молекулярно-генетические маркеры иммунного ответа при
реклама
Федеральное государственное бюджетное учреждение «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии имени академика В.И. Кулакова» Министерства здравоохранения Российской Федерации На правах рукописи Бурменская Ольга Владимировна МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ОРГАНОВ ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ 03.03.03 – иммунология Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор, академик РАН Сухих Геннадий Тихонович; доктор биологических наук Трофимов Дмитрий Юрьевич Москва - 2014 ОГЛАВЛЕНИЕ СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ..................................................................................... 7 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ........................................................... 11 1. ВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ ОРГАНОВ ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ И МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ В ДИАГНОСТИКЕ ВАГИНИТОВ И ХРОНИЧЕСКОГО ЭНДОМЕТРИТА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) ....................................................... 21 1.1 КЛИНИКО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ СЛИЗИСТОЙ ВЛАГАЛИЩА И ЭНДОМЕТРИЯ...................................................................................................... 21 1.1.1 Воспалительные заболевания слизистой влагалища: распространение, симптомы, этиология и факторы риска развития заболевания ........................ 21 1.1.2 Современные представления о микробиоценозе влагалища у женщин репродуктивного возраста .................................................................................... 24 1.1.3 Хронический эндометрит: распространение, патогенез и факторы риска развития заболевания ............................................................................................ 29 1.2 МЕХАНИЗМЫ ИММУННОЙ ЗАЩИТЫ ПОЛОВЫХ ПУТЕЙ ЖЕНЩИН ................................................................................................................................. 32 1.3 КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВУЛЬВОВАГИНИТОВ И ХРОНИЧЕСКОГО ЭНДОМЕТРИТА ............................................................. 53 1.3.1 Диагностика воспалительных заболеваний нижних отделов органов женской репродуктивной системы ...................................................................... 53 1.3.2 Клинико-лабораторная диагностика хронического эндометрита ........... 60 1.4 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МАРКЕРОВ ЛОКАЛЬНЫХ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ ................................................................. 62 1.4.1 Микроскопия мазков с подсчетом числа лейкоцитов .............................. 64 1.4.2 Метод лазерной проточной цитометрии с применением моноклональных антител ..................................................................................... 65 1.4.3 Метод иммуноферментного анализа. ......................................................... 66 2 1.4.4 Технология мультиплексного иммуноанализа для исследования цитокинового профиля генов иммунного ответа............................................... 68 1.4.5 Методы иммуногистохимического исследования .................................... 69 1.4.6 Определение транскрипционных профилей генов ................................... 70 1.4.7 Полиморфизмы генов иммунной системы и современные методы их идентификации ...................................................................................................... 72 1.4.8 Ассоциация полиморфизмов генов иммунной системы с предрасположенностью к развитию инфекционно-воспалительных заболеваний нижних отделов органов женской репродуктивной системы .... 81 Резюме .................................................................................................................... 84 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ............................................................................. 85 2.1 Материалы исследования ............................................................................... 85 2.2 Объем исследования ....................................................................................... 85 2.3 Методы исследования ..................................................................................... 88 2.3.1 Определение состава микрофлоры влагалища ......................................... 88 2.3.2 Определение транскрипционного профиля генов иммунного ответа .... 90 2.3.3 Определение замен одиночных нуклеотидов............................................ 91 2.3.4 Дополнительные клинико-лабораторные методы .................................... 91 2.4 Параметры, используемые для описания ПЦР в реальном времени ......... 92 2.5 Нормировка ...................................................................................................... 92 2.6 Статистика ....................................................................................................... 93 2.7 Метод бинарной логистической регрессии .................................................. 94 2.8 ROC-анализ ...................................................................................................... 95 2.9 Характеристики диагностических тестов ..................................................... 95 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ................................. 97 3.1 Разработка систем для оценки профиля экспрессии мРНК генов иммунной системы ................................................................................................ 97 3.1.1 Подбор праймеров и флуоресцентно-меченных проб .......................... 97 3.1.2 Проверка праймеров и зондов ............................................................... 101 3 Выбор референсных генов и разработка алгоритмов нормировки, 3.1.3 оптимальных для оценки уровней экспрессии мРНК генов человека в тканях эндометрия и влагалища ..................................................................................... 106 Апробация метода исследования транскрипционных профилей на 3.1.4 образцах тканей эндометрия двух стадий менструального цикла ................. 107 3.2 Прикладные аспекты идентификации молекулярно-генетических маркеров с использованием ПЦР в реальном времени ................................... 113 3.2.1 Воспалительные заболевания нижних отделов половых путей ........ 113 3.2.1.1 Характеристика состава микробиоценоза влагалища небеременных женщин ................................................................................................................. 114 3.2.1.2 Характеристика состава микробиоценоза влагалища беременных женщин ............................................................................................................... 116 3.2.1.3 Типирование и количественная оценка лактобактерий .................. 119 3.2.1.4 Транскрипционные профили генов иммунного ответа в соскобах отделяемого слизистой влагалища .................................................................... 123 3.2.1.5 Характеристика уровней представленности транскриптов генов иммунного ответа в соскобах отделяемого слизистой влагалища. ............... 123 3.2.1.6 Зависимость транскрипционных профилей от стадии менструального цикла......................................................................................... 125 3.2.1.7 Сравнение транскрипционных профилей генов иммунной системы в клетках вагинальных соскобов у беременных и небеременных женщин ..... 126 3.2.1.8 Особенности экспрессии мРНК генов иммунной системы в клетках вагинальных соскобов в норме, при вагините и БВ ........................................ 127 3.2.1.9 Корреляция Lactobacilus iners с уровенем экспрессии генов ......... 131 3.2.1.10 Разработка способа оценки локальной воспалительной реакции ............................................................................................................ 133 3.2.1.11 Преимущества использования индексов и интегральной оценки локального воспаления ....................................................................................... 136 3.2.1.12 Сравнение предложенного способа оценки локальной воспалительной реакции с клиническими данными ....................................... 139 4 3.2.1.13 Сравнение предложенного способа оценки локальной воспалительной реакции с методом подсчета числа лейкоцитов в мазке .... 143 3.2.2 Осложнения родов и послеродового периода у пациенток с вагинитами и Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл........................ 144 3.2.3 Определение ассоциаций полимофизмов генов цитокинов с предрасположенностью к развитию вагинитов ............................................... 146 3.2.4 Хронический эндометрит ...................................................................... 154 3.2.4.1 Идентификация микроорганизмов в полости матки ........................... 154 3.2.4.2 Локальный транскрипционный профиль при хроническом эндометрите ......................................................................................................... 156 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ................................................................ 164 4.1. Молекулярно-генетические маркеры при вагинитах............................. 164 4.1.1. Транскрипционный профиль генов иммунного ответа в норме и его зависимость от фазы менструального цикла в тканях эндометрия ............... 164 4.1.2. Зависимость транскрипционных профилей генов иммунного ответа в клетках соскобов из влагалища от беременности ............................................ 167 4.1.3. Доминирование в составе биоценозов влагалища лактобактерий – механизм защиты плода и новорожденного от условно-патогенных микроорганизмов................................................................................................. 168 4.1.4. Ассоциация L.iners и L.gasseri с дисбиотическими и воспалительными процессами во влагалище ................................................................................... 170 4.1.5. Транскрипционные профили в клетках соскобов слизистой влагалища при вагинитах ...................................................................................................... 173 4.1.6. TNF, TLR4, GATA3 и IL18 – маркеры объективной интегральной оценки локальной воспалительной реакции во влагалище ............................ 180 4.1.7. Актуальность определения дисбиотических и воспалительных процессов во влагалище для прогнозирования и предупреждения акушерских осложнений .......................................................................................................... 183 4.1.8. Генетически обусловленная пониженная экспрессия TNF-α и TGF-ß1 – фактор предрасположенности к развитию вагинитов .................................. 184 5 4.2. Молекулярно-генетические маркеры при хроническом эндометрите ......................................................................................................... 187 4.2.1. Особенности транскрипционного профиля генов иммунного ответа при фиброзе стромы эндометрия .............................................................................. 187 4.2.2. Роль инфекционных агентов в патогенезе хронического эндометрита ......................................................................................................... 189 4.2.3. Особенности транскрипционных профилей при полном симптомокомплексе хронического эндометрита и лимфоидной инфильтрации стромы .................................................................................................................. 190 ВЫВОДЫ ............................................................................................................. 193 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ................................................................................... 204 6 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АГ – антиген АПК - антигенпрезентирующие клетки АТ - антитело БВ – бактериальный вагиноз ВАК – Высшая аттестационная комиссия ВИЧ – вирус иммунодефицита человека ВВК – вульвовагинальный кандидоз ВМС – внутриматочная спираль ГЭ – геном-эквивалент ДИ (СI) – доверительный интервал (confidence interval) ДК – дендритные клетки ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота ИППП – инфекции, передаваемые половым путем кДНК – комплементарная ДНК КОЕ – колониеобразующие единицы ЛВ – локальное воспаление ЛВР – локальная воспалительная реакция ЛРС (СLR) - лектиновые рецепторы С- типа (C-type lectin receptor) МКА – моноклональные антитела мРНК – матричная рибонуклеиновая кислота МФ - макрофаг НВ – неспецифический вагинит НК – натуральные киллеры НЛР (NLR) - нод-лайк рецепторы (nucleotide oligomerization domain (NOD)like receptor) ОБМ – общая бактериальная масса ОТ-ПЦР – обратная транскрипция и полимеразная цепная реакция ПАМП (PAMP) – патоген-ассоциированные (pathogen-associated molecular patterns) 7 молекулярные паттерны ПРР (PRR) - паттерн-распознающие рецепторы (pathogen recognition receptors) ПЦОР (NPV)- прогностическая ценность отрицательного результата (negative predictive value) ПЦПР (PPV) - прогностическая ценность положительного результата (positive predictive value) ПЦР – полимеразная цепная реакция РВВК – рецидивирующий вульвовагинальный кандидоз РНК – рибонуклеиновая кислота РФ – Российская Федерация США – Соединенные Штаты Америки ТУ – технические условия УПМ – условно-патогенные микроорганизмы ФСГ - фолликулостимулирующий гормон ХЭ - хронический эндометрит ЭКО – экстракорпоральное оплодотворение СD – cluster of differentiation, дифференцировочные антигены cut off – порог отсечки положительного результата HLA - Human Leucocyte Antigens, группа антигенов гистосовместимости IgA – иммуноглобуллины класса А IgG – иммуноглобуллины класса G ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay, метод твердофазного иммуноферментного анализа IUSTI - International (Европейский Union Международный against союз Sexually по Transmitted борьбе с Infections инфекциями, передаваемыми половым путем) MHCI - major histocompatibility complex class I, главный комплекс гистосовместимости I класса 8 MHCII - major histocompatibility complex class II, главный комплекс гистосовместимости II класса Me – медиана NCBI - National Center for Biotechnology Information OR - odds ratio, отношение шансов (ОШ) ROC - Receiver Operator Characteristic SNP – single-nucleotide polymorphism, замены одиночных нуклеотидов WHO (ВОЗ) - World Health Organization (Всемирная организация здравоохранения) Маркеры ACTB – референсный ген β-актин B2M – референсный ген β-2-микроглобулин CD45 (PTPRC) – ген кодирующий общий лейкоцитарный антиген CD68 – ген, кодирующий трансмембранный белок CD68 CD69 – ген, кодирующий транмембранный белок СD69 ESR - ген эстрогенового рецептора Foxp3 – ген, кодирующий транскрипционный фактор скурфин GAPDH – референсный ген глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа GATA3 – ген, кодирующий транскрипционный фактор GATA-связывающий протеин 3 GNLY - ген гранулизина GUSB – референсный ген β-глюкоронидаза HPRT1 – референсный ген гипоксантин-гуанин фосфорибозилтрансфераза IFNG – ген, кодирующий интерферон гамма (IFN-γ) IL1A – ген интерлейкина 1 альфа (IL-1α) IL1B – ген интерлейкина 1 бета (IL-1ß) IL1RN – ген, кодирующий антагонист рецептора интерлейкина-1 (IL-1RA) IL2 - ген интерлейкина 2 (IL-2) IL2Rα – ген, кодирующий α-цепь рецептора интерлейкина 2 (IL-2Rα) IL4 - ген интерлейкина 4 (IL-4) 9 IL6 - ген интерлейкина 6 (IL-6) IL8 - ген интерлейкина 8 (IL-8) IL10 - ген интерлейкина 10 (IL-10) IL12A- ген, кодирующий субъединицу р35 интерлейкина 12 (IL-12) IL12B - ген, кодирующий субъединицу р40 IL-12 и IL-23 IL15- ген интерлейкина 15 (IL-15) IL18- ген интерлейкина 18 (IL-18) IL23- ген, кодирующий субъединицу р19 интерлейкина 23 (IL-23) LIF – ген, кодирующий лейкемия-ингибирующий фактор (LIF) PGR – ген прогестеронового рецептора RORC – ген, кодирующий транскрипционный фактор RORC ТВР – референсный ген TATA-связывающий протеин TBX21 - ген, кодирующий транскрипционный фактор TBX21 TGFB1 – ген, кодирующий трансформирующий ростовой фактор бета 1 (TGF-ß1) TLR2 - ген, кодирующий толл-подобный рецептор (TLR-2) TLR4- ген, кодирующий толл-подобный рецептор (TLR-4) TLR9 - ген, кодирующий толл-подобный рецептор (TLR-9) TNF - ген фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) VEGFA – ген, кодирующий сосудистый эндотелиальный фактор роста (VEGF-A) 18SrRNA – референсный ген 18S рибосомальной РНК 10 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность Открытие и внедрение в практику в конце 80 годов метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) внесло огромный вклад в развитие современной биологии и медицины. В течение следующих 20 лет были разработаны способы флуоресцентной детекции результатов амплификации. Помимо этого модификация и совершенствование методики шло по пути автоматизации процесса, уменьшения объема реакционных смесей и возможности амплификации в одной пробирке нескольких фрагментов ДНК (мультиплексирование), что способствовало широкому внедрению данного метода в рутинную практику. В настоящее время метод ПЦР широко используется для решения целого ряда фундаментальных и прикладных задач, включающих в себя определение генетических заболеваний, вариантов полиморфизма генов, функциональной активности генома, а также изучение воздействия на организм человека биотических факторов окружающей среды (бактерий, грибов, вирусов). Следует отметить, что каждая из выше перечисленных задач может решаться как самостоятельно, так и в составе комплексного исследования. В данной работе комплексный подход предложен для решения фундаментальных и прикладных задач современной иммунологии на примере исследования воспалительных процессов, сопровождающих заболевания органов женской репродуктивной системы. Воспалительные заболевания органов женской репродуктивной системы занимают лидирующие позиции в акушерско-гинекологической практике. Воспалительные заболевания нижних отделов половых путей (вульвиты, вагиниты) являются одной из наиболее распространенных причин обращения женщин к врачу акушеру-гинекологу [142]. От неспецифического вагинита (НВ) страдает почти каждая пятая пациентка гинекологической практики (19,2%), а среди пациенток с патологическими белями частота его выявления возрастает в 4 раза [4]. Известно, что в основе репродуктивных 11 неудач (трубно-перитонеальный фактор бесплодия, самопроизвольные выкидыши), акушерских осложнений родов и послеродового периода, таких как преждевременное излитие околоплодных вод, внутриутробное и интранатальное инфицирование плода и новорожденного, мертворождение, хориоамнионит в родах, послеродовые гнойно-септические осложнения, также лежат те или иные воспалительные заболевания половых органов [21]. Воспаление чаще всего вызвано действием патогенных и условнопатогенных микроорганизмов, идентификация которых чрезвычайно важна при выборе инфекционного терапии. Однако процесса в значительной определяется степени состоянием развитие локального (мукозального) иммунитета и зависит от иммунологической реактивности макроорганизма. В патогенезе заболевания микробный фактор играет такую же роль, как и состояние макроорганизма, и те обстоятельства, которые изменяют его иммунобиологические свойства [48]. Поэтому изучение мукозального иммунитета представляет чрезвычайный интерес. В то же время, спектр методов исследования мукозального иммунитета остается весьма ограниченным из-за малого количества материала и наличия слизи в образцах. В ходе исследования возникают вопросы, связанные с нормировкой материала, способов его взятия и транспортировки. Вследствие этого существующие знания об изменении при вагинитах различных иммунологических показателей (цитокинов, дефензинов, иммуноглобулинов, рецепторов иммунокомпетентных клеток и др.) не получили должного применения в клинической практике. Основным, и зачастую, единственным методом оценки состояния локального иммунитета в настоящее время остается микроскопия мазка с подсчетом числа лейкоцитов. Альтернативой подсчету числа лейкоцитов может служить оценка иммунологических показателей (как пример, транскрипционный профиль генов цитокинов). В настоящее время накоплены многочисленные данные о зависимости экспрессии цитокинов не только от влияния патогенных факторов, но и от генетической вариабельности кодирующих их генов. В частности, получены 12 данные об ассоциациях отдельных полиморфизмов генов цитокинов с такими нозологическими формами как вульвовагинальный кандидоз [166] и бактериальный вагиноз [93; 127; 132; 134; 257]. Оригинальность настоящего исследования состоит в том, что различные нозологические формы неспецифических вагинитов были исследованы в совокупности, включая случаи воспаления неустановленной этиологии. Использование такого подхода обосновано тем, что зачастую воспалительная реакция является неспецифической в отношении инициирующего патологического агента, поскольку иммунном ответе в первую очередь задействованы механизмы врожденного иммунитета. Кроме того, большое внимание исследователей привлечено к проблеме воспалительных заболеваний органов малого таза, среди которых хронический эндометрит (ХЭ) является наиболее распространенным. Он выявляется примерно у 10% женщин репродуктивного возраста, но у пациенток с нарушениями генеративной функции частота его обнаружения увеличивается до 23–57% [33]. Среди женщин с ХЭ 80–90% составляют женщины детородного возраста. ХЭ обуславливает у них нарушения менструальной и репродуктивной функций, приводя, в конечном итоге, к развитию бесплодия, неудачам в программах экстракорпорального оплодотворения (ЭКО), невынашиванию беременности и осложненному течению гестационного процесса и родов [55]. Все предложенные в данной работе молекулярно-генетические маркеры (транскрипты генов иммунной системы, полиморфизмы генов, а также возбудители воспалительных заболеваний) могут быть идентифицированы в одном и том же образце с использованием одного универсального метода – полимеразной цепной реакцией, что сокращает время для проведения исследований. Учитывая преимущества метода ПЦР (его быстроту, высокую чувствительность и специфичность, объективность, возможность автоматизации и одновременного исследования большого количества образцов), можно прогнозировать широкое внедрение данного 13 метода в систему диагностики воспалительных заболеваний органов женской репродуктивной инфекционных системы. агентов Помимо чрезвычайно традиционного исследования перспективными являются исследования факторов генетической предрасположенности к развитию заболевания и транскрипционных профилей маркеров воспаления. Цель и задачи работы Цель работы: Разработать комплексный подход к характеристике воспалительных процессов органов женской молекулярно-генетических репродуктивной маркеров, системы включающих на основе количественную идентификацию инфекционных агентов, определение транскрипционного профиля генов иммунной системы и генетических особенностей организма. Задачи: 1. Для оценки профиля экспрессии генов иммунного ответа разработать тест-системы на основе метода количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени. 2. Выявить особенности экспрессии мРНК генов иммунного ответа (цитокины, рецепторы, транскрипционные факторы и др.) при вагинитах и хроническом эндометрите. 3. Установить распределение аллельных вариантов генов иммунного ответа, ассоциированных с предрасположенностью к развитию вагинитов у женщин репродуктивного возраста. 4. Провести характеристику состава микроорганизмов, способствующих развитию воспалительных заболеваний органов женской репродуктивной системы (вагиниты, хронический эндометрит). 5. Разработать способы идентификации локальной воспалительной реакции при вагинитах и хроническом эндометрите на основе интегральной оценки транскрипционных профилей генов иммунного ответа. 14 6. Определить наиболее важные молекулярно-генетические маркеры воспалительного процесса, позволяющие одновременно получать информацию о полиморфизмах и активности генов иммунной системы, а также вирусологическом и бактериологическом фоне. Научная новизна исследования Впервые разработан и апробирован метод комплексной оценки клинического биоматериала на молекулярно-генетическом уровне при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы, позволяющий одновременно получать информацию о вирусологическом и бактериологическом фоне, а также полиморфизмах и активности генов иммунной системы. Впервые при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы на основе метода ОТ-ПЦР проведено исследование представленности транскриптов широкого спектра генов иммунного ответа (цитокины IL1B, IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, IL12A, IL12B, IL15, IL18, IL23, TNF, TGFB1, IFNG, LIF, VEGFA изоформы 121, 165, 189), транскрипционные факторы (TBX21, GATA3, RORC, Foxp3), толл-подобные-рецепторы (TLR2, TLR4, TLR9), клеточные маркеры иммунной системы (IL2Rα, CD45, CD68, СD69), а также гранулизин GNLY). Выбраны наиболее информативные маркеры воспалительного процесса при вагините (TNF, IL18, TLR4, GATA3) и хроническом эндометрите (IL1B, IL2, IL10, Foxp3, TLR9, IL2Ra). Впервые применен способ интегральной оценки представленности транскриптов генов иммунного ответа при вагинитах и хроническом эндометрите, иммунитета позволивший и предложить охарактеризовать новый состояние локального молекулярно-генетический метод определения воспалительных процессов слизистой влагалища и эндометрия. Впервые при исследовании транскрипционных профилей использован метод определения индекса соотношения уровня экспрессии генов, позволяющий осуществлять анализ без нормировки на референсные гены, 15 что существенно упрощает и снижает стоимость исследования, делает его доступным для рутинной диагностики. Впервые получены данные об ассоциации Lactobacillus iners с состоянием локального иммунитета: у условно здоровых женщин доминирование L. iners в составе лактофлоры приводит к повышению уровня экспрессии мРНК генов IL8, TLR4, IL10, CD69, CD45 и снижению уровня экспрессии мРНК IL18 по сравнению с образцами, в которых доминирует L. crispatus. Определены развитию генетические вагинитов. предикторы Впервые предрасположенности установлено, предрасположенность к пониженной экспрессии что TNF-α к генетическая и TGF-β1, обусловленная генотипом GG локуса TNF –238 G>A и генотипом СС локуса TGFB1 -509 C>T, является фактором риска развития вагинита. Научно-практическая значимость Представленная работа является фундаментально-прикладным исследованием, результаты которого имеют важное значение для развития как фундаментальных, так и прикладных аспектов иммунологии, молекулярной биологи и медицины. Созданный в ходе работы методический подход позволяет получить более полную информацию об активности генов иммунной системы при воздействии на организм женщин биотических факторов (бактерий, грибов, вирусов) при вагинитах и хроническом эндометрите. Определены перспективы использования комплексного подхода к диагностике воспалительных заболеваний органов женской репродуктивной системы в гинекологической практике для объективной оценки локальных воспалительных реакций, индивидуального прогноза развития заболевания, для количественного определения микроорганизмов с целью выбора оптимальных схем терапии. В акушерской практике предлагаемый подход может быть использован для предупреждения и профилактики родовых и 16 послеродовых осложнений. В работе использована отечественная приборная и технологическая база с целью импортозамещения в области инновационных прикладных молекулярно-генетических исследований. По результатам диссертационной работы поданы 2 заявки на патент и 1 на регистрационное удостоверение: Патент на изобретение № 201147924 от 25.11.2011 г.: «Способ диагностики неспецифических вагинитов у беременных женщин по уровню экспрессии мРНК генов интерлейкинов во влагалищных мазках». Авторы: Бурменская О.В., Меджидова М.К., Непша О.С., Донников А.Е., Трофимов Д.Ю., Сухих Г.Т. Патент на изобретение № 2013145241 от 9.10.2013 г.: «Способ определения локальной воспалительной реакции у женщин репродуктивного возраста по уровню экспрессии мРНК генов цитокинов во влагалищных мазках». Авторы: Бурменская О.В., Байрамова Г.Р., Непша О.С., Тютюнник В.Л., Трофимов Д.Ю., Сухих Г.Т. Регистрационное удостоверение № 3756 от 7.02.2014 г. на Набор реагентов для оценки локальной воспалительной реакции влагалища методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени (Экспрессия генов. Воспаление влагалища) по ТУ производства ООО «Научно-производственного объединение ДНК-Технология». Положения, выносимые на защиту 1. Для исследования функциональной активности генов иммунного ответа при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы разработаны 32 тест-системы на основе количественной ОТ-ПЦР в режиме реального времени. 2. Воспалительные процессы слизистой влагалища сопровождаются изменением транскрипционного профиля иммунокомпетентных клеток: повышается экспрессия мРНК генов IL1B, IL8, IL10, СD45, CD69, TLR2, 17 TLR4, TNF, снижается экспрессия мРНК генов GATA3, CD68, IL12A, IL18, TGFB1, RORC. 3. Установлена генетическая предрасположенность к развитию воспалительных заболеваний нижних отделов половых путей у носителей аллеля С локуса TGFB1 -509 C>T и протективная роль аллеля А локуса TNF –238 G>A в развитии вагинитов. 4. Профиль экспрессии генов иммунного ответа в эндометрии зависит от фазы менструального цикла и наличия воспаления. При полном симптомокомплексе хронического эндометрита и лимфоидной инфильтрации стромы эндометрия повышена экспрессия мРНК генов IL1В, IL6, IL8, IL10, IL12А, TNF, TGFB1, Foxр3, IL2Ra, LIF, TLR9, VEGFА, TLR2. Склерозирование сосудов и фиброз стромы эндометрия сопровождаются более выраженным изменением цитокинового каскада: повышается экспрессия мРНК генов IL1B, IL6, IL8, IL12А, TGFB1, Foxр3, IL2Ra, LIF, TLR9, VEGFА, TLR2, IL18, IFNG и TLR4. 5. Определены ассоциации различных видов лактобактерий с состоянием микробиоты влагалища и местного иммунитета: у условно здоровых женщин доминирование L. iners в составе лактофлоры приводит к повышению уровня экспрессии мРНК генов IL8, TLR4, IL10, CD69, СD45 и снижению IL18. 6. При хроническом эндометрите в полости матки определена ведущая роль бактериального фона, обусловленного условно-патогенными микроорганизмами (Enterobacteriaceae, Gardnerella vaginalis/ Prevotella spp./ Porphyromonas spp., Ureaplasma spp). 7. Предложены способы оценки функционального состояния местного иммунитета при вагинитах и хроническом эндометрите с фиброзом стромы эндометрия по транскрипционному профилю генов иммунного ответа, основанные на методах многофакторного анализа. 18 Апробация работы Материалы диссертационной работы были доложены и обсуждены на Всероссийских и Международных конгрессах, конференциях, съездах и симпозиумах: итоговая конференция по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2007 г.); XI и XII Всероссийские научные форумы «Мать и дитя» (Москва, 2010 г., 2011 г.); VI Региональный научный форум «Мать и дитя» (Ростов-на-Дону, 2012 г.); Всероссийский конгресс «Амбулаторно- поликлиническая практика: проблемы и перспективы» (Москва, 2011 г.); III и IV междисциплинарные «Урогенитальные инфекции научно-практические и репродуктивное конференции здоровье: клинико- лабораторная диагностика и терапия» (Санкт-Петербург, 2010 г.; Москва, 2011 г.); 54 научная конференция МФТИ «Проблемы фундаментальных и прикладных естественных и технических наук в современном информационном обществе. Молекулярная и биологическая физика». (Москва, 2011 г.); XXIV Международный Конгресс c курсом эндоскопии (Москва, 2011 г.); V и VI Международный конгресс по репродуктивной медицине «Репродуктивное здоровье семьи» (Москва, 2011 г., 2012 г.); V Российская конференция "Иммунология репродукции. Теоретические и клинические аспекты" (Иваново, 2012 г.); 7 и 8 Европейские конгрессы по иммунологии репродукции (Афины, Греция, 2009 г.; Мюнхен, Германия, 2010 г.); 14 Всемирный конгресс по репродукции человека (Aвстрия, 2011 г.); 4 Международный конгресс IVI-клиник (Валенсия, Испания, 2011 г.); I Конференция по биомаркерам в репродуктивной медицине: возникновение нового направления исследования (Валенсия, Испания, 2012 г.); Всемирный конгресс по гинекологии, бесплодию и перинатологии (Барселона, Испания, 2012 г.). Диссертация частично выполнена в рамках работ по Государственному 19 контракту Министерства образования и науки РФ №16.522.12.2009 от 29 сентября 2011 года и Государственному контракту Министерства образования и науки РФ №16.512.11.2093 от 22 февраля 2011 года. Публикации По теме диссертации опубликованы 54 печатные работы, в том числе 30 статей в 11 рецензируемых научных изданиях, 3 патента, 21 публикация в материалах отечественных и международных конференций и конгрессов. Объем и структура диссертации Диссертация изложена на 249 страницах машинописного текста, содержит 32 таблицы, 46 рисунков. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, описания результатов исследований, обсуждения полученных результатов, выводов и списка литературы. Библиография включает 336 источников, из них 60 – на русском, 276 - на иностранных языках. Личный вклад автора Личный вклад автора состоит во включенном участии на всех этапах процесса, непосредственном участии соискателя в получении исходных данных и научных экспериментах, личном участии в апробации результатов исследования, обработке и интерпретации экспериментальных данных, выполненных лично автором, подготовке выполненной работе. 20 основных публикаций по 1. ВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ ЗАБОЛЕВАНИЯ ОРГАНОВ ЖЕНСКОЙ РЕПРОДУКТИВНОЙ СИСТЕМЫ И МОЛЕКУЛЯРНО- ГЕНЕТИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ В ДИАГНОСТИКЕ ВАГИНИТОВ И ХРОНИЧЕСКОГО ЭНДОМЕТРИТА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ) 1.1 КЛИНИКО-ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ СЛИЗИСТОЙ ВЛАГАЛИЩА И ЭНДОМЕТРИЯ 1.1.1 Воспалительные заболевания слизистой влагалища: распространение, симптомы, этиология и факторы риска развития заболевания Воспалительные заболевания нижних отделов репродуктивной системы женщин (вагиниты - воспаление слизистой оболочки влагалища, вульвиты – воспаление наружных половых органов, вульвовагиниты) широко распространены среди женщин. Неспецифичекские вагиниты составляют, по мнению ряда авторов, до 40% случаев обращения к гинекологам [21; 22] К характерным симптомам вагинита относят: зуд и жжение в области половых органов; обильные выделения с неприятным запахом (гнойные, молочные, творожистые, пенистые, в осложненных случаях - кровяные); гиперемия и отечность наружных половых органов; ноющие боли внизу живота, болезненные ощущения во время полового акта; дизуретические расстройства; диспареуния; иногда увеличение температуры тела. Различают острую и хроническую форму течения заболевания. Острая форма заболевания отличается ярко выраженными, а хроническая форма обладает менее явными, слабо выраженными симптомами. К основным этиологическим факторам возникновения вагинита относят [68; 118]: • инфекции; • аллергические реакции, в том числе на латекс, спермициды, антисептические препараты для местного применения (свечи, таблетки); 21 • атрофические изменения, обусловленные дефицитом эстрогенов в перименопаузальном и постменопаузальном возрасте; • химические агенты (применение концентрированных растворов при спринцевании); • физические факторы (инородное тело); • анатомические (выпадение стенок влагалища или матки). Среди инфекционных вагинитов выделяют специфические вагиниты, вызванные патогенами (Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Treponema pallidum, Mycobacterium tuberculosis и Chlamydia trachomatis), и неспецифические, обусловленные условно-патогенными микроорганизмами (УПМ), такими как грибы, стрептококки, стафилококки, кишечная палочка и др. Иногда вагиниты, обусловленные Candida spp., также относят к специфическим. Согласно данным Европейского Международного союза по борьбе с инфекциями, передаваемыми половым путем (IUSTI - International Union against Sexually Transmitted Infections) 2011 года анализ зарубежных исследований, опубликованных в период между 1966 и 2003, показал, что у женщин с симптомами вагинита основными причинами заболевания являются бактериальный вагиноз (БВ) - в 22-50%, вульвовагинальный кандидоз - (ВВК) в 17-39%, трихомониаз в - 4-35% случаев [277]. Бактериальный вагиноз - клинический полимикробный синдром, возникающий в результате замены нормальной микрофлоры влагалища (перекись водорода-продуцирующие виды Lactobacillus spp.) на анаэробные микроорганизмы: Bacteroides/Prevotella spp., Mobiluncus spp., Veillonella spp., Gargenerella vaginalis, Atopobium vaginalis и другие. БВ встречается в различных популяциях женщин от 16 до 65%, у 15– 37% беременных женщин, а при патологических белях – до 87% [40]. Вульвовагинальный кандидоз - инфекционное поражение слизистой оболочки вульвы и влагалища, вызываемое дрожжеподобными грибами рода 22 Candida. Доминирующим видом является Candida albicans, составляя до 90% среди встречающихся видов. Реже встречаются грибы Candida non-albicans: C.glabrata, C.tropicalis, C.krusei, C.