанной липазы штамма Y-3592 была наибольшей на 5 сутки ферментации и составляла 16300 ед/г сухого веса. Культура дорастала до 40 г сухого веса/л, а активность секретируемой липазы была 550 ед/мл. Рис. 17 Ферментация штамма Y-3592, продуцирующего липазу Lip2, закреплённую на поверхности клеточной стенки с помощью С-домена Ylcwp1 Штамм Y-3593 продуцировал клеточно-связанную липазу с активностью 18800 ед/г сухого веса на 5 сутки ферментации, в культуральной жидкости при этом обнаружено 670 ед/мл липазной активности, а биомасса составляет 43 г сухого веса/л (Рис. 18). 18 Рис. 18 Ферментация штамма Y-3593, продуцирующего липазу Lip2, закреплённую на поверхности клеточной стенки с помощью С-домена Ylcwp3 Активность клеточно-связанной липазы штамма Y-3594 достигала наибольшего уровня также на 5 сутки ферментации – 17700 ед/г сухого веса. Секретируемая липазная активность составляла 630 ед/мл и биомасса – 38 г сухого веса/л (Рис. 19). Рис. 19 Ферментация штамма Y-3594, продуцирующего липазу Lip2, закреплённую на поверхности клеточной стенки с помощью С-домена Ylcwp6 19 Несмотря на наблюдаемый высокий уровень активности клеточно-связанной липазы, закреплённой с помощью С-доменов Ylcwp1, Ylcwp3 и Ylcwp6 6 молекул/клетку), только 55-60% ферментной (экспонирование 1-1,2×10 активности обнаружено в ассоциированной с клетками форме. Данный результат, кажется, неожиданным, так как использование С-доменов с сайтами прикрепления гликозилфосфатидилинозитола позволяет белку прочно ковалентно связываться с гликанами клеточной стенки. Связь данного белкового комплекса и клеточной стенки стабильна при действии горячих растворов щелочей, SDS и β-меркаптоэтанола и разрушается только при действии таких ферментов как гликозидазы. Белковый электрофорез в разделяющем геле культуральной жидкости показал, что белок, секретируемый в среду, обладает массой меньшей, чем размер ожидаемого рекомбинантного комплекса (данные не показаны). Из этого мы можем предположить, что данная секреция может быть результатом литической активности неких протеаз Y. lipolytica. Проведение ферментаций отобранных штаммов Y-3600 и Y-3601, а также Y-3592, Y-3593 и Y-3594, продуцирующих клеточно-связанную липазу, закреплённую с помощью YlPir1 и N-домена Flo1p гомолога, а также С-доменов Ylcwp1, Ylcwp3, Ylcwp6, показало существование общих тенденций. Так рост культуры характеризовался затянутой логарифмической фазой, штаммы достигали стационара в среде YNBDO только на 5 сутки культивирования (Рис. 12, 13, 17-19). Максимум продукции липазы также приходился на этот период, что может быть объяснено наибольшим уровнем экспрессии промотора hp4d в конце логарифмической - начале стационарной фазы роста. Изучаемые способы иммобилизации на поверхности клеток (с помощью N- и С-концевого закрепления) были успешно применены для экспозиции липазы. Добавление аминокислотных последовательностей белка YlPir1 и С-доменов Ylcwp1, Ylcwp3, Ylcwp6 к липазе Lip2 позволило получить штаммы с высокой активностью клеточно-связанной липазы, сравнимой с активностью фермента, секретируемого штаммом-продуцентом липазы Y-3260 (1200 ед/мл; 0,1г/л), а также мировому аналогу продуцента липазы на базе дрожжей Y. lipolytica. В дополнение, полученные данные примерно в 70 раз превосходят лучшие опубликованные в литературе результаты по иммобилизации липазы на поверхности клеточной стенки дрожжей. Однако, несмотря на такой высокий уровень активности клеточно-связанной липазы, в большинстве случаев значительная часть активности фермента обнаружена и в среде культивирования. Необходимо проведение дальнейших исследований с целью изучения секреции полученных рекомбинантных комплексов. 20 5. Изучение термостабильности клеточно-связанной липазы Для изучения термостабильности клеточно-связанной липазы были выбраны штаммы Y-3600 и Y-3593, на поверхности которых фермент закреплён с помощью белка клеточной стенки YlPir1 и С-домена предполагаемого гликопротеина Ylcwp3. Клетки дрожжей ресуспензировали в 50 мМ Трис-HCl буфере (рН 8.0) и инкубировали при 450С на протяжении 1–6 часов. Остаточную липазную активность измеряли каждый час спектрофотометрически по гидролизу п-нитрофенилбутирата. В качестве контроля использовали секретируемую липазу, продуцируемую штаммом Y-3260. Сравнение термостабильности клеточносвязанной и свободной форм липазы показало, что иммобилизация на поверхности клетки приводит к значительному повышению данного свойства фермента (Рис. 20). Клеточно-связанная липаза сохраняет около 98-100% активности при инкубации на протяжении 1 часа и 57% после 6 часов, тогда как остаточная активность свободной липазы спустя 1 час составляет 66%, а после 6 часов инкубации фермент полностью теряет свою активность. Рис. 20 Сравнение термостабильности клеточно-связанной липазы, иммобилизованной с помощью YlPir1, а также С-домена Ylcwp3, и свободной секретируемой липазы 6. Получение клеток-биокатализаторов и изучение их стабильности Штаммы Y-3600 и Y-3593 были использованы в качестве примера для получения клеток-биокатализаторов. Для этого культуры дрожжей растили в среде YNBDO на протяжении 5 суток, клетки осаждали центрифугированием, дважды промывали водой и лиофилизировали. Следует отметить, что экспонированная на клетках липаза сохраняет активность после лиофилизации (Таблица 1). 21 Для определения стабильности полученных клеток-биокатализаторов с иммобилизованной липазой лиофилизированные клетки ресуспензировали в 50мМ Трис-HCl буфера (рН 8.0) и измеряли активность фермента. Далее клетки осаждали центрифугированием, отделяли супернатант, ресуспензировали в Трис-HCl буфере и опять измеряли активность клеточно-связанной липазы. Эту процедуру осаждения и ресуспензирования клеток проводили ещё один раз и в третий раз измеряли активность фермента. Таким образом, был смоделирован процесс повторного трёхкратного использования клеток-биокатализаторов для реакции гидролиза. Из Таблицы 1 видно, что после трёх раундов использования лиофилизированные клетки штаммов Y-3600 и Y-3593 сохраняют 86% и 98% от начальной активности, соответственно. Следует отметить, что, по литературным данным, после трёх раундов использования для реакции гидролиза липазы Y. lipolytica, иммобилизованной на носителях хитозане и альгинате, сохраняется только 35% и 30% от начальной активности. Таблица 1. Сравнение активности клеточно-связанной липазы до и после лиофилизации; повторное использование лиофилизированных клеток для реакции гидролиза Активность Активность Повторное использование клеточно-связанной клеточно-связанной Штамм липазы до липазы после Остаточная активность, % лиофилизации лиофилизации (ед/г сухого веса) (ед/г сухого веса) 1 раунд 2 раунд 3 раунд Y-3600 17000 ± 800 15900 ± 700 100 93 86 Y-3593 18785 ± 1130 18900 ± 1000 100 99 98 Подводя итог, можно заключить, разработанные подходы позволили получить штаммы-продуценты клеточно-связанной липазы, что предполагает возможность разработки новых технологий ферментативного катализа на их основе. 22 ВЫВОДЫ 1. В дрожжах Y. lipolytica на примере липазы Lip2 разработаны основные способы экспонирования белков на поверхности клетки – N-концевой способ иммобилизации и прикрепление с помощью С-доменов гликопротеинов клеточной стенки. 2. Выявлены ранее не охарактеризованные белки клеточной стенки, аминокислотные последовательности которых были успешно использованы для экспозиции липазы на поверхности клеток. 3. Было показано, что все изучаемые фрагменты белков клеточной стенки способны закреплять липазу на поверхности клеток. Однако разные белки клеточной стенки позволяют получить разные наблюдаемые активности клеточно-связанного фермента. 4. Было продемонстрировано, что липаза, иммобилизованная на поверхности клеток с помощью N- и С-концевого способов закрепления, обладает значительно более высокой термостабильностью, чем свободная форма. 5. Впервые были получены штаммы-продуценты клеточно-связанной липазы, продуктивность которых сравнима с продуктивностью промышленно-значимых штаммов Y. lipolytica продуцентов секретируемой формы липазы. 23 Список публикаций по теме диссертации 1. Синеокий С.П., Юзбашев Т.В., Лаптев И.А., Юзбашева Е.Ю., Выборная Т.В., Соболевская Т.И. Штамм дрожжей Yarrowia lipolytica - продуцент липазы. Патент РФ №2355754. Дата приоритета 25.12.2007. 2. Юзбашева Е.Ю., Юзбашев Т.В., Лаптев И.А., Ларина А.С., Синеокий С.П. Генетическая конструкция для экспозиции белка на поверхности клеточной стенки дрожжей Yarrowia lipolytica. Заявка на Патент РФ №2010146280. Дата приоритета 13.11.2010. 3. Юзбашева Е.Ю., Юзбашев Т.В., Константинова Т.К., Лаптев И.А., Перковская Н.И., Синеокий С.П. Способность N- и C-доменов гомолога белка клеточной стенки Saccharomyces cerevisiae Flo1p экспонировать липазу Lip2 на поверхности клеток дрожжей Yarrowia lipolytica. 2011. Биотехнология (Москва), т. 1, стр. 23-29. 4. Тихонова Е.Ю. (Юзбашева Е.Ю.), Синеокий С.П. Разработка эффективных продуцентов липаз. 2007. Материалы международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития», март 12-16, стр. 310. 24