рarapsilosis, C.famata, C.lipolytica, C.norvegensis, C.rugosa, C.zeylanoides. 75% женщин репродуктивного возраста переносят по меньшей мере один эпизод неосложненного острого ВВК [121; 184]. 10–20% здоровых женщин являются бессимптомными носителями: грибы рода Candida spp. присутствуют на слизистой оболочке влагалища и вульвы, но клинические проявления инфекции отсутствуют; бессимптомное носительство Candida spp. среди беременных женщин достигает 40% [277]. На долю неосложненного острого ВВК приходится 90-95% случаев, на долю рецидивирующего ВВК (РВВК) – 5-10% [184]. Трихомониаз - инфекционное заболевание мочеполовых органов, передаваемое половым путем, вызываемое простейшим одноклеточным паразитом Trichomonas vaginalis. Заболеваемость в мире по данным WHO 2001 года составляет 86 млн. женщин в год, из них в США – около 4 млн., в Западной Европе – около 5,5 млн., Восточной Европе и Центральной Азии – 6,8 млн [325]. В РФ за последние 5 лет отмечено снижение уровня заболеваемости с 199,5 на 100 тысяч населения в 2006 г. до 112,2 на 100 тысяч населения в 2011 г. [43]. К факторам риска развития вагинита относят: - при вагините, обусловленном бактериальным вагинозом: низкий социально-экономический статус, спринцевание влагалища, курение, использование внутриматочных контрацептивных средств, частую смену или несколько половых партнеров, незащищенный половой акт, гомосексуальные отношения, частое использование высоких доз спермицида ноноксинол-9 [86; 115; 227; 268; 271]; - при трихомониазе: низкий социально-экономический статус, несколько половых партнеров, высокая сексуальная активность, другие 23 ИППП, незащищенный секс, использование противозачаточных средств, употребление наркотиков, курение [118]; - при ВВК: вагинальное или системное применения антибиотиков, избыточное потребление рафинированного сахара, сахарный диабет [86; 118; 321]; - при атрофическом вагините: менопауза и другие состояния, связанные с дефицитом эстрогенов, овариэктомия, лучевая терапия, химиотерапия, иммунологические расстройства, преждевременное угасание функции яичников, эндокринные расстройства, лечение антиэстрогенами [138]; - при аллергическом вагините: сперма, спринцевание, латексные презервативы или диафрагмы, тампоны, лекарства, одежда, атопия в анамнезе [118]. 1.1.2 Современные представления о микробиоценозе влагалища у женщин репродуктивного возраста У здоровых женщин репродуктивного возраста общее количество микроорганизмов во влагалищном отделяемом составляет 106–108,5 КОЕ/мл. В состав микрофлоры влагалища входит свыше 400 видов микроорганизмов, включая бактерии, вирусы и грибы [34]. Микробиоценоз влагалища в норме состоит из постоянно обитающих микроорганизмов (индигенная или автохтонная микрофлора) и транзиторных (аллохтонная или случайная микрофлора). Автохтонная микрофлора представлена в основном Lactobacillus spp., она составляет до 95-100% численности микроорганизмов в составе микробиоценоза влагалища [31]. Общая численность транзиторных микроорганизмов в норме не превышает 15–20% от всего пула микроорганизмов [5; 107; 134; 326] Доминирование лактобактерий в составе микробиоценоза влагалища определяется высоким фоном эстрогенов, которые индуцируют накопление в вагинальном эпителии гликогена, являющегося идеальным субстратом для 24 роста лактобактерий. Лактобактерии расщепляют гликоген с образованием молочной кислоты, которая поддерживает рН среды на низком уровне (3,84,5), что ограничивает рост условно-патогенных микроорганизмов. Помимо молочной кислоты защитные механизмы лактобактерий обусловлены выработкой бактериоцинов и перекиси водорода [182]. Исследования последних лет показали, что лактобактерии выделяют во внеклеточную среду экзополисахариды, способствующие их адгезии на слизистом эпителии, обеспечивающие стабильность мукозального слоя слизистых и резистентность к УПМ [124]. Описано свыше 120 видов лактобактерий, входящих в состав микробиоценозов; из них только 20 видов колонизируют слизистую влагалища, такие как L.crispatus, L.iners, L.jensenii, L.gasseri, L.acidophilus, L.johnsoni, L.vaginalis, L.amylolyticus, L.amylovorus, L.gallinarium, L.fermentum, L.brevis, L.rhamnosus, L.salivarius и другие [182]. При этом чаще всего основу микробиоты влагалища здоровых женщин репродуктивного возраста составляют 4 вида: Lactobacillus crispatus, L.iners, L.gasseri и L.jensenii [42; 327]. Несмотря на то, что L.iners в норме присутствует в составе микробиоты влагалища достаточно часто, ее протективное значение остается спорным, а некоторые авторы даже полагают, что L.iners играет негативную роль и участвует в патогенезе бактериального вагиноза [327]. Сдвиг баланса в сторону условно-патогенных микроорганизмов приводит к дисбиотическим состояниям. В свою очередь дисбиозы могут протекать как без видимых клинических проявлений, так и сопровождаться такими симптомами, как обильные выделения из половых путей с неприятным запахом, зуд, жжение, диспареуния, т.е. сопровождаются признаками вагинитов. В случае преобладания в составе микрофлоры облигатно-анаэробных микроорганизмов, таких как Gargenerella vaginalis, Mobiluncus spp., Atopobium vaginalis, Bacteroides spp., Fusobacterium spp., Prevotella spp., Prophyromanas spp., Peptostreptococcus spp., речь идет о бактериальном 25 вагинозе. В мазках при микроскопии обнаруживаются грамвариабильные палочки и «ключевые клетки», образующиеся в результате адгезии анаэробов на десквамированном эпителии. Распространенность БВ составляет до 30 процентов [64]. БВ в зарубежной печати рассматривается в качестве одной из наиболее распространенных причин воспалительных заболеваний влагалища. В противоположность зарубежным исследованиям большинство отечественных ученых традиционно считает БВ инфекционным полимикробным невоспалительным синдромом, характеризующимся резким снижением или отсутствием лактофлоры и ее заменой на полимикробные ассоциации строгих анаэробов [8; 40]. Бактериальный вагиноз является самой распространенной причиной патологических выделений из влагалища и неприятного запаха из половых путей. Рыбный запах, обусловленный производством анаэробными бактериями аминов, является наиболее патогномоничным признаком БВ. Характерный запах становится наиболее выраженным при увеличении рН после полового акта или во время менструации при наличии крови [193]. В половине случаев бактериальный вагиноз протекает бессимптомно, не вызывает воспаление слизистой оболочки вульвы и влагалища, редко вызывает зуд вульвы [281]. По данным литературы сам по себе бактериальный вагиноз не связан с риском развития воспалительных заболеваний органов малого таза, однако, даже при бессимптомном носительстве наличие БВ ассоциировано с высоким риском возникновения эндометрита и воспалительных заболеваний органов малого таза после инвазивных гинекологических процедур и абортов [228]. Как симптоматические так и бессимптомные формы бактериального вагиноза ассоциированы с повышенном риском заражения возбудителями ИППП [94; 199; 319], в частности вирусом иммунодефицита человека ВИЧ -1 (OR= 1,89 , 95% ДИ от 1,46 до 2,43 ) [199]. 26 Бактериальный вагиноз может стать причиной преждевременных родов [187; 260; 291], преждевременного разрыва плодных оболочек [180] и послеродового эндометрита [163]. В патогенезе преждевременных родов при инфекции существенное влияние может иметь повышение TNF-α, который стимулирует синтез простагландинов [259], металлопротеиназ [123; 311] и апоптотических каспаз [206], которые в свою очередь оказывают влияние на разрыв плодных оболочек и преждевременное «созревание» шейки матки. Как полагают, в основе механизмов срочных и преждевременных родов может быть повышенный синтез провоспалительных цитокинов IL-1ß, IL-6, IL-8 и TNF-α в плаценте [238; 265; 332]. Родовая деятельность находится под контролем нескольких медиаторов: окситоцина, простагландинов, гистамина, прогестерона, кортизола и активно взаимодействиующих с ними цитокинов. В норме началу родов предшествует инфильтрация плаценты лейкоцитами (макрофагами, тучными клетками и гранулоцитами). Все эти клетки начинают активно вырабатывать провоспалительные цитокины, которые увеличивают синтез простагландинов Е2 и F, стимулирующих сокращение мускулатуры матки. Помимо этого IL-1ß и IL-6 вызывают усиление синтеза экспрессии окситоцина и рецепторов окситоцина в миометрии [126; 254]. Именно окситоцин служит одним из основных медиаторов родовой деятельности, вызывая стимуляцию сокращения гладкой мускулатуры миометрия матки. Преждевременные роды ассоциированы с увеличением уровня провоспалительных цитокинов - одной из причин необычно раннего повышения цитокинов может быть наличие инфекции. Патогены могут проникать в матку в силу несостоятельности защитных механизмов, в норме предохраняющих плод от инфицирования. Патогены активируют TLR и запускают развитие локальной воспалительной реакции, сопровождающейся синтезом провоспалительных цитокинов, которые, в свою очередь, усиливают синтез простагландина Е2, вызывающего сокращение гладкой мускулатуры матки. Внутриматочные инфекции обычно затрагивают амнион 27 и амниотическую жидкость, в которых также возрастает синтез провоспалительных цитокинов. По данным Hagberg H. и соав. почти у половины обследованных женщин с преждевременными родами в амниотической жидкости были повышены уровни IL-1ß, IL-6, IL-8 и они коррелировали с микробной колонизацией и клинической картиной воспаления у матери [140]. Маркером риска преждевременных родов также является повышение концентрации IL-6 в цервикальном канале у матери, как правило повышение IL-6 ассоциировано с дисбиотическими процессами во влагалище [131]. В случае увеличения в составе микрофлоры аэробных микроорганизмов, таких как Enterobacteriaceae (Escherichia coli, Klebsiella spp., Proteus spp.), Staphylococcus aureus, S.epidermidis, Streptococcus agalactiae, Enterococcus spp. обычно развивается воспалительная реакция вагинит). (аэробный Иногда под неспецифическим вагинитом, подразумевают исключительно аэробый вагинит. Полагают, что патогенный потенциал аэробных сравнительно микроорганизмов умеренном их может быть реализован количестве 105 КОЕ/мл. При при аэробном дисбалансе дефицит лактобактерий может быть умеренным, «ключевые» клетки отсутствуют, но достаточно много клеток десквамированного эпителия влагалища и нейтрофилов, повышен рН, флора представлена кокками [4; 5; 20; 181; 296]. Считается, что аэробный вагинит тоже может стать причиной преждевременных родов. В 1998 году Donders G.G. и соавт. наблюдали и впервые описали случай преждевременных родов, обусловленный аэробным вагинитом, сопровождающимся высокими концентрациями в цервиковагинальной жидкости IL-1ß, LIF и IL-8 [108; 109]. Вульвовагинальный кандидоз в виде моноинфекции в отличие от других форм дисбиозов протекает на фоне сохраненой нормофлоры. Для грибов характерен тропизм к тканям, богатым гликогеном. Грибы являются аэробами, оптимальная среда для роста рН=6-6,5, однако они выживают и в 28 более кислой среде до рН=2,5-3,0 [39; 57; 241; 282; 336]. Выделяют три формы ВВК: 1. Бессимптомное носительство без клинических проявлений. Эта форма ВВК достаточно широко распространена и составляет до 15-20% случаев у небеременных женщин и до 40% случаев у беременных женщин при выявлении грибов [277]. 2. Кандидозный вульвовагинит. 3. Сочетание ВВК с бактерильным вагинозом или аэробными микроорганизмами. 1.1.3 Хронический эндометрит: распространение, патогенез и факторы риска развития заболевания Хронический эндометрит впервые выделен как отдельная нозологическая форма в Международной статистической классификации болезней, травм и причин смерти IX пересмотра в 1975 г. Хронический эндометрит определяется характеризующийся как клинико-морфологический комплексом морфофункциональных синдром, изменений эндометрия воспалительного генеза, приводящих к нарушению нормальной циклической трансформации и рецептивности ткани [11]. Частота его распространения в общей популяции женского населения по различным оценкам составляет от 0,8 % до 19,0 % [246]. Заболевание может протекать, как бессимптомно, так и сопровождаться такими клиническими проявлениями, как перименструальные кровянистые выделения, обильные менструации, ациклические маточные кровотечения, боль в малом тазу, диспареуния, обильные выделения из половых путей серозного и гноевидного характера, а также бесплодие, привычное невынашивание беременности, преждевременные роды [95; 96]. Большинство исследователей полагают, что патогномоничным признаком ХЭ являются перименструальные кровянистые выделения из половых путей [58; 95; 96]. 29 Полагают, что существенная роль в развитии ХЭ принадлежит инфекционным поражениям органов репродуктивного тракта. Ведущая роль в патогенезе ХЭ принадлежит УПМ, которые выявляют в полости матки в 60-70% случаев при ХЭ [28; 96; 226], при этом только у 5% пациентов микроорганизмы выявляются в полости матки при отсутствии признаков ХЭ [96]. Гомболевская Н.А. и соавт. при культуральном исследовании аспиратов эндометрия идентифицировали микроорганизмы в полости матки в 55% случаев. Основными возбудителями ХЭ были Gardnerella vaginalis в 29,4% случаев, Enterococcus faecalis – 17,6%, Escherichia сoli – 11,8%. При этом авторы отмечают сильную корреляционную связь между спектрами микроорганизмов, выявляемых во влагалище и в полости матки [12]. Сложности интерпретации результатов идентификации микроорганизмов в полости матки состоят в технике взятия биоматериала. Полагают, что «загрязнения» внутриматочных проб содержимым влагалища и эндоцервикса при трансцервикальном заборе материала, трудно избежать. Duff P. и соавт. при трансцервикальном взятии материала получили частоту 72,2% положительных эндометриальных культур, в то время как у этой же категории больных при трансфудальном взятии материала частота положительных эндометриальных культур составила 38,8% [112]. В настоящее время при использовании современных методов взятия материала с помощью эндобраншей трансцервикальным путем контаминация флорой влагалища составляет 4,1-7,5% [69; 70]. Только в 32 % случаев одни и те же виды микроорганизмов были найдены и во влагалище, и в полости матки, в то время как приблизительно в 20% случаев определенные виды бактерий были выделены лишь из эндометрия [96]. Вопрос о присутствии бактерий в полости матки у здоровых женщин до сих пор остается открытым. Существует точка зрения, что в норме полость матки стерильна, что микробное проникновение в полость матки происходит только при восходящем инфицировании в результате многократных хирургических вмешательств в слизистую оболочку матки, а 30 также при использовании внутриматочных противозачаточных средств [141; 175]. Однако, трудно представить, что слизистая оболочка матки может быть стерильна при наличии вероятности восходящей инфекции из нижних отделов половых путей, и при половом контакте, когда сперма проникает через слизистую пробку цервикального канала в матку и маточные трубы [114]. Факторами риска развития хронического эндометрита являются инвазивные вмешательства в полость матки (гистероскопия, диагностические выскабливания, аспирационная биопсия эндометрия, аборты, гистеросальпингография, инсеминации, экстракорпоральное оплодотворение – ЭКО и др.), инфекционно-воспалительные осложнения после родов, использование внутриматочных спиралей (ВМС), инфекции влагалища и шейки матки, стеноз шейки матки, деформации полости матки, лучевая терапия органов малого таза [27; 218]. Основой для понимания биологических процессов, происходящих на слизистых оболочках взаимодействия половых макро- и путей женщин, микроорганизмов. является концепция Условно-патогенные микроорганизмы могут при определенных условиях начать проявлять свои патогенные свойства. Оппортунистические инфекции можно рассматривать, как своеобразный маркер дефекта защитных механизмов макроорганизма [35]. Макроорганизм обладает целым рядом системных и локальных механизмов защиты, препятствующих микробной инвазии. Защита от потенциально патогенных микроорганизмов осуществляется компонентами врожденного и приобретенного иммунитета, которые будут рассмотрены в следующем разделе. 31 1.2 МЕХАНИЗМЫ ИММУННОЙ ЗАЩИТЫ ПОЛОВЫХ ПУТЕЙ ЖЕНЩИН Иммунитет слизистых оболочек половых путей женщин представляет собой уникальную систему, которая эффективно распознает патогенные микроорганизмы и препятствует их размножению, но в то же время, сохраняет и защищает аллогенно чужеродный плод. Основные функции иммунной системы половых путей женщины состоят в обеспечении условий для успешного прохождения сперматозоидов, оплодотворения, имплантации и развития эмбриона и плода. Гормональные изменения. Гормональные изменения в течение менструального цикла регулируют иммунную систему на всем протяжении слизистых оболочек половых путей [217; 324]. Гормональные изменения являются циклическими и носят двухфазный характер (рис.1). Первая фолликулярная фаза овариального цикла характеризуется созреванием и развитием в яичнике под влиянием ФСГ примордиальных фолликулов, один из которых становится доминирующим. Далее происходит выход яйцеклетки из фолликула – овуляция, она приходится примерно на середину цикла. Вторая лютеиновая фаза связана с образованием желтого тела на месте созревшего фолликула под влиянием ЛГ. В соответствии со сменой фаз цикла регенерация и пролиферация функционального слоя в эндометрии сменяется секреторной активностью его желез. В фазу развития и селекции фолликулов осуществляется возрастающая секреция эстрогенов; желтое тело, формирующиеся после овуляции на месте созревшего фолликула, синтезирует прогестерон и эстрогены (рис.1). Изменения в эндометрии заканчиваются десквамацией функционального слоя (менструация). Под влиянием гормонов яичников (эстрогенов и прогестерона) циклическим изменениям подвергается как эндометрий (менструальный цикл), так и слизистая оболочка маточных труб, цервикального канала и влагалища. В каждом цикле эндометрий пролиферативную и секреторную фазу. 32 проходит менструальную, Овуляторный цикл Рисунок 1. Циклические изменения в эндометрии и соответствуюший им гормональный фон. В пролиферативную фазу цикла под влиянием эстрогенов происходит пролиферация клеток базального слоя и восстановление функционального слоя эндометрия. Эпителиальные клетки желез базального слоя мигрируют на поверхность, пролиферируют и образуют новую эпителиальную выстилку 33 эндометрия, происходит формирование новых маточных желез и врастание спиральных артерий из базального слоя. В секреторную фазу эпителиальные клетки прекращают деление, маточные железы становятся более разветвленными, железистые клетки начинают секретировать гликоген, гликопротеины, липиды, муцин и выделяют секрет в просвет матки. Спиральные артерии приближаются к поверхности слизистой оболочки матки и приобретают более извитой характер. В поверхностных частях функционального слоя увеличивается количество соединительнотканных накапливаются гликоген и клеток, липиды. в цитоплазме Вокруг клеток которых формируются коллагеновые и ретикулиновые волокна, образованные коллагеном I и III типов. Клетки стромы приобретают черты децидуальных клеток плаценты. У человека в отличие от мышей децидуализация клеток стромы осуществляется в каждом цикле вне зависимости от инвазии эмбриона [252]. Функциональный слой эндометрия высокочувствителен к половым гормонам яичника эстрогенам и прогестерону. Однако есть мнение, что решающую роль в имплантации играет не столько абсолютное содержание стероидных гормонов, сколько рецептивность эндометрия, то есть количество функционально полноценных рецепторов к соответствующим стероидным гормонам в ткани эндометрия [37]. Эстрогеновый рецептор кодируется двумя генами ESR1 (или ESR-α) и ESR2 (или ESR-β), прогестероновый одним геном PGR, но имеет две изоформы (α и β) [316]. Продукт гена ESR1 является доминирующей формой в матке, он лучше исследован, т.к. открыт был раньше, чем ESR2. Общепринятым является представление о том, что главным физиологическим регулятором экспрессии ядерных рецепторов внутри клеток-мишеней является уровень циркулирующих свободных гормонов. Эстрогены усиливают синтез собственных рецепторов, рецепторов прогестерона и андрогенов. Прогестерон не только не усиливает синтез 34 собственных рецепторов, но, напротив, подавляет его, а также синтез рецепторов эстрадиола [59]. Данные литературы по экспрессии эстрогенового и прогестеронового рецепторов являются противоречивыми. Согласно данным Nikas G. в период имплантации содержание ESR1 в эндометрии повышается, при этом наибольшая концентрация ядерных рецепторов к эстрогенам характерна для конца поздней пролиферативной и начала секреторной фазы [231]. Овуляторный всплеск эстрогенов способствует наиболее высокой экспрессии ESR1 в эпителиальных клетках эндометрия в период имплантационного окна [293], что приводит к активной пролиферации эпителия [88] и способствует инвазии эмбриона. Прогестерон является ключевым гормоном имплантации и элонгации беременности. Помимо участия в процессе инвазии эмбриона он участвует в процессах децидуализации фибробластов эндометрия и формировании железистого эпителия [316]. Экспрессия прогестероновых рецепторов в эпителии резко понижается в эпителии в период имплантационного окна [293] и резко возрастает в строме эндометрия при децидуализации фибробластов [316]. В значительной степени результаты исследования могут зависеть от локуса взятия материала, в норме наиболее высокая концентрация рецепторов, обладающих сродством к стероидным гормонам, отмечается в эндометрии в области «дна» матки (верхняя стенка) и трубных углов. Количество рецепторов к гормонам уменьшается от «дна» к шейке матки [230]. Влияние гормонов на уровень экспрессии эстрогеновых и прогестероновых рецепторов было изучено Tibbetts T.A. и соавт. на мышах с удаленными яичниками, которым экзогенно вводили гормоны [298]. В отсутствии гормональной стимуляции высокий уровень экспрессии ESR1 отмечался в железистом эпителии и стороме, высокий уровень экспрессии PGR – в люминальном и железистом эпителии. При введении эстрогенов 35 экспрессия ESR1 увеличивалась в люминальном эпителии и миометрии и затухала в строме, экспрессия PGR увеличивалась в строме, железистом эпителии и миометрии, но затухала в люминальном эпителии. Прогестерон снижал экспрессию прогестероновых рецепторов. При одновременном введении эстрогенов и прогестерона экспрессия ESR1 увеличивалась в железистом эпителии и подавлялась в миометрии. К периоду овуляции происходят не только изменения в структуре стромы, желез и спиральных артерий эндометрия, но формируется комплекс иммунологических механизмов, которые, с одной стороны, должны поддержать имплантацию и развитие эмбриона, а с другой стороны, обеспечить защиту от микроорганизмов, которые могут проникнуть из нижних отделов половых путей. Иммунная защита от биотических факторов (бактерий, грибов, вирусов) включает целый комплекс реакций взаимодействия между клетками и механизмов активации различных компонентов системы. Существует несколько уровней защиты, включая физиологический и иммунологический барьер в виде эпителиальных клеток и слоя муцина. Далее защиту обеспечивают компоненты врожденного и приобретенного (или адаптивного) иммунитета (рис.2). Верхние отделы половых путей представлены эндоцервиксом, эндометрием и фаллопиевыми трубами. Они выстланы однослойным цилиндрическим эпителием с плотными контактами между клетками. В экспериментах in vitro показано, что под влиянием эстрадиола проницаемость слизистых оболочек может изменяться [116; 324]. Кроме того, клетки стромы эндометрия влияют на проницаемость эпителиального слоя посредством синтеза цитокинов и ростовых факторов, экспрессия которых регулируется гормонами [137]. Например, высокий уровень TNF-α в строме эндометрия понижает экспрессию в эпителии клаудина - основного 36 белка плотных контактов. Это способствует успешной инвазии эмбриона, но приводит к увеличению проницаемости для микроорганизмов [87; 136; 225]. Рисунок 2. Основные компоненты иммунной системы слизистых половых путей женщин (модифицировано) [149]. Нижние экзоцерквикса, отделы половых выстланы путей, состоящие неороговевающим из влагалища и многослойным плоскоклеточным эпителием, прикрепленным к подслизистой оболочке (lamina propria). Многослойный эпителий защищает основную ткань от 37 микротравм во время полового акта. Эпителий влагалища состоит из четырех слоев: базального, парабазального, промежуточного и поверхностного. Поверхностные клетки постоянно слущиваются, вследствие чего гликоген, содержащийся в этих клетках, создает питательную среду для резидентных бактерий [249]. Между клетками эпителиального слоя отсутствуют плотные контакты, что способствует проникновению мелких микрооорганизмов, в частности вирусов, в эпителий. В слое эпителия происходит взаимодействие патогенов с диффузно расположенными клетками Лангерганса, либо CD4+ лимфоцитами [152]. Эпителиальные клетки формируют не только физический барьер, но и содержат паттерн-распознающие рецепторы (ПРР, PRR- pattern-recognition receptor), которые воспринимают патоген-ассоциированные молекулярные паттерны микроорганизмов (PAMP - pathogen-associated molecular pattern, ПАМП или «образы патогенности»), при этом запускается целый каскад реакций, результатом которых является синтез цитокинов, хемокинов и противомикробных пептидов этими клетками. От прямого контакта с патогенами эпителий частично защищает слизь. Слизь состоит из гликозилированных белков, так называемых муцинов. Помимо этого в водной фазе муцинов содержатся иммуноглобулины и противомикробные пептиды, которые тоже предохраняют эпителий от поражения [211]. Состав шеечно-вагинальной слизи зависит от гормонального фона. При действии эстрадиола в пролиферативную фазу и во время овуляции она жидкая, водянистая, с низкой плотностью, что способствует продвижению сперматозоидов. Под действием прогестерона в секреторную, раннюю пролиферативную фазу и во время менструации слизь становится более концентрированной [310]. Важной составляющей шеечновлагалищной слизи является кислая среда рН=4-5, которая препятствует размножению УПМ. Врожденный иммунитет. Врожденный иммунитет обеспечивает первую линию обороны и лежит в основе большинства воспалительных 38 реакций. К клеткам врожденного иммунитета относятся макрофаги (МФ), дендритные клетки (ДК), натуральные киллеры (НК-клетки), нейтрофилы. Макрофаги и дендритные клетки. Макрофаги и дендритные клетки осуществляют фагоцитоз и уничтожение микроорганизмов посредством ферментативного расщепления. Процесс фагоцитоза сопровождается синтезом целого ряда провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-1ß, IL-6 и др.), сигнализирующих о внедрении чужеродных микроорганизмов и обеспечивающих привлечение других иммунокомпетентных клеток в очаг воспаления: нейтрофилов, НК-клеток, моноцитов и плазмоцитоидных ДК из крови [162]. Макрофаги составляют около 10% субпопуляции лейкоцитов в составе органов половых путей, их число выше в строме эндометрия и миометрия. Количество макрофагов зависит от фазы менструального цикла. Наибольшее их количество содержится в эндометрии накануне менструации [287]. Напротив, число влагалищных макрофагов остается постоянным на протяжении всего менструального цикла [323]. Макрофаги слизистых оболочек половых путей отличаются от кишечных, в частности в них выше содержание CD4, хемокинов CCR5 и CXCR4 [89]. Дендритные клетки локализованы в строме эндометрия. Во влагалище они присутствуют и в эпителиальных слоях [158]. Ochiel D.O. было установлено, что эпителиальные клетки секретируют в строму растворимые медиаторы, которые влияют на фенотип ДК с пониженной экспрессией костимулирующих молекул CD83и CD86, а также менее выраженным ответом на стимуляцию TLR-3 и TLR-4 [237]. Как профессиональные антигенпредставляющие клетки, МФ и ДК являются важными посредниками запуска адаптивного иммунитета во время инфекционного процесса. Процессы фагоцитоза инициируют в МФ и ДК процессы созревания и презентации антигенов в составе молекул главного комплекса гистосовместимости I или II класса (HLA-I и HLA-II). 39 Презентация антигена наивным Т-лимфоцитам (Th0) приводит к запуску патоген-специфичного адаптивного иммунитета [266]. Натуральные киллеры. НК-клетки обладают цитотоксической активностью, выполняют защитные функции, обеспечивают имплантацию и поддержание беременности [219; 323]. В отличие от НК-клеток крови содержат уникальный маркер CD9 [219]. НК-клетки эндометрия и эндоцервикса содержат такие маркеры, как CD96, CD94 [219]. Количество НК-клеток в эндометрии зависит от стадии цикла и достигает 70% в популяции лейкоцитов в секреторную фазу [323]. В других отделах половых путей количество НК клеток не зависит от стадии цикла и составляет 10-30% в общем пуле лейкоцитов. Наименьшее количество НК клеток содержится в фаллопиевых трубах. Подобно НК-клеткам крови маточные НК-клетки (uNK) продуцируют GM-CSF, IL-10, IL-8 и IFN-γ, тем самым поддерживают воспалительную реакцию, активируя макрофаги и цитотоксические Т-лимфоциты. Маточные НК-клетки в отличие от кровяных, продуцируют LIF и другие ангиогенные ростовые факторы, которые необходимы для формирования сосудов. Нейтрофилы. Меньше всего нейтрофилов содержится в фаллопиевых трубах, их число постепенно повышается по направлению к нижним отделам половых путей, достигая максимума во влагалище. Количество нейтрофилов практически не зависит от стадии цикла, однако повышается во время менструации, чему способствует «выброс» IL-8 в тканях эндометрия. Во время менструации нейтрофилы выполняют две важные функции: во-первых, способствуют разрушению тканей эндометрия посредством синтеза эластазы, активирующей матричные металлопротеазы; во-вторых, обеспечивают иммунную защиту в условиях неполноценного эпителиального барьера. Нейтрофилы экпрессируют TLR 1-9 и уничтожают чужеродные микроорганизмы посредством фагоцитоза, синтеза антимикробных пептидов и окислительных соединений. Нейтрофилы продуцируют также ингибиторы 40 протеаз (траппин-2/элафин), альфа-дефензины, фосфолипазы и цитокины [274]. Распознавание «образов патогенности». Все клетки врожденного иммунитета и эпителий содержат ПРР, которые воспринимают патогенассоциированные повторяющиеся молекулярные инвариантные паттерны молекулярные микроорганизмов. структуры Общие патогенов и рецепторы к ним впервые были описаны Janeway C. A. в 1992 году [164]. В роли ПАМП могут выступать различные структурные компоненты клеточной стенки вирусов, бактерий или грибов, которые одинаковы у многих патогенов, но не встречаются у человека и, таким образом, опознаются иммунной системой хозяина как «чужое». За последние 10-15 лет были идентифицированы и изучены многочисленные ПРР. Они могут быть разделены на 3 большие группы: 1) толл-лайк рецепторы ТЛР (TLR- toll-like receptor, toll – диал., амер. завлекать, заманивать в ловушку); 2) нод-лайк рецепторы, НЛР (NLR – nucleotide oligomerization domain (NOD)-like receptor); 3) лектиновые рецепторы С- типа ЛРС (СLR-C-type lectin receptor) [155]. Наиболее хорошо изучены в настоящее время TLR. У человека их десять, девять из них встречаются в органах половых путей женщин [224]. TLRs 1, 2, 4, 5 и 6 экспрессируются в основном на поверхности клеток и распознают компоненты жгутиков простейших и клеточных стенок бактерий и грибов. TLR 3, 7, 8 ,9 - фрагменты нуклеиновых кислот микроорганизмов и расположены внутриклеточно на поверхности эндосом. TLR-4 взаимодействует с липополисахаридами (LPS) клеточных стенок грамотрицательных бактерий и маннаном кандид, TLR-9 – с неметилированными CpG-мотивами бактериальной и вирусной ДНК, TLR-1 и TLR-2 – с широким спектром паттернов, включая липопротеины и пептидогликаны клеточных стенок грам-положительных и грам-отрицательных бактерий, а также зимозаном и фосфолипоманом грибов [170]. 41 В неактивном состоянии толл-подобные рецепторы находятся в мембране в мономерном состоянии, а при активации они димеризуются. Большинство рецепторов образуют гомодимеры, а TLR-2 - гетеродимеры с TLR-1 либо с TLR-6 в зависимости от лиганда. После активации рецептора происходит передача сигнала внутрь клетки через адаптерные молекулы и синтез определенных цитокинов в зависимости от типа сигнального пути. Известны два сигнальных ответа. Первый путь связан с включением адаптерного белка MyD88, который активирует транскрипционный фактор NF-kB, инициирующий транскрипцию провоспалительных цитокинов (TNF-α, IL-6 и др). Второй путь осуществляется через активацию интерферон-регулирующего фактора 3 (IRF3), инициирующего выработку IFN I типа и последующую активацию интерферон-регулируемых генов [196; 224]. Преимущества распознавания микроорганизмов посредством ПРР заключается в возможности изменения экспрессии ряда генов, включая гены цитокинов, и модулировании адаптивного иммунного ответа [303]. В частности, важное значение в инициации иммунного ответа в отношении грибов имеют TLR-1, -2, , -4, -6, лектиновые рецепторы С-типа, такие как дектин-1, -2; рецептор маннозы и др. [184]. В качестве лигандов у кандид выступают компоненты клеточной стенки. Клеточная стенка Candida albicans состоит из β-глюкана (60%), маннопротеинов (35–40%) и хитина (1–5%). Наружный слой клеточной стенки обогащен маннопротеинами, внутренний составляют преимущественно хитин и β-глюкан. β-глюкан является доминирующим компонентом клеточной стенки, но он располагается во внутреннем слое, и доступен только во время почкования дрожжевых клеток или гибели патогена [174]. На разных стадиях жизненного цикла (бластоспоры и гифы) кандид могут связываться с различными TLR. Бластоспоры активируют как TLR-2, так и TLR-4 рецепторы, гифы только TLR-2 рецепторы [304]. Взаимодействие маннопротеинов кандид с TLR-4 стимулирует Th1-ответ и продукцию IL-12, IFN-γ, TNF-α и IFN I типа [229], 42 что в конечном счете приводит к эффективной ликвидации кандид. Напротив, связывание кандид с TLR-2 приводит к экспрессии TGF-β1 и IL-10, которые поддерживают иммуносупрессию и обеспечивают толерантность к антигенам кандид [304]. Однако, при активации β-глюканом кандид TLR-2 в гетеродимере с дектином-1 запускается сигнальный каскад, который способствует синтезу провоспалительных цитокинов. Таким образом, Candida albicans теоретически может вызывать несколько типов иммунного ответа в зависимости от стадии жизненного цикла возбудителя и активации различных комплексов TLR. В этом случае цитокины будут своего рода маркерами типа иммунного ответа: от толерантности к антигенам кандид до резко выраженной воспалительной реакции. Одним из основных типов клеток во влагалище являются нейтрофилы, они экспрессируют все TLR, за исключением TLR-3, и таким образом могут реагировать на широкий спектр «образов патогенности [147]. Эпителиальные клетки влагалища и шейки матки экспрессируют TLR-1, 2, 3, 5, 6, но экспрессия TLR-4 – низкая [245]. Адаптивный иммунитет. Механизмы приобретенного иммунитета основаны на специфическом распознавании антигена, также способствуют уничтожению чужеродных микроорганизмов, но помимо этого обеспечивают иммунологическую память и развитие таких осложнений, как аутоиммунные процессы и аллергическая реакция. Адаптивный иммунитет реализуется после взаимодействия наивных Ти В-лимфоцитов с АПК. Антигены презентуются лимфоцитам в комплексе с молекулами HLA. В качестве АПК выступают макрофаги, ДК, клетки Лангерганса, а также эпителиальные клетки цервикса и эндометрия. Наивные Т-лимфоциты (Th0) могут диференцироваться в 4 направлениях: Th1-лимфоциты (фактор дифференцировки TBX-21) участвуют в клеточно-опосредованном иммунитете и характеризуются синтезом таких цитокинов, как IFN-γ, IL-2, TNF-ß; 43 Th2 – лимфоциты (фактор дифференцировки GATA-3) участвуют в гуморальном ответе, т.е. синтезе АТ, а также защите от паразитарных инфекции и развитии аллергических реакций; характеризуются синтезом таких цитокинов, как IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-13; Treg-клетки – регуляторные клетки экспрессируют транскрипционный фактор Foxp3 и участвуют в супрессии иммунного ответа; Th17-клетки (фактор дифференцировки RORC) участвуют в воспалительных реакциях. Th1 клеточно-опосредованный иммунитет направлен на уничтожение внутриклеточных патогенов и обеспечивается Т-лимфоцитами. цитотоксические CD8+ эффекторные Т-клетки взаимодействуют с инфицированными клетками посредством связывания с молекулами HLA I класса, запускают процесс апоптоза через перфорин и гранзим- опосредованный цитолиз [190]. CD4+ Т-клетки секретируют высокий уровень IFN-γ, поддерживая цитотоксические Т-лимфоциты, а также непосредственно блокируют вирусную репликацию [158; 222]. Т-клетки расположены в строме влагалища, шейки матки и эндометрия, а также среди эпителиальных клеток влагалища и известны, как интраэпителиальные лимфоциты [165]. В эндометрии СD8+ клеток больше (35-50%), чем CD4+ лимфоцитов (около 25%). Слизистая оболочка матки содержит уникальные лимфоидные скопления клеток, представленные большим количеством CD8+ лимфоцитов, расположенных вокруг клеточного центра, состоящего из В-клеток и инкапсулированных макрофагами. Лимфоидные скопления начинают развиваться в пролиферативную фазу менструального цикла, достигая максимальных размеров в секреторную фазу [330]. Образование скоплений лимфоцитов регулируется эстрадиолом и прогестероном. У женщин в постменопаузе подобные скопления не образуются. 44 Гуморальный иммунитет направлен на образование антител, которые связываясь с антигенами микроорганизмов, способствуют их нейтрализации. После связывания АТ с АГ элиминация возбудителя осуществляется за счет фагоцитарной активности МФ или активации комплимента. Th2-клетки способствуют превращению наивных В-лимфоцитов в плазматические клетки, продуцирующие АТ [177]. В отличие от других слизистых поверхностей: респираторного и желудочно-кишечного тракта, где доминирующим изотипом являются IgA, секреты слизистых половых путей в равной степени содержат как IgG, так и секреторные sIgA. Исследование соотношения IgG/IgA антител показало, что оно составляет 2:1 и 6:1 в цервикальной слизи и цервико-вагинальном лаваже соответственно [169]. Относительно соотношения IgG/IgA в маточном секрете данных нет. Транспортировка IgA-АТ из стромы эндометрия через эпителий осуществляется через рецепторы pIgR. Показано, что экспрессия этих рецепторов зависит от стадии менструального цикла: высокая - в секреторную фазу, уменьшается в пролиферативную фазу, самая низкая – во время менструации [292]. На моделях крыс было показано, что секреция IgAАТ, IgG-АТ рецепторов pIgR повышается при стимуляции эстрадиолом [322]. Хотя секреция IgA-АТ регулируется гормонами в течение менструального цикла, но в значительной степени определяется и опосредуется процессами антигенной стимуляции. На момент оплодотворения иммунная система должна обеспечить условия для успешной имплантации и поддержания беременности. Под действием эстрадиола в пролиферативную фазу происходит накопление CD4 + CD25 + Foxp3 + регуляторных Т-клеток (Treg) в строме эндометрия [75]. Treg являются иммуносупрессорами. Механизм их действия может быть либо прямым (непосредственный контакт между клетками), либо опосредованным через выработку иммуносупрессорных факторов Foxp3 и TGF-ß1. Мишенями действия Тreg-клеток являются Т-эффекторные клетки (Т-хелперы и Т-цитотоксические лимфоциты) и дендритные клетки, 45 ответственные за презентацию антигена и активацию Т-клеток. При прямой супрессии Treg взаимодействуют с эффекторными Т-клетками, выделяют гранзим B, который вызывает апоптоз в этих клетках, тем самым элиминируя активные Т-клетки. Тreg клетки, взаимодействуя с рецептором CD86 на дендритных клетках при помощи CTLA-4, блокируют активацию Т-клеток дендритными клетками. При опосредованном действии транскрипционный фактор Foxp3 регулирует транскрипцию генов, а TGF-ß1 связывается со своими рецепторами на поверхности Т-эффекторных клеток и ингибирует их активацию. Важным механизмом также служит захват IL-2 при помощи CD25high и секвестрация рецептора у эффекторных Т-клеток [294; 295]. Как известно, IL-2 является основным аутокринным стимулирующим фактором, поддерживающим дифференцировку и клональную пролиферацию Т-клеток. Помимо накопления Treg в эндометрии на момент оплодотворения происходит снижение цитолитической активности CD8+цитотоксических лимфоцитов [317]. Большое число внутриэпителиальных γδT – лимфоцитов тоже подавляют отторжение эмбриона посредством синтеза TGF-ß1 [232]. Особый интерес при изучении инфекционного аспекта могут представлять γδT – лимфоциты. Они расположены в непосредственной близости к эпителию. Полагают, что γδT – лимфоциты одними из первых реагируют на внедрение патогенов в эпителий, активируются и дифференцируются либо в направлении Т-хелперов, либо в направлении Ткиллеров [60]. Не исключают, что хронизация инфекционных процессов может быть обусловлена несостоятельностью γδT – лимфоцитов. В присутствии провоспалительных цитокинов, таких как IL-6, происходит дифференцировка Т-лимфоцитов в Th17-клетки, которые участвуют в воспалительной реакции. Было показано, что Th17 регулируют миграцию нейтрофилов при гонорее [119], хламидийной инфекции [273] и на поздних стадиях самопроизвольных выкидышей [223]. Участие Th17 клеток в воспалительном процессе мало исследований. 46 изучено и требует дальнейших Снижение защитных условно-патогенными функций иммунокомпетентных микроорганизмами. Полагают, что клеток вещества, вырабатываемые УПМ, снижают защитные функции иммуннокомпетентных клеток и факторов локального иммунитета. Ряд исследователей полагает, что анаэробные бактерии, ассоциированные с БВ, выделяют вещества, которые ингибируют миграцию нейтрофилов во влагалище [92; 212; 286]. Установлено, что сукцинат, выделяемый бактероидами, ингибирует функции нейтрофилов [262]. Сиалидазы, продуцируемые гарденереллой и некоторыми другими анаэробами стимулируют некоторые клетки иммунной системы и ингибируют фагоцитоз [151], помимо этого способствуют разрушению муцина [320]. Ureaplasma urealyticum может продуцировать протеазы, которые расщепляют IgA [171; 258]. Роль цитокинов во взаимодействии иммунокомпетентных клеток. Одной из важнейших функций системы цитокинов является обеспечение согласованного действия иммунной, эндокринной и нервной систем в развитии реакции воспаления. Цитокиновая сеть представлена множеством протеинов или гликопротеинов, вырабатываемых лимфоцитами, макрофагами и другими типами лейкоцитов, а также фибробластами, эндотелиальными, эпителиальными и другими соматическими клетками. Далее рассмотрены функции основных цитокинов и медиаторов иммунного ответа, которые исследованы в работе в качестве маркеров локальных воспалительных реакций. CD45 – общий лейкоцитарный антиген (тирозиновая протеинфосфатаза C рецепторного типа). CD68 – макросиалин - трансмембранный белок, используется в качестве маркера макрофагов, экспрессируется также дендритными клетками. СD69 – транмембранный гликопротеин, относится к лектинам C типа – ранний маркер пролиферации Т-лимфоцитов, экспрессируется также на поверхности активированных В-лимфоцитов, 47 натуральных киллеров, нейтрофилов, эозинофилов, эпидермальных клеток Лангерганса (ДК) и тромбоцитов. Foxp3 – транскрипционный фактор скурфин, регулирует транскрипцию генов, ответственных за дифференцировку Т-клеток и экспрессию цитокинов и других факторов, участвует в супрессии иммунного ответа, один из основных маркеров естественных Т-регуляторных клеток. GATA3 – транскрипционный фактор GATA-связывающий протеин 3, ключевой фактор дифференцировки Т-хелперов II типа. GNLY - гранулизин, компонент гранул цитотоксических Т-лимфоцитов и НК-клеток, обладающий антимикробной активностью IFN-γ (ИФН-γ) – интерферон гамма обладает иммунорегулирующими функциями: активация макрофагов, усиление Th1-ответа, индукция экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости типа II на антигенпрезентирующих и других клетках, проявляет противовирусную и антипролиферативную активность. IL-1α (ИЛ-1α) – интерлейкин 1 альфа - провоспалительный цитокин, один из важных медиаторов воспалительного ответа, функции аналогичны IL-1ß; главным образом является медиатором местных защитных реакций, в окружающую среду экспрессируется в незначительном количестве, в основном представлен мембранной формой, в то время как IL-1ß представляет собой секреторный цитокин и осуществляет свои функции как на локальном, так и на системном уровне. IL-1ß (ИЛ-1ß) – интерлейкин 1 бета - провоспалительный цитокин, один из основных медиаторов воспалительного процесса, активирует лимфоциты и макрофаги, вызывает усиление клеточной адгезии, является одним из медиаторов реакций острой фазы воспаления, в том числе на системном уровне вызывает повышение температуры и изменение синтеза острофазовых белков в печени. Помимо этого IL-1ß оказывает влияние на метаболизм соединительной ткани: стимулирует пролиферацию фибробластов, увеличивает продукцию ими простагландинов, ростовых 48 факторов и ряда цитокинов. Под влиянием IL-1ß в клетках соединительной ткани увеличивается синтез коллагена и металлопротеиназ. Роль IL-1ß заключается в стимуляции общего процесса перестройки соединительной ткани после повреждения, что необходимо для регенерации тканей и восстановления их целостности. IL-1RA - антагонист интерлейкина-1, взаимодействует с рецептором IL-1 и препятствует активации внутриклеточного сигнального каскада, запускаемого IL-1. IL-2 (ИЛ-2) - интерлейкин 2 - фактор роста и созревания Т-лимфоцитов, основными продуцентами являются активированными Т-хелперы I типа после взаимодействия антигена с Т-клеточным антигенным рецептором. IL-2 вызывает функциональную активацию многих клеточных типов: в Тлимфоцитах усиливает цитотоксические свойства и синтез самого IL-2, в Вклетках – продукцию антител, в НК-клетках – противоопухолевую активность, в моноцитах и макрофагах – продукцию провоспалительных цитокинов, бактерицидность и фагоцитоз. Полагают, что IL-2 участвует в формировании нормального числа Т-регуляторных клеток на периферии. IL-2Rα – α-цепь рецептора IL-2, трансмембранный белок, представляет собой одну из субъединиц рецептора IL-2. Помимо этого в состав рецептора входят ß и γ субъединицы. В комплексе все три субъединицы образуют высоко аффинный рецептор IL-2 – CD25high, который является маркером активированных Т-лимфоцитов и естественных Т-регуляторных клеток. IL-4 (ИЛ-4) - интерлейкин 4 – фактор роста Т- и В-лимфоцитов, промотор IgE-опосредованных реакций и роста тучных клеток, синтезируется Тхелперами II типа. IL-6 (ИЛ-6) - интерлейкин 6 – фактор роста и дифференцировки Влимфоцитов, активатор поликлональной продукции иммуноглобулинов, поддерживает пролиферацию Т-клеток, является одним из медиаторов реакций острой фазы воспаления. 49 IL-8 (ИЛ-8) - интерлейкин 8 – хемокин семейства CXC, обеспечивает хемотаксис нейтрофилов и Т-лимфоцитов, активирует нейтрофилы, способствует ангиогенезу, ингибирует выброс гистамина базофилами, регулирует синтез IgE В-клетками. IL-10 (ИЛ-10) - интерлейкин 10 – противовоспалительный цитокин, обладает иммуносупрессорной активностью в отношении Т-хелперов I типа и антигенпрезентующих клеток, подавляет продукцию провоспалительных цитокинов, однако костимулирует пролиферацию, дифференцировку и функциональную активность В-лимфоцитов. IL-12 (ИЛ-12) - интерлейкин 12 – провоспалительный цитокин, состоит из двух субъединиц (р35 и р40), активирует и стимулирует дифференцировку Тхелперов I типа и НК-клеток, тем самым способствует синтезу IFN-γ, является фактором созревания цитотоксических лимфоцитов. IL-15 (ИЛ-15) - интерлейкин 15 – провоспалительный цитокин, регулирует активацию и пролиферацию Т-лимфоцитов и НК-клеток. По биологическим свойстам похож на IL-2. Однако роль IL-2 больше связана с регуляцией Тлимфоцитов, тогда как IL-15 более важен для поддержания функций НКклеток, интраэпителиальных γδТ-лимфоцитов и цитотоксических Т- лимфоцитов. IL-18 (ИЛ-18) – интерлейкин 18 – провоспалительный цитокин, один из основных индукторов синтеза IFN-γ Т-лимфоцитами и НК- клетками. Обладает провоспалительными свойствами за счет активации различных типов лейкоцитов и НК–клеток, в том числе в макрофагах происходит индукция синтеза циклооксигеназы и NO-синтазы, провоспалительных цитокинов и хемокинов. В присутствии IL-12 является избирательным активатором Th1-лимфоцитов. Однако в отсутствии IL-12 вызывает аллергическую сенсибилизацию, повышает синтез IL-4 и IgE [331]. IL-23 (ИЛ-23) – интерлейкин 23 является одним из ключевых цитокинов воспалительного процесса, вместе 50 с IL-6 и TGF-β1 способствует дифференцировке наивных Т-лимфоцитов в Th17-клетки, состоит из двух субъединиц (р19 и р40), р 40 является общей субъединицей с IL-12. LIF (ЛИФ) – лейкемия-ингибирующий фактор тормозит пролиферацию моноцитов и макрофагов, является одним из факторов ангиогенеза, обладает свойствами провоспалительного и гемопоэтического цитокина, напоминая по биологическим свойствам IL-6 [143]. LIF считается одним из ключевых регуляторов имплантации [172]. RORC – транскрипционный фактор дифференцировки Th17-лимфоцитов. TBX21 - транскрипционный фактор дифференцировки Т-хелперов I типа, индуцирует экспрессию рецептора IL-12Rß2 и направляет ремодулирование хроматина в индивидуальных аллелях гена IFN-γ [220]. TGF-ß1 (ТФР-ß1) – трансформирующий фактор роста бета 1 - многофункциональный белок, обладает тремя основными биологическими свойствами: изменение пролиферации клеток, в большинстве случаев – подавление (в том числе подавляет пролиферативную и функциональную активность Т-лимфоцитов и НК-клеток); усиление формирования внеклеточного матрикса; иммуносупрессивное действие. TLR-2 (ТЛР-2) - толл-подобный рецептор 2 распознает компоненты клеточных стенок грам-положительных бактерий и грибов. TLR-4 (ТЛР-4) - толл-подобный рецептор 4 распознает липополисахариды клеточных стенок грам-отрицательных бактерий. TLR-9 (ТЛР-9) - толл-подобный рецептор 9 распознает неметилированные CpG-динуклеотиды бактериальной ДНК. TNF-α (ФНО-α) - фактор некроза опухоли альфа – провоспалительный цитокин, один из основных медиаторов воспалительного процесса и активации лейкоцитов, индуцирует экспрессию молекул адгезии и хемокинов на эндотелии, стимулирует продукцию IL-1, IL-6, IL-8, IFN-γ, является одним из важных факторов защиты от внутриклеточных паразитов и вирусов, может индуцировать апоптоз клеток-мишеней. 51 VEGF-A (СЭФР) - сосудистый эндотелиальный фактор роста - один из ключевых факторов ангиогенеза, который оказывает выраженное митогенное воздействие на эндотелиальные клетки сосудов, влияет на развитие новых кровеносных сосудов и выживание незрелых кровеносных сосудов, обеспечивая сосудистую поддержку, увеличивает проницаемость микрососудов и первоначально идентифицирован, как «сосудистый фактор проницаемости». Он связывается с двумя близкими по строению мембранными тирозинкиназными рецепторами (VEGFR1 и VEGFR2). Полагают, что VEGFR2 запускает сигнальный каскад, который в конечном итоге стимулирует рост эндотелиальных клеток сосудов, их выживание и пролиферацию. Функции рецептора VEGFR1 исследованы меньше, но полагают, что он модулирует сигналы VEGFR2, в том числе он может выступать как «ловушка», которая изолирует белок VEGF от рецептора VEGFR2. Белок VEGFA представлен 5 изоформами, состоящими из 121, 145, 165, 189 и 206 аминокислот. Разные изоформы отличаются по митогенному потенциалу, хемотактическим свойствам, переносу белка, сигнальной трансдукции, сродству к гепарину, взаимодействию с фактором роста, по характеристикам связывания рецепторов и тканеспецифичности экспрессии. Наиболее хорошо изучены изоформы VEGF-121 и VEGF-165. Известно, что VEGF-121 обладают в сто раз меньшим митогенным потенциалом для эндотелиальных клеток, чем VEGF-165. 52 1.3 КЛИНИКО-ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА ВУЛЬВОВАГИНИТОВ И ХРОНИЧЕСКОГО ЭНДОМЕТРИТА 1.3.1 Диагностика воспалительных заболеваний нижних отделов органов женской репродуктивной системы Традиционно в рутинной диагностике вульвовагинитов используют комбинацию признаков: анализ жалоб и результатов осмотра пациентки (табл.1), микроскопия мазков, наличие запаха (аминный тест), определение рН вагинальной жидкости. При такой оценке приблизительно у 30 процентов женщин с симптомами заболевания этиологический фактор остается неустановленным [68]. Таблица 1. Общие причины, симптомы и признаки вагинита. Тип вагинита этиология Ассоциированный с Gardnerella БВ vaginalis, Mycoplasma hominis и другие анаэробные бактерии: Prevotella species, Mobiluncus species Трихомониаз Trichomonas vaginalis Вульвовагинальный Candida albicans, кандидоз Candida krusei, Candida glabrata Клинические симптомы Выделения Боли Однородные Не основной прозрачные, симптом белые или серые, с неприятным рыбным запахом Зеленожелтые, пенистые Зуд Не основной симптом Наличие боли, боль при половом акте, дизурия Белые, Жжение, творожистые, дизурия, без запаха диспареуния Не основной симптом Редко Атрофический вагинит Дефицит эстрогенов Желтые или зеленоватые, без запаха Аллергический Аллергическая реакция Не обильные Сухость во влагалище, боль при половом акте Не основной симптом Часто Возможен *Составлено по Anderson M.R. [68] и Farage M.A. [118] По данным литературы в сочетании эти тесты имеют чувствительность и специфичность 81 и 70% соответственно при БВ, 84 и 85% при ВВК и 85 и 53 100% при трихомониазе по сравнению с ДНК-тестами определения микроорганизмов [194]. В отечественной рутинной практике основное внимание уделяется микроскопии мазка, рН-тест и аминный тест используются редко, часто врач руководствуется личным субъективным опытом. Для лучшей идентификации заболевания используют окраску мазков по Граму. При анализе мазков учитывают лейкоцитарную реакцию, анализируют особенности эпителия и состав микрофлоры. При наличии воспалительной реакции количество лейкоцитов увеличено (более 10 в поле зрения, более 20 для беременных женщин), эпителий влагалища представлен клетками поверхностного и промежуточного слоев, а при выраженном воспалительном процессе и парабазального слоя [31]. Для оценки состояния микрофлоры влагалища используют оригинальную классификацию Кира Е. Ф. микроскопической характеристики [18; 19]. В ней отражены 4 типа состояния микробиоценоза влагалища на основе микроскопической картины (табл. 2): 1. Нормоценоз 2. Промежуточный тип микробиоценоза влагалища 3. Дисбиоз влагалища 4. Вагинит Для диагностики БВ чаще всего используют критерии Амсела [66]: • однородные, гомогенные, прозрачные, белые или серые выделения из влагалища; •вагинальный рН выше 4,5; • КОН-тест (или аминный тест) – положительный: при добавлении 10процентного раствора гидроксида калия образуются полиамины с характерным рыбным запахом; • выявление в нативных препаратах мазков из влагалища «ключевых клеток» (эпителиальные клетки с адгезированными на них коккобациллами). 54 Часто для лучшей идентификации «ключевых клеток» мазки окрашивают по Граму. Таблица 2. Микроскопическая характеристика биоценоза влагалища (Кира Е.Ф.,1995). Состояние (тип) биоценоза Характеристика признаков Нозологические формы Нормоценоз Доминирование лактобактерий, отсутствие Типичное состояние грамотрицательной микрофлоры, спор, нормального биотопа мицелия, псевдогифов, лейкоцитов, влагалища единичные «чистые» эпителиальные клетки Промежуточный тип Умеренное или сниженное количество Часто наблюдают у лактобактерий, наличие грамположительных здоровых женщин, редко кокков, грамотрицательных палочек. сопровождается Обнаруживают лейкоциты, моноциты, субъективными жалобами макрофаги, эпителиальные клетки и клинической картиной Дисбиоз влагалища Незначительное количество или полное отсутствие лактобактерий, обильная полиморфная грамотрицательная и грамположительная палочковая и кокковая Бактериальный вагиноз микрофлора; наличие «ключевых клеток». Количество лейкоцитов вариабельно, отсутствие или незавершенность фагоцитоза. Полимикробная картина мазка Большое количество лейкоцитов, Неспецифический макрофагов, эпителиальных клеток, Вагинит вагинит выраженный фагоцитоз. (воспалительный тип мазка) При обнаружении: гонококков, трихомонад, Гонорея, трихомоноз, мицелия, псевдогифов, спор. микотический вагинит Обычно упоминают о том, что содержание «ключевых клеток» должно быть не менее 20%. Изначально в критериях Амсела процентное соотношение данного показателя не определено. Для положительного результата необходимо наличие хотя бы 3 из четырех критериев. 55 Однако определение двух из четырех критериев Амсела бывает достаточно для верификации БВ. При обследовании 269 женщин установлено, рН-тест является наиболее чувствительным (89%), а аминныйтест – наиболее специфичным (93%) [139]. Другим наиболее распространенным критерием БВ является оценка по шкале Нугента (Ньюджента), предложена в 1991 году [233]. В основе лежит система баллов от 0 до 7 и их комбинация для диагностики бактериального вагиноза по оценке трех морфотипов бактерий: А лактобациллы - большие грам-позитивные палочки, B - гарднерелла и бактероиды - мелкие грамвариабельные и грамотрицательные кокки, С Мобилункус - изогнутые грамвариабельные палочки. Мазок из влагалища окрашивают по Граму и считают отдельно количество выявленных морфотипов под иммерсионной системой микроскопа (табл.3). Таблица 3. Шкала Ньюджента. Баллы А) Lactobacilli В) Gardnerella С) Mobiluncus 0 более 30 морфотипов нет морфотипов нет морфотипов 1 5 - 30 морфотипов один морфотип один морфотип 2 1-4 морфотипа 1-4 морфотипа 1-4 морфотипа 3 один морфотип 5 - 30 морфотипов 5-30 морфотипов 4 нет морфотипов более 30 морфотипов более 30 морфотипов Количество полученных баллов суммируют (A+B+C). Количество баллов оценивают следующим образом: 0 - 3 балла : нормальная микрофлора 4 - 6 баллов: промежуточная микрофлора => 7 баллов: бактериальный вагиноз. Менее известна система оценки БВ по Hays/Ison [146; 161] В качестве специальных методов исследования при вагините используется культуральный метод, иммуноферментные методы и ДНК56 тестирование. Лабораторные тесты дают больше информации для установления инфекционных этиологических факторов заболевания. Культуральный стандандартом» метод исследования диагностики. Помимо считается видовой «золотым идентификации микроорганизмов он дает представление о чувствительности выявленных микроорганизмов к антибиотикам. Внедрение в практику микробиологии протеомной идентификации культивированных микроорганизмов с помощью время-пролетной масс-спектрометрии (MALDI-TOF масс-спектрометрия) расширило возможности диагностики. Масс-спектрометрия обеспечивает высокую производительность, автоматизацию процесса и близкую к 100% специфичность и чувствительность, а также непревзойденную скорость анализа (менее 2 минут на образец), при этом образцом может служить первичная колония. Спектр белков определяется напрямую из бактериальной клетки без предварительной длительной пробоподготовки. Однако бактериологический метод диагностики не лишен ряда серьезных ограничений. Условно-патогенная микрофлора, являющаяся наиболее частой причиной урогенитальных заболеваний у женщин, представлена, главным образом, Подавляющее большинство анаэробными лечебных микроорганизмами. учреждений практического здравоохранения в настоящее время не имеют условий для культивирования таких микроорганизмов. К недостаткам культурального метода следует отнести длительные сроки культивирования микроорганизмов (в среднем 5 дней) и необходимость сохранения их жизнеспособности до момента поступления биоматериала в лабораторию [40; 49]. Иммунологические методы исследования направлены на выявление антигенов и антител патогенных микроорганизмов. Молекулярные методы исследования направлены на выявление ДНК и РНК бактерий, грибов и вирусов. Наибольшее распространение в последние годы получили методы полимеразной цепной реакции и секвенирования микроорганизмов. 57 Методы секвенирования микроорганизмов включают несколько принципиально разных подходов. Во-первых, используется традиционный метод секвенирования по Сэнгеру. В основе метода лежит процесс ферментативного секвенирования с использованием терминирующих ddNTP. Специфическая реакционную терминация смесь наряду синтеза с dNTP обеспечивается добавлением флуоресцентно-меченных в 2',3'- дидезоксинуклеозид-трифосфатов (ddATP, ddTTP, ddCTP или ddGTP). ddNTP включается в растущую цепь ДНК без дальнейшего копирования ДНК из-за отсутствия 3'-ОН группы. Отношение концентраций dNTP/ddNTP подобраны так, чтобы в итоге получить набор копий ДНК различной длины [269; 270]. Используемые в реакции праймеры чаще всего специфичны к региону 16SрРНК, т.к. данный регион есть у всех бактерий; содержит как консервативные, так и вариабельные области; кроме того, у большинства бактерий последовательности известны. К ограничениям метода следует отнести необходимость предварительного культивирования микроорганизмов, т.к. для работы нужна колония; идентификация смеси бактерий не возможна. С разработкой так называемых "методов нового или второго поколения" (Next-Generation Sequencing, NGS) диагностические возможности метода секвенирования расширились. Во-первых, при использовании NGS можно расшифровать все ампликоны 16SрРНК, полученные из клинического образца даже при смешанных инфекциях. Во-вторых, NGS обеспечивает возможность полногеномного секвенирования микроорганизма с определением факторов патогенности, но при этом микроорганизм должен быть предварительно культивирован для получения достаточного количества материала. В-третьих, NGS обеспечивает возможность тотального прочтения ДНК всего генетического материала всех микроорганизмов в составе микробиоценозов отдельных локусов: кожа, кишечник, ротовая полость, влагалищные мазки и т.д. (метагеномные исследования). В 2008 году по 58 инициативе Национального института здоровья США с целью определить видовой и количественный состав всей микробиоты здорового человека стартовал масштабный международный проект «Микробиом человека» [300]. В 2012-2013 году были опубликованы первые результаты работы по данному проекту [61; 125; 198]. Классические методы диагностики патогенных микроорганизмов, когда достаточно определить наличие возбудителя (культуральный метод, качественное определение микроорганизмов по ДНК или серодиагностика по АГ и АТ), оказались малоинформативными в диагностике заболеваний, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, т.к. обычно не учитывается количество микроорганизмов. Культуральный метод оказался неинформативным для диагностики БВ. Более того, культуральный метод определения Gardnerella vaginalis не рекомендуется из-за низкой специфичности [142]. Внедрение в практику ПЦР в режиме реального времени существенно улучшило лабораторную диагностику воспалительных заболеваний, сократив время исследования до 3-6 часов. К другим преимуществам ПЦР в режиме реального времени можно отнести: исключение контаминации ампликонами за счет закрытых систем детекции результатов амплификации, возможность количественной оценки микроорганизмов, определение микроорганизмов и вирусов, которые сложны для культивирования, высокая чувствительность и специфичность метода (от 2 до 10 копий ДНК в амплификационной пробирке). Например, тест-система «Фемофлор 16» (Россия) обеспечивает определение широкого спектра микроорганизмов, в том числе анаэробных бактерий, большая часть из которых сложна для культивирования, дает возможность количественной оценки нормофлоры (лактобактерии) и условно-патогенной микрофлоры в составе общей бактериальной массы [9; 10; 30; 36; 57]. 59 1.3.2 Клинико-лабораторная диагностика хронического эндометрита Клинико-лабораторная диагностика хронического эндометрита сложна и основана на анализе клинических симптомов и анамнеза, результатах ультразвукового исследования, гистероскопии и морфологического исследования [50; 58; 96; 113]. Эхографические критерии хронического эндометрита впервые разработаны В.Н.Демидовым (1993 г.). Исследование проводят на 5–7-й и 17–21-й день ментруального цикла. Наиболее частыми признаками являются изменение структуры эндометрия, что выражается в возникновении в зоне срединного М-эха участков повышенной эхогенности различной величины и формы. Внутри участков выявляются отдельные зоны неправильной формы и сниженной эхогенности. В полости матки могут определяться пузырьки газа, иногда с характерным акустическим эффектом “хвоста кометы”. В базальном слое эндометрия часто визуализируются четкие гиперэхогенные образования диаметром до 0,1–0,2 см, представляющие собой очаги фиброза, кальциноза. В одной трети случаев определяется расширение полости матки до 0,3–0,7 см за счет жидкостного содержимого. У каждой второй больной отмечается наличие нескольких из перечисленных признаков [13]. Надежными гистероскопическими маркерами ХЭ служат наличие гиперемии, отека и микрополипов, представляющих васкуляризированные врастания менее 1 мм в диаметре, покрытые эндометрием и содержащие лимфоциты и плазматические клетки [102]. Микрополипы, по мнению ряда авторов, способствуют массивному выбросу цитокинов [95; 102]. Наиболее частыми признаками воспалительного процесса в эндометрии являются: неравномерная толщина эндометрия — 30% случаев, полиповидные нарастания — 32,2%, неравномерная окраска и гиперемия слизистой оболочки — 23% и 11,8%, точечные кровоизлияния — 9%, очаговая гипертрофия слизистой оболочки — 7% [38]. По разным данным гистероскопия позволяет по макроскопическим 60 признакам точно идентифицировать хронический эндометрит только в 16–35% случаев [38; 218]. “Золотым стандартом” диагностики хронического эндометрита является морфологическое исследование эндометрия [28]. Диагностическое выскабливание слизистой оболочки матки производят в среднюю и позднюю фазу пролиферации, на 7–10-й день менструального цикла. В последние годы общепринятыми критериями морфологической диагностики хронического эндометрита являются [27]: - наличие воспалительных инфильтратов, которые состоят преимущественно из лимфоидных элементов и расположенные чаще вокруг желез и кровеносных сосудов, реже диффузно; очаговые инфильтраты имеют вид “лимфоидных фолликулов” и располагаются не только в базальном, но и во всех отделах функционального слоя, в состав их входят также лейкоциты и гистиоциты; - наличие плазматических клеток; - очаговый фиброз стромы, возникающий при длительном течении хронического воспаления, иногда захватывающий обширные участки; - склеротические изменения стенок спиральных артерий эндометрия, появляющиеся при наиболее длительном и упорном течении заболевания и выраженной клинической симптоматике. Учитывая, что для точной верификации диагноза ХЭ врач вынужден прибегать к инвазивным процедурами, возникает необходимость разработки неинвазивных биомолекулярных маркеров, на основании которых в будущем можно будет с высокой достоверностью судить о наличии хронической воспалительной реакции в эндометрии [11]. Такой принципиально новый подход в молекулярной диагностике ХЭ был использован Tortorella C. и соавт. Авторы предложили неинвазивный метод диагностики ХЭ по менструальной крови методом ИФА по уровню провоспалительных цитокинов TNF-α, IL-1ß и IL-6 [299]. 61 экспрессии трех Таким образом, в диагностике хронического эндометрита одним из ключевых лабораторных методов исследования является гистологическое исследование, помимо этого проводят исследование на наличие патогенных и условно-патогенных микроорганизмов в полости матки, чаще всего при этом используется культуральный метод исследования. 1.4 МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ МАРКЕРОВ ЛОКАЛЬНЫХ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ПРОЦЕССОВ В настоящее воспалительных время в заболеваний рутинной широкое клинической распространение диагностике получили преимущественно методы определения молекулярно-генетических маркеров патогенных и условно-патогенных микроорганизмов. Вместе с тем, интенсивность воспалительного процесса при одном и том же возбудителе может широко варьировать среди разных пациенток и определяется не только агрессивностью микроорганизмов, но и зависит от состояния системного и локального иммунитета. Более того, при хроническом эндометрите воспалительный процесс зачастую продолжается уже в отсутствии самого возбудителя. Как правило, в рутинной клинической практике состояние системного и локального иммунитета не оценивается. В отношении системного иммунитета при хронических заболеваниях определение иммунного статуса согласно нашим наблюдениям в большинстве случаев нецелесообразно, т.к. системный иммунитет отражает состояние организма в целом. Малая информативность исследования системного иммунитета при местных воспалительных процессах продемонстрирована в частности Hedges S.R. и соавт. [148]. Результаты исследований локального иммунитета достаточно широко представлены в научных публикациях. Для исследований при вагинитах используют вагинальную жидкость, для ее сбора используют четыре метода: 1) вагинальный смыв (влагалище и влагалищную часть шейки матки промывают буферным раствором, после чего собирается полученная 62 жидкость), 2) цервиковагинальные щетки (специальные щетки, которые прикладывают к слизистой оболочке влагалища, чтобы собрать цервиковагинальную жидкость), 3) цервиковагинальные тампоны (тампоны или губки поглощающие вагинальную жидкость), 4) устройства мембранного типа - специальная чашечка [41]. Материалом для исследования могут быть как клеточные компоненты вагинального проточная содержимого цитометрия, (цитологические определение мРНК исследования, (транскриптомы), лазерная так и биологические жидкости (исследование белков методами ИФА, протеомика). В настоящее время накоплены многочисленные знания об изменении иммунологических показателей при вагинитах, которые будут представлены далее в обзоре. Реакция макроорганизма на действие патогенов и условнопатогенных микроорганизмов может быть различной. Как правило, чрезмерно выраженная воспалительная реакция может приводить к повреждению тканей, в то время как недостаточность иммунного ответа не способствует элиминации возбудителя [176]. Наличие воспаления может быть определено несколькими способами: путем оценки количества воспалительных клеток, чаще всего представленных нейтрофилами [92; 278; 333]; а также путем оценки количества и профиля медиаторов воспаления, таких как цитокины [92; 110], антимикробные пептиды - дефензины [77; 78], алармины S100A8, S100A9 [328]. Важно то, что несмотря на внушительное число публикаций по данной проблеме, ни один из используемых в научных исследованиях методов, в клинической рутинной практике не нашел применения. Отчасти это связано со спецификой самого материала (необходимостью получения суспензий клеток при работе с тканями; сложности обусловлены наличием слизи, которая мешает при проведении любых исследований, а ее удаление из образцов может приводить как к разведению образцов и потере материала, так и к активации иммунокомпетентных клеток). Практически все применяемые иммунологические методы (лазерная проточная цитометрия, 63 ИФА и др.) очень хорошо приспособлены для работы с кровью и требуют определенных усилий по адаптации при использования такого биоматериала, как вагинальная жидкость и ткани эндометрия. Помимо этого ограничения по использованию научных наработок в рутинной практике связаны с отсутствием четких и убедительных алгоритмов интерпретации полученных результатов, т.е. фактически с отсутствием порогов отсечек (точка cut off), позволяющих дискриминировать норму от воспалительного процесса. В рутинной преимущественно практике один при показатель вульвовагинитах локального оценивается иммунитета - число лейкоцитов во влагалищных мазках. Метод является очень простым, дешевым и доступным к практическому использованию, но в то же время не отражает в полной мере состояние локального иммунитета при вагинитах. 1.4.1 Микроскопия мазков с подсчетом числа лейкоцитов Число лейкоцитов более 10 в поле зрения (увеличение х 400) во влагалищных мазках для небеременных женщин и более 20 для беременных женщин рассматривается, как признак локальной воспалительной реакции во влагалище [34; 144; 333]. Для определения повышенного содержания лейкоцитов в мазках используют термин «лейкорея». Поскольку основная субпопуляция лейкоцитов представлена нейтрофилами, иногда лейкорею определяют, как наличие более одного нейтрофила на одну эпителиальную клетку [98; 183]. Увеличение числа нейтрофилов во влагалищных мазках отмечено, по меньшей мере, при трихомониазе [100; 183], хламидиозе [144], вульвовагинальном кандидозе [328]. Чувствительность, специфичность, прогностическая ценность положительного и отрицательного результата метода микроскопии мазков с подсчетом числа лейкоцитов является невысокой. Например, при трихомониазе она составляет 78%, 51%, 25% и 92% соответственно [183]. Метод микроскопии мазков помимо определения лейкореи позволяет идентифицировать основные морфотипы бактерий. Однако многие виды и 64 роды условно-патогенных микроорганизмов имеют похожие морфотипы, тогда как их патогенные свойства и чувствительность к антибиотикам могут значительно отличаться. Кроме того, микроскопическое исследование не позволяет идентифицировать ряд этиологически значимых условно- патогенных бактерий. Например, Atopobium vaginae, ассоциированный с развитием бактериального вагиноза [120], не визуализируются при микроскопическом исследовании, а может выявляться только культуральным методом, либо методом полимеразной цепной реакции [276]. К недостаткам метода микроскопии мазков можно отнести субъективизм и зависимость результата исследования от квалификации врача-лаборанта [49]. Изменения в составе лейкоцитов во влагалищных мазках при вульвовагинитах описаны достаточно неплохо [130; 159; 242; 318]. Полезным инструментом в этих исследованиях стал метод проточной лазерной цитометрии с применением моноклональных антител (МКА) [129; 130; 272; 318]. 1.4.2 Метод лазерной проточной цитометрии с применением моноклональных антител Определение популяционного и субпопуляционного состава лейкоцитов осуществляется за счет связывания моноклональных антител с дифференцировочными антигенами (СD – cluster of differentiation) лейкоцитов и окрашивания антиглобулиновыми антителами, меченными флуорофором. В настоящее время существует большое количество МКА к дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека. В таблице 4 представлены основные маркеры кластеров дифференцировки лейкоцитов, описанных при вагинитах и эндометрите. Giraldo P.C. и соавт. исследовали популяционный состав лейкоцитов в вагинальных лаважах в норме, при кандидозном вульвовагините и БВ [129]. Гранулоциты присутствовали 84,9% образцов, нейтрофилы были преобладающими гранулоцитами и присутствовали в 84,6% проб, CD4 + Т65 лимфоциты присутствовали в 33,3% образцов, макрофаги и СD8+ Тлимфоциты в 25% образцов. НК-клетки и В-лимфоциты присутствовали в 10,5 и 13,5% вагинальных лаважах, соответственно, но интересно, что большинство из них принадлежали к группам с вульвовагинальным кандидозом и бактериальным вагинозом. В контрольной группе в пуле лейкоцитов преобладали нейтрофилы (48±24%), другие клетки составили: СD8+Т-лимфоциты - 9±9%, СD4+Т-лимфоциты - 3±2%, макрофаги - 3±8%, В-лимфоциты – менее 1%. Среднее процентное содержание нейтрофилов было выше при вульвовагинальном кандидозе и ниже при БВ. Среднее процентное содержание СD4+Т-лимфоцитов было выше и при вульвовагинальном кандидозе и при БВ по сравнению с контрольной группой [129]. Таблица 4. Некоторые кластеры дифференцировки лейкоцитов, исследуемые в клетках влагалища и тканях эндометрия. Маркер СD24 CD24 CD15 CD16 CD14 СD3 CD4 CD3 CD8 CD19 CD56 CD45 CD138 CD9 CD94 CD96 CD4 CD25 Foxp3 Тип клеток Гранулоциты Нейтрофилы макрофаги СD4 + T-лимфоциты CD8+ T-лимфоциты В-лимфоциты НК-клетки общий лейкоцитарный антиген плазматические клетки уникальные маркеры НКклеток эндометрия естественные Т регуляторные клетки 1.4.3 Метод иммуноферментного анализа. Иммуноферментный анализ (ИФА) — лабораторный иммунологический метод качественного или количественного определения 66 различных соединений, в основе которого лежит специфическая реакция антиген-антитело. Выявление образовавшегося комплекса проводят с использованием фермента в качестве метки для регистрации сигнала. Помимо этого в качестве метки для регистрации сигнала используют флуоресцентные красители (иммунофлуоресцентный), радиоиммунные красители (РИА). Различают прямые и непрямые методы иммунного анализа. Также имеет значение и среда, в которой проводится реакция. Если используются антитела, фиксированные на поверхности, то тест обозначается, как твердофазный ИФА (тИФА, ELISA - enzyme-linked immunosorbent assay). В клинической практике наибольшее распространение получил ELISA. Аналитическая чувствительность данного метода составляет 10 пг/мл. С использованием данного метода выполнены многочисленные исследования цитокинов и других маркеров воспалительного процесса в вагинальной жидкости. Установлено, что при БВ повышается уровень провоспалительных цитокинов. По меньшей мере, в 11 публикациях при БВ отмечено повышение уровня IL-1ß [65; 79; 91; 92; 127; 128; 148; 160; 202; 284; 290]. Данные по изменению уровня других маркеров воспаления при БВ являются противоречивыми. Например, в некоторых исследованиях не отмечено изменений при БВ таких маркеров, как TNF-α [65; 148], IL-6 [65; 148], IL-8 [65; 92; 148] дефензинов [77], IL-2 [65], IFN-γ [65], IL-12 [65], IL-4[65] и IL-10 [65]. В других исследованиях установлено повышение при БВ TNF-α [290], IL-6 [79], IL-8 [79; 284; 315], IL-10 [97; 329] и лактоферрина [256]. Возможно, что такая разница в исследованиях обусловлена различными формами БВ, который протекает как с выраженными признаками воспалительной реакции, так и бессимптомно. Установлено, что ВВК сопровождается повышением в вагинальной жидкости таких маркеров воспалительного процесса, как IL-1ß [52; 79], IL-8 [52; 79], IL-12 [52] , TNF-α [52], IFN-γ [52], нейтрофильной эластазы [52], ßдефензинов-2, -3 [244], гиалуроновой кислоты [188], дефензина-5 [335] и 67 понижением IL-10 [52]. В противоположность этим исследованиям Lilic D. и соавт. продемонстировали при хроническом кандидозе кожи и слизистых повышение IL-10, IL-6 и снижение IL-12 [191]. Заслуживает внимания исследование Weissenbacher T.M. и соавт., в котором установлено, что рецидивирующий вульвогинальный кандидоз сопровождается повышенной экспрессией в вагинальной жидкости IL-4, кандида-специфических IgE и простагландинов. Авторы обсуждают аллергическую природу рецидивов вульвовагинального кандидоза [314]. 1.4.4 Технология мультиплексного иммуноанализа для исследования цитокинового профиля генов иммунного ответа Технология мультиплексного анализа базируется на количественном методе определения цитокинового профиля с использованием суспензии микросфер каждая из которых специфически связывается с определенным цитокином и идентифицируется по флуоресцентной метке лазерами работающими в красном (532 нм) и зеленом (635 нм) диапазонах спектра. Подобная технология позволяет высокоточно определять от 1 до 100 аналитов единовременно. Процедура анализа включает в себя обработку реакционного микропланшета (МП) специальным буферным раствором, добавление микросфер в ячейки МП, внесение стандартов и образцов в МП, инкубацию в течение 30 минут, добавление детектирующих антител, повторную инкубацию, добавление реагента для флуоресцентной детекции, повторную инкубацию, ресуспензирование и чтение результатов (рис.3). Между этапами осуществляется отмывка через микрофильтры с использованием генератора вакуума. Детекция происходит при накоплении не менее 1000 событий на исследуемый аналит. Чувствительность анализа составляет 10 пг/мл. С помощью этого метода Spear G.T. и соавт. исследовали 32 медиатора воспалительной реакции в отделяемом из влагалища и получили данные о повышении IL-8, IL-3, IL-7, IL-1ß, лактоферрина и миелопероксидазы при 68 наличии гонореи, хламидиоза, бактериального вагиноза и трихомониаза [285]. Рисунок 3. Принцип технологии мультиплексного иммуноанализа. Boomsma C.M. и соавт. исследовали взаимосвязь бактериального вагиноза с профилем экспрессии цитокинов и других медиаторов воспаления (17 маркеров) в слизистой эндометрия у женщин. Методом многофакторной логистической регрессии выявлена положительная корреляция экспрессии IL-1ß и отрицательная корреляция экспрессии эотаксина в слизистой эндометрия с БВ [84]. 1.4.5 Методы иммуногистохимического исследования Методы иммуногистохимического исследования чаще используются для тканей эндометрия. В основном при хроническом эндометрите проводится иммуногистохимическое выявление маркера плазматических клеток CD138 [81; 173; 309]. Однако, диагностическая точность данного метода отстается спорной. Achilles S.L. и соавт. сообщают о выявлении СD138-маркера у здоровых женщин фертильных женщин в 48,3% случаев [63]. Помимо этого к недостаткам метода следует отнести и то, что одни и те 69 же образцы у разных исследователей могут быть интерпретированы поразному. 1.4.6 Определение транскрипционных профилей генов Методы определения экспрессии мРНК генов на основе ОТ-ПЦР стали широко использоваться в научных исследованиях в конце 90 годов, однако не нашли широкого применения в клинической практике в силу ряда причин. Главными из которых были отсутствие количественной оценки, проблемы с нормировкой и сложности интерпретации результатов. Первое ограничение было преодалено разработкой флуоресцентномеченных олигонуклеотидов и внедрением метода ПЦР в режиме реального времени, с помощью которого стала возможной относительная количественная оценка по значению пороговых циклов (Сq). Далее были описаны десятки генов «домашнего хозяйства» (нормировочные или референсные гены), способы выбора наиболее оптимальных референсных генов для разных типов тканей и способы обсчета результатов по нескольким референсным генам [101; 305]. Долгие годы исследования экспрессии мРНК генов были сосредоточены на поиске «универсального и наиболее информативного маркера заболевания». Практически все попытки дискриминировать группы по одному маркеру (за исключением отдельных заболеваний) не увенчались успехом, т.к. диапазоны уровней экспрессии мРНК в контрольной и исследуемой выборке практически всегда перекрываются между собой. Открытым оставался вопрос и о том, как интерпретировать экспрессию нескольких генов в одном образце, особенно в тех случаях, когда потенциальные маркеры имеют разнонаправленный характер экспрессии (повышение и понижение). Наконец были предложены методы многофакторного анализа. Впервые они были применены в отношении рака молочной железы, а уровни экпрессии мРНК генов были использованы, как факторы предсказания течения заболевания и прогноза подбора наиболее 70 эффективной терапии [240]. В качестве основных статистических методов исследования при многофакторном анализе для дискриминации двух групп может быть использован метод бинарной логистической регрессии. Метод ОТ-ПЦР состоит из нескольких стадий и обычно включает: 1. Выделение РНК. 2. Обработку образцов ДНК-азой, чтобы исключить отжиг праймеров, используемых в ПЦР, на матрице геномной ДНК. 3. Проведение реакции обратной транскрипции, в ходе которой с матрицы мРНК получают комплементарную ей ДНК (кДНК). 4. Проведение полимеразной цепной реакции. При постановке ПЦР для контроля эффективности обработки образцов ДНК-азой обычно в параллели ставятся отрицательные контрольные образцы (п.2), обработанные ДНКазой, но не прошедшие реакцию обратной транскрипции. В ряде публикаций продемонстрирована возможность применения метода ОТ-ПЦР при воспалительных заболеваниях нижних отделов половых путей. Meng W. и соавт. отметили достоверное повышения уровня экспрессии ß-дефензинов 2 и 3 при негонококковых цервицитах [205]. Goffinet F. и соавт. продемонстрировали, что определение мРНК гена IL6 в вагинальных мазках ассоциировано с инфекционным процессом, преждевременными родами и неональной инфекцией [133]. Zariffard М.R. и соавт. продемонстрировали, что стимуляция мононуклеарных клеток крови компонентами цервиковагинальных смывов женщин с БВ приводит к повышению уровня экспрессии мРНК генов TNF, TLR2, TLR4 [334]. Libby E.K. и соавт. показали, что стимуляция культур эпителиальных клеток Atopobium vaginae и Gardnerella vaginalis приводит к повышению экспрессии мРНК генов IL6, IL8 и ß-дефензина 4 [189]. 71 1.4.7 Полиморфизмы генов иммунной системы и современные методы их идентификации В настоящее время известно, что уровень экспрессии генов зависит не только от влияния биотических факторов внешней среды, но также определяется генетическими особенностями организма хозяина, в том числе полиморфизмами генов иммунной системы. Полиморфными принято называть гены, которые представлены в популяции несколькими разновидностями – аллелями. За счет полиморфизма генов формируется разнообразие признаков внутри вида. Полиморфизмы нуклеотидных последовательностей обнаружены во всех структурных элементах генома: экзонах, интронах, регуляторных и некодирующих участках и т.д. В основе полиморфизма ДНК лежат вставки (ins), делеции (del), изменение числа тандемных повторов (минисателлитная ДНК длинные повторы, либо микросателлитная ДНК – короткие тетра-, три-, диили мононуклеотидные повторы), а также замены одиночных нуклеотидов (single-nucleotide polymorphism, SNP). В настоящее время известно более 50 миллионов полиморфизмов генов человека. Для многих генов удается выделить нормальный аллель или «дикий»самый распространенный в популяции, который встречается значительно чаще других. Иногда среди аллелей нет ни одного, который можно было бы считать «диким». В ходе эволюции разные аллели произошли в результате мутаций от единого аллеля-предшественника, чаще всего они отличаются друг от друга заменой одного нуклеотида. Существуют различные критерии полиморфности генов. Обычно локус определяется как полиморфный, если частота наиболее распространенного аллеля не превышает 99%, иначе высока вероятность того, что в небольшой популяционной выборке можно не найти ни одного мутантного аллеля. Такое деление носит условный характер и в литературе можно найти и другие критерии полиморфности. 72 Наиболее ярким примером полиморфизма являются гены иммунного ответа и, в том числе система генов молекулы главного комплекса гистосовместимости (HLA). Наряду с генами, кодирующими молекулы главного комплекса гистосовместимости, установлено значительное число так называемых не-HLA генов, которые не являются такими полиморфными, как гены HLA, в то же время кодируют большое количество разнообразных сигнальных, регуляторных и эффекторных компонентов иммунного ответа. Важным шагом в формировании представлений о роли генетического полиморфизма на уровне одиночных нуклеотидных замен была расшифровка всего генома человека в ходе реализации международного проекта «Геном человека» в 2001 году [307]. Данный проект был реализован в течение года после 10 лет подготовительной работы. Проект открыл возможность полногеномного сервенирования генома человека, который содержит около 3 млрд. пар оснований и включает информацию о последовательности всех генов (около 20 тысяч) и некодирующих участков. В ходе реализации данного проекта было использовано автоматизированное секвенирование по методу Сэнгера, которое относят к "методу первого поколения". В настоящее время для полногеномного секвенирования используются более современные методы, так называемые "методы нового, или второго, поколения" (Next-Generation Sequencing, NGS). Основными коммерческими технологиями являются платформы: 454 Sequencing (Roche), Solexa/Illumina (Illumina), SOLiD и IonTorrent (Applied Biosystems). В основе этих технологий находятся различные стратегии, основанные на уникальных комбинациях приготовления ДНК-матриц, секвенирования, визуализации, а также выравнивания и составления последовательностей ДНК [197; 208]. Ожидается, что существенный прогресс последних лет в секвенировании, может привести в скором времени к уменьшению стоимости секвенирования до 1000 долларов за индивидуальный геном [275]. 73 На основании полученных данных возникла новая отрасль медицины – персонифицированная медицина, основным принципом которой является подбор методов лечения заболеваний в соответствии с генетическими особенностями пациентов. Обсуждаются и возможности использования секвенирования "третьего поколения", которое осуществляется с помощью приборов Helicos Heliscope (Helicos BioScience Corporation), PacBio RS SMRT (Pacific Biosciences) и MinION (Oxford Nanopore). При использовании данной технологии не требуется первичная амплификация, ДНК секвенируется непосредственно на уровне одной молекулы с использованием специально созданных полимераз. К преимуществам данного способа следует отнести то, что удается избежать ошибок, возникающих при амплификации ДНК. Широкого применения в практике данные технологии пока не получили. Для получения более точной информации о геноме человека в 2010 году стартовал новый Проект «1000 геномов» [62; 210]. Целью проекта является обнаружить, генотипировать и обеспечить точную информацию по гаплотипам полиморфизмов генома человека в различных популяциях: Европа, Восточная Азия, Южная Азия, Западная Африка и Америка. В проекте используются высокопроизводительные технологии секвенирования “нового поколения”. Учитывая объем исследования, описываются не только варианты аллелей, частота встречаемости которых в популяции составляет не менее 1% (классическое определение полиморфизма), но и варианты генов с частотой встречаемости от 0,1%. Участие в проекте принимают 9 Центров, используется 3 технологии секвенирования ДНК: 454 Sequencing (Roche), Solexa/Illumina (Illumina), SOLiD (Applied Biosystems). В ходе реализации проекта исследуется расположение, частота аллелей и локальная структура гаплотипов около 15 млн. SNP и 1млн. вставок и делеций. Официальные данные по реализации данного проекта представлены на сайте (http://www.ensembl.org/index.html). Данные этого сайта по частотам 74 распространения полиморфизмов представлены в наиболее удобной и полной форме (рис.4). Рисунок 4. Частоты распространения аллелей локуса TNF (G–238A) rs361525. В таблице 5 представлены данные по частотам распространения аллелей и генотипов полиморфизмов в различных популяциях по проекту “1000 геномов”. Помимо этого в таблице 5 представлены результаты исследования 300 образцов доноров крови русской популяции г. Москвы, полученные при проведении популяционно-иммуногенетических исследований в лаборатории генетики гистосовместимости ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России [1; 23; 24; 53; 54]. Исследования выполнены методом ПЦР с анализом кривых плавления методом «примыкающих проб» (вариант метода adjacent probes, kissing probes) (рис.5). Метод разработан сотрудниками лаборатории генетики гистосовместимости ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России в 2008 году [2; 46; 54]. 75 Рисунок 5. Плавление с использованием «примыкающих проб». Система состоит из двух типов олигонуклеотидов, гибридизующихся на матрицу рядом. Один из олигонуклеотидов несет флуорофор, другой – гаситель флуоресценции. При образовании специфичного продукта реакции и пониженной температуре, олигонуклеотиды гибридизуются рядом, что ведет к эффективному гашению флуоресценции (А, Г). При последующем повышении температуры происходит плавление дуплексов, разъединение проб, и возрастание уровня флуоресценции. Совершенные дуплексы более тугоплавкие, возрастание уровня флуоресценции будет зарегистрировано при более высокой температуре, чем для несовершеных. Если анализируемый образец содержит только один вариант последовательности (гомозиготен по исследуемому полиморфизму), температура плавления для пробы, образующей совершенный дуплекс, существенно выше, чем для пробы, образующей несовершенный дуплекс (Б, В). В случае гетерозиготного образца температуры плавления практически одинаковые (Д, Е). При идентификации замен одиночных нуклеотидов вначале проводят ПЦР с праймерами, общими для обоих вариантов последовательности, затем определяют температуру плавления олигонуклеотидых зондов, которая напрямую зависит от наличия или отсутствия нуклеотидных замен в матрице ДНК в области гибридизации зондов. Для определения температуры плавления, помимо флуоресцентно меченного типирующего зонда, в реакционную смесь добавляется тугоплавкий олигонуклеотидный зонд с гасителем флуоресценции, который гибридизуется на матрице ДНК в непосредственной близости к типирующему зонду («примыкает» к нему). В реакции используют один общий олигонуклеотид с гасителем флуоресценции и набор сиквенс-специфичных олигонуклеотидов, несущих 76 флуорофор. Олигонуклеотидные пробы, соответствующие различным аллельным вариантам, метят различными флуорофорами, что позволяет определять оба варианта аллеля в одной пробирке (рис.5). Таким образом, определение генотипа проводят после ПЦР и гибридизации путем измерения уровня флуоресценции в ходе температурной денатурации дуплексов олигонуклеотидов и полученных матриц. Измерение уровня флуоресценции при плавлении осуществляется в режиме реального времени. Высокая достоверность полученных результатов обеспечивается получением кривых плавления по двум каналам флуоресценции FAM и HEX (рис.6). 700 FAM 600 HEX 250 A2A2 200 A1A1 400 300 200 A1A2 dF/dT 500 dF/dT 300 A1A2 100 100 50 0 0 -100 -50 -200 A2A2 A1A1 150 -100 25 30 35 40 45 50 55 60 65 25 70 30 35 40 45 50 55 60 65 70 Температура °C Температура °C Рисунок 6. Анализ кривых плавления и определение однонуклеотидных замен в программном обеспечении к прибору «ДТ-96». Температура плавления зондов определяется по максимуму функции dF/dT, полученной путем дифференцирования экспериментальной зависимости флуоресценции от температуры. Результаты по часоте выявления аллелей полиморфных генов в русской популяции г. Москвы соответствуют базе данных по Европе (http://www.ensembl.org/index.html - дата обращения 19-21 августа 2014 г.), за исключением двух локусов IL1RN (rs315952) и IL8 (rs4073). Однако по этим локусам результаты соответствуют общим частотам свидетельствует о смешанной популяции г. Москвы. 77 аллелей, что Таблица 5. Частота аллелей и генотипов полиморфизмов генов иммунной системы. SNP IL1A (C-889T) rs1800587 IL1B (G-511A) rs16944 IL1B (T-31C) rs1143627 IL1B (C+3953Т) rs1143634 IL1R1 (IL1RA) (C+197T) rs2234650 IL1RN (11100 msp1) rs315952 IL6 (G-174C) rs1800795 IL8 (А-251Т) rs4073 Аллели или генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип С T C/C C/T T/T A G A/A G/A G/G C T CC CT TT C T CC CT TT C T CC CT TT C T CC CT TT C G CC CG GG A T AA AT TT Проект "1000 геномов" Общая Африка Америка Азия Европа частота 74,7% 61,8% 74,6% 91,6% 70,4% 25,3% 38,2% 25,4% 8,4% 29,6% 56,9% 37,0% 54,1% 84,3% 50,4% 35,7% 49,6% 40,9% 14,7% 40,1% 7,4% 13,4% 5,0% 1,0% 9,5% 46,6% 61,4% 50,8% 45,5% 35,8% 53,4% 38,6% 49,2% 54,5% 64,2% 23,4% 39,4% 24,9% 23,1% 12,7% 46,2% 43,9% 51,9% 44,8% 46,2% 30,3% 16,7% 23,2% 32,2% 41,2% 48,1% 67,5% 51,1% 45,6% 35,9% 51,9% 32,5% 48,9% 54,4% 64,1% 25,3% 46,7% 25,4% 23,4% 12,7% 45,6% 41,5% 51,4% 44,4% 46,4% 29,1% 11,8% 23,2% 32,2% 40,9% 85,4% 89,2% 86,2% 96,9% 74,0% 14,6% 10,8% 13,8% 3,1% 26,0% 73,7% 79,7% 74,0% 94,1% 54,4% 23,4% 19,1% 24,3% 5,6% 39,3% 2,8% 1,2% 1,7% 0,3% 6,3% 58,9% 26,6% 67,4% 67,1% 69,5% 41,1% 73,4% 32,6% 32,9% 30,5% 37,4% 7,7% 44,2% 44,4% 48,0% 43,0% 37,8% 46,4% 45,5% 43,0% 19,6% 54,5% 9,4% 10,1% 9,0% 39,1% 45,7% 20,2% 57,9% 29,6% 60,9% 54,3% 79,8% 42,1% 70,4% 17,7% 19,5% 4,4% 34,3% 10,3% 42,8% 52,4% 31,5% 47,2% 38,5% 39,6% 28,0% 64,1% 18,5% 51,2% 18,5% 2,6% 20,7% 0,0% 41,7% 81,5% 97,4% 79,3% 100,0% 58,3% 7,3% 0,0% 2,8% 0,0% 19,8% 22,3% 5,3% 35,9% 0,0% 43,8% 70,3% 94,7% 61,3% 100,0% 36,4% 50,3% 83,5% 44,8% 37,8% 40,9% 49,7% 16,5% 55,2% 62,2% 59,1% 28,2% 69,9% 21,0% 13,3% 15,8% 44,2% 27,2% 47,5% 49,0% 50,1% 27,6% 2,8% 31,5% 37,8% 34,0% 78 Россия, Москва 70,5% 29,5% 50,7% 39,7% 9,7% 33,7% 66,3% 11,7% 44,0% 43,3% 33,6% 66,4% 11,4% 44,3% 44,3% 75,2% 24,8% 57,3% 35,7% 7,0% 65,9% 34,1% 44,0% 44,0% 12,1% 39,7% 60,3% 12,0% 55,4% 32,6% 44,8% 55,2% 18,0% 53,7% 28,3% 50,5% 49,5% 24,0% 53,1% 22,9% SNP CCL2 (2493A>G, -2578A>G) rs1024611 IL10 (A-1082G) rs1800896 IL10 (A-592C) rs1800872 IL10 (T-819C) rs1800871 IL12B (A-1188C) rs3212227 IL18 (G-137C) rs187238 IL18 (G-607T) rs1946518 IL18 (A-656C) rs1946519 Аллели или генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип A G AA AG GG A G AA AG GG A C AA AC CC C T CC CT TT A C AA AC CC C G CC CG GG G T GG GT TT A C AA AC CC Проект "1000 геномов" Общая Африка Америка Азия частота 59,5% 75,6% 54,1% 38,6% 40,5% 24,4% 45,9% 61,4% 36,5% 57,3% 30,9% 13,3% 46,0% 36,6% 46,4% 50,7% 17,5% 6,1% 22,7% 36,0% 69,7% 66,3% 68,2% 94,4% 30,3% 33,7% 31,8% 5,6% 53,3% 45,5% 47,5% 89,9% 32,9% 41,5% 41,4% 9,1% 13,8% 13,0% 11,0% 1,0% 40,9% 42,1% 33,4% 67,7% 59,1% 57,9% 66,6% 32,3% 20,3% 16,7% 12,7% 46,5% 41,1% 50,8% 41,4% 42,3% 38,6% 32,5% 45,9% 11,2% 59,2% 57,9% 66,6% 32,3% 40,8% 42,1% 33,4% 67,7% 38,6% 32,5% 45,9% 11,2% 41,0% 50,8% 41,4% 42,3% 20,3% 16,7% 12,7% 46,5% 66,2% 63,4% 68,0% 51,9% 33,8% 36,6% 32,0% 48,1% 45,4% 42,3% 49,7% 25,5% 41,6% 42,3% 36,5% 52,8% 13,0% 15,4% 13,8% 21,7% 22,8% 20,1% 33,7% 11,2% 77,2% 79,9% 66,3% 88,8% 6,3% 5,3% 11,0% 2,1% 33,1% 29,7% 45,3% 18,2% 60,6% 65,0% 43,6% 79,7% 53,6% 64,6% 50,3% 41,6% 46,4% 35,4% 49,7% 58,4% 29,3% 42,7% 24,9% 17,5% 48,5% 43,9% 50,8% 48,3% 22,2% 13,4% 24,3% 34,3% 46,3% 35,4% 49,7% 58,0% 53,7% 64,6% 50,3% 42,0% 22,1% 13,4% 24,3% 33,9% 48,5% 43,9% 50,8% 48,3% 29,4% 42,7% 24,9% 17,8% 79 Европа Россия, Москва 67,4% 32,6% 43,3% 48,3% 8,4% 54,1% 45,9% 33,5% 41,2% 25,3% 23,5% 76,5% 6,6% 33,8% 59,6% 76,6% 23,4% 59,9% 33,5% 6,6% 78,0% 22,0% 60,4% 35,1% 4,5% 28,2% 71,8% 7,9% 40,6% 51,5% 57,0% 43,0% 31,7% 50,7% 17,7% 43,0% 57,0% 17,7% 50,7% 31,7% 65,8% 34,2% 40,2% 51,1% 8,7% 56,5% 43,5% 31,0% 51,0% 18,0% 22,8% 77,2% 4,7% 36,3% 59,0% 77,0% 23,0% 58,7% 36,7% 4,7% 77,7% 22,3% 61,7% 32,0% 6,3% 28,2% 71,8% 8,3% 39,7% 52,0% 57,8% 42,2% 34,7% 46,3% 19,0% 42,3% 57,7% 19,0% 46,7% 34,3% SNP TNF (G–238A) rs361525 TNF (G-308A) rs1800629 TGFB1 (T+869 C) rs1800470 TGFB1 (C-509 T) rs1800469 IFNG (T+874A) rs2430561 TLR4 (А+776 G) (А+896 G) rs4986790 TLR2 (Т+597 C) rs3804099 Аллели или генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип Число исследованных аллелей A G AA AG GG A G AA AG GG C T CC CT TT C T CC CT TT A T AA AT TT A G AA AG GG C T CC CT TT 2n Проект "1000 геномов" Общая Африка Америка Азия Европа частота 5,1% 3,3% 7,5% 3,0% 6,7% 94,9% 96,7% 92,5% 97,0% 93,3% 0,2% 0,0% 0,0% 0,3% 0,3% 9,8% 6,5% 14,9% 5,2% 12,9% 90,0% 93,5% 85,1% 94,4% 86,8% 9,5% 9,6% 7,2% 5,6% 13,6% 90,5% 90,4% 92,8% 94,4% 86,4% 0,8% 0,4% 1,1% 0,0% 1,6% 17,4% 18,3% 12,2% 11,2% 24,0% 81,8% 81,3% 86,7% 88,8% 74,4% 44,5% 41,5% 46,4% 51,7% 40,0% 55,5% 58,5% 53,6% 48,3% 60,0% 19,8% 19,1% 17,7% 26,6% 16,1% 49,4% 44,7% 57,5% 50,3% 47,8% 30,9% 36,2% 24,9% 23,1% 36,1% 64,1% 77,8% 58,8% 48,8% 69,3% 35,9% 22,2% 41,2% 51,2% 30,7% 42,6% 62,2% 32,0% 24,1% 48,8% 43,0% 31,3% 53,6% 49,3% 40,9% 14,4% 6,5% 14,4% 26,6% 10,3% 26,8% 18,5% 26,5% 12,2% 43,4% 73,2% 81,5% 73,5% 87,8% 56,6% 9,2% 3,7% 7,7% 2,1% 18,7% 35,3% 29,7% 37,6% 20,3% 49,3% 55,5% 66,7% 54,7% 77,6% 31,9% 95,6% 93,3% 95,3% 100,0% 93,8% 4,4% 6,7% 4,7% 0,0% 6,2% 91,5% 87,0% 90,6% 100,0% 88,4% 8,2% 12,6% 9,4% 0,0% 10,8% 0,4% 0,4% 0,0% 0,0% 0,8% 43,1% 64,8% 35,4% 28,5% 43,7% 56,9% 35,2% 64,6% 71,5% 56,3% 19,5% 43,1% 11,6% 5,2% 18,7% 47,2% 43,5% 47,5% 46,5% 49,9% 33,3% 13,4% 40,9% 48,3% 31,4% 2184 492 80 362 572 758 Россия, Москва 3,3% 96,7% 0,0% 6,7% 93,3% 14,0% 86,0% 1,0% 26,0% 73,0% 45,7% 54,3% 21,7% 47,8% 30,4% 66,5% 33,5% 42,9% 47,3% 9,9% 43,3% 56,7% 19,0% 48,7% 32,3% нет данных 600 1.4.8 Ассоциация полиморфизмов генов иммунной системы с предрасположенностью к развитию инфекционно-воспалительных заболеваний нижних отделов органов женской репродуктивной системы Одиночные олигонуклеотидные замены и другие полиморфизмы могут приводить к изменению экспрессии генов. Предполагают, что полиморфизмы в промоторных участках (5’- нетранслируемые области) приводят к изменению транскрипции генов, т.е. могут определять количество мРНК, а олигонуклеотидные замены в 3’- нетранслируемой области могут менять стабильность мРНК и влиять на трансляцию, т.е. на количество белка. В настоящее время установлены ассоциации некоторых полиморфизмов генов иммунного ответа с предрасположенностью к развитию вульвовагинального кандидоза и бактериального вагиноза (табл. 6). Известно, что БВ может приводить к преждевременным родам. Ряд полиморфизмов ассоциирован с преждевременными родами [73; 106]. В частности продемонстрирована связь полиморфизмов локусов TNF (G-308A), IL1B (C+3953Т), IL6 (G-174C), а также TLR4 с преждевременными родами [306]. Заслуживает внимания ассоциация с преждевременными родами не только бактериального вагиноза, но и заболеваний периодонта [239; 247]. В основе такой связи могут быть факторы иммунитета слизистых, особенностей локального обусловленные предрасположенностью. 81 генетической Таблица 6. Ассоциации SNP с воспалительными заболеваниями нижних отделов половых путей и преждевременными родами. SNP Публикации IL1B(G-511A) rs16944 IL1B (C+3953Т) rs1143634 IL4 (C-589Т) IL6 (G-174C) rs1800795 Cauci S.[93] Cauci S.[93] Babula O. [76] Gómez L.M. [134] Simhan H.N. [279] IL12B (ins/del) rs41292470 IL10 (A-1082G) rs1800896 Johnson M.D.[166] Johnson M.D.[166] Goepfert AR [132] TNF (G–238A) rs361525 Jones N.M. [167] Выявленные ассоциации с воспалительными заболеваниями нижних отделов половых путей увеличение риска БВ OR = 1,5 (1,03-2,14, р = 0,032) увеличение риска БВ OR = 2,8 (1,37-5,88, р = 0,004), повышенный риск РВВК OR = 3 (2-4,5, p<0,001) снижение риска преждевременных родов при наличии БВ OR 0,33 (0,16–0,71), р<0,05 снижение риска преждевременных родов OR = 0,17 (0,04-0,74), р<0,05 предрасположенность к персистенции кандида OR=5,4 (1,5-19,0), р=0,02 предрасположенность к персистенции кандида OR = 3,5 (1.3-8,9), р= 0,03 ассоциация с понижением IFN-γ протективная роль полиморфизма в развитии БВ при беременности OR = 0,77 (0,63-0,96, р=0,017) повышение риска преждевременных родов OR = 2,6 (1,2-5,8), p=0,02 82 Тип модели Влияние SNP на экпрессию аутосомно-рецессивная модель повышение экспрессии IL-1ß повышение экспрессии IL-1ß повышение экспрессии IL-4 [76] снижение экспрессии IL-6 [279] аутосомно-рецессивная модель аутосомно-рецессивная модель аутосомно-рецессивная модель аутосомно-рецессивная модель аутосомно-доминантная снижение экспрессии IL-12 [166] аутосомно-доминантная снижение экспрессии IL-10 [166] аутосомно-доминантная модель аутосомно-доминантная увеличению продукции TNF-α в ответ на стимуляцию SNP Публикации TNF (G-308A) rs1800629 Macones G.A. [195] Menon R. [207] Moore S. [216] TLR4 (А+776 G) (А+896 G) rs4986790 Genc M.R.[127] Rey G.[257] Royse K.E. [263] Выявленные ассоциации с воспалительными заболеваниями нижних отделов половых путей повышенный риск преждевременных родов (OR= 2,7 (1,7-4,5, p<0,05); при наличи БВ риск преждевременных родов выше (OR=6,1 (1,9-21), p<0,05) Повышенный риск преждевременных родов OR=1,4 (0,9-2,2), р<0,05 повышенный риск преждевременных родов OR=2,2 (1-5), р=0,026 ассоциация с повышением рН (р=0,05), более чем 10-кратным увеличением в составе микробиоты количества G. vaginalis (р<0,001), Prevotella, Bacteroides and Porphyromonas (р=0,08); понижение концентрации ИЛ-1 (p=0,01), ИЛ-1ra (p<0,0002) ассоциация с преждевременными родами; ассоциация с БВ ассоциация с БВ OR= 1,47, (1,15-1,87) р<0,05 83 Тип модели Влияние SNP на экпрессию аутосомно-доминантная липополисахаридами [83; 192] аутосомно-доминантная аутосомно-доминантная аутосомно-доминантная аутосомно-доминантная снижение интенсивности ответа на стимуляцию липополисахаридами [74] Резюме Таким образом, проблема воспалительных заболеваний органов женской репродуктивной системы чрезвычайно актуальна в связи с широким распространением, частым рецидивированием заболевания, высокой вероятностью акушерских и гинекологических осложнений. Возникновение и течение заболевания определяется несколькими факторами и включает взаимодействие организма хозяина с микроорганизмами, особенности состояния иммунитета и генетические особенности макро- и микроорганизмов. Немаловажное значение имеет тот факт, что нередко этиологическими агентами заболевания являются условно-патогенные микроорганизмы, следовательно, генетические факторы и особенности фенотипического их проявления могут играть ключевую роль в патогенезе заболевания. В настоящее время накоплены многочисленные знания об этиологических агентах заболевания и особенностях состояния локального иммунитета при воспалительных заболеваниях органов женской репродуктивной системы. Однако если большинство научных наработок по идентификации инфекционных агентов нашли выход в клиническую практику, то состояние локального иммунитета в рутинной практике не оценивается. Поэтому разработка методов оценки состояния локального иммунитета, доступных и адаптированных для использования в рутинной практике, чрезвычайно актуальна. Разработке таких методов и посвящена представляемая работа. 84 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 2.1 Материалы исследования В качестве биоматериала для исследований использовали соскобы отделяемого биоптаты слизистой оболочки тканей эндометрия. влагалища, периферическую кровь, Взятие биоматериала осуществлялось медицинским персоналом ФГБУ «НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова» при подписании пациенткой информированного согласия на проведение исследования. Для определения микроорганизмов и уровня экспрессии мРНК генов иммунного ответа взятие материала (соскобы, биоптаты тканей эндометрия) осуществляли со стенок влагалища, аспирационную биопсию эндометрия проводили с помощью кюретки Pipelle de Cornie. Взятие материала для определения микроорганизмов осуществляли в пробирки объемом 1,5 мл с физиологическим раствором. Взятие материала для определения экспрессии мРНК генов иммунного ответа во избежание деградации РНК осуществляли в пробирки объемом 1,5 мл со специальной транспортной средой (лизирующий раствор набора «Проба НК» производства ООО «НПО ДНКТехнология», Россия). Взятие цельной периферической крови проводили в вакуумные пластиковые пробирки типа Vacuette объёмом 2,0 или 4,0 мл с добавленной в качестве антикоагулянта динатриевой солью этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) в конечной концентрации 2,0 мг/мл. Хранение материала осуществляли при температуре 2–8°С не более 8 часов, далее при температуре минус 20°С в течение 1 месяца или при температуре минус 70°С в течение 1 года. 2.2 Объем исследования Всего исследовано 1684 образца: из них 1168 образцов соскобов отделяемого слизистой влагалища, 210 образцов крови, 306 образцов тканей эндометрия. Исследовано и проанализировано 90 молекулярно-генетических маркеров (табл.7). 85 в общей сложности Таблица 7. Материалы и объем исследования. Биоматериал Молекулярно-генетические маркеры Количество маркеров Количество образцов Соскобы отделяемого слизистой оболочки влагалища Общая бактериальная масса, Lactobacilus spp., факультативно-анаэробные (Enterobacteriaceae, Streptococcus spp., Staphylococcus spp.), облигатно-анаэробные микроорганизмы (Gardnerella vaginalis, Prevotella spp., Porphyromonas spp., Eubacterium spp., Sneathia spp., Leptotrihia spp., Fusobacterium spp., Megasphaera spp., Veilonella spp., Dialister spp., Lachnobacterium spp., Clostridium spp., Mobiluncus spp., Corynebacterium spp., Peptostreptococcus spp., Atopobium vaginae), а также Candida spp., Ureaplasma spp., Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium Патогены Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, вирусы ВПГ1,2 типа, ЦМВ, другие УПМ Enterococcus spp, E.coli, Streptococcus agalactiae, Klebsiella spp., Staphylococcus aureus, Candida albicans. Типирование лактобактерий: L.crispatus, L.iners, L.jensenii, L.gasseri, L.jonsonii, L. vaginalis, L.acidiphilis, L.casei/ L.rhamnosus, L.plantarum, L.fermentum. 37 584 мРНК генов цитокинов (IL1В, IL6, IL8, IL10, IL12А, IL15, IL18, IL23, TNF, IFNG, TGFB1, LIF), транскрипционных факторов (TBX21, GATA3, RORC, Foxp3), толл-подобных рецепторов (TLR2, TLR4, TLR9) и поверхностных маркеров клеток иммунной системы (IL2Rα, CD45, CD68, CD69), гранулизина (GNLY) 24 584 Одиночныe олигонуклеотидные замены (SNP): IL1A (rs1800587), IL1B (rs1143627, rs1143634, rs16944), IL1R1или IL1RA (rs2234650), IL1RN (rs315952), IL6 (rs1800795), IL8 (rs4073), IL10 (rs1800871, rs1800872, rs1800896), IL12B (rs3212227), IL18 (rs187238, rs1946518, rs1946519), INFG (rs2430561), TNF (rs1800629, rs361525) и TGFB1 (rs1800469, rs1982073=rs1800470), TLR2 (rs4986790), TLR4 (rs3804099), CCL2 (rs1024611) 23 210 Все микроорганизмы, за исключением типирования лактобактерий 27 153 мРНК генов цитокинов (IL1B, IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, IL12A, IL12B, IL18, TNF, TGFB1, IFNG, LIF, VEGFA изоформы 121, 165, 189), транскрипционного фактора Foxр3, α-цепи рецептора ИЛ-2 (IL2RА) и толл-подобных рецепторов (TLR2, TLR4, TLR9), ESR1, PGR 21 153 ИТОГО 90 1684 Кровь Биоптаты эндометрия тканей 86 Группы исследования лабораторное исследование при 411 вагинитах. пациенток Проведено клинико- научно-поликлинического отделения в возрасте от 18 до 45 лет и 101 беременной женщины в возрасте от 18 до 40 лет на сроках от 37 до 40 недель беременности без родовой деятельности с целым плодным пузырем. На основании результатов клиниколабораторного исследования были сформированы следующие группы. Небеременные женщины: 1A - группа сравнения или условно здоровых женщин (n=95); 1B подгруппа - наличие Ureaplasma spp. более 104 ГЭ/мл (n=19); 1С подгруппа - кандидоносительство (n=27); 2-ая группа - пациентки с вагинитом (n=215); 3-я группа – пациентки с бактериальным вагинозом (n=55). Беременные женщины: 1A - группа сравнения или условно здоровых женщин (n=50); 2B подгруппа - наличие Ureaplasma spp. более 104 ГЭ/мл (n=16); 1С подгруппа - кандидоносительство (n=11); 2-ая группа – пациентки с вагинитом (n=24). Критерии включения: репродуктивный возраст, для беременных женщин сроки от 37 до 40 недель беременности без признаков родовой деятельности. Критерии исключения: наличие патогенов (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas применение vaginalis), антибактериальных препаратов за месяц до обследования. В отношении беременных женщин – наличие у пациенток тяжелой экстрагенитальной и акушерской патологии, исцмико-цервикальная недостаточность с ее хирургической коррекцией, наличие вирусных инфекций. Группы исследования при хроническом эндометрите. Проведено клинико-лабораторное исследование 110 пациенток отделения клинической эндокринологии ФГБУ «НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова» Минздрава России в возрасте от 18 до 45 лет. Критерии включения: гистологически подтвержденный диагноз хронического эндометрита. Критерии исключения: тяжелая соматическая патология; миома матки, 87 аденомиоз или образования в яичниках, требующих оперативного лечения; наличие онкологических заболеваний; гормонотерапия в течение последних 3 месяцев. На основании результатов клинико-лабораторного исследования были сформированы следующие группы: 1-ая - группа сравнения или условно здоровых женщин (n=31); 2-ая группа - женщины с хроническим эндометритом (n=79). 2.3 Методы исследования Базовый метод исследования – ПЦР в режиме реального времени, включающий определение транскрипционного профиля состава генов микрофлоры иммунного влагалища, ответа, анализ типирование полиморфизмов генов иммунного ответа. Все ПЦР-исследования выполнены согласно Инструкциям с использованием реактивов и приборов (детектирующие амплификаторы «DTprime» (в модификациях 4 канала, 96х0,2 мл и 5 каналов, термоблок 384х0,1 мл); термостаты «Гном» и «Термит», станции для раскапывания реагентов «DTstream»; стройство для запечатывания микропланшетов «DTpack») производства ООО «НПО ДНКТехнология», Россия. 2.3.1 Определение состава микрофлоры влагалища Для выделения ДНК микроорганизмов использовали наборы «Проба ГС». Метод основан на сорбции ДНК на носителе (сорбенте), отмывке примесей с последующей элюцией нуклеиновых кислот с сорбента. При количественной оценке биоценоза влагалища учитывали: общее количество бактерий, количество Lactobacillus spp. и 14 основных групп микроорганизмов, представляющих условно-патогенную флору, включая факультативно-анаэробные, облигатно-анаэробные микроорганизмы, а также Candida spp., Ureaplasma spp., Mycoplasma hominis, Mycoplasma genitalium (тест «Фемофлор 16»). При оценке состава условно-патогенной флоры учитывалось не только 88 ее присутствие, но и количество по отношению к общей бактериальной массе (ОБМ). Также определялось количество лактобактерий по отношению к общей бактериальной массе. Результаты ПЦР исследования были интерпретированы на основании рекомендаций “Применение метода полимеразной цепной реакции в реальном времени для оценки микробиоценоза урогенитального тракта у женщин (тест Фемофлор)”, разработанной НЦАГиП им. В.И.Кулакова и НИИАиГ им. Д.О. Отта [49] с незначительной модификацией: наличие Candida spp. рассматривалось, как вульвовагинальный кандидоз (ВВК), и трактовалось либо, как бессимптомное кандидоносительство при отсутствии воспалительной реакции, либо как вагинит при наличии симптомов заболевания и количестве лейкоцитов в мазке более 10 для небеременных женщин и более 20 для беременных. Под абсолютным нормоценозом понимали вариант биоценоза, при котором доля нормофлоры (Lactobacillus spp.) в его составе была более 80% по отношению к общему количеству бактерий, количество Ureaplasma spp., M.hominis – менее 104 ГЭ/мл. Условный нормоценоз расценивали как вариант биоценоза, при котором доля нормофлоры в составе ОБМ была более 80%, но количество Ureaplasma spp., M.hominis – могло быть более 104 ГЭ/мл. Под анаэробным и аэробным дисбиозом понимали дисбаланс биоты, обусловленный одним или несколькими УПМ соответственно в количестве более 20% по отношению к общему количеству бактерий, и долей нормофлоры менее 80%. Смешанный дисбиоз - дисбаланс, вызванный сочетанием бактериальной биоты и Candida spp. на фоне снижения количества нормофлоры. У всех пациенток исследуемых групп методом ПЦР в режиме реального времени также определяли наличие патогенов: Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis (комплект реагентов TNC КОМПЛЕКС), вирусов: ВПГ1,2 типа, ЦМВ (комплект реагентов ГерпесКомплекс), условно-патогенных микроорганизмов: Enterococcus spp., 89 E.coli, Streptococcus agalactiae, Klebsiella spp., Staphylococcus aureus, Candida albicans. При типировании лактобактерий оценивали количество 6 основных видов лактобактерий влагалища (L.crispatus, L.iners, L.jensenii, L.gasseri, L.jonsonii, L.vaginalis) и 5 биотехнологических видов (L.acidiphilis, L.casei/ L.rhamnosus, L.plantarum, L.fermentum). При исследовании бактериального фона в эндометрии определяли те же самые микроорганизмы, что и во влагалище, за исключением типирования лактобактерий. 2.3.2 Определение транскрипционного профиля генов иммунного ответа Для выделения нуклеиновых кислот использовали наборы «Проба НК». Метод основан на лизисе клеток в 4М растворе гуанидинтиоцианата и осаждении нуклеиновых кислот изопропанолом в присутствии соосадителя с последующими отмывками этанолом и ацетоном. В случае наличия в образце большого количества материала (ткани эндометрия) использовали метод фенол-хлороформной экстракции [267]. Реакцию обратной транскрипции (синтез кДНК из полученной РНК) проводили в объеме 40 мкл. В качестве праймеров для обратной транскрипции специфичные олигонуклеотиды использовали оригинальные и обратную транскриптазу M-MuLV. Реакцию проводили при температуре 40ºС в течение 30 минут, с последующей инактивацией обратной транскриптазы при 95ºС в течение 5 минут. Амплификацию осуществляли в режиме реального времени с измерением уровня флуоресценции по каналу FAM на каждом цикле при температуре отжига праймеров. Реакцию ставили в двух повторах для каждой точки. Для постановки ПЦР в реальном времени использовали обычную Taq-полимеразу с обеспечением «горячего старта» с помощью парафина или Taq-полимеразу с AT (Taq-AT), позволяющую осуществить реализацию «горячего старта» без 90 применения парафина. Taq-AT использовалась при работе с автоматическими станциями в формате 384луночного планшетного раскапывания реактивов и кДНК. Спектр исследованных мРНК-маркеров при вагинитах и хроническим эндометрите представлен в таблице 7. Нормировка уровня экспрессии исследуемых генов осуществлялась методом сравнения пороговых циклов (метод ΔΔCq) по 4 референсным генам (B2M, GUSB, TBP и HPRT1) и значению медианы уровня экспрессии в группе сравнения, которую принимали равной 1. 2.3.3 Определение замен одиночных нуклеотидов Для определения SNP ДНК выделяли из ядер лимфоцитов. Метод основан на разрушении лимфоцитов с помощью лизирующего буфера, не влияющего на целостность мембран ядер лимфоцитов [150]. ДНК из ядер выделяли с использованием наборов «Проба ГС». Для типирования однонуклеотидных полиморфизмов генов иммунного ответа использована ПЦР с плавлением продуктов реакции в присутствии «примыкающих» олигонуклеотидов (вариант метода adjacent probes, kissing probes). Высокая достоверность полученных результатов обеспечивалась получением кривых плавления по двум каналам флуоресценции (FAM и HEX). Спектр исследованных полиморфизмов представлен в таблице 7. 2.3.4 Дополнительные клинико-лабораторные методы при вагинитах: сбор анамнестических данных, жалоб пациентки; осмотр вульвы, слизистых влагалища и шейки матки в зеркалах, бимануальное гинекологическое исследование; микроскопия мазков, окрашенных по Граму; культуральное исследование. при хроническом эндометрите: клинические (анализ жалоб, анамнеза, определение гинекологического статуса); гистероскопия, диагностическое выскабливание эндометрия; гистологическое исследование; ультразвуковое 91 исследование органов малого таза. Дополнительные клинико-лабораторные исследования были выполнены врачами и сотрудниками ФГБУ «НЦАГиП им. академика В.И. Кулакова». 2.4 Параметры, используемые для описания ПЦР в реальном времени Сq (или Ср) - значение характеристического цикла амплификации, автоматически определяемое детектирующим амплификатором (пороговый или индикаторный цикл). Slope – разница в значениях Ср (ΔСр) при разведении образца в 10 раз. Эффективность амплификации оценивали по формуле: ( ) или ( ) (формула 1). Уровень экспрессии мРНК исследуемого гена Х относительно мРНК одного референсного гена N определяли по формуле: ⁄ ⁄ (формула 2), где ЕN, EX – эффективности амплификации, СpN,CpX - значения пороговых циклов. 2.5 Нормировка Нормировка по нескольким референсным генам производилась методом сравнения пороговых циклов (метод ΔΔCq с нормировкой на референсные гены и значение медианы уровня экспрессии в группе сравнения). Для каждого образца на основании уровней экспрессии 4 референсных генов вычислялся нормировочный фактор (NF) – среднее арифметическое значений Cр референсных генов. ( ( ) ( ) ( 92 ) ( ) ), (формула 3) Относительное значение экспрессии гена x вычислялось по формуле: Expression(Х) = ( ( ) ) (формула 4). 2.6 Статистика Статистическую обработку результатов исследования уровней экспрессии генов проводили с использованием методов непараметрического анализа. Исследованные количественные показатели представлены в виде Ме (L-H), где Ме – медиана, L – нижний квартиль, Н – верхний квартиль. Значения Ме в группе сравнения были приняты за 1, а значения Ме в исследуемых группах показывала во сколько раз уровень экспрессии гена выше или ниже по отношению к группе здоровых пациенток. Для сопоставления двух групп по количественным признакам использован Uкритерий Манна-Уитни. Различие между группами полагали статистически значимым при p<0,05. Для выявления взаимосвязи переменных проводили расчет коэффициента ранговой корреляции по Спирмену. Обработку полученных результатов проводили с использованием программ StatSoft Statistica 6.0, SPSS Statistics версия 17.0. Отношение шансов (OR) и значимость различий в частоте встречаемости качественных признаков рассчитывали с помощью программного продукта WINPEPI. ОR приведено с 95% доверительным интервалом (CI). Оценку соответствия выявленных частот генотипов закону ХардиВайнберга проводили по критерию χ2-квадрат в сравнении с ожидаемыми частотами генотипов равновесного распределения. Для оценки ассоциаций рассчитывали отношение шансов OR по формуле: (формула 5), где а — число лиц с наличием анализируемого маркера среди больных; b — его отсутствие среди больных; 93 c и d — число лиц соответственно с наличием и отсутствием маркера в контрольной группе. Величина ОR = 1 указывает на отсутствие ассоциации, ОR > 1 — имеет место при положительной ассоциации (фактор риска) и ОR < 1 — отрицательная ассоциация аллеля (или генотипа) с заболеванием (протективный фактор). Статистическую ошибку распределения частот аллелей вычисляли по формуле: √ ( ) (формула 6), где р – частота аллеля, N – число индивидов в выборке. Для дискриминации групп использовался многофакторный анализ (бинарная логистическая регрессия), который позволил вычислить вероятность «классификации в группу наличия признака или заболевания» (Р) для каждого клинического образца. Для расчёта оптимального значения величины порога отсечения Р (точки cut off) использовали ROC-анализ (Receiver Operator Characteristic). 2.7 Метод бинарной логистической регрессии Метод позволяет исследовать зависимость дихотомических переменных от независимых переменных. Как правило, рассматривается некоторое событие, которое может произойти (болен) или не произойти (здоров). Вероятность наступления события для каждого конкретного случая рассчитывается по формуле: (формула 7), где z=k1*x1+k2*x2+…..kn*xn+const (формула 8) где x1, x2, xn – значения переменных (уровень экспрессии мРНК генов или индексы отношений уровня экспрессии генов, k1, k2, kn - коэффициенты, расчёт которых является задачей бинарной логистической регрессии, const —константа. 94 Если Р<50% можно предположить, что событие не наступит. В противном случае предполагается наступление события. Пороговое значение наступления события более корректно может быть рассчитано с помощью ROC-анализа. 2.8 ROC-анализ (Receiver Operator Characteristic) используется для определения оптимального значение величины порога отсечения (точки cut off). Основой данного анализа является построение ROC-кривой, которая показывает зависимость количества верно классифицированных положительных примеров от количества неверно классифицированных отрицательных примеров. Критерием выбора точки cut off может быть либо требование максимальной чувствительности, либо специфичности, а также требование максимальной суммарной чувствительности и специфичности метода. 2.9 Характеристики диагностических тестов В работе представлены следующие характеристики тестов: Чувствительность (sensitivity) - доля позитивных результатов теста в группе больных пациентов, вычисляется по формуле: (формула 9) согласно четырехпольной таблице 8. Специфичность (specificity) - доля негативных результатов теста в группе здоровых пациентов, вычисляется по формуле: (формула 10). Прогностическая ценность теста - вероятность наличия (отсутствия) заболевания при известном результате исследования. Прогностическая ценность положительного результата (positive predictive value) - вероятность наличия заболевания при положительном результате теста, вычисляется по формуле: 95 (формула 11). Прогностическая ценность отрицательного результата (negative predictive value) - вероятность отсутствия заболевания при отрицательном результате теста, вычисляется по формуле: (формула 12). Таблица 8. Четырехпольная таблица для расчета основных характеристик диагностического теста. Результат теста положительный отрицательный Заболевание присутствует отсутствует a b истинно положительный ложно положительный c d ложно отрицательный истинно отрицательный . 96 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1 Разработка систем для оценки профиля экспрессии мРНК генов иммунной системы Задача данного этапа диссертационной работы состояла в формировании, разработке и клинической адаптации тест-систем для количественного определения уровня экспрессии мРНК выбранных геновмаркеров, включая оптимизацию методов выделения РНК и ДНК, метода обратной транскрипции, подбор, проверку и оптимизацию температур отжига олигонуклеотидных праймеров и проб, характеристику используемых тест-систем, способов и методов нормировки уровня экспрессии мРНК генов-маркеров. 3.1.1 Подбор праймеров и флуоресцентно-меченных проб Подбор праймеров и флуоресцентно-меченных проб (ДНК-зондов) осуществляли путем анализа последовательностей ДНК и мРНК генов базы данных NCBI (http//www.ncbi.nlm.nih.gov). При подборе праймеров и зондов учитывали структурную организацию генов, кодирующих мРНК, чтобы исключить отжиг праймеров на геномной ДНК, а также наличие псевдогенов и различные варианты альтернативного сплайсинга (табл.9). В ряде случаев было разработано несколько систем и выбрана наиболее оптимальная. Всего было разработано 28 тест-систем для определения экспрессии мРНК генов иммунного ответа (IL1В, IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, IL12А, IL12B, IL15, IL18, IL23А, TNF, TGFВ1, IFNG, LIF, VEGFA изоформы 121, 165, 189, TBX21, GATA3, RORC, Foxp3, TLR2, TLR4, TLR9, IL2Rα, CD45, CD68) и 4 тест-системы для определения экспрессии мРНК референсных генов (B2M, HPRT1, TBP и GUSB). 97 Таблица 9. Основные характеристики генов и тест-систем для определения экспрессии мРНК. мРНК Ген Локализация гена IL1B Адресация ДНК Эффективность Длина Число амплификации, продукта псевдогенов Е, % ПЦР, п.н. Адресация основной формы Число экзонов Варианты альтернативного сплайсинга Какие варианты определяет система 2q14 NM_000576.2 7 нет NM_000576.2 NC_000002.11 нет 96 131 IL2 4q26-q27 NM_000586.3 4 нет NM_000586.3 NC_000004.11 нет 97 203 IL4 5q31.1 NM_000589.2 4 NM_172348.1 NM_000589.2 NC_000005.9 нет 94 214 IL6 7p21 NM_000600.1 5 нет NM_000600.1 NC_000007.13 нет 96 334 LIF 22q12.2 NM_002309.4 3 NM_001257135.1 NM_002309.4 NC_000022.10 нет 97 262 IL8 4q13-q21 NM_000584.2 4 нет NM_000584.2 NC_000004.11 нет 98 174 IL10 1q31-q32 NM_000572.2 5 нет NM_000572.2 NC_000001.10 нет 98 188 IL12A 3q25.33-q26 NM_000882.2 7 нет NM_000882.2 NC_000003.11 нет 96 177 IL12B 5q31.1-q33.1 NM_002187.2 8 нет NM_002187.2 NC_000005.9 нет 92 114 IL15 4q31 NM_172174.1 8 NM_172175.1 NM_000585.2 NM_172174.1 NM_172175.1 NM_000585.2 NC_000004.11 нет 96 327 IL18 11q22.2-q22.3 NM_001562.2 6 нет NM_001562.2 NC_000011.9 нет 95 175 IL23А 12q13.3 NM_016584.2 4 нет NM_016584.2 NC_000012.11 нет 97 135 TNF 6p21.3 NM_000594.2 4 нет NM_000594.2 NC_000006.11 нет 98 83 TGFB1 19q13.1 NM_000660.3 7 нет NM_000660.3 NC_000019.9 нет 97 175 IFNG 12q14 NM_000619.2 4 нет NM_000619.2 NC_000012.11 нет 98 216 TBX21 17q21.32 NM_013351.1 6 нет NM_013351.1 NC_000017.10 нет 94 152 мРНК Ген Локализация гена GATA3 RORC VEGFA Эффективность Длина Число амплификации, продукта псевдогенов Е, % ПЦР, п.н. Адресация основной формы Число экзонов Варианты альтернативного сплайсинга 10p15 NM_001002295.1 6 NM_002051.2 NM_001002295.1 NC_000010.10 NM_002051.2 нет 94 150 1q21 NM_005060.3 12 NM_001001523.1 NM_005060.3 NC_000001.10 NM_001001523.1 нет 98 166 изоформа 121 6 97 108 изоформа 165 7 95 240 изоформа 189 8 95 237 91 405 91 231 6р12 NM_003264.3 Какие варианты определяет система Адресация ДНК NM_001025370.2 19 изоформ NM_001025368.2 NM_001033756.2 NC_000006.11 нет NM_003376.5 3 нет NM_003264.3 NC_000004.11 NM_138554.4 3 NM_003266.3 NM_138557.2 NM_138554.4 NM_003266.3 NM_138557.2 NC_000009.11 3p21.3 NM_017442.3 2 нет NM_017442.3 NC_000003.11 нет 95 110 IL2Ra 10p15-p14 NM_000417.1 8 нет NM_000417.1 NC_000010.10 нет 97 265 Foxp3 Xp11.23 NM_014009.3 12 NM_001114377.1 NM_014009.3 NC_000023.10 NM_001114377.1 нет 96 210 CD45 PTPRC 1q31-q32 NM_002838.4 33 3 изоформы нет 98 200 TLR2 4q32 TLR4 9q33.1 TLR9 NM_002838.4 NM_080921.3 99 NC_000001.10 1 нет мРНК Ген Локализация гена CD68 Адресация ДНК Адресация основной формы Число экзонов Варианты альтернативного сплайсинга Какие варианты определяет система 17p13 NM_001251.2 6 NM_001040059.1 NM_001251.2 NC_000017.10 NM_001040059.1 GUSB 7q21.11 NM_000181.3 12 нет NM_000181.3 B2M 15q21-q22.2 NM_004048.2 4 нет HPRT1 Xq26.1 NM_000194.1 9 нет TBP 6q27 NM_003194.4 8 NM_001172085.1 нет 97 227 NC_000007.13 18 92 266 NM_004048.2 NC_000015.9 нет 98 353 NM_000194.1 NC_000023.9 4 95 284 нет 96 242 NM_003194.4 NC_000006.11 NM_001172085.1 100 Эффективность Длина Число амплификации, продукта псевдогенов Е, % ПЦР, п.н. 3.1.2 Проверка праймеров и зондов Проверку праймеров и зондов для ПЦР проводили на панели образцов, включающей: образцы, прошедшие реакцию обратной транскрипции (кДНК); отрицательный контрольный образец, прошедший пробоподготовку и реакцию обратной транскрипции; образцы, не прошедшие реакцию обратной транскрипции (геномная ДНК). Критерии приемлемой тест-системы были следующие: 1. Наличие амплификации в образцах, прошедших реакцию обратной транскрипции. 2. Отсутствие на форезе дополнительных неспецифичных полос. 3. Амплитуда разгорания флуоресцентно-меченных проб не менее чем в 2 раза по отношению к фону. 4. Эффективность амплификации не менее 90%. 5. Отсутствие амплификации в отрицательном контрольном образце. 6. Отсутствие амплификации на геномной ДНК. Обычно гексамеры и для обратной транскрипции поли-Т-нуклеотиды. Однако используются было случайные установлено, что использование смеси коротких (12-15 п.н.) специфичных ОТ-праймеров предпочтительнее по сравнению с использованием случайных гексамеров и поли-(Т)-праймеров. Значения пороговых циклов ПЦР при использовании специфичных ОТ-праймеров в среднем для разных тест-систем были на 2,2±1,8 и 3,2±1,3 меньше, чем в случае поли-(Т)- праймеров и случайных гексамеров соответственно. Результаты проверок тест-систем для референсного гена В2М и маркера CD68 представлены в качестве примера на рисунках 7 - 14 и таблицах 10 – 11. По другим тест-системам выполнена аналогичная работа. 101 Исходные данные Геометрический (Ср) 5 500 2 500 5 000 2 000 Флуоресценция Флуоресценция 4 500 4 000 3 500 3 000 2 500 1 500 1 000 500 2 000 1 500 0 1 000 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 1 6 11 Номер цикла 16 21 26 31 36 41 Номер цикла 46 Рисунок 7. Зависимость флуоресценции канала FAM от номера цикла (проверка ПЦР-праймеров и зонда для B2M) синим цветом отмечены 3 образца в двух повторах кДНК красным - 3 образца в двух повторах геномная ДНК Рисунок 8. Электрофореограмма продуктов амплификации B2M. дорожки 1 - 6 – 3 образца в двух повторах кДНК, длина ампликона 353 п.н.; дорожки 7, 8 – отрицательный контроль; дорожка 9 - pUC – маркер длин (500-404-331; 242-190-147-110-67 п.н.); дорожки 10-15 –3 образца в двух повторах геномная ДНК. 102 Зависимость флуоресценции канала FAM от Зависимость флуоресценции канала FAM от номера цикла образец №1 номера цикла образец №2 2 500 2 000 Флуоресценция Флуоресценция 2 000 1 500 1 000 1 500 1 000 500 500 0 0 1 6 11 16 21 26 31 36 Номер цикла Красный – t отжига=67°C Синий - t отжига=64°C Зеленый - t отжига=62,3°C Черный - t отжига=60°C T отжига, °C Cp 24,3 67 24,9 64 24,7 62,3 24,9 60 1 6 11 16 21 26 31 36 Номер цикла Красный – t отжига=67°C Синий - t отжига=64°C Зеленый - t отжига=62,3°C Черный - t отжига=60°C T отжига, °C Cp 28,7 67 28,5 64 28,2 62,3 28,8 60 24,8 24,8 24,6 24,6 28,6 28,3 28,7 28,3 Рисунок 9. Проверка температуры отжига ПЦР-праймеров (B2M) Образец 1 Образец 2 2 500 2 500 2 000 Флуоресценция Флуоресценция 2 000 1 500 1 000 1 500 1 000 500 500 0 0 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 1 6 Номер цикла 11 16 21 26 31 Номер цикла 36 41 46 Красным цветом отмечены – специфичные олигонуклеотиды (конечная концентрация 0,15 pM) Синим – случайные гексамеры (конечная концентрация 0,5 pM) Зеленым – поли-Т (конечная концентрация 0,5 pM) Черным – праймеры отсутствуют (матрица получена с затравок фрагментов ДНК из образцов) Рисунок 10. Проверка ОТ-праймеров для B2M. 103 Таблица 10. Сравнение различных ОТ-праймеров для B2M. Образец Специфичные Случайные Поли – Т Нет праймеров гексамеры Ср Ср Ср Ср Ср Ср Ср Ср Образец 1 23,9 23,7 28,4 28,3 24,3 24,4 32,1 32,2 Образец 2 23 22,9 26,6 26,6 23,7 23,6 30,9 30,8 Исходные данные Геометрический (Ср) 900 800 700 1 200 Флуоресценция Флуоресценция 1 400 1 000 800 600 500 400 300 200 600 100 0 400 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 1 6 11 16 Номер цикла 21 26 31 36 41 46 Номер цикла Рисунок 11. Зависимость флуоресценции канала FAM от номера цикла (проверка ПЦР-праймеров и зонда для СD68) зеленым цветом отмечены 3 образца в двух повторах кДНК светло-зеленым - 3 образца в двух повторах геномная ДНК. Рисунок 12. Электрофореограмма продуктов амплификации СD68. дорожки 1 - 6 - 3 образца в двух повторах кДНК, длина ампликона 227 п.н. дорожки 7, 8 – отрицательный контроль дорожка 9 - pUC – маркер длин (500-404-331; 242-190-147-110-67 п.н.) дорожки 10-15 –3 образца в двух повторах геномная ДНК. 104 Зависимость флуоресценции канала FAM от Зависимость флуоресценции канала FAM от номера цикла образец №1 номера цикла образец №2 2 500 2 000 1 500 Флуоресценция Флуоресценция 2 000 1 000 1 500 1 000 500 500 0 0 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 Номер цикла Красный – t отжига=67°C Синий - t отжига=64°C Зеленый - t отжига=62,3°C Черный - t отжига=60°C T отжига, °C Cp 28,7 67 28,9 64 28,9 62,3 28 60 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 Номер цикла Красный – t отжига=67°C Синий - t отжига=64°C Зеленый - t отжига=62,3°C Черный - t отжига=60°C T отжига, °C Cp 30,8 67 30,8 64 30,9 62,3 30,3 60 28,8 28,9 28,7 28,1 31 31,1 30,6 30,2 Рисунок 13. Проверка температуры отжига ПЦР-праймеров (CD68) Образец 1 Образец 2 800 700 700 600 Флуоресценция Флуоресценция 600 500 400 300 200 500 400 300 200 100 100 0 0 1 6 11 16 21 26 31 36 41 46 1 6 11 Номер цикла 16 21 26 31 36 41 46 Номер цикла Красным цветом отмечены – специфичные олигонуклеотиды (конечная концентрация 0,15 pM) Синим – случайные гексамеры (конечная концентрация 0,5 pM) Зеленым –поли – Т (конечная концентрация 0,5 pM) Черным – праймеры отсутствуют (матрица, вероятно, получена с затравок фрагментов ДНК из образцов) Рисунок 14. Проверка ОТ-праймеров для CD68. 105 Таблица 11. Сравнение различных ОТ-праймеров для CD68. Образец Специфичные Случайные Поли – Т Нет праймеров гексамеры Ср Ср Ср Ср Ср Ср Ср Ср Образец 1 26,3 26,6 30,2 30,7 29 29 32,1 33,5 Образец 2 27 26,7 29,8 30 30 29,1 31,4 31,8 3.1.3 Выбор референсных генов и разработка алгоритмов нормировки, оптимальных для оценки уровней экспрессии мРНК генов человека в тканях эндометрия и влагалища Наиболее предпочтительной является нормировка по нескольким референсным генам. Одним из главных требований к нормировочным генам является постоянство экспрессии во всех тканях и примерное соответствие диапазонов уровней экспрессии нормировочных и исследуемых генов. В качестве нормировочных были проанализированы семь геновкандидатов: 18S рибосомальная фосфатдегидрогеназа (GAPDH), фосфорибозилтрансфераза РНК (18SrRNA), β-актин (ACTB), (HPRT1), глицеральдегид-3гипоксантин-гуанин β2-микроглобулин (B2M), TATA- связывающий протеин (ТВР), β-глюкоронидаза (GUSB). К наиболее часто используемым референсным генам относятся 18SrRNA, GAPDH, ACTB, однако предпочтение было отдано не этим генам в силу ряда причин. Ген 18SrRNA экспрессируется на очень высоком уровне, составляя при выделении 80% фракции суммарной РНК, при этом только 2-5% представлено пулом мРНК, причем соотношение рРНК/мРНК не всегда остается постоянным [156]. Гены GAPDH и ACTB также экспрессируются в клетках на высоком уровне. Помимо этого к недостаткам GAPDH и ACTB следует отнести большое число псевдогенов: 52 для GAPDH и 18 для ACTB [http://www.pseudogene.org], что создает трудности при подборе праймеров. В качестве референсных генов были выбраны HPRT1, B2M, ТВР и GUSB. В тканях эндометрия все четыре гена экспрессируются на высоком уровне 105107,5 копий/мл. В соскобах слизистой влагалища B2M экспрессируется на 106 высоком уровне106 копий/мл, HPRT1, ТВР и GUSB – на среднем 103- Концентрация мРНК референсных генов, lg коп/мл 104 копий/мл (рис.15). 8,0 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0 B2M HPRT1 TBP GUSB B2M HPRT1 эндометрий TBP GUSB соскобы из влагалища Рисунок 15. Уровень экспрессии референсных генов в образцах вагинальных соскобов и тканей эндометрия. Отмечены медианы и межквартильный размах. Разработанные тест-системы для определения экспрессии мРНК генов иммунного ответа были апробированы на образцах тканей секреторного и пролиферативного эндометрия. Выбор был обусловлен наличием четких гистологических критериев, позволяющих различать эндометрий пролиферативной и секреторной фаз менструального цикла. 3.1.4 Апробация метода исследования транскрипционных профилей на образцах тканей эндометрия двух стадий менструального цикла Задача данного этапа работы состояла в оценке возможности сравнительного анализа транскрипционных профилей в пролиферативном и секреторном эндометрии, а также поиске способов дискриминации образцов в зависимости от стадии менструального цикла на основе изучаемых маркеров. 107 Основная функция органов женской репродуктивной системы и в частности эндометрия состоит в выполнении репродуктивной функции, т.е. обеспечении условий для успешного оплодотворения, имплантации и созревания развивающегося эмбриона и плода. Все эти процессы находятся под контролем гормональной и иммунной системы с участием нескольких семейств цитокинов. Важнейшими из них являются цитокины сем. IL-6 (IL-6 и LIF), сем. TGF-ß, IL-1 и др. [103]. Эндометрий чувствителен к половым гормонам яичника эстрогенам и прогестерону. Яичники в фазу селекции и развития фолликулов в нарастающем до овуляции количестве секретируют эстрогены, после овуляции желтое тело, образовавшееся на месте созревшего фолликула, секретирует прогестерон, а количество эстрогенов снижается. Однако есть мнение, что решающую роль в имплантации играет не столько абсолютное содержание стероидных гормонов, сколько рецептивность эндометрия, то есть количество функционально полноценных рецепторов к соответствующим стероидным гормонам в ткани эндометрия [37]. Под действием гормонов эндометрий претерпевает циклические изменения: фаза пролиферации проходит под преимущественным действием эстрогенов, фаза секреции — под влиянием прогестерона и эстрогенов. Учитывая циклические изменения в эндометрии под влиянием гормонов, был также учтен уровень экспрессии мРНК прогестеронового (PGR) и эстрогенового рецепторов (ESR1) в пролиферативном и секреторном эндометрии. В соответствии с полученными результатами для эндометрия секреторной фазы характерно повышение таких маркеров, как LIF в 2,5 (р=0,031), IL6 в 2,7 (р=4,7х10-4), TLR4 в 2,7 (р=1,8х10-5), VEGFA изоформа 189 в 3,1 (р=0,002), TNF в 2,2 (р=0,004), IL4 в 1,4 (р=10-10) раза и снижение таких маркеров, как IL12A в 1,4 (р=0,007), IL12B в 1,1 (p=0,009), Foxp3 в 2,6 (р=8,7х10-5), IL2 в 8,1 (р=0,015) и PGR в 5,9 (р=1,9х10-8) раза по сравнению с пролиферативным эндометрием (табл.12, рис.16). 108 Таблица 12. Уровень экспрессии мРНК генов иммунного ответа в образцах тканей эндометрия в зависимости от стадии менструального цикла. Ген Стадия пролиферации n=31 Ме (L-H) Стадия секреции n=19 Ме (L-H) р - уровень значимости LIF 1 (0,40-1,74) 2,46 (0,39-20,46) 0,031* IL6 1 (0,32-3,12) 2,70 (2,21-4,79) 4,7 х 10-4* TLR4 1 (0,65-1,50) 2,70 (1,57-3,61) 1,8 х 10-5* VEGFA189 1 (0,65-1,36) 3,07 (1,7-4,85) 0,002* TNF 1 (0,68-1,59) 2,24 (1,17-3,35) 0,004* IL4 1 (0,51-1,78) 1,45 (0,68-1,84) 1,1 х 10-10* TLR2 1 (0,82-1,40) 1,45 (0,85-1,86) 0,106 TLR9 1 (0,45-1,72 1,35 (0,53-1,76) 0,260 VEGFA165 1 (0,56-1,46) 1,50 (0,7-1,92) 0,282 IL10 1 (0,62-1,68) 1,15 (0,51-1,41) 0,458 IL1В 1 (0,56-1,62) 0,98 (0,63-2,66) 0,413 TGFB1 1 (0,65-1,43) 0,92 (0,39-1,46) 0,636 VEGFA121 1 (0,62-1,35) 0,98 (0,52-1,27) 0,439 IL18 1 (0,74-1,34) 0,81 (0,61-1,08) 0,366 IFNG 1 (0,47-1,33) 0,77 (0,38-1,55) 0,661 IL2Ra 1 (0,69-1,60) 0,75 (0,55-1,34) 0,573 ESR1 1 (0,40-2,22) 0,63 (0,29-1,22) 0,064 IL8 1 (0,37-2,88) 0,55 (0,22-1,38) 0,245 IL12B 1 (0,70-1,83) 0,89 (0,39-1,51) 0,009* IL12A 1 (0,86-1,34) 0,73 (0,57-0,95) 0,007* FoxP3 1 (0,62-1,52) 0,38 (0,26-0,48) 8,7 х 10-5* PGR 1 (0,68-1,37) 0,17 (0,15-0,35) 1,9 х 10-8* IL2 1 (0,62-1,53) 0,12 (0,08-0,22) 0,015* *р<0,05 109 5,00 0,50 0,05 LIF* IL6* TLR4* VEGFA189* TNF* IL4* TLR2 TLR9 VEGFA165 IL10 IL1В TGFB1 VEGFA121 IL18 IFNG IL2Ra IL8 ESR1 IL12B* IL12A* FoxP3* PGR* IL2* Относительный уровень экспрессии мРНК 50,00 ст.пролиферации ст.секреции Рисунок 16. Экспрессионный профиль мРНК генов иммунной системы и гормональных рецепторов в эндометрии в зависимости от стадии цикла. Данные представлены в виде медианы и межквартильного размаха. Значение Ме в группе ст. пролиферации принято за 1. * р < 0,05 На основании экспериментальных данных по экспрессии генов с помощью методов статистического анализа были выбраны 5 наиболее информативных маркеров, которые позволили различить пролиферативный и секреторный эндометрий: IL6, TLR4, VEGFA189, Foxp3 и IL2. Однако дискриминатная ценность отдельных маркеров была не высока, уровни экспрессии при статистически значимых различиях между группами не позволяли достаточно надежно отличить стадию цикла (рис.17, табл.13). Настоящей находкой стало вычисление индексов, т.к. они могут быть определены напрямую без использования референсных генов по формуле: ⁄ (формула 13), где Сq1 и Сq2- значения пороговых циклов для соответствующих генов. 110 Относительный уровень экспрессии мРНК 10 1 0,1 0,01 IL6 IL2 TLR4 ст.пролиферации Foxp3 VEGF189 ст.секреции Рисунок 17. Относительный уровнь экспрессии мРНК наиболее информативных генов в образцах эндометрия стадии пролиферации и секреции. Таблица 13. Чувствительность и специфичность метода дискриминации образцов эндометрия пролиферативной и секреторной фаз менструального цикла Показатель Чувствительность Специфичность Значение сut off IL6 89,5% 64,5% 1,5 IL2 87,1% 84,2% 0,5 TLR4 73,7% 83,9% 1,7 Foxp3 83,9% 84,2% 0,5 VEGFA189 73,7% 83,9% 1,8 IL6/IL2 84,2% 93,5% 4,4 TLR4/Foxp3 96,8% 100% 16,3 VEGFA189/IL2 84,2% 93,5% 322 *Значение порогов отсечек определено с помощью ROC-анализа, как требование наибольшей суммарной чувствительности и специфичности метода Исключение из исследования референсных генов снимает вопросы нормировки, нивелирует результатов исследования, ошибки нормировки, сокращает 111 упрощает количество маркеров обработку и дает возможность внедрение данного метода в рутинную практику. Однако основное преимущество использования индексов состоит в повышении чувствительности и специфичности метода при дискриминации двух групп образцов (рис.18, табл.13). Использование индекса [TLR4]/[Foxp3] позволило в 30 из 31 случая отличить эндометрий пролиферативной фазы Индексы соотношения уровней экспрессии мРНК менструального цикла от секреторной фазы (чувствительность 96,8%). 10000 1000 100 10 1 0,1 0,01 IL6/IL2 TLR4/Foxp3 ст.пролиферации VEGFA189/IL2 ст.секреции Рисунок 18. Индексы соотношения уровней экспрессии генов для образцов стадии пролиферации и секреции. На примере образцов пролиферативного и секреторного эндометрия разработан алгоритм использования метода бинарной логистической регрессии для дискриминации образцов эндометрия двух фаз менструального цикла. Линейное уравнение имело следующий вид: z= 1,5*ln([VEGF189/IL2Ra]) + 6,1*ln([TLR4/Foxp3]) -23,2 (формула 14), где [VEGF189]/[IL2Ra], [TLR4]/[Foxp3] – индекс соотношения уровней экспрессии соответствующих генов. Значения показателей Р (вероятность стадии секреции) выше 50% классифицировали, как маркер эндометрия стадии секреции (рис.19). В соответствии с предложенной статистической моделью все образцы пролиферативного эндометрия были определены в свою группу (100%). 18 из 112 19 (94,5%) образцов были классифицированы, как стадия секреции. В качестве проверочной выборки были использованы образцы эндометрия женщин с хроническим эндометритом. Из 79 образцов с хроническим эндометритом, взятых на 5-7 день менструального цикла, 77 (97,5%) были Вероятность стадии секреции, % определены в группу стадии пролиферации (рис.19). 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 cт.пролиферации (n=31) ст.секреции (n=19) cut-off хронический эндометрит (n=79) Рисунок 19. Распределение образцов в группы пролиферативного и секреторного эндометрия. Таким образом, образцы стадии пролиферации и секреции отличались между собой по ряду маркеров. Очевидно, что исследование мРНК-маркеров при хроническом эндометрите должно быть привязано к определенной стадии цикла. Поскольку диагностическое выскабливание при лечении ХЭ осуществляется в пролиферативную фазу менструального цикла, взятие пайпель-аспирата эндометрия с целью исследования транскрипционного профиля целесообразно проводить в пролиферативную фазу цикла. 3.2 Прикладные аспекты идентификации молекулярно- генетических маркеров с использованием ПЦР в реальном времени 3.2.1 Воспалительные заболевания нижних отделов половых путей Основные направления исследования данного этапа работы состояли в определении особенностей состояния микробиоценоза влагалища, включая 113 количественную оценку УПМ и нормофлоры с типированием лактобактерий; изучении особенностей профиля экспрессии мРНК генов иммунного ответа и разработке способа оценки локальной воспалительной реакции; определении ассоциаций полимофизмов генов цитокинов с предрасположенностью к развитию воспалительных заболеваний. Кроме этого, в работе представлены результаты исходов родов и послеродового периода у женщин с вагинитами. В лабораторной диагностике вагинитов в рутинной практике используются методы культивирования микроорганизмов и микроскопии мазка. Бактериальный вагиноз обычно диагностируется по наличию трех из четырех критериев Амсела [66]. Предлагаемый в данной работе метод определения состава микробиоценоза на основе ПЦР в режиме реального времени («Фемофлор 16) хорошо дополняет «классические» методы диагностики, более того, имеет ряд преимуществ по сравнению с микробиологическим исследованием. К преимуществам метода можно отнести: идентификацию широкого спектра микроорганизмов, включая анаэробы, часть из которых трудно поддается культивированию; а также возможность количественной оценки микроорганизмов с определением их доли в составе общей бактериальной массы. Возможность количественной оценки особенно актуальна в случаях воспалений, обусловленных УПМ, поскольку заболевание в данных случаях связано не столько с самим присутствием возбудителя, сколько его количеством по отношению к ОБМ. 3.2.1.1 Характеристика состава микробиоценоза влагалища небеременных женщин На основании клинико-анамнестических данных и результатов лабораторных методов исследования были сформированы группы пациенток и охарактеризован состав микробиоценоза влагалища. Первая группа - условно здоровых женщины с отсутствием жалоб и признаков воспаления на момент обследования (n=141). По результатам 114 микроскопии число лейкоцитов в мазке не превышало 10 в поле зрения. В составе микробиоценоза влагалища у всех женщин доминировали лактобактерии. У 95 женщин выявлен абсолютный нормоценоз (группа сравнения, подгруппа 1А), у 19 – выявлена Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл (условный нормоценоз, подгруппа 1В), а у 27 – Candida spр. более 103 ГЭ/мл на фоне сохраненной нормофлоры (кандидоносительство, подгруппа 1С). Вторая группа – пациентки с признаками вагинита (n=215). Во 2-ой группе пациенток выявлено наличие воспалительной реакции со стороны слизистой влагалища и шейки матки, количество лейкоцитов в мазке более 10 в поле зрения. Пациентки предъявляли жалобы на обильные выделения из половых путей (77,2%), зуд (41,4%), жжение (32,6%) во влагалище, неприятный запах (13%), диспареунию (9,8%), дизурические расстройства (3,3%). По структуре биоценоза в группе женщин с вагинитами выделено несколько вариантов состояния биоценоза (рис.3): абсолютный нормоценоз (n=42), ВВК (n=51), аэробный дисбиоз (n=16), облигатно-анаэробный дисбиоз (n=31), аэробно-анаэробный дисбиоз (n=18) и смешанный дисбиоз (n=42). У 7 пациенток выявлена Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл, которая рассматривалась, как возможный этиологический агент вагинита; у 8 – вирус простого герпеса (ВПГ 1 или 2 типов). ВВК 3% 4% анаэробы 24% аэробы 20% аэробы+анаэробы 14% 20% смешанный дисбиоз абсолютный нормоценоз 7% 8% уреаплазма>4lg/мл ВПГ Рисунок 20. Типы дисбиозов при вагинитах у небеременных женщин. 115 Третья группа - пациентки с бактериальным вагинозом (n=55) (согласно критериям Амсела, при количестве лейкоцитов в мазке менее 10 в поле зрения). Пациентки этой группы предъявляли жалобы на обильные выделения из половых путей (58,2%), наличие неприятного запаха (25,5%), зуд (10,9%), жжение (7,3%) во влагалище. Диспареуния отмечена в 3,6% случаев. В 32,7% случаев БВ протекал бессимптомно без жалоб со стороны пациенток. Более подробный анализ спектра микроорганизмов в группах исследования представлен в таблице 14. Значимой считали концентрацию микроорганизмов более 104 ГЭ/мл для Ureaplasma spp. и M. hominis, более 103 ГЭ/мл для Candida spp. и 1% от общей бактериальной массы для остальных микроорганизмов. При вагинитах спектр выявляемых микроорганизмов был представлен грибами, аэробами, анаэробами, более чем в половине случаев отмечены сочетанные формы возбудителей. При БВ в основном отмечены полимикробные ассоциации анаэробных микроорганизмов. В группе с наличием уреаплазмы в количестве более 104 ГЭ/мл статистически достоверно чаще присутствовала группа микроорганизмов Gardnerella vaginalis/Prevotella spp./Porphyromonas spp. А в группе с кандидоносительством – Eubacterium spp. и Ureaplasma spp., при этом в половине случаев отмечено сочетание Candida spp. с другими микроорганизмами. 3.2.1.2 Характеристика состава микробиоценоза влагалища беременных женщин Первая группа - условно здоровых беременных женщин с отсутствием жалоб и признаков воспаления на момент обследования (n=77). По результатам микроскопии число лейкоцитов в мазке не превышало 20 в поле зрения. В составе микробиоценоза влагалища у всех женщин доминировали лактобактерии. У 50 женщин выявлен абсолютный нормоценоз (группа сравнения, подгруппа 1А), у 16 – выявлена Ureaplasma spp. в количестве 116 более 104 ГЭ/мл (условный нормоценоз, подгруппа 1В), а у 11 – Candida spp. в количестве более 103 ГЭ/мл (кандидоносительство, подгруппа 1С). Таблица 14. Частоты выявления УПМ в группах небеременных женщин** УПМ Enterobacterium spp. Streptococcus spp. Staphylococcus spp. Enterococcus spp. Gard/Pre/Porph Eubacterium spp. Sne/Lept/Fuso Mega/Veil/Dial Lachno/Clost Mobi/Coryne Peptostrept Atopobium vaginae Подгруппа Подгруппа Подгруппа Вагинит 1A 1В 1С 1,1 5,3 АЭРОБЫ,% 5,3 10,5 14,9* 20,5* 3,7 7,4* 3,6 12,7 3,6 3,7 37,7* 43,7* 6,5* 22,8* 9,3* 9,3* 14,9* 14,4* 87,3* 85,5* 29,1* 41,8* 27,3* 12,7* 30,9* 49,1* 3,7 29,6* 1,9 27,9* 9,1* 34,5* 100* 55,6* 43,3* 61,9* 94,5* 7,4 3,7 АНАЭРОБЫ, % 3,2 15,8* 11,1 8,4 15,8 39,6* 3,7 3,7 2,1 7,4 3,7 2,1 БВ МОЛЛИКУТЫ, % Mycoplasma spp. Ureaplasma spp. Candida spp. Сочетанные формы 100* ГРИБЫ, % 2,1 10,5 ВИРУСЫ, % ВПГ 3,7 *p < 0,05 по сравнению с подгруппой 1А **Значимой считали концентрацию микроорганизмов более 104 ГЭ/мл для Ureaplasma spp. и M.hominis, более 103 ГЭ/мл для Candida spp. и 1% от общей бактериальной массы для остальных микроорганизмов. 117 Вторая группа – пациентки с признаками вагинита (n=24). Во 2-ой группе пациенток выявлено наличие воспалительной реакции со стороны слизистой влагалища и шейки матки, количество лейкоцитов в мазке более 20 в поле зрения. По структуре биоценоза в группе женщин с вагинитами различали несколько вариантов состояния биоценоза: абсолютный нормоценоз (n=9), ВВК (n=9), облигатно-анаэробный дисбиоз (n=6). Более подробный анализ спектра микроорганизмов в группах беременных женщин представлен в таблице 15. При вагинитах спектр выявляемых микроорганизмов был представлен грибами и анаэробами, более чем в половине случаев отмечены сочетанные формы возбудителей. В группе с наличием уреаплазмы в количестве более 104 ГЭ/мл статистически достоверно чаще присутствовала группа Peptostreptococcus spp. А в группе с кандидоносительством – Ureaplasma spp. Таким образом, этиологическими агентами воспалительных заболеваний наиболее часто являются грибы рода Candida и анаэробные микроорганизмы, ассоциированные с БВ, что согласуется с данными IUSTI. Согласно данным IUSTI 2011 года основными причинами инфекционновоспалительных заболеваний влагалища являются бактериальный вагиноз (22-50%), вульвовагинальный кандидоз (17-39%) и трихомониаз (4-35%) [277]. Однако в проведенном нами исследовании Trichomonas vaginalis была выявлена только в одном случае, Chlamydia trachomatis - в 4 случаях, Neisseria gonorrhoeae не выявлена. В силу редкого выявления патогенов, данные пациентки были исключены из рассмотрения. Полученные нами данные о редком выявлении патогенных микроорганизмов согласуются с официальными данными по России. Согласно официальным данным по России за 2011 год заболеваемость Trichomonas vaginalis составила 112,2 случая, Chlamydia trachomatis – 66,3 случая, Neisseria gonorrhoeae – 38,4 на 100 000 населения [43]. Основными этиологическими агентами воспалительных заболеваний у женщин являются условно-патогенные микроорганизмы. 118 Таблица 15. Частоты выявления УПМ в группах беременных женщин** Подгруппа Подгруппа Подгруппа 1A 1В 1С УПМ Вагинит АЭРОБЫ,% 2 Enterobacterium spp. Streptococcus spp. Staphylococcus spp. 6,3 6 4,2 6,3 4,2 АНАЭРОБЫ, % Gard/Pre/Porph Eubacterium spp. Sne/Lept/Fuso Mega/Veil/Dial Lachno/Clost Mobi/Coryne Peptostrept Atopobium vaginae 12 6,3 9,1 14 12,5 9,1 2 37,5* 6,3 8,3* 12,5 16,7* 4 12,5 2 8,3 12,5* 8,3* 4 25* МОЛЛИКУТЫ, % 4,2 Mycoplasma spp. Ureaplasma spp. 100* 36,4* 45,8* 100* 37,5* 45,5* 58,3* ГРИБЫ, % Candida spp. Сочетанные формы 37,5* 12 *p < 0,05 по сравнению с подгруппой 1А **Значимой считали концентрацию микроорганизмов более 104 ГЭ/мл для Ureaplasma spp. и M.hominis, более 103 ГЭ/мл для Candida spp. и 1% от общей бактериальной массы для остальных микроорганизмов. 3.2.1.3 Типирование и количественная оценка лактобактерий При исследовании лактобактерий было выявлено, что основными/ преобладающими видами в составе лактофлоры (более 50 % по отношению к суммарному количеству лактобактерий) были только 4 вида лактобактерий: L.crispatus, L.iners, L.jensenii, L.gasseri (табл.16, рис.21). 119 Таблица 16. Доминирующий вид лактобактерий в составе лактофлоры в группах пациенток в норме, при вагинитах и бактериальном вагинозе. Доминирующий Группа Уреаплазма>4lg/мл Кандидоносительство Вагинит БВ вид сравнения (n=25) (n=29) (n=161) (n=46) (n=120) L.crispatus 60 (50%) 12 (48%) 15 (51,7%) 27 (16,8%) 8 (17,4%) OR=0,2 (0,12-0,34) OR=0,21 (0,09-0,5) p=2,5 x 10-9 p=1,3 x 10-4 L.acidophilis 0 0 0 1 (0,7%) 0 L.iners 32 (27%) 12 (48%) 11 (37,9%) 77 (47,9%) 15 (32,6%) OR=5 (1,5-13,1) OR=2,9 (1-8,5) OR=4,4 (1,9-9,9) -3 p=6,2 x 10 p=0,046 p=2,2 x 10-4 p=0,09 L.jensenii 19 (15,8%) 0 2 (6,9%) 19 (11,3%) 4 (8,7%) L.gasseri 9 (7,5%) 1 (4%) 1 (3,5%) 23 (14,4%) 14 (30,4%) OR=5,4 (2,1-13,6) p=0,08 p=1,3 x 10-4 L.jonsonii 0 0 0 2 (1,3%) 0 L.vaginalis 0 0 0 5 (3,2%) 1 (2,2%) p=0,09 Lactobacillus spp. 0 0 0 7 (4,4%) 4 (8,7%) не выявлено OR=10,9 (0,6-193) OR=22,8 (1,2-440) p=0,043 p=3,3 x 10-3 120 группа сравнения вагинит 8% 5% 4% 16% L.crispatus L.iners 17% 14% L.jensenii 50% L.gasseri 12% 27% другие виды 48% Lactobacillus не выявлено кандидоносительство БВ 2% 9% Ureaplasma spp > 4lg/мл 7% 3% 17% 4% 52% 30% 38% 48% 48% 33% 9% Рисунок 21. Доминирующий вид Lactobacillus в составе лактофлоры в зависимости от состояния микробиоценоза влагалища. 121 Доля других видов в составе лактофлоры в подавляющем большинстве случаев была незначительной. Только в нескольких случаях при вагините и БВ в составе L. acidophilus. лактофлоры Полнота доминировали выявления L. vaginalis, отдельных видов L .jonsonii и лактобактерий подтверждалась родоспецифичными праймерами для Lactobacillus spp. В зависимости от группы исследования доля образцов с L.crispatus в качестве основного вида в составе лактофлоры составила от 17% до 52%, L.iners – 27 48%, L.gasseri – 3 - 30%, L.jensenii – 0 - 16%, других видов – до 5%. Доля «биотехнологических» видов в составе лактофлоры в подавляющем большинстве случаев была незначительной, и только в 1 случае при вагините доминировали L.acidophilus. Необходимо отметить, что в группе сравнения лактобактерии были доминирующим видом, составляющим основную часть бактериальной массы (не менее 80%). В то время как при вагинитах и БВ количество лактобактерий по отношению к общей бактериальной массе было сниженным (менее 80%) или лактобактерии отсутствовали, а количество УПМ превышало 20%. Поэтому учитывали долю отдельных видов лактобактерий в составе лактофлоры. Преобладание L.crispatus в составе лактофлоры ассоциировано с нормальным состоянием микробиоты влагалища. Преобладание L.crispatus составило 50% и было статистически более значимым в группе сравнения, чем в группе женщин с вагинитами – 17% (OR= 0,2 (0,12-0,34), p=2,5x10-9) и бактериальным вагинозом – 17% (OR=0,21 (0,09-0,5), p=1,3x10-4). Напротив, доля образцов с преобладанием L.iners в составе лактофлоры была выше при дисбиотических процессах и составила 48% при вагинитах (OR=4,4 (1,9-9,9), p=2,2x10-4), 38% при кандидоносительстве (OR=2,9 (1-8,5), p=0,046), 48% при условном нормоценозе (OR=5 (1,5-13,1), p=6,2x10-3) и 27% - в группе сравнения. Аналогичная тенденция была получена и для группы женщин с бактериальным вагинозом (р=0,09). Кроме того, с неблагоприятным состоянием микробиоты, вероятно, ассоциировано и преобладание в составе лактофлоры L.gasseri. В группе 122 женщин с БВ достоверно чаще отмечено наличие L.gasseri, как основного вида в составе нормофлоры – 30% (OR=5,4 (2,1-13,6), p=1,3x10-4), чем в группе сравнения (8%). Аналогичная тенденция получена и для группы с вагинитом (р=0,08). При вагинитах и БВ выявлены образцы без лактобактерий. Их доля составила 4% при вагинитах и 9% при БВ. Таким образом, несмотря на то, что L.iners в норме присутствует в составе микробиоты влагалища достаточно часто, ее протективное значение остается спорным. Обнаружено, что с неблагоприятным состоянием микробиоты, вероятно, ассоциировано и преобладание в составе нормофлоры L.gasseri. Транскрипционные профили генов иммунного ответа в 3.2.1.4 соскобах отделяемого слизистой влагалища В то время как для идентификации возбудителей помимо микробиологического исследования используются и другие альтернативные методы, включая ПЦР, микроскопия мазка остается единственно доступным методом оценки локальной воспалительной реакции. Обнаружение во влагалищных мазках более 10 лейкоцитов в поле зрения микроскопа (более 20 у беременных женщин) является признаком воспаления. Известно, что персистирование патогенных и условно-патогенных микроорганизмов на слизистой влагалища приводит к стимуляции клеток иммунной системы и эпителия, что проявляется в изменении профиля цитокинов, экспрессируемых клетками. Вероятно, что данные маркеры могут быть использованы для оценки локальной воспалительной реакции во влагалище. С целью наиболее оптимальных маркеров был исследован широкий спектр транскриптов генов иммунного ответа (30 маркеров). 3.2.1.5 Характеристика уровней представленности транскриптов генов иммунного ответа в соскобах отделяемого слизистой влагалища Абсолютный уровень экспрессии мРНК генов иммунного ответа в соскобах был различным, что обусловило необходимость определения 123 среднестатистического транскрипционного профиля. По количеству копий мРНК в биологическом материале все гены можно было условно разделить на 3 группы (рис.22): гены с высоким уровнем экспрессии и концентрацией транскрипта от 107 до 105 копий мРНК/мл (IL8, IL1B, IL18, TGFB1, CD68, GATA3); гены со средним уровнем экспрессии и концентрацией транскрипта от 105 до 103 копий мРНК/мл (TNF, CD45, IL12A, IL23, TLR2, TLR4, CD69, IL10, RORC) и гены с низким уровнем экспрессии - менее 103 копий мРНК/мл (IL15, Foxp3, LIF, TLR9, GNLY, TBX21, IFNG, IL6, IL2Ra). Следует отметить, что экспрессия последней группы генов довольно часто не детектировалась в клетках соскобов слизистой влагалища, либо из двух повторов 7,0 6,0 5,0 высокий средний 4,0 низкий 3,0 2,0 1,0 IL1B IL8 TGFB1 CD68 IL18 GATA3 CD45 TNFA TLR2 TLR4 IL23 IL12A CD69 IL10 RORC IL15 LIF IL6 GNLY TLR9 FOXP3 IFNG IL2RA TBX21 B2M GUSB TBP Концентрация мРНК, lg коп/мл положительным был только один. Рисунок 22. Уровень представленности транскриптов генов иммунного ответа в клетках вагинальных соскобов. Отмечены медианы и межквартильный размах. С целью выяснения нижних границ линейного диапазона тест-систем были раститрованы образцы кДНК. Например, результаты по референсному гену B2M приведены на рисунке 23. Зависимость порогового цикла от концентрации матрицы была линейной в диапазоне 102,7-106,3 копий/мл, ошибка повторных исследований не превышала 0,2 цикла. Данные по другим тест-системам аналогичны (102,6-103 копий/мл - нижние границы линейного диапазона). 124 В качестве потенциальных маркеров воспаления было целесообразно использование генов с высоким и средним уровнем экспрессии (с концентрацией матрицы более 103 копий мРНК/мл), экспрессия которых находится в пределах линейного диапазона тест-систем. Маркеры с низким уровнем экспрессии были проанализированы как качественные показатели по частоте выявления в группах. Они были исключены из дальнейшего рассмотрения в качестве маркеров локального воспаления. 45 40 y = -3,46x + 45,3 R² = 0,9998 Ср 35 30 25 20 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 lg (No) копий/мл 6,0 7,0 экспериментальные данные область линейногодиапазона Рисунок 23. Определение области нижних границ линейного диапазона тест-системы для гена В2М. 3.2.1.6 Зависимость транскрипционных профилей от стадии менструального цикла Учитывая цикличность менструального цикла и чувствительность органов женской репродуктивной системы к влиянию стероидных гормонов, была исследована зависимость транскрипционного профиля генов иммунной системы в клетках вагинальных соскобов от стадии цикла в группе сравнения (рис.24). Экпрессия мРНК TGFB1 была выше в 2 раза в секреторную фазу цикла по сравнению с пролиферативной фазой (р=0,045). Использование данного маркера не желательно для оценки воспалительной реакции. Достоверных различий по другим маркерам не выявлено. 125 Относительный уровень экспрессии мРНК 4 3 2 1 0 ст.пролиферации (n=21) cт.секреции (n=32) Рисунок 24. Экспрессионный профиль мРНК генов иммунной системы в клетках соскобов слизистой влагалища в зависимости от фазы цикла. Данные представлены в виде медианы и межквартильного размаха. Значение Ме в группе ст. пролиферации принято за 1. 3.2.1.7 Сравнение транскрипционных профилей генов иммунной системы в клетках вагинальных соскобов у беременных и небеременных женщин При сравнении транскрипционных профилей в клетках вагинальных соскобов у беременных и небеременных женщин (группы сравнения) было установлено, что у беременных женщин снижена экспрессия мРНК TLR2, TLR4, IL1B, CD45, TNF, CD45 и повышена – IL12A, CD69, IL10 и TGFB1 Относительный уровень экспрессии мРНК. (р<0,05) (рис.25, табл.17). 20 2 0,2 0,02 небеременные (n=95) беременные (n=50) Рисунок 25. Сравнение транскрипционного профиля в клетках соскобов слизистой влагалища у беременных и небеременных женщин (группы сравнения). Данные представлены в виде медианы и межквартильного размаха. Значение Ме в группе небеременных женщин принято за 1. 126 Таблица 17. Транскрипционные профили генов иммунного ответа во влагалищных мазках у беременных и небеременных женщин. Ген Небеременные женщины n=95 Ме (L-H) IL8 Беременные женщины (n=50) Уровень экспрессии Ме (L-H) р - уровень значимости 1 (0,28-1,98) 0,57 (0,24-1,18) 0,062 TLR2* 1 (0,54-3,06) 0,55 (0,26-1,26) 0,040 TLR4* 1 (0,37-1,81) 0,48 (0,18-1,10) 0,027 IL1B* 1 (0,49-1,75) 0,45 (0,26-1,10) 0,005 CD45* 1 (0,44-1,74) 0,34 (0,19-0,71) 8,5 х 10-5 TNFA* 1 (0,63-2,06) 0,43 (0,25-0,80) 1,2 х 10-6 IL18* 1 (0,59-1,69) 0,50 (0,30-0,71) 2,0 х 10-9 IL23 1 (0,53-2,08) 0,68 (0,39-2,40) 0,543 GATA3 1 (0,68-1,41) 0,80 (0,52-1,30) 0,078 CD68 1 (0,46-1,42) 1,02 (0,68-1,53) 0,177 IL12a* 1 (0,73-1,87) 1,48 (1,11-2,24) 0,018 CD69* 1 (0,54-2,67) 2,79 (0,94-5,31) 0,003 IL10* 1 (0,41-2,30) 2,46 (1,25-5,04) 6,4 х 10-5 TGFB1* 1 (0,53-1,75) 7,42 (4,07-18,49) 1,6 х 10-17 3.2.1.8 Особенности экспрессии мРНК генов иммунной системы в клетках вагинальных соскобов в норме, при вагините и БВ В ходе работы были исследованы транскрипционные профили генов иммунного ответа в клетках соскобов слизистой влагалища у женщин в норме, при вагинитах и БВ. Поскольку уровень экспрессии исследуемых мРНК различался в группах сравнения беременных и небеременных женщин, то каждая из исследуемых групп была отнормирована на свою группу сравнения. 127 Уровень мРНК генов IL8, TLR2, TLR4, IL1B, IL10, CD69, CD45, TNF при вагинитах был существенно выше, а IL18, GATA3, CD68, IL12A, RORC, TGFB1, чем в группе сравнения (табл.18, табл.19, рис.26, рис.27). Изменений в уровне экспрессии мРНК гена IL23 не выявлено. Полученные данные для небеременных (табл.18, рис.26) и беременных женщин (табл.19, рис.27.) были аналогичными. Похожие изменения в профиле экспрессии генов, но менее выраженные, были и в группе женщин с БВ, за исключением TNF и RORC. Таблица 18. Транскрипционный профиль генов иммунного ответа в соскобах отделяемого слизистой влагалища небеременных женщин при вагинитах и БВ. Вагинит (n=215) БВ (n=55) Ген Группа сравнения n=95 Ме (L-H) Уровень экспрессии Ме (L-H) р - уровень значимости Уровень экспрессии Ме (L-H) р - уровень значимости IL8 1 (0,28-2,05) 5,66 (2,56-11,7) 1,3 x 10-20 3,27 (0,84-7,78) 4,2 x 10-5 TLR2 1 (0,53-3,61) 4,39 (2,63-7,13) 6,9 x 10-9 3,12 (0,74-7,80) 0,054 TLR4 1 (0,37-1,82) 4,09 (2,36-6,39) 1,3 x 10-7 1,46 (0,59-3,59) 0,014 -17 2,51 (0,80-6,03) 2,5 x 10-4 IL1B 1 (0,48-1,87) 3,91 (1,89-7,21) 3,4 x 10 IL10 1 (0,41-2,30) 3,86 (2,01-7,82) 1,3 x 10-13 2,10 (0,88-4,90) 2,0 x 10-9 CD69 1 (0,54-2,93) 3,40 (1,79-6,61) 7,3 x 10-11 1,52 (0,47-3,78) 1,8 x 10-13 CD45 1 (0,43-1,74) 2,86 (1,59-4,59) 2,2 x 10-13 1,70 (0,80-2,92) 0,035 TNF 1 (0,60-2,07) 1,52 (0,68-2,96) 0,014 1,18 (0,51-1,97) 0,73 IL23 1 (0,51-2,24) 0,91 (0,39-2,81) 1,0 0,51 (0,18-4,53) 0,45 TGFB1 1 (0,51-1,82) 0,45 (0,27-0,77) 1,5 x 10-10 0,70 (0,35-1,31) 0,053 -40 0,66 (0,14-1,24) 2,3 x 10-15 IL12A 1 (0,72-1,89) 0,25 (0,07-0,57) 4,1 x 10 RORC 1 (0,45-1,91) 0,24 (0,13-0,51) 0,041 0,58 (0,21-1,10) 0,93 -21 CD68 1 (0,46-1,43) 0,23 (0,13-0,42) 8,2 x 10 0,52 (0,17-0,92) 7,4 x 10-4 GATA3 1 (0,68-1,41) 0,11 (0,03-0,20) 1,3 x 10-33 0,22 (0,09-0,88) 1,2 x 10-7 IL18 1 (0,58-1,70) 0,10 (0,03-0,20) 6,0 x 10-32 0,24 (0,08-0,68) 1,7 x 10-9 128 Относительный уровень экспрессии мРНК 10 1 0,1 вагинит (n=215) бактериальный вагиноз (n=55) Рисунок 26. Относительный уровень транскриптов генов иммунного ответа при вагинитах и БВ у небеременных женщин. Показаны медианы. Медиана в группе сравнения Me=1, на графике не отражена. Таблица 19. Транскрипционный профиль генов иммунного ответа в клетках соскобов отделяемого слизистой влагалища беременных женщин при вагинитах. Вагинит (n=24) Ген Группа сравнения n=50 Ме (L-H) Уровень экспрессии Ме (L-H) р - уровень значимости IL8 1 (0,43-2,06) 6,22 (2,82-12,33) 9,5 x 10-8 TLR2 1 (0,47-2,27) 8,19 (5,11-12,81) 2,0 x 10-8 TLR4 1 (0,38-2,30) 7,14 (4,82-12,52) 1,7 x 10-6 IL1B 1 (0,57-2,46) 9,24 (6,50-11,69) 1,3 x 10-3 IL10 1 (0,51-2,05) 3,80 (3,04-7,27) 0,011 CD69 1 (0,34-1,91) 2,99 (1,20-8,24) 0,017 CD45 1 (0,56-2,11) 5,69 (4,18-9,46) 1,4 x 10-7 TNF 1 (0,59-1,85) 2,39 (1,52-4,11) 2,6 x 10-4 IL23 1 (0,58-3,55) 2,16 (0,72-8,59) 0,092 TGFB1 1 (0,55-2,49) 0,39 (0,21-0,80) 1,8 x 10-4 IL12A 1 (0,75-1,52) 0,49 (0,28-0,92) 0,018 RORC 1 (0,62-2,96) 0,21 (0,08-0,66) 6,3 x 10-6 CD68 1 (0,66-1,50) 0,34 (0,21-0,52) 1,0 x 10-7 GATA3 1 (0,66-1,63) 0,22 (0,13-0,33) 3,9 x 10-9 IL18 1 (0,61-1,43) 0,18 (0,13-0,42) 8,3 x 10-9 129 Относительный уровень экспрессии мРНК 10,0 1,0 0,1 вагинит (n=24) Рисунок 27. Относительный уровень транскриптов генов иммунного ответа при вагинитах у беременных женщин. Показаны медианы. Медиана в группе сравнения Me=1, на графике не отражена. Частота получения положительных результатов для генов, экспрессирующихся в низких концентрациях, оценивалась как качественный показатель и была достоверно выше при вагинитах (рис.28) для мРНК генов IL6 (OR=9,4 (4,2-21,2), p=5,9x10-9), IFNG (OR=2,4 (1,1-5,3), p=0,027), IL2Ra (OR=7,7 (2,5-23,8), p=1,1x10-4), TBX21(OR=17,1 (6,4-45,6), p=5,0x10-11), GNLY (OR=4,4 (1,9-10,2), p=2,4x10-4). Частота выявления % 100 80 60 40 20 0 IL6* IFNG* TLR9 IL2Ra* Foxp3 TBX21* IL15 группа сравнения GNLY* LIF вагинит Рисунок 28. Частота выявления положительных результатов для генов, экспрессирующихся в низкой концентрации. 130 3.2.1.9 Корреляция Lactobacilus iners с уровенем экспрессии генов Учитывая заболеваниями ассоциацию Lactobacilus влагалища, была iners c воспалительными проанализирована зависимость транскрипционного профиля от типа лактобактерий. При анализе данных было установлено, что в образцах группы сравнения с доминированием L.iners достоверно повышены уровни экспрессии мРНК генов IL8 в 1,7 (p=0,026), TLR4 в 2 (p=0,033), IL10 в 3,8 (p=0,01), CD69 в 2,5 (p=0,005), CD45 в 1,7 (p=0,049) раза и снижен IL18 в 1,7 (p=0,005), чем в образцах с Относительный уровень экспрессии мРНК доминированием L.crispatus (рис.29). 10 1 0,1 IL1B IL8* IL10* CD69* CD45* TLR4* IL12A CD68 TGFB1 IL18* GATA3 0,01 группа сравнения доминирует L.iners бактериальный вагиноз вагинит Рисунок 29. Транскрипционный профиль генов иммунной системы в зависимости от типа лактобактерий. Представлены медианы значений в группах. Значение Ме в группе сравнения с доминирование L.crispatus принято за 1. При доминировании в составе лактофлоры L.gasseri (n=5) в группе сравнения были достоверно повышены уровни экспрессии мРНК генов IL1В в 1,5 раза (р=0,046), TLR4 в 2,6 раза (р=0,023), CD45 в 2,7 раза (р=0,023), чем в образцах с доминированием L.crispatus. Изменения в транскрипционном профиле генов, ассоциированные с L.iners, аналогичны изменениям, характерным для вагинитов и БВ, хотя и существенно менее выраженные. Полученные данные согласуются с лучшей 131 протективной функцией L.crispatus, а преобладание в составе нормофлоры L.iners ассоциировано с легким провоспалительным фоном. Полное описание транскрипционного профиля генов иммунного ответа в образцах группы сравнения с доминированием L.iners представлено в таблице 20. Таблица 20. Транскрипционный профиль генов иммунного ответа во влагалищных мазках группы сравнения небеременных женщин доминированием L.iners и L.crispatus. Ген Доминирует L.crispatus n=32 Ме (L-H) Доминирует L.iners (n=26) Уровень экспрессии Ме (L-H) р - уровень значимости IL1B 1 (0,52-1,49) 1,63 (0,82-3,45) 0,056 IL8* 1 (0,42-1,32) 1,74 (0,86-4,15) 0,029 IL10* 1 (0,59-1,86) 3,83 (1,46-6,58) 0,010 CD69* 1 (0,39-1,70) 2,53 (1,15-6,40) 0,005 CD45* 1 (0,55-1,46) 1,70 (0,65-3,88) 0,049 TLR4* 1 (0,52-1,54) 1,98 (0,60-4,79) 0,033 IL12А 1 (0,72-1,51) 1,07 (0,49-1,95) 0,737 CD68 1 (0,66-1,47) 0,90 (0,49-1,07) 0,135 TGFB1 1 (0,44-1,58) 0,65 (0,51-0,98) 0,096 IL18* 1 (0,69-1,50) 0,58 (0,33-1,11) 0,005 GATA3 1 (0,73-1,18) 0,71 (0,45-1,21) 0,161 TNF 1 (0,69-1,79) 1,16 (0,42-2,32) 0,701 *p < 0,05 132 с 3.2.1.10 Разработка способа оценки локальной воспалительной реакции Для практичекого использования экспрессионного профиля генов с целью диагностики локальной воспалительной реакции был выполнен регрессионный анализ (метод бинарной логистической регрессии). Поскольку в группе беременных женщин были выявлены те же самые закономерности изменения транскрипционного профиля при вагинитах, что и у небеременных женщин, была построена общая регрессионная модель для беременных и небеременных женщин. Анализ проводился в два этапа. На первом этапе случайным образом были отобраны две группы пациенток (обучающая выборка): 43 небеременных и 50 беременных женщин группы сравнения (n=93) и 115 небеременных и 24 беременных пациенток группы с вагинитами (n=139). На втором этапе была исследована проверочная выборка: 52 пациентки группы сравнения и 100 женщин из группы с вагинитами. Уравнение линейной функции, подобранное с помощью метода регрессионного анализа включало два индекса соотношения экспрессии мРНК 4 генов иммунного ответа и имело вид: z=1,4*ln([TLR4]/[GATA3])+1,3*ln([TNF]/[IL18])+7,8 (формула 15) где [TLR4]/[GATA3], [TNF]/[IL18] – индексы соотношения уровней экспрессии соответствующих генов. Оптимальное значение величины порога отсечения (точки cut off) было определено с помощью ROC-анализа. ROC-анализ для беременных и небеременных женщин был выполнен раздельно. Для небеременных женщин площадь под ROC-кривой составила AUC=0,989±0,007 (p=3,4х10-21) (рис.30). Пороговое значение вероятности воспаления составило 57% (Р=57%). Значения показателей Р выше 57% классифицировали, как маркер вагинитов для небеременных женщин. 133 Рисунок 30. ROC-кривая для дискриминации воспалительного процесса в образцах из влагалища для небеременных (слева) и беременных (справа) женщин. Для беременных женщин площадь под ROC-кривой составила AUC=0,985±0,015 (p=1,9х10-11) (рис.30). Пороговое значение вероятности воспаления - 68% (Р=68%). Значения показателей Р выше 68% классифицировали как маркер вагинитов для беременных женщин. Чувствительность и специфичность предложенного метода оценки локальной воспалительной реакции в области порогового значения составила 95,7% (133 из 139) и 96,8% (90 из 93) соответственно для обучающей выборки. Прогностическая ценность положительного результата (positive predictive value PPV) и прогностическая ценность отрицательного результата (negative predictive value NPV) составили PPV=97,8% и NPV=93,8%. Чувствительность и специфичность предложенного метода оценки локальной воспалительной реакции в области порогового значения для проверочной выборки составила 94% (94 из 100) и 90,4 (47 из 52) соответственно, PPV=94,9%, NPV=88,7%. 134 Результаты оценки наличия локальной воспалительной реакции во всех исследованных образцах представлены в таблице 21 и на рисунках 31 и 32. Таблица 21. Классификация мазков по наличию воспаления в группах женщин с дисбиозами и в норме Группа 1А. Группа сравнения (n=145) 1В. нормоценоз, Ureaplasma spp. более 104 ГЭ/мл (n=35) 1С. Кандидоносительство (n=38) 2.Вагинит (n=239) 3.БВ (n=55) Наличие воспаления нет воспаление 137 8 94,5% 21 14 40% 36 2 94,7% 228 11 95,4% 29 26 47,3% Согласно полученным данным и в соответствии с предложенной моделью бактериальный вагиноз в половине случаев (47,3%) и условный нормоценоз с Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл в 40% случаев сопровождается воспалительным процессом. В тоже время при Вероятность наличия воспалительной реакции, % кандидоносительстве большая часть образцов (94,7%) определены как норма. группа сравнения (n=95) 100 90 нормоценоз, Ureaplasma spp > 4lg/мл (n=19) 80 70 кандидоносительство (n=27) 60 50 вагинит (n=215) 40 30 БВ (n=55) 20 10 линия cut off 0 Рисунок 31. Вероятность наличия локальной воспалительной реакции в группах небеременных женщин 135 Вероятность наличия воспалительной реакции, % 100 группа сравнения (n=50) 90 80 нормоценоз, Ureaplasma spp > 4lg/мл (n=16) 70 60 кандидоносительство (n=11) 50 40 вагинит (n=24) 30 20 линия сut off 10 0 Рисунок 32. Вероятность наличия локальной воспалительной реакции в группах беременных женщин . Преимущества использования индексов и интегральной 3.2.1.11 оценки локального воспаления Оригинальность использовании и индексов новизна данного соотношения исследования, уровня экспрессии состоит в отдельных маркеров и метода бинарной логистической регрессии для дискриминации образцов женщин с воспалительными заболеваниями органов женской репродуктивной системы. В качестве примера, демонстрирующего преимущества использования этих методических приемов далее приведены данные по диагностической чувствительности и специфичности отдельных показателей (индивидуальных уровней экспрессии, индексов и многофакторного критерия оценки наличия локальной воспалительной реакции) во влагалищных соскобах. Данные представлены в графической форме для небеременных (рис.33, рис.35) и беременных женщин (рис.34, рис.35). 136 1,E+02 Соотношение уровней экспрессии Относительный уровень экспрессии мРНК 1,E+02 1,E+01 1,E+00 1,E-01 1,E-02 1,E-03 1,E-04 TLR4 GATA3 TNF группа сравнения 1,E+01 1,E+00 1,E-01 1,E-02 1,E-03 1,E-04 1,E-05 IL18 TLR4/GATA3 вагинит группа сравнения TNF/IL18 вагинит Рисунок 33. Индивидуальные показатели уровней экспрессии и индексов в обучающей выборке образцов небеременных женщин. Точки cut off рассчитывались для каждого индивидуального показателя, индексов соотношения экспрессии мРНК генов и вероятности наличия локальной воспалительной реакции с помощью ROC-анализа с условием обеспечения наибольшей суммарной чувствительности и 1,E+02 1,E+01 1,E+01 1,E+00 Соотношение уровней экспрессии Относительный уровень экспрессии мРНК специфичности метода (табл.22). 1,E+00 1,E-01 1,E-02 1,E-03 TLR4 GATA3 TNF группа сравнения 1,E-01 1,E-02 1,E-03 1,E-04 IL18 TLR4/GATA3 вагинит группа сравнения TNF/IL18 вагинит Рисунок 34. Индивидуальные показатели уровней экспрессии и индексов в обучающей выборке образцов беременных женщин. 137 Таблица 22. Преимущества использования индексов соотношения уровня экспрессии генов и интегрального критерия оценки транскрипционных профилей. Показатель Чувствительность Специфичность Значение cut off Образцы небеременных женщин TLR4 85,2% 86% 2,5 GATA3 95,3% 92,2% 0,3 TNF 53% 74,4% 1,5 IL18 88,4% 94,8% 0,5 TLR4/GATA3 95,7% 95,3% 0,06 TNF/IL18 94,8% 90,7% 0,04 Вероятность ЛВ, % 94,8% 97,7% 57 Образцы беременных женщин TLR4 91,7% 84% 3,4 GATA3 74% 95,8% 0,7 TNF 79,2 66% 1,5 IL18 72% 95,8% 0,7 TLR4/GATA3 95,8% 92% 0,08 TNF/IL18 91,7% 86% 0,06 Вероятность ЛВ, % 100% 96% 68 Вероятность локальной воспалительной реакции, % 100 90 80 70 60 группа сравнения 50 вагинит 40 cut-off 30 20 10 0 небеременные Рисунок 35. Индивидуальные беременные показатели воспалительной реакции в обучающей выборке. 138 вероятности локальной 3.2.1.12 Сравнение предложенного способа оценки локальной воспалительной реакции с клиническими данными Традиционно в рутинной диагностике вагинитов используют комбинацию признаков: анализ жалоб и результатов осмотра пациентки, а также микроскопическое проведено сравнение исследование результатов влагалищных мазков. предварительного Было клинического заключения с результатами микроскопии мазков и ОТ-ПЦР исследования на транскрипционный профиль генов иммунного ответа. При первичном клиническом осмотре наличие воспаления оценивалось врачом акушеромгинекологом как: 1 – отсутствие воспаления, 2 – незначительное воспаление, 3 – умеренное воспаление, 4 – выраженное воспаление. При анализе мазков, окрашенных по Граму, учитывалось количество лейкоцитов в поле зрения (до 10 – норма, анализ выполнен для небеременных женщин), особенности эпителия и состав микрофлоры. Данные сравнительного анализа результатов предварительного заключения с результатами микроскопии мазков (рис.36) и ОТ-ПЦР на маркеры локальной Результаты микроскопии мазков воспалительной реакции (рис.37) представлены на диаграммах. 100% 23% 80% 60% 51% 71% 40% 20% 14% 77% 86% 49% 29% лейкоциты ≤ 10 в поле зрения лейкоциты > 10 в поле зрения 0% 1 2 3 4 визуальная оценка воспалительной реакции Рисунок 36. Сравнение микроскопии мазков с результатами клинического осмотра. При первичном клиническом осмотре наличие воспаления оценивали по 4-бальной шкале, где 1 – отсутствие воспаления, 2 – незначительное воспаление, 3 – умеренное воспаление, 4 – выраженное воспаление. 139 Результаты ОТ-ПЦР 100% 14% 85% 86% 34% 80% 60% 15% 75% 40% Р≤57 Р>57 66% 20% 25% 0% 1 2 3 4 визуальная оценка воспалительной реакции Рисунок 37. Сравнение результатов ОТ-ПЦР с результатами клинического осмотра. При первичном клиническом осмотре наличие воспаления оценивали как 1 – отсутствие воспаления, 2 – незначительное воспаление, 3 – умеренное воспаление, 4 – выраженное воспаление. Р - вероятность локальной воспалительной реакции. При предварительном заключении врача об отсутствии воспаления, тем не менее примерно в 25% случаев отмечена локальная воспалительная реакция по результатам микроскопии мазков и ОТ-ПЦР, что свидетельствует о субъективности клинической оценки и наличии субклиничеких форм заболевания без ярко выраженной симптоматики. При наличии незначительной и умеренной воспалительной реакции ОТ-ПЦР оказался более чувствительным методом, чем лейкоцитарная реакция. При выраженных формах воспаления результаты ОТ-ПЦР и микроскопии мазков были идентичны. Не во всех случаях клинически предварительно диагностированного вагинита, заболевание подтверждено лабораторными методами исследования. Помимо ошибок лабораторных методов исследования, вероятно, это связано и с субъективной оценкой состояния слизистой влагалища, что также вносит определенный вклад в погрешность диагностики воспалительных заболеваний. Результаты количественной оценки лабораторных показателей в зависимости от предварительного заключения по наличию воспаления 140 представлены на рис.38 и в табл.23. В группу 1 (отсутствие воспаления) тем не менее попали женщины с вагинитами согласно результатам лабораторных методов исследования. Самой сложной для интерпретации результатов была группа 2 (незначительное воспаление), в которую попали женщины, как без воспаления, так и ярко выраженной воспалительной реакцией по результатам лабораторных методов исследования. Таким образом, заключение по результатам только подтверждения клинического предварительного осмотра диагноза требует уточнения лабораторными и методами 100 80 70 80 60 50 60 40 40 30 20 20 10 0 Количество лейкоцитов Вероятность локальной воспалительной реакции, % исследования. 0 1 2 3 4 шкала клинической картины воспаления вероятность локальной воспалительной реакции лейкоциты Рисунок 38. Сравнение предложенного способа оценки локального воспаления по уровню экспрессии мРНК генов иммунной системы с традиционными клиническим и микроскопическим методами. Клиническая оценка воспаления: 1 – отсутствие воспаления, 2 – незначительное воспаление, 3 – умеренное воспаление, 4 – выраженное воспаление. Данные представлены в виде медианы и межквартильного размаха. 141 Таблица 23. Сравнение разных методов оценки локальной воспалительной реакции Клиническая оценка воспалительной реакции при первичном осмотре 1 – отсутствие воспаления 2 – незначительное воспаление 3 – умеренное воспаление 4 – выраженное воспаление Число лейкоцитов Me (L-H) 7 (3-13) 15 (4-25) Вероятность воспаления, % Me (L-H) 18 (1-68) 95 (7-100) 20 (13-30) 33 (17-63) 99 (87-100) 98 (91-100) Для определения диагностических характеристик разных методов (заключение первичного клинического осмотра, микроскопии мазков и ОТПЦР на маркеры ЛВР) был использован комплексный подход диагностики воспалительных заболеваний, учитывающий результаты клинического осмотра, жалобы пациентки, результаты микроскопии мазков и наличия возбудителей заболевания, выявленных культуральным методом исследования и путем количественной оценки микроорганизмов методом ПЦР. Результаты по чувствительности и специфичности использованных методов оценки ЛВР представлены в табл. 24. ОТ-ПЦР не уступает по данным показателям микроскопии мазков и клиническому методу исследования. Таблица 24. Сравнение чувствительности и специфичности различных способов оценки ЛВР. Метод Первичный клинический осмотр Микроскопия мазков ОТ-ПЦР Чувствительность 126 из 143 88,1% Специфичность 79 из 98 80,6% PPV 126 из 145 86,9% NPV 79 из 96 82,3% 123 из 143 86% 135 из 143 94,4% 89 из 98 90,8% 95 из 98 96,9% 123 из 132 93,2% 135 из 138 97,8% 89 из 109 81,7 95 из 103 92,2% Полученные результаты согласуются с данными литературы о невысокой чувствительности и специфичности способов оценки ЛВ на основании результатов клинического осмотра и микроскопии мазков. 142 В сочетании эти тести имеют чувствительность и специфичность 81 и 70% соответственно при БВ, 84 и 85% при ВВК по сравнению с ДНК-тестами определения микроорганизмов [194]. 3.2.1.13 Сравнение предложенного способа оценки локальной воспалительной реакции с методом подсчета числа лейкоцитов в мазке По результатам исследования коэффициент корреляции по Спирмену результатов микроскопии мазков и предлагаемого способа оценки локальной Вероятность локальной воспалительной реакции,% воспалительной реакции составил rS=0,61 (p = 1,6x10-28) (рис.39). 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 10 20 30 40 50 число лейкоцитов группа сравнения 60 70 80 вагиниты Рисунок 39. Корреляция предложенного способа оценки локальной воспалительной реакции с микроскопическим методом подсчета числа лейкоцитов. Сравнение результатов микроскопии мазков и локальной воспалительной реакии в группе сравнения и при вагинитах представлены в таблице 25. По положительным образцам совпали 82,3%, по отрицательным – 84,2%. Доля ложноотрицательных результатов, полученных методом ОТПЦР, составила 5,6%, а по результатам микроскопии мазков она была выше и составила 12,1%. Доля ложноположительных результатов, полученных 143 методом ОТ-ПЦР, составила 6,3%, по результатам микроскопии мазков 9,5%. Таким образом, предлагаемый способ оценки локальной воспалительной реакции на основе метода ОТ-ПЦР в режиме реального времени по транскрипционному профилю генов иммунного ответа обеспечивает лучшую чувствительность и специфичность диагностики. Таблица 25. Результаты микроскопии мазков и ОТ-ПЦР Лейкоциты L L≤10 норма L>10 воспаление Вагиниты Группа сравнения Вероятность воспаления, Р % P≤57 норма 0 P>57 воспаление 26 (12,1%) P≤57 норма 80 (84,2%) 6 (6,3%) 12 (5,6%) 177 (82,3%) 9 (9,5%) 0 P>57 3.2.2 Осложнения родов и послеродового периода у пациенток с вагинитами и Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл Использование предлагаемого способа оценки локальной воспалительной реакции представляет интерес и для прогнозирования и предупреждения акушерских осложнений. Анализ родоразрешения показал, что в 1-ой группе роды через естественные родовые пути проходили у 44 (57,1%) беременных: 28 (56%) – подгруппа 1А, 13 (81,3) - подгруппа 1В; 3 (27,3%) – подгруппа 1С. Во 2-ой группе через естественные родовые пути родоразрешены 16 (66,7%) женщин. Остальным беременным произведено кесарево сечение в нижнем маточном сегменте поперечным разрезом. Структура методов родоразрешения не различалась между группами 1 и 2. Наиболее значимые осложнения родов и послеродового периода у обследованных беременных представлены в таблице 26. Осложнения родов и послеродового периода достоверно чаще отмечены в группе беременных с признаками воспаления слизистой (OR=3,7 (1,3–10,5), p=0,01,) и подгруппе 1В с Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл (OR=4,1 (1,2– 13,3), p=0,016,) по сравнению с подгруппой 1А. Таким образом, наличие 144 вагинита и Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл может рассматриваться как фактор риска осложнений родов и послеродового периода. Таблица 26. Осложнения родов и послеродового периода Осложнения Подгруппа 1А (n=50) Кол. % 8 16 Группа 1 Подгруппа 1В (n=16) Кол. % 5 31,3 Преждевременное излитие околоплодных вод Разрывы мягких тканей 3 6 3 18,8 родовых путей Послеродовые осложнения 3 6 3 18,8 Всего Из них: Субинволюция матки, 3 6 2 12,5 раневая инфекция Послеродовой эндометрит 1 6,3 Всего женщин с 12 24 9 56,3 (р=0,016) осложнениями * – достоверные различия по сравнению с подгруппой 1А Подгруппа 1С (n=11) Кол. % 0 0 0 0 Группа 2 (n=24) Кол. 7 7 % 29,2 29,2* (р=0,006) 0 0 6 25,0* (р=0,019) 0 0 4 16,7 0 0 0 0 2 13 8,3 54,2* (р=0,01) У женщин с бессимптомным носительством грибов не было ни одного случая осложнений родов и послеродового периода. В то время как у женщин с кандидозным вагинитом осложнения родов и послеродового периода отмечались у 7 из 9 (77,8%) пациенток (OR=73,5 (2,9-1882), p=7,6х10-4). Таким образом, Candida spp. может рассматриваться как фактор риска осложнений родов и послеродового периода только при наличии локальной воспалительной реакции. Как видно из данных, представленных в таблице 26, наиболее часто встречающимся осложнением родового акта явилось преждевременное излитие околоплодных вод с тенденцией к повышению в подгруппе 1В и группе 2 (р=0,18). Разрыва мягких тканей родовых путей достоверно чаще наблюдались во 2-ой группе - у 7 (29,2%) по сравнению с 3 (6%) в 1А подгруппе (OR=6,5 (1,5-27,8), p=0,006). При анализе подгрупп наблюдалась тенденция к 145 повышению частоты разрывов мягких тканей родовых путей у женщин подгруппе 1В (р=0,12). Общее количество осложнений послеродового периода в группе с признаками воспаления слизистой было статистически значимо более высоким и составило 6 (25,0%) случаев по сравнению с беременными подгруппы 1А, где осложнения пуэрперия наблюдались у 3 (6%) женщин (OR=5,2 (1,2-23), р=0,019). Отмечена тенденция к повышению послеродовых осложнений при наличии Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл (р=0,12). 3.2.3 Определение ассоциаций полимофизмов генов цитокинов с предрасположенностью к развитию вагинитов Вышеизложенные данные свидетельствуют о влиянии УПМ на экспрессию медиаторов локального иммунитета - цитокинов. Вместе с тем известно, что уровень экспрессии генов зависит не только от влияния персистирующих микроорганизмов, но также определяется генетическими особенностями организма хозяина. В связи с этим были выполнены исследования ассоциации полиморфизмов генов иммунного ответа с предрасположенностью к развитию воспалительных заболеваний нижних отделов половых путей женщин. Распределение частот генотипов для всех полиморфизмов в группе сравнения соответствовало закону Харди-Вайнберга. Результаты исследования распределения частот генотипов полиморфизмов в группе сравнения и значение критерия χ-квадрат в соответствии с ожидаемыми частотами генотипов равновесного распределения приведены в таблице 27. 146 Таблица 27. Частоты полиморфизмов генов иммунной системы в группе сравнения (n=60). ген IL1A IL1B IL1B IL1B IL1R1 IL1RN IL6 IL8 CCL2 IL10 IL10 IL10 IL12B IL18 IL18 IL18 TNF TNF TGFB1 TGFB1 IFNG TLR4 TLR2 Позиция в rs-номер гене -889 rs1800587 +3953 rs1143634 -511 rs16944 -31 rs1143627 Pst11970 rs2234650 11100 rs315952 -174 rs1800795 -251 rs4073 +2493, -2578 rs1024611 -1082 rs1800896 -592 rs1800872 -819 rs1800871 -1188 rs3212227 -137 rs187238 -607 rs1946518 -656 rs1946519 -238 rs361525 -308 rs1800629 +869 rs1800470 -509 rs1800469 +874 rs2430561 +776 rs4986790 +597 rs3804099 аллель А1 С С A С С С C A A A A С A C G A A A С С A A С А2 Т Т G Т Т Т G Т G G C Т C G Т C G G Т Т Т G Т Частота аллеля, % А1 А2 68,3±4,2 31,7±4,2 72,5±4,1 27,5±4,1 35,0±4,4 65,0±4,4 35,0±4,4 65,0±4,4 65,0±4,4 35,0±4,4 30,0±4,2 70,0±4,2 40,0±4,5 60,0±4,5 60,8±4,5 39,2±4,5 70,0±4,2 30,0±4,2 60,8±4,5 39,2±4,5 16,7±3,4 83,3±3,4 83,3±3,4 16,7±3,4 77,5±3,8 22,5±3,8 30,0±4,2 70,0±4,2 54,2±4,5 45,8±4,5 45,8±4,5 54,2±4,5 9,2±2,6 90,8±2,6 8,3±2,5 91,7±2,5 49,2±4,6 50,8±4,6 59,2±4,5 40,8±4,5 41,7±4,5 58,3±4,5 90,0±2,7 10,0±2,7 42,5±4,5 57,5±4,5 147 Частота генотипа, % А1А1 А1А2 А2А2 43,3 50 6,7 48,3 48,3 3,3 10,0 50,0 40,0 10,0 50,0 40,0 45,0 40,0 15,0 5,0 50,0 45,0 23,3 33,3 43,3 35,0 51,5 13,3 46,7 46,7 6,7 40,0 41,7 18,3 3,3 26,7 70,0 70,0 26,7 3,3 56,7 41,7 1,7 11,7 36,7 51,7 33,3 41,7 25,0 25,0 41,7 33,3 0,0 18,3 81,7 0,0 16,7 83,3 20,0 58,3 21,7 33,3 51,7 15,0 21,7 40,0 38,3 81,7 16,7 1,7 18,3 48,3 33,3 χ2 р 1,20 1,21 0,83 0,83 0,04 1,20 0,32 0,83 0,85 0,04 0,04 0,04 0,88 0 0 0 0,06 0,06 2,10 0,83 0 0 0,30 0,27 0,27 0,36 0,36 0,85 0,27 0,57 0,36 0,36 0,85 0,84 0,84 0,35 1 1 1 0,81 0,80 0,15 0,36 1 1 0,58 Полученные данные о частотах встречаемости аллелей однонуклеотидных полиморфизмов в генах иммунной системы, в группе сравнения соответствуют данным по Европе за исключением локусов TGFB1 -509 C>T и IL8 – 251 A>T (табл.28). Частота определения аллеля С локуса TGFB1 -509 C>T в 1,2 раза ниже в исследуемой группе сравнения, чем в популяции европеоидов (OR=0,54 (0,36-0,8), р=0,028). Частота определения аллеля А локуса IL8 – 251 Т>A в 1,5 раза выше в исследуемой группе сравнения, чем в популяции европеоидов (OR=2,2 (1,5-3,3), р=4,3х10-5). Вероятно, полученные расхождения связаны со спецификой смешанной русской популяции и спецификой выборки исследуемой группы сравнения. Частоты встречаемости аллелей при вагинитах представлены в таблице 28. При сравнении частот встречаемости аллелей в группе женщин с вагинитами выявлены достоверные различия для аллеля А локуса TNF –238 G>A локуса (OR=0,21 (0,07-0,68), p=0,004) и аллеля С TGFB1 –509 C>T (OR=1,8 (1,1-2,9), p=0,015) (рис.40). В группе женщин с вагинитами достоверно реже отмечен редкий гетерозиготный генотип GA локуса TNF –238 G>A (OR=0,19 (0,06-0,64), p=0,0035, аутосомно-доминантная модель), чем в группе сравнения (рис.41). Помимо этого в группе женщин с вагинитами достоверно чаще отмечен гомозиготный генотип СC локуса TGFB1 -509 C>T (OR=2,3(1,2-4,4), p=0,016, аутосомно-рецессивная модель), чем в группе сравнения (рис.41). 148 Таблица 28. Частота аллелей и генотипов полиморфизмов генов иммунной системы. SNP IL1A (C-889T) rs1800587 IL1B (G-511A) rs16944 IL1B (T-31C) rs1143627 IL1B (C+3953Т) rs1143634 IL1R1 (IL1RA) (C+197T) rs2234650 IL1RN (11100 msp1) rs315952 IL6 (G-174C) rs1800795 IL8 (A-251T) rs4073 Аллели или генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип С T C/C C/T T/T A G A/A G/A G/G C T CC CT TT C T CC CT TT C T CC CT TT C T CC CT TT C G CC CG GG A T AA AT TT Европеоиды*, проект «100 геномов» (n=378) 70,4% 29,6% 50,4% 40,1% 9,5% 35,8% 64,2% 12,7% 46,2% 41,2% 35,9% 64,1% 12,7% 46,4% 40,9% 74,0% 26,0% 54,4% 39,3% 6,3% 69,5% 30,5% 48,0% 43,0% 9,0% 29,6% 70,4% 10,3% 38,5% 51,2% 41,7% 58,3% 19,8% 43,8% 36,4% 40,9% 59,1% 15,8% 50,1% 34,0% 149 Группа сравнения (n=60) 68,3% 31,7% 43,3% 50,0% 6,7% 35,0% 65,0% 10,0% 50,0% 40,0% 35,0% 65,0% 10,0% 50,0% 40,0% 72,5% 27,5% 48,3% 48,3% 3,4% 65,0% 35,0% 45,0% 40,0% 15,0% 30,0% 70,0% 5,0% 50,0% 45,0% 40,0% 60,0% 23,3% 33,4% 43,3% 60,8% 39,2% 35,0% 51,7% 13,3% Группа женщин с вагинитами (n=96) 66,1% 33,9% 43,8% 44,8% 11,5% 35,9% 64,1% 14,6% 42,7% 42,7% 35,9% 64,1% 14,6% 42,7% 42,7% 71,4% 28,6% 49,0% 44,8% 6,3% 63,0% 37,0% 38,5% 49,0% 12,5% 33,9% 66,1% 11,5% 44,8% 43,8% 42,7% 57,3% 21,9% 41,7% 36,5% 52,1% 47,9% 28,1% 47,9% 24,0% SNP CCL2 (2493A>G, -2578A>G) rs1024611 IL10 (A-1082G) rs1800896 IL10 (A-592C) rs1800872 IL10 (T-819C) rs1800871 IL12B (A-1188C) rs3212227 IL18 (G-137C) rs187238 IL18 (G-607T) rs1946518 IL18 (A-656C) rs1946519 Аллели или генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип A G AA AG GG A G AA AG GG A C AA AC CC C T CC CT TT A C AA AC CC C G CC CG GG G T GG GT TT A C AA AC CC Европеоиды*, проект «100 геномов» (n=378) 67,4% 32,6% 43,3% 48,3% 8,4% 54,1% 45,9% 33,5% 41,2% 25,3% 23,5% 76,5% 6,6% 33,8% 59,6% 76,6% 23,4% 59,9% 33,5% 6,6% 78,0% 22,0% 60,4% 35,1% 4,5% 28,2% 71,8% 7,9% 40,6% 51,5% 57,0% 43,0% 31,7% 50,7% 17,7% 43,0% 57,0% 17,7% 50,7% 31,7% 150 Группа сравнения (n=60) 70,0% 30,0% 46,6% 46,7% 6,7% 60,8% 39,2% 40,0% 41,7% 18,3% 16,7% 83,3% 3,3% 26,7% 70,0% 83,3% 16,7% 70,0% 26,7% 3,3% 77,5% 22,5% 56,7% 41,6% 1,7% 30,0% 70,0% 11,6% 36,7% 51,7% 54,2% 45,8% 33,3% 41,7% 25,0% 45,8% 54,2% 25,0% 41,7% 33,3% Группа женщин с вагинитами (n=96) 68,2% 31,8% 49,0% 38,5% 12,5% 50,0% 50,0% 28,1% 43,8% 28,1% 19,3% 80,7% 2,1% 34,4% 63,5% 80,7% 19,3% 63,5% 34,4% 2,1% 81,3% 18,7% 65,6% 31,3% 3,1% 27,6% 72,4% 10,4% 34,4% 55,2% 57,8% 42,2% 32,3% 51,0% 16,7% 42,2% 57,8% 16,7% 51,0% 32,3% SNP TNF (G–238A) rs361525 TNF (G-308A) rs1800629 TGFB1 (T+869 C) rs1800470 TGFB1 (C-509 T) rs1800469 IFNG (T+874A) rs2430561 TLR4 (А+776 G) (А+896 G) rs4986790 TLR2 (Т+597 C) rs3804099 Аллели или генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип аллель генотип A G AA AG GG A G AA AG GG C T CC CT TT C T CC CT TT A T AA AT TT A G AA AG GG C T CC CT TT Европеоиды*, проект «100 геномов» (n=378) 6,7% 93,3% 0,3% 12,9% 86,8% 13,6% 86,4% 1,6% 24,0% 74,4% 40,0% 60,0% 16,1% 47,8% 36,1% 69,3% 30,7% 48,8% 40,9% 10,3% 43,4% 56,6% 18,7% 49,3% 31,9% 93,8% 6,2% 88,4% 10,8% 0,8% 43,7% 56,3% 18,7% 49,9% 31,4% Группа сравнения (n=60) 9,2% 90,8% 0,0% 18,3% 81,7% 8,3% 91,7% 0,0% 16,7% 83,3% 49,2% 50,8% 20,0% 58,3% 21,7% 59,2% 40,8% 33,3% 51,7% 15,0% 41,7% 58,3% 21,7% 40,0% 38,3% 90,0% 10,0% 81,7% 16,7% 1,7% 42,5% 57,5% 18,3% 48,4% 33,3% Группа женщин с вагинитами (n=96) 2,1% 97,9% 0,0% 4,2% 95,8% 6,8% 92,2% 0% 13,5% 86,5% 38,5% 61,5% 14,6% 47,9% 37,5% 72,4% 17,6% 53,1% 38,5% 8,3% 39,6% 60,4% 15,6% 47,9% 36,5% 90,6% 9,4% 81,3% 18,8% 0,0% 39,1% 60,9% 13,5% 51,0% 35,4% * согласно данным сайта http://www.ensembl.org/index.html 151 Частота аллеля, % 90 60 30 0 С T A G C IL1A IL1B rs1800587 rs16944 T C T С Т С Т C G A Т IL1B IL1B IL1R1 IL1RN IL6 IL8 rs4073 rs1143634 rs1143627 rs2234650 rs315952 rs1800795 Частота аллеля, % 90 60 30 0 A G A G A C С Т A C C G G T A C CCL2 IL10 IL10 IL10 IL12B IL18 IL18 IL18 rs1024611 rs1800896 rs1800872 rs1800871 rs3212227 rs187238 rs1946518 rs1946519 Частота аллеля, % 100 80 60 40 20 0 A G TNF rs361525 A С G TNF rs1800629 Т TGFB1 rs1800470 С Т TGFB1 rs1800469 группа сравнения A Т IFNG rs2430561 A G TLR4 rs4986790 С Т TLR2 rs3804099 вагинит Рисунок 40. Частоты распределения аллелей в группе сравнения и при вагинитах. 152 Частота аллеля или генотипа,% TNF(G-238A) rs361525 TGFB1(С-509T) rs1800469 A* G аллели AA AG* Частота аллеля или генотипа,% 100 80 60 40 20 0 GG 80 60 40 20 0 С* Т CC* аллели генотип CT TT генотип группа сравнения группа сравнения пациентки с вагинитами пациентки с вагинитами Рисунок 41. Частота выявления аллелей генотипов локусов TNF –238 G>A и TGFB1 -509 C>T. Ген TNF картирован на хромосоме 6p21.3, имеет размер 2762 п.н. и содержит 4 экзона. Два полиморфизма в промоторной области гена –238 G>A (rs361525) и -308 G>A (rs1800629) по отношению к сайту начала транскрипции содержат замену гуанина на аденин, что приводит к увеличению продукции TNF-α в ответ на стимуляцию липополисахаридами [83; 192]. Ген TGFB1 картирован на хромосоме 19q13.1, имеет размер 23403 п.н. и содержит 7 экзонов. Полиморфный вариант Т локуса TGFB1 -509 С>T (rs1800469) содержит замену цитозина на тионин, что приводит к повышению уровня экспрессии этого цитокина [135]. В нашем исследовании установлено, что вагиниты ассоциированы с «диким» генотипом СС, характеризующимся пониженным уровнем экспрессии мРНК. Полученные нами данные позволяют рассматривать генетическую предрасположенность к пониженной экспрессии TNF-α и TGF-ß1 как факторы риска развития вагинита. По остальным локусам достоверных отличий частот аллелей и генотипов в группе женщин с вагинитами не выявлено. 153 3.2.4 Хронический эндометрит 3.2.4.1 Идентификация микроорганизмов в полости матки Полость матки защищена естественными физиологическими барьерами и остается малодоступной для микроорганизмов, обитающих в окружающей среде. Вместе с тем нижние отделы половых путей обильно заселены микроорганизмами. Суммарная бактериальная масса у женщин репродуктивного возраста может составлять до 108 микроорганизмов в соскобах со слизистой влагалища. В норме большая часть флоры представлена лактобактериями, которые вырабатывают перекись водорода и создают кислую среду, препятствующую росту условно-патогенной микрофлоры. При дисбиотических состояниях количество УПМ возрастает, однако даже в этом состоянии полость матки остается защищенной благодаря анатомическому и функциональному строению половых путей: наличию эндоцервикса и слизистой пробки. Вместе с тем, данная защита остается относительно проницаемой, в том числе при нарушении строения шейки матки и при естественном прохождении сперматозоидов и семенной жидкости, которая также может нести различные микроорганизмы. При идентификации микроорганизмов в полости матки возникают определенные затруднения. Во-первых, необходимо исключить контаминацию материала микроорганизмами из нижних отделов половых путей. Это требует определенной техники взятия биоматериала: санации нижних отделов половых путей и использования пайпель-аспирации с изолированным внутренним поршнем [12]. Во-вторых, концентрация микроорганизмов может быть очень низкой и недостаточной для идентификации, полагают, что в некоторых случаях инфекционный возбудитель остается не выявленным. С другой стороны, инфекционные агенты зачастую запускают воспалительный процесс, который продолжается уже в отсутствии самого возбудителя и связан с механизмами репарации поврежденных тканей. 154 Согласно полученным данным степень бактериальной обсеменности полости матки составляет около 104 микроорганизмов (табл. 29). Таблица 29. Спектр выявленных микроорганизмов в биоптатах эндометрия Возбудитель Группа сравнения (n=31) Кол-во, lg n Me % (L-H) Хронический эндометрит (n=79) n Кол-во, lg Me (L-H) % C.trachomatis 1 1,3 CMV 2 2,6 ОБМ 31 Lactobacillus spp. 26 Enterobacteriaceae 2 3,8 (3,4-4,1) 3,6 (3,0-4,0) 3,2 (3,2-3,3) 100 79 83,9 64 6,5 25 Streptococcus agalactiae 2 Staphylococcus spp 3 Enrerococcus spp 2 4,0 (3,4-4,7) 3,7 (3,2-4,5) 3,3 (3,2-3,4) менее 3 100 81 25,3 Eubacterium spp 5 Lachno/Clost 1 Peptostrept 1 4,7 1,3 Atopobium vaginae 4 менее 3 5,1 Mycoplasma spp 2 менее 3 2,6 12 менее 3 3,7 (3,6-3,9) 15,2 Ureaplasma spp 1 2 3,1 менее 3 3,2 6,5 Candida spp сочетанные Всего положительных 14 2 р=0,0022 2,6 3,5 (3,3-3,7) менее 3 3,5 (3,2-3,7) 3,3 (3,2-3,6) 3,5 Gard/Pre/Porph р - уровень значимости 3,8 2,6 17,7 р=0,046 6,3 1,3 2,6 2 6,5 16 20,3 р=0,08 4 13 36 45,3 р=0,0014 В основном бактериальная масса представлена лактобактериями. При хроническом эндометрите частота выявления различных микроорганизмов составляет: Enterobacteriaceae (E.coli, Klebsiella spp. и др.) – 25,3%, Gardnerella vaginalis/Prevotella spp./Porphyromonas spp. – 17,7%, Ureaplasma 155 spp. – 15,2%, идентифицированы также такие возбудители урогенитальных инфекций, как C.trachomatis, Streptococcus agalactiae, Staphylococcus spp., Enrerococcus spp., Atopobium vaginae, Mycoplasma spp., Peptostreptococcus spp. и другие. В группе сравнения выявлены такие микроорганизмы, как Enterobacterium – 6,5%, Gardnerella vaginalis/Prevotella spp./Porphyromonas spp. – 3,5%, Ureaplasma spp. – 6,5%. Однако при хроническом эндометрите частота выявления групп микроорганизмов Enterobacterium и Gardnerella статистически vaginalis/Prevotella spp./Porphyromonas spp. достоверно отличалась от группы сравнения и была выше. Таким образом, только в половине случаев (45,3%) при хроническом эндометрите в полости матки были выявлены микроорганизмы. Полученные нами данные позволяют расширить представление о развитии механизмов хронического эндометрита, и связать их не только с влиянием инфекционных агентов. 3.2.4.2 Локальный транскрипционный профиль при хроническом эндометрите Гистологическая верификация ХЭ была основана на современных общепризнанных критериях [27; 50]. При одновременном наличии в строме эндометрия очагового фиброза стромы, склеротических изменений стенок спиральных сосудов эндометрия, воспалительных лимфоидных инфильтратов, в сочетании с плазматическими клетками - ставился диагноз ХЭ (полный симптомокомплекс ХЭ). При выявлении у женщин с клиническими проявлениями ХЭ только одного из выше перечисленных морфологических признаков имело место - неполная форма заболевания. На основе результатов гистологического исследования эндометрия пациентки были разделены на следующие группы: 1. Группа сравнения (n=31) - эндометрий ранней, средней или поздней стадии пролиферации. 2. Женщины с хроническим эндометритом (n=79), из них: 2A- полный симптомокомплекс ХЭ (n=44) с наличием в строме эндометрия очагового 156 фиброза стромы, склеротических изменений стенок спиральных сосудов эндометрия, воспалительных лимфоидных инфильтратов в сочетании с плазматическими клетками; 2B - неполная форма ХЭ с очаговой и рассеянной инфильтрацией стромы лимфоцитами и плазмоцитами (n=20); 2C - неполная форма ХЭ с фиброзом стромы эндометрия и склеротическими изменениями стенок спиральных сосудов эндометрия (n=15) (рис. 11 А-Г). А. Хронический эндометрит с крупным лимфоидным фоликулом (2А подгруппа) увеличение х 250 Б. Хронический эндометрит с рассеяной лимфоидной инфильтрацией (2В подгруппа) увеличение х 400 В. Хронический эндометрит со склерозом стромы (2С подгруппа) увеличение х 250 Рисунок 42. Морфологическая Г. Эндометрий стадии пролиферации (1-ая группа – группа сравнения) увеличение х 400 картина ХЭ пролиферации. Окраска гематоксилином и эозином. 157 и эндометрия стадии В группах обследованных больных по возрасту, весу, росту, менархе, количеству родов и абортов статистически значимых различий выявлено не было. Основные причины обращения пациенток представлены в таблице 30. Таблица 30. Причины обращения пациенток (абс.число женщин / %). Жалобы 1 группа сравнения (n=31) 1 3,2% Обильные менструации Перименструальные кровянистые выделения Гипоменструальный синдром 3 9,7% Бесплодие 10 32,3% 0 0 2А подгруппа ХЭ (n=44) 18 40,9%* p=2,2x10-4 20 45,5%* p=9,9x10-4 4 9,1% 2В подгруппа ХЭ (n=20) 8 40%* p=7,7x10-4 10 50%* p=1,3x10-3 2 10% 2С подгруппа ХЭ (n=15) 4 26,7%* p=0,017 6 40,0%* p=0,015 5 33,3%* p=6,6x10-4 9 60,0% 3 20,0% p=0,01 0 23 10 52,3% 50% Невынашивание 5 5 беременности 11,4% 25% p=0,052 p=3,4x10-3 Отсутсвие жалоб 19 5 0 61,3% 11,4% Сочетание 2 28 12 6 указанных жалоб 6,5% 63,6% 60% 40% *- статистически значимые различия 2А, 2В, 2С подгрупп по сравнению с 1-ой группой (р<0,05). Пациентки с хроническим эндометритом по сравнению с женщинами группы 1 чаще предъявляли жалобы на наличие перименструальных кровянистых выделений и обильных менструаций, невынашивание беременности (р<0,05). У пациенток подгруппы 2С с фиброзом стромы эндометрия чаще наблюдался гипоменструальный синдром по сравнению со всеми остальными группами. При наличии полного симптомокомплекса ХЭ (подгруппа 2А) были достоверно повышены уровни экспрессии мРНК следующих цитокинов: IL1В в 2,1 (р=0,006), IL6 в 1,9 (р=0,023), IL8 в 1,6 (р=0,043), IL10 в 2 (р=0,014) , IL12А в 1,5 (р=0,019), TNF в 1,5 (р=0,007), TGFB1 в 1,5 (р=0,042), Foxp3 в 1,4 (р=0,019), IL2Ra в 1,7 (р=0,002), LIF в 1,5 (р=0,002), TLR9 в 1,6 (р=0,014), 158 изоформ VEGFА в 1,5 раза (p<0,05), TLR2 в 1,4 раза (р=0,003), чем в группе сравнения (табл.31, рис.43). Таблица 31. Уровень экспрессии мРНК генов иммунного ответа в тканях эндометрия при хроническом эндометрите в подгруппах 2А и 2В. 2А подгруппа (n=44) 2В подгруппа (n=20) Ген 1 группа сравнения n=31 Ме (L-H) Уровень экспрессии Ме (L-H) р-уровень значимости Уровень экспрессии Ме (L-H) р-уровень значимости IL1В 1 (0,56-1,62) 2,1 (1,0-5,3) 0,006 2,0 (0,8-7,1) 0,005 IL6 1 (0,32-3,12) 1,9 (1,2-5,9) 0,023 2,9 (0,8-5,8) 0,023 TNF 1 (0,68-1,59) 1,5 (1,2-2,8) 0,007 1,8 (1,1-4,9) 0,007 IL8 1 (0,37-2,88) 1,6 (1,0-6,0) 0,043 2,2 (0,6-10,3) 0,096 LIF 1 (0,40-1,74) 1,5 (1,0-3,9) 0,002 2,4 (1,0-4,7) 0,009 IL10 1 (0,62-1,68) 2,0 (1,0-4,1) 0,014 1,9 (0,7-2,9) 0,035 TLR9 1 (0,45-1,72 1,6 (0,7-4,3) 0,014 2,3 (0,6-3,1) 0,050 TGFB1 1 (0,65-1,43) 1,5 (1,0-2,3) 0,042 1,5 (0,9-2,3) 0,012 IL12A 1 (0,86-1,34) 1,5 (1,1-1,8) 0,019 1,6 (1,0-1,8) 0,032 IL18 1 (0,74-1,34) 1,3 (0,8-2,0) 0,228 1,3 (0,8-2,0) 0,146 IFNG 1 (0,47-1,33) 1,0 (0,7-1,9) 0,186 1,0 (0,6-1,6) 0,726 TLR2 1 (0,82-1,40) 1,4 (1,3-2,9) 0,003 1,5 (0,701,9) 0,145 FoxP3 1 (0,62-1,52) 1,4 (1,1-2,0) 0,019 1,6 (0,8-2,6) 0,062 IL2Ra 1 (0,69-1,60) 1,7 (1,3-3,0) 0,002 1,8 (0,09-2,9) 0,014 IL12B 1 (0,70-1,83) 1,0 (1,0-3,2) 0,107 1,6 (0,7-2,3) 0,970 IL4 1 (0,51-1,78) 1,6 (0,9-3,7) 0,054 1,9 (0,7-2,9) 0,068 VEGFA121 1 (0,62-1,35) 1,4 (0,9-1,8) 0,049 1,2 (0,9-2,0) 0,012 VEGFA189 1 (0,65-1,36) 1,5 (1,2-2,1) 0,006 1,7 (1,1-2,4) 0,006 TLR4 1 (0,65-1,50) 1,1 (1,0-1,6) 0,267 1,2 (0,8-1,7) 0,260 VEGFA165 1 (0,56-1,46) 1,4 (1,1-1,8) 0,009 1,3 (1,0-2,1) 0,004 IL2 1 (0,62-1,53) 0,7 (0,6-1,0) 0,137 0,7 (0,4-1,2) 0,116 Аналогичные изменения были отмечены и при лимфоидной инфильтрации стромы (подгруппа 2В), были достоверно повышены уровни экспрессии мРНК следующих цитокинов: IL1В в 2 (р=0,005), IL6 в 2,9 (р=0,023), IL10 в 1,9 (р=0,035), IL12А в 1,6 (р=0,032), TNF в 1,8 (р=0,007), 159 TGFB1 в 1,5 (р=0,012), IL2Ra в 1,8 (р=0,014), LIF в 2,4 (р=0,009), TLR9 в 2,3 (р=0,05), изоформ VEGFА в 1,2-1,7 (p<0,05), чем в группе сравнения (табл.31, рис.43), а так же отмечена тенденция к повышению IL8 в 2,2 (р=0,096), Foxp3 100,0 10,0 IL2 VEGFA165 TLR4 VEGFA189 0,1 VEGFA121 IL4 IL12В IL2Ra Foxр3 TLR2 IFNG IL18 IL12А TGFB1 TLR9 IL10 LIF IL8 TNF IL6 1,0 IL1В Относительный ровень экспрессии мРНК в 1,6 (р=0,062) и TLR2 в 1,5 раза (р=0,14), чем в группе сравнения. полный симптомокомплекс ХЭ (n=44) инфильтрация стромы лимфоцитами (n=20) фиброз стромы (n=15) Рисунок 43. Профиль экспрессии мРНК генов иммунной системы в тканях эндометрия у женщин с хроническим эндометритом. Представлены медианы значений в группах. Значение Ме в группе сравнения принято за 1. Более выраженные изменения в уровне экспрессии мРНК отмечены при фиброзе стромы эндометрия (подгруппа 2С): IL1В в 26 раз (р=9,6х10-8), IL6 в 16,6 (р=0,0014), IL8 в 7,9 (р=6,7х10-5), IL10 в 5,9 (р=4,1х10-6) , IL12А в 4,3 (р=7,4х10-6), TNF в 16 (р=6,6х10-7), TGFB1 в 4,7 (р=3,5х10-6), Foxp3 в 2,6 (р=3,5х10-5), IL2Ra в 2,3 (р=0,025), LIF в 6,3 (р=1,4х10-6), TLR9 в 5(р=4,3х10-6)) изоформы 121 VEGFА в 2,2 (p=1,8х10-3), TLR2 в 2,6 (р=8,3х10-5) раза, а также IL18 в 3,5 (р=6,3х10-6), IFNG в 2,8 (p=2,1х10-3), TLR4 в 1,7 (р=3,2х10-3) раз по сравнению с группой 1 (рис.43, табл.32). 160 Таблица 32. Уровень экспрессии мРНК генов иммунного ответа в тканях эндометрия при фиброзе стромы эндометрия. 2С подгруппа (n=15) Ген 1 группа сравнения n=31 Ме (L-H) Уровень экспрессии Ме (L-H) р-уровень значимости IL1В 1 (0,56-1,62) 26,0 (11,4-49,7) 9,6 х 10-8 IL6 1 (0,32-3,12) 16,6 (2,7-24,2) 0,0014 TNF 1 (0,68-1,59) 16,0 (9,1-22,1) 6,6 х 10-7 IL8 1 (0,37-2,88) 7,9 (4,7-179,5) 6,7 х 10-5 LIF 1 (0,40-1,74) 6,3 (3,2-9,7) 1,4 х 10-6 IL10 1 (0,62-1,68) 5,9 (3,1-21,0) 4,1 х 10-6 TLR9 1 (0,45-1,72 5,0 (2,8-10,3) 4,3 х 10-6 TGFB1 1 (0,65-1,43) 4,7 (2,2-6,2) 3,5 х 10-6 IL12A 1 (0,86-1,34) 4,3 (2,9-7,4) 7,4 х 10-6 IL18 1 (0,74-1,34) 3,5 (1,9-5,7) 6,3 х 10-6 IFNG 1 (0,47-1,33) 2,8 (1,0-4,6) 2,1 х 10-3 TLR2 1 (0,82-1,40) 2,6 (1,5-8,0) 8,3 х 10-5 FoxP3 1 (0,62-1,52) 2,6 (2,0-3,6) 3,5 х 10-5 IL2Ra 1 (0,69-1,60) 2,3 (1,3-4,1) 2,5 х 10-2 IL12B 1 (0,70-1,83) 2,3 (1,1-5,5) 0,1 IL4 1 (0,51-1,78) 2,2 (0,4-2,8) 0,34 VEGFA121 1 (0,62-1,35) 2,2 (1,3-3,3) 1,8 х 10-3 VEGFA189 1 (0,65-1,36) 2,1 (0,9-2,7) 0,054 TLR4 1 (0,65-1,50) 1,7 (1,2-4,8) 3,2 х 10-3 VEGFA165 1 (0,56-1,46) 1,3 (0,9-3,0) 0,082 IL2 1 (0,62-1,53) 0,9 (0,8-1,4) 0,76 Хроническая активация иммунокомпетентных клеток сопровождается повышенной выработкой цитокинов и других биологически активных веществ, что приводит к нарушению микроциркуляции, экссудации и фиброзу стромы эндометрия. В первую очередь имеет место склерозирование стенок сосудов и образование периваскулярного склероза вокруг спиральных артерий и в базальных отделах эндометрия, что приводит к развитию ишемии 161 сосудов эндометрия[55]. Таким образом, фиброз стромы и склероз сосудов эндометрия могут рассматриваться, как более тяжелые формы ХЭ, требующие наибольшего внимания. В связи с этим на основании полученных данных проведен регрессионный анализ с целью дискриминировать группу образцов с фиброзом стромы эндометрия. Уравнение линейной функции имело следующий вид: z=3,6*ln([IL1B]/[IL2])+5,5*ln([IL10]/[FOXP3])+3,5*ln([TLR9]/[IL2Ra])-10 (формула 16), где [IL1B]/[IL2], [IL10]/[FOXP3], [TLR9]/[IL2Ra] – индексы соотношения уровня экспрессии соответствующих маркеров. В результате ROC- анализа выбрано значение точки сut off = 63%. Площадь по кривой составила AUC=0,996±0,006 (p=6,3х10-7) (рис.44). Чувствительность и специфичность предложенной модели составили 93,3% и 100% соответственно. При значении вероятности более 63% образцы следует рассматривать, как наличие фиброза стромы эндометрия. Рисунок 44. ROC-кривая для дискриминации образцов с фиброзом стромы эндометрия. В соответствии с предложенной статистической моделью все образцы группы сравнения были определены, как отсутствие фиброза. Как образцы с 162 фиброзом эндометрия, были определены 12 пациенток (27%) подгруппы 2А (полный симптомокомплекс хронического эндометрита), 7 пациенток (35%) подгруппы 2В (лимфоидная инфильтрация) и 14 пациенток (93%) - Вероятность фиброза, % подгруппы 2С с фиброзом эндометрия (рис.45). 100 1 группа сравнения 80 подгруппа 2A 60 подгруппа 2B 40 2C фиброз линия cut off 20 0 Рисунок 45. Дискриминация образцов эндометрия в зависимости от наличия фиброза стромы. Учитывая разнонаправленный характер синтеза IL4 и IL2, был поссчитан индекс отношения экспрессии [IL4]/[IL2] (рис.46). В подгруппе 2В данный индекс был достоверно выше и составил Me=0,11(0,06-0,21), p=0,012), чем в группе сравнения (Me=0,07(0,03-0,10)). Аналогичная тенденция отмечена и в подгруппе 2А (Me=0,13(0,04-0,21), p=0,06). При фиброзе эндометрия (подгруппа 2С) данная тенденция не подтвердилась (Me=0,10(0,02-0,16, p=0,61). Соотношение экспрессии мРНК [IL4]/[IL2] 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 группа сравнения подгруппа 2А ХЭ подгруппа 2В ХЭ Рисунок 46. Сотношение уровня экспрессии мРНК [IL4]/[IL2]. Данные представлены в виде медианы и межквартильного размаха. 163 подруппа 2С фиброз ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 4. 4.1. Молекулярно-генетические маркеры при вагинитах 4.1.1. Транскрипционный профиль генов иммунного ответа в норме и его зависимость от фазы менструального цикла в тканях эндометрия Репродуктивный цикл женщины характеризуется обусловленной созреванием в яичнике фолликулов цикличностью, и подготовкой эндометрия к инвазии и развитию эмбриона. Под влиянием гормонов яичников (эстрогенов и прогестерона) циклическим изменениям подвергается как эндометрий (менструальный цикл), так и слизистая оболочка влагалища. Учитывая взаимосвязь эндокринной и иммунной систем, одна из задач работы состояла в исследовании транскрипционных профилей генов иммунного ответа в зависимости от стадии менструального цикла. Образцы тканей эндометрия брали в пролиферативную и секреторную стадии менструального цикла, поскольку действие двух ключевых гормонов эстрадиола и прогестерона осуществляется через взаимодействие со своими рецепторами, помимо маркеров локального иммунитета в тканях эндометрия оценивалась экспрессия эстрогенового (ESR1) и прогестеронового (PGR) рецепторов. Получены данные по снижению уровня экспрессии мРНК гена PGR в секреторную фазу цикла (рис.16, табл.12) по сравнению с пролиферативной фазой. Аналогичная тенденция получена и для ESR1. Данные литературы по экспрессии эстрогенового и прогестеронового рецепторов являются противоречивыми, они представлены в обзоре литературы. Полученные нами данные по снижению транскриптов рецепторов прогестерона в секреторную фазу согласуются с известными фактами о повышении прогестерона в секреторную фазу и подавлении данным гормоном синтеза собственных рецепторов, а также рецепторов к эстрогеновому рецептору [59]. К периоду овуляции происходят не только изменения в структуре стромы, желез и спиральных артерий эндометрия, но формируется комплекс 164 иммунологических механизмов, которые, должны поддержать имплантацию и развитие эмбриона. Эти процессы предусматривают активные межклеточные взаимодействия с участием нескольких семейств цитокинов. Наиболее изученными цитокинами, регулирующими процесс имплантации, являются цитокины сем. IL-6, в частности LIF [200]. Полагают, что без нормальной экспрессии LIF, имплантация невозможна. Это продемонстрировано на нокаутированных по данному гену мышах [172]. По мнению ряда авторов максимальное количество LIF содержится в эндометрии в средней и поздней стадии секреции [179; 185; 209]. Полученные нами данные по увеличению экспрессии мРНК генов LIF и IL6 в секреторную фазу цикла (рис.16, табл.12) соответствуют этим фактам. Помимо этого нами установлено повышение экспрессии мРНК генов TLR4, VEGFA изоформа 189, TNF, IL4 и снижение экспрессии мРНК генов IL12A, IL12B, Foxp3, IL2 в секреторную фазу менструального цикла по сравнению с пролиферативной (рис.16, табл.12). Известно, что высокая концентрация прогестерона в секреторную фазу цикла может вносить вклад в установление толерантности в отношении плода путем модуляции баланса Th1<Th2 иммунного ответа [243]. Miyaura H. и соавт. продемонстрировали, что прогестерон in vitro ингибирует развитие изолированных CD4+CD8+ лимфоцитов в Th1-лимфоциты и способствует их дифференцировке в Th2-лимфоциты [213]. Поэтому полученный нами данные по увеличению экспрессии мРНК гена IL4 (один из основных цитокинов, продуцируемых Th2-лимфоцитами) и снижению экспрессии мРНК генов IL2 (один из основных цитокинов, продуцируемых Th1лимфоцитами) и IL12A, IL12B (две субъединицы IL-12 - одного из основных модуляторов Th1-ответа) являются закономерными. Как известно, в секреторную фазу цикла осуществляется ремоделирование и развитие спиральных артерий эндометрия. Ключевое значение в этом процессе играет VEGF. Фактор роста эндотелия сосудов (vascular endothelial growth factor, VEGF) был впервые описан в 1989 г. как 165 гепарин-связывающий ангиогенный фактор роста, который оказывает выраженное митогенное воздействие на эндотелиальные клетки сосудов, обеспечивая развитие новых и поддержку незрелых кровеносных сосудов. Белок VEGF представлен 5 изоформами, состоящими из 121, 145, 165, 189 и 206 аминокислот. Наиболее хорошо изучены изоформы VEGF-121 и VEGF-165. Помимо этих двух изоформ в работе исследована экспрессия третьей изоформы VEGF-189, по которой и получены наиболее интересные результаты. Установлено, что в секреторную фазу цикла экспрессия транскриптов изоформы 189 гена VEGFA выше по сравнению с пролиферативной фазой в 3,1 раза (табл.12, рис.16). Полученные данные согласуются с результатами Ancelin M., который полагает, что VEGF-189 регулирует проницаемость мембран эндотелия капилляров, необходимую для имплантации и поддержания беременности [67]. Известно также, что экспрессия VEGF регулируется гормонами. Эстрадиол повышает экспрессию всех изоформ VEGF [80]. Прогестерон избирательно повышает экспрессию только изоформы VEGF-189 в секреторную фазу цикла и во время беременности [67]. Не соответствуют ожидаемому результату данные по снижению экспрессии мРНК гена Foxp3 в секреторную фазу цикла по сравнению с пролиферативной. В настоящее время Treg – клетки рассматриваются, как основные регуляторы толерантности к развивающемуся плоду во время беременности. Известно, что в тканях эндометрия секреторной фазы происходит накопление Treg-клеток [104; 214], а у женщин с самопроизвольными выкидышами наблюдается дефицит Treg-клеток в эндометрии по сравнению с женщинами с нормальным течением беременности [204]. Между тем исследований по сравнению количества транскриптов гена Foxp3 в пролиферативном и секреторном эндометрии не проводилось. Таким образом, в результате исследования установлено, что транскрипционные профили генов иммунного ответа в секреторную и 166 пролиферативную фазу менструального цикла в тканях эндометрия существенно отличаются по целому ряду маркеров, часть из них повышена, часть понижена. Полученные различия позволили достаточно четко дискриминировать группы образцов эндометрия пролиферативной и секреторной фаз менструального цикла (рис.19). В тоже время при сравнении транскрипционных профилей в клетках влагалищных соскобов разных фаз менструального цикла достоверные различия были получены только для транскриптов гена TGFB1 (рис.24), который является иммуносупрессором. Экспрессия мРНК гена TGFB1 в клетках влагалищных соскобов повышена в 2 раза в секреторную фазу менструального цикла по сравнению с пролиферативной. 4.1.2. Зависимость транскрипционных профилей генов иммунного ответа в клетках соскобов из влагалища от беременности Иммунная система в первую очередь обеспечивает защиту организма от микроорганизмов, паразитов и вирусов. Особенностью локального иммунитета половых путей женщин является еще и необходимость обеспечить условия для имплантации и развития эмбриона и плода, по сути дела являющегося гаплоидентичным аллотрансплантантом. Достигается это за счет естественной иммуносупрессии. В связи с этим были исследованы транскрипционные профили в клетках слизистой оболочки влагалища у беременных и небеременных женщин групп сравнения условно здоровых женщин (рис.25, табл.17). У беременных женщин выявлено повышение экспрессии мРНК иммуносупрессорных генов цитокинов IL10 более, чем в 2 раза и TGFВ1 более, чем в 7,5 раз по сравнению с небеременными. Возможно, этот высокий иммуносупрессорный фон способствовал понижению экпрессии мРНК генов провоспалительных маркеров TLR2, TLR4, IL1B, TNF и CD45 у беременных женщин. 167 Полученные данные о повышении иммуносупрессорных цитокинов IL -10 и TGF-ß1 согласуются с концепцией о беременности, как состоянии относительного иммунного компромисса. Эта концепция подтверждается супрессией некоторых звеньев клеточного иммунитета и клиническими наблюдениями о более сильных осложнениях инфекционных процессов во время беременности [313]. Данные литературы по уровню экспрессии цитокинов в половых путях женщин во время беременности являются противоречивыми. В исследовании Kutteh W.H. и Franklin R.D. сообщается, что у здоровых беременных женщин без инфекций половых путей уровнь IL-1β в эндоцервикальной слизи повышен, IL-6 и IL-10 остаются без изменений [178]. Аналогично были получены данные, что при БВ уровень провоспалительных цитокинов IL-1β , IL-6 и IL-8 в эндоцервикальной слизи у беременных женщин выше по сравнению с небеременными [82]. Не подтверждают эти выводы Donders G.G. и соавт.: при сравнении IL-1β, IL-6 и IL-8 у беременных и небеременных женщин без инфекций половых путей достоверных различий уровней экспрессии данных цитокинов во влагалище они не выявили [110]. Все результаты по уровню экспрессии у беременных и небеременных женщин получены для белков методом ИФА. Аналогичных исследований транскрипционных профилей с помощью ОТ-ПЦР в режиме реального времени у беременных и небеременных женщин не проводилось. 4.1.3. Доминирование в составе биоценозов влагалища лактобактерий – механизм защиты плода и новорожденного от условнопатогенных микроорганизмов Высокий иммуносупрессорный фон во время беременности должен был бы способствовать обострению оппортунистических генитальных инфекций, но колонизационная резистентность, обусловленная доминированием в составе нормофлоры лактобактерий, подавляет рост условно-патогенных микроорганизмов. 168 Под колонизационной резистентностью подразумевается совокупность механизмов, придающих индивидуальную стабильность нормальной микрофлоре и обеспечивающих предотвращение заселения организма хозяина патогенными или условнопатогенными микроорганизмами [51]. Этот простой микробиологический механизм доминирования в составе нормофлоры лактобактерий связан с высоким эстрогеновым фоном. Но реализован он по сути дела только у женщин репродуктивного возраста и, очевидно, направлен на противоинфекционную защиту эмбриона, плода и новорожденного во время беременности на фоне иммуносупрессии. У девочек и у женщин в менопаузе лактобактерии в составе микробиоценозов влагалища не являются доминирующим видом. Лактобациллы у девочек доминируют в составе флоры влагалища только во II фазу пубертатного периода (14-17 лет) и до 4-6 недель после рождения. обусловлено Доминирование пассивной лактобацилл эстрогеновой у новорожденных насыщенностью в девочек связи с трансплацентарным переходом в кровоток плода половых гормонов, синтезируемых материнским организмом, стимулирующих у плода и новорожденной девочки синтез гликогена в промежуточных клетках вагинального эпителия. В остальные возрастные периоды у девочек микрофлора влагалища представлена стафилококками, энтеробактериями, стрептококками, а также анаэробными микроорганизмами, рН влагалищной среды составляет от 7,2 до 5,8, общая обсемененность влагалища - от 102 КОЕ/мл до 105 КОЕ/мл [3]. В климактерическом периоде дефицит эстрогенов вызывает развитие возрастных атрофических изменений слизистой оболочки влагалища, что приводит к снижению содержания гликогена в эпителии влагалища и снижению колонизации лактобациллами. В связи со сменой флоры происходит увеличение рН влагалищной среды до 5,5–7,5. Влагалище и нижние мочевые пути колонизируют грамотрицательные факультативноанаэробные виды семейства энтеробактерий, в основном кишечная палочка, 169 и типичные представители микрофлоры кожных покровов. Главный отличительный признак влагалищной атрофии — отсутствие или резкое снижение титра лактобацилл [31]. 4.1.4. Ассоциация L.iners и L.gasseri с дисбиотическими и воспалительными процессами во влагалище Один из механизмов защиты от инфекционных заболеваний нижних отделов половых путей у женщин репродуктивного возраста обусловлен доминированием лактобактерий в составе микробиоценоза влагалища. Персистенция лактобактерий на слизистой влагалища подавляет рост условно-патогенных микроорганизмов за счет синтеза молочной кислоты, поддерживающей кислую рН среды [85], бактериоцинов [234] и перекиси водорода [145; 235; 236]. Впервые защитные функции лактобактерий были описаны Додерлейном А. в 1892 году. 1928 году Стэнли Томас определил палочку Додерлейна как Lactobacillus acidophilus, пророчески добавив, что скорее всего, это группа родственных видов [297]. Согласно последним исследованиям в комплекс бактерий, схожих с L.acidophilus, входит целая группа лактобактерий: L.acidophilus, L.amylovorus, L.amyloliticus, L.crispatus, L.gallinarum, L.gasseri, L.johnsonii , L.iners, и L.jensenii [111; 117; 251]. Известно около 20 видов лактобактерий, входящих в состав микробиоценозов влагалища [182]. Основу микробиоты влагалища составляют 4 вида: Lactobacillus crispatus, L.iners, L.gasseri и L.jensenii [107; 327]. Полученные в нашем исследовании результаты (табл.16, рис.21) соответствуют этим данным. Только в одном случае доминирующим видом в составе лактофлоры была L.acidophilus (табл.16). Виды лактобактерий, входящих в состав кисломолочных продуктов (биотехнологические виды L.acidophilus, L.casei/L.rhamnosus, L. plantarum, L. fermentum) в состав влагалищной лактофлоры в доминирующих количествах входят редко, хотя и 170 могут присутствовать в незначительных количествах, поэтому их типирование не целесообразно. Частоты доминирования различных видов лактобактерий в группе сравнения (рис.21) приблизительно соответствуют данным Дж. Равель для белой популяции женщин [255]. Равель, исследовав около 400 образцов влагалищных мазков женщин северо-американского континента различных рассово-этнических групп (белые, темнокожие, азиатки, испанки) без симптомов воспалительных заболеваний, описал 5 основных кластеров бактериальных микробиотов: 1) доминирование L.crispatus; 2) доминирование L.gasseri; 3) доминирование L.iners; 4) доминирование УПМ; 5) доминирование L.jensenii. По результатам исследования Дж. Равель L.crispatus доминировали в 45,4% случаев, L.iners – 26,8%, L.gasseri – 8,2%, L.jensenii – 9,3%, дисбиотические состояния отмечены у 10,3% белых женщин. Согласно полученным нами результатам доминирование L.crispatus в составе лактофлоры ассоциировано с нормальным состоянием микробиоты влагалища (табл.16, рис.21). Доминирование L.crispatus было статистически более значимым в группе условно здоровых женщин по сравнению с группами женщин с вагинитами (OR=5(2,9-8,6), p=2,5x10-9) и бактериальным вагинозом (ОR=4,8 (2-11), p=1,3x10-4). Напротив, доля образцов с доминированием L.iners в составе лактофлоры влагалища была выше при дисбиотических процессах (табл.16, рис.21) и составила 48% при вагинитах (p=2,2х10-4), 38% - при кандидоносительстве (p=0,046), 48% - при условном нормоценозе (p=0,0062) по сравнению с условно здоровыми женщинами (27%). Аналогичная тенденция была получена и для группы женщин с бактериальным вагинозом (р=0,09). Кроме того выявлено, что в группе женщин с БВ достоверно чаще отмечено доминирование L.gasseri с составе нормофлоры - 30% (p=1,3х10-4) по сравнению с условно здоровыми женщинами (группа сравнения - 8%). 171 Аналогичная тенденция по L.gasseri получена и для группы с вагинитом (р=0,08). Полученные результаты согласуются с данными, приведенными в ряде публикаций. Защитная роль лактобактерий, по меньшей мере, обусловлена двумя факторами, это выработкой молочной кислоты и перекиси водорода. В работе Дж. Равель показана зависимость рН-среды от вида лактобактерий. Наиболее кислая среда (рН=4,0±0,3) во влагалищном отделяемом была при доминировании L.crispatus, рН=4,4±0,6 – при доминировании L.iners [255]. Antonio M.A. и соавт. отмечают, что большинство штаммов L. crispatus, выделенных из влагалища и кишечника, являются хорошими производители перекиси водорода, в то время как большинство штаммов L. iners ее не продуцируют [72]. Помимо этого Rampersaud R. выделил и охарактеризовал токсин инеролизин, выделяемый L.iners, аналогичный интермедилизину Streptococcus intermedius и вагинолизину Gardnerella vaginalis, роль которых в патогенезе дисбиотических процессов доказана [253]. Согласно литературным данным большинство штаммов L. jensenii, L. gasseri являются хорошими продуцентами H2O2 [302]. Однако при доминировании L.jensenii и L.gasseri влагалищная среда становится менее кислой (соответственно рН=4,7±0,4 и рН=5,0±0,7), чем при доминировании L.crispatus (рН=4,0±0,3) [255]. Verstraelen Н. и соавт., описывая состав микрофлоры влагалища беременных женщин 9 и 32 недели гестации, пришли к заключению, что доминирование L.crispatus обеспечивает стабильное состояние экосистемы. Микрофлора, включающая L. jensenii вызывает промежуточное состояние стабильности, а при доминировании L.iners и L.gasseri состояние системы наименее стабильно [308]. Нами получены новые данные о влиянии L.iners на уровень экспрессии цитокинов (табл.20, рис.29). Выявлено, что доминирование L.iners в составе лактофлоры в группе сравнения ассоциировано с легким провоспалительным фоном, аналогичным изменениям при вагинитах и БВ. 172 При дисбиотических процессах выявлены образцы без лактобактерий. Их доля составила 4% - при вагинитах и 9% при БВ (табл.16, рис.21). Интересен и тот факт, что при значительном снижении доли нормофлоры в некоторых образцах (3% в группе женщин с вагинитом) доминирующим видом была L.vaginalis. Хотя статистически значимые различия по сравнению с группой условно здоровых женщин не получены, данный факт заслуживает дальнейшего исследования. 4.1.5. Транскрипционные профили в клетках соскобов слизистой влагалища при вагинитах Дисбиотические процессы во влагалище, обусловленные чрезмерным размножением УПМ, приводят к стимуляции клеток иммунной системы и эпителия, что проявляется экспрессируемых клетками. высококонсервативных в изменении Известно, структур что профиля при микроорганизмов цитокинов, взаимодействии с паттерн- распознающими рецепторами, прежде всего толл-подобными рецепторами TLR-2, TLR-4 на поверхности макрофагов, дендритных и других клетках врожденного иммунитета, происходит активация синтеза ряда провоспалительных цитокинов TNF-а, IL-1ß, IL-6, IL-8, IL-12 [16; 203]. Данные маркеры могут быть использованы для оценки локальной воспалительной реакции во влагалище. В результате исследования локальных транскрипционных профилей генов иммунного ответа методом ОТ-ПЦР в режиме реального времени установлено, что вагиниты сопровождаются повышением уровня экспрессии мРНК генов IL8, TLR2, TLR4, IL1B, IL10, CD69, CD45, TNF и снижением уровня экпрессии мРНК генов IL18, GATA3, CD68, IL12A, RORC, TGFB1 (табл.18, табл.19, рис.26, рис.27). В случаях с низким уровнем экспрессии генов транскрипционные профили оценены, как качественные показатели (рис.28). Частота получения положительных результатов для мРНК генов IL6, IFNG, IL2Ra, TBX21, GNLY была достоверно выше при вагинитах. 173 Увеличение количества транскриптов генов толл-подобных рецепторов TLR2, TLR4, провоспалительных цитокинов IL1B, TNF, IL6, IL8, маркеров активированных Т-клеток CD69, IL2Ra, общего лейкоцитарного антигена СD45, маркера НК-клеток и цитотоксических лимфоцитов GNLY, маркеров активации Th1-лимфоцитов TBX21 и IFNG при вагинитах соответствует ожидаемым результатам. Увеличение экспрессии этих генов свидетельствует об активации клеток врожденного и адаптивного иммунитета, что соответствуют данным литературы [65; 71; 79; 92; 97; 148; 170; 189; 284; 285; 290; 315; 334]. Ключевую роль в иммунном ответе при бактериальных и грибковых инфекциях играют макрофаги, нейтрофилы и натуральные киллеры, обеспечивающие фагоцитоз и уничтожение возбудителя непосредственно на слизистых оболочках нижних отделов репродуктивной системы. Фагоцитоз сопровождается синтезом в макрофагах ряда цитокинов (TNF-α, IL-1β, IL-6, IL-8 и др.), сигнализирующих о внедрении патогенов и обеспечивающих привлечение клеток иммунной системы в очаг воспаления. Эффективность фагоцитоза обеспечивается вовлечением в данный процесс CD4+ Т-хелперов 1 типа (Th1-лимфоцитов), которые вырабатывают IFN-γ, тем самым усиливая фагоцитирующие функции макрофагов. IFN-γ является наиболее сильным стимулятором макрофагов (микробоцидной активности, продукции цитокинов), он повышает экспрессию МНСI и МНСII, а также молекул адгезии на эндотелиальных клетках, увеличивая проницаемость эндотелия. Важную роль в иммунном ответе при вагинитах помимо макрофагов и нейтрофилов играют дендритные клетки. Главным образом, ДК способны поглощать пептидные фрагменты, переходить из периферической ткани в лимфатические узлы и запускать дифференцировку примитивных Th0лимфоцитов по Th1-типу. Распознавание патогенов дендритными клетками осуществляется через TLR. Активированные макрофаги и некоторые дендритные клетки экспрессируют CD68 [264; 289]. Ожидали повышение экспрессии данного маркера при вагинитах. 174 Важность IL-12 и IL-18 при инфекционных процессах определяется их участием в дифференцировке Тh0 в Th1-лимфоциты [221], следовательно, способностью стимулировать выработку IFN-γ. Показано, что при экспериментальном кандидозе у мышей рекомбинантный IL-12 значительно повышает эффективность антифунгальной терапии за счет повышения синтеза IFN-γ [29]. Вопреки ожидаемым результатам в нашем исследовании было показано, что уровень эксрессии мРНК генов IL12А и IL18 (основных индукторов Th1-ответа) снижен. Снижение количества транскриптов генов IL12A, IL18 и CD68 может быть вызвано тем, что клональная пролиферация и презентация антигенов осуществляются в региональных лимфоидных органах, а не локально [99]. IL-18 относится к сем. IL-1, синтезируется ввиде неактивного предшественника без сигнального пептида и остается в качестве внутриклеточного цитокина. В отличие от IL-1ß IL-18 конститутивно присутствует в мононуклеарных клетках крови здоровых людей, в эндотелиальных клетках, в эпителиальных клетках желудочно-кишечного тракта, кератиноцитах и других эпителиальных клетках [248]. Значение этой фоновой экспрессии в настоящее время не исследовано. Переход в активную форму осуществляется каспазой-1, при этом 80% предшественника остается внутри клетки. Активная форма IL-18 взаимодействует со своими рецепторами, различной степени аффинности. Рецепторы, представленные α-цепью IL-18 (IL-18Ra) обладают низкой аффинностью. Комплекс, включающий ß-цепь IL-18 (IL-18Rα – IL-18Rß) имеет высокое сродство к IL-18. Связывание IL-18 с высоко аффинными рецепторами приводит к запуску реакций, схожих с действием IL-1ß: активацией MyD88, четырех IRAK, TRAF-6, синтезом транскрипционного фактора NFκB и провоспалительных цитокинов IL-8, IL-32, регулирующего синтез IL-1ß и TNF-α [312]. Для активации клеток с высокоаффинными рецепторами требуется высокий уровень IL-18 (10-20 нг/мл и более), в то время как IL-1α или IL-1β активны в концентрациях пикограмм на миллилитр [186]. 175 IL-18 в присутствии IL-12 и IL-15 индуцирует в Тh1-лимфоцитах и НКклетках синтез IFN-γ. Полагают, что IL-12 и IL-15 увеличивает экспрессию IL-18Rβ, что очень важно для передачи сигнала, опосредованного IL-18. Ряд исследователей полагает, что IL-18 без IL-12 или IL-15 играет определенную роль в аутоиммунных заболеваниях [221]. Другие исследователи считают, что аутоиммунные заболевания, такие как системная красная волчанка, ревматоидный артрит, сахарный диабет типа 1, болезнь Крона, псориаз и трансплантат против хозяина опосредованы высокой продукцией IL-18, активацией им НК-клеток и ролью НК клеток в патогенезе аутоиммунных заболеваний [105]. Снижение уровня экспрессии мРНК гена IL18, вероятно, направлено на снижение факторов риска развития аутоиммунных процессов при хроническом воспалении слизистой влагалища. IL-12 состоит из двух субъединиц – р35 (кодирует ген IL12A) и р40 (кодирует ген IL12В), связанных между собой дисульфидными мостиками. Большинство клеток организма продуцируют только субъединицу IL-12p35, которая считается биологически не активной, но при этом наличие и предназначение фоновой экспрессии не исследовано. Субъединица IL-12p40 продуцируется в основном макрофагами и дендритными клетками. Экспрессия обеих субъединиц в одной клетке приводит к формированию биологически активной молекулы IL-12 [17]. Функцией IL-12, как уже отмечалось ранее, является поляризация наивных Th0 в Th1-лимфоциты. Он вызывает пролиферацию и дифференцировку Th1-лимфоцитов [288]. Вместе с тем IL-12 блокирует развитие Th2-ответа и продукцию IgEи IgA [168]. IL-10, TGF-β1 являются иммуносупрессорами. Полагают, что одними из продуцентов этих цитокинов у человека являются Т-регуляторные клетки. Существует точка зрения, что диссеминация Candida spp. в организме и хронизация процесса сопровождается иммунорегуляторными изменениями в звене адаптивного иммунитета, связанными с повышением IL-10 и TGF-β1 в крови [56]. Наши исследования показали, что мРНК гена TGFВ1 176 присутствует в клетках вагинальных соскобов в большом количестве. Однако количество транскриптов гена TGFB1 соскобах из влагалища понижается при вагинитах и БВ. Количество мРНК гена IL10 напротив повышается при вагинитах и БВ, что согласуется с данными Lilic D. при кандидозе [191] и Yasodhara P. при БВ [329]. Описаны некоторые механизмы супрессорного действия С.albicans на иммунную систему хозяина. В частности белок р43 гриба С.albicans обладает способностью стимулировать синтез противовоспалительных цитокинов IL-4 и IL-10 [304]. Очевидно, что при дисбиозах влагалищной микрофлоры очень важен баланс провоспалительных и иммуносупрессорных цитокинов. Провоспалительные цитокины обеспечивают развитие и полноценное функционирование всех стадий иммунных реакций против возбудителей. Противовоспалительные цитокины сдерживают чрезмерную активность воспалительного процесса и не дают ему перейти в разряд патологических. Вклад в пул транскриптов генов иммунного ответа вносят не только клетки иммунной системы, но и эпителий. Клетки эпителия слизистой оболочки влагалища не только создают механический барьер для инфекционных агентов, но также принимают участие в процессинге и презентации чужеродных антигенов (АГ), а также вырабатывают множество медиаторов иммунной системы, которые непосредственно осуществляют и регулируют как врожденный, так и адаптивный иммунитет [90]. В исследованиях in vitro эпителиальных клеток слизистой влагалища выявлено дифференциальное влияние секреторных продуктов различных микроорганизмов на функциональное состояние слизистой эпителиальных клеток, проявляющихся в повышении продукции цитокинов IL-1ß, IL-6, IL-8, TNF-α [26; 283]. В исследовании многослойной культуры эпителиальных клеток влагалища были смоделированы условия антигенной стимуляции TLR соответствующими паттернами микроорганизмов, определены изменения в экспрессии цитокинов, связанные с повышением IL-1ß, IL-6, IL-8, TNF-α, 177 G-CSF, GM-CSF, MIP-1ß, RANTES, IL-1ra, а также определена защитная роль культур синантропных бактерий Lactobacillus crispatus, L.jensenii и L.rhamnosus [261]. В последнее время огромная роль при оппортунистических вагинальных инфекциях отводится факторам воздействия на макроорганизм метаболитов, образуемых условно-патогенными микроорганизмами. Экзо- и эндоферменты грибов рода Candida, стрептолизины, стрептокиназы, гиалуронидазы, липопротеиназы коккобацилярной флоры приводят не только к гибели и дисфункции лейкоцитов, но к деградации и повышенной десквамации эпителиоцитов [7; 45]. Нейтрализация метаболитов осуществляется главным образом секреторными иммуноглобуллинами IgA [29]. На фоне активации гуморального звена адаптивного иммунитета ожидали повышение уровня экспрессии гена GATA3. Как известно, транскрипционный фактор GATA3 отвечает за дифференцировку Th0 в Th2лимфоциты [215]. Однако в результате исследования выявлено снижение уровня экспрессии мРНК данного маркера при вагинитах и БВ (табл.18, табл.19, рис.26, рис.27). Однако известно, что GATA3 экспрессируется не только иммунокомпетентными, но и некоторыми другими типами клеток. В частности он играет важную роль в поддержании гомеостаза эпителия [153]. Известно, что воспалительные процессы в коже при псориазе сопровождаются активной десквамацией и пролиферацией эпидермиса, а также понижением уровня экспрессии мРНК гена GATA3 [250]. По аналогии, снижение уровня экcпрессии мРНК гена GATA3 при вагинитах может быть связано с процессами десквамации и физиологической регенерации эпителия влагалища. Функции GATA3 в местном иммунитете слизистой влагалища могут отличаться от функций в региональных лимфатических узлах и требуют дальнейшего исследования. 178 Таким образом, транскрипционный профиль при воспалительных заболеваниях следует рассматривать не только в контексте воздействия макроорганизма на инфекционные агенты с целью их уничтожения, но и необходимости репарации поврежденных тканей. Помимо этого, учитывая, что цитокины обладают плейотропными свойствами, возможно, в местном иммунитете слизистых у цитокинов могут быть и другие функции, которые требуют дальнейших исследований. Заслуживает внимания тот факт, что для беременных и небеременных женщин, а также для вагинита и бактериального вагиноза (за исключением двух маркеров TNF и RORC при БВ) были отмечены аналогичные изменения транскрипционного профиля, что свидетельствует о реализации одних и тех же механизмов воспалительного процесса вне зависимости от типа возбудителя. Прежде всего, речь может идти о механизмах врожденного иммунитета. Некоторые исследователи расценивают БВ не как инфекционновоспалительное заболевание, а как синдром и даже как вариант нормы. Этот взгляд на проблему основан на том, что в половине случаев БВ протекает бессимптомно, не вызывает такого мощного воспалительного ответа как трихомониаз или кандидоз. Несмотря на то, что бактериальный вагиноз до сих пор рассматривается, как невоспалительный синдром [6; 122], есть данные о повышении локального уровня провоспалительных цитокинов у женщин с бактериальным вагинозом [92; 286]. Помимо этого доминирование УПМ приводит к разрушению слизистого слоя (муцина), который является естественным барьером на поверхности эпителия влагалища. При разрушении слизистого слоя обнажается эпителий, это дает возможность УПМ паразитировать на его поверхности. Согласно современным представлениям о дисбиозах, выделяют несколько этапов в развитии инфекционного процесса [14; 15; 47]. Первый этап включает адгезию микробов на эпителиальных клетках. Второй этап – это усиленное размножение микроорганизмов, которое приводит к вагинальному дисбиозу. 179 Если происходит колонизация влагалища преимущественно облигатноанаэробными бактериями, то речь идет о бактериальном вагинозе. Третий этап – поражение эпителиальных клеток, проникновение УПМ в подлежащие ткани, индукция местной воспалительной реакции, что клинически манифестируется как вагинит. Таким образом, принципиально различать два фактора, описывающих состояние слизистой влагалища: характеристика биоценоза и состояние локального иммунитета, включая наличие воспалительной реакции. В настоящее время два этих понятия пытаются объединить в одном термине (бактериальный вагиноз, вульвовагинальный кандидоз или вагинит). К сожалению, все многообразие вариантов состояния слизистой влагалища не укладываются в нескольких используемых в настоящее время терминах. С позиций состояния микробиоценоза слизистой влагалища более уместным было бы использование терминов «аэробный дисбиоз», «вульвовагинальный кандидоз», «анаэробный дисбиоз» (или «бактериальный вагиноз»). Как перечисленных показывает выше практика, дисбиотических клиническая состояний манифестация может быть как бессимптомной, так и сопровождаться наличием локальной воспалительной реакции. С позиций наличия локальной воспалительной реакции более уместным было бы использование терминов «вагинит» и «отсутствие воспаления» (или «бессимптомное носительство»). 4.1.6. TNF, TLR4, GATA3 и IL18 – маркеры объективной интегральной оценки локальной воспалительной реакции во влагалище На основании полученных результатов об особенностях экспрессии транскрипционного профиля генов иммунного ответа в соскобах отделяемого слизистой влагалища при вагинитах был разработан и предложен к практическому использованию способ интегральной оценки локальной воспалительной реакции по уровню экспрессии мРНК 4 генов TNF, TLR4, IL18 и GATA3. 180 При использовании нового метода оценки наличия локальной воспалительной реакции большая часть образцов при кандидоносительстве (94,7%) определены как норма (табл.21, рис.31, рис.32). В то время как при условном нормоценозе с Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл в 40% случаев отмечено наличие локальной воспалительной реакции. Вопрос о роли уреаплазм в патогенезе воспалительных заболеваний половых путей до сих пор остается неоднозначным. В период с 1986 по 1998 года данный микроорганизм рассматривался как инфекция, передаваемая половым путем [157]. Ureaplasma spp. может вызывать уретриты, циститы, с уреаплазмой попрежнему связывают преждевременные роды. Данный микроорганизм выявляется и у здоровых женщин. Однако некоторые авторы полагают, что присутствие уреаплазмы в количестве более 104 КОЭ, может свидетельствовать об инфекционном процессе [157]. Разработанный нами способ определения локальной воспалительной реакции может быть полезным инструментом определения воспаления при наличии Ureaplasma spp. Согласно полученным данным и в соответствии с предложенной моделью определения локальной воспалительной реакции, бактериальный вагиноз в половине цитокинового Полеченные профиля, нами случаев (47,3%) характерным результаты не для сопровождается изменением воспалительного подтверждают процесса. представление о бактериальном вагинозе, как невоспалительном синдроме. Однако они соответствуют данным IUSTI, согласно которым бактериальный вагиноз рассматривается как этиологический фактор вагинита [277]. Разработанный нами способ определения локальной воспалительной реакции может быть полезным инструментом определения воспаления при анаэробных дисбиозах. При сравнении предлагаемого нового способа интегральной оценки наличия локальной воспалительной реакции с традиционно используемыми методами диагностики вагинитов (микроскопия мазков, клиническая диагностика на основании жалоб пациентки и результатов клинического 181 осмотра) определены лучшие диагностические характеристики теста (табл.24, табл.25). Помимо этого, предлагаемый метод является более объективным, чем сравниваемые традиционные методы диагностики вагинитов. Оригинальность нашего исследования состоит в использовании индексов соотношения экспрессии генов и интегрального критерия оценки локальной воспалительной реакции на основе транскрипционных профилей. Основное преимущество такого подхода - это улучшение диагностических характеристик предлагаемых тест-систем (повышение чувствительности и специфичности) по сравнению с использованием отдельных маркеров (табл.22, рис.33, рис.34, рис.35). К другим преимуществам такого способа интерпретации транскрипционных профилей следует отнести исключение из исследования референсных генов. Исключение референсных генов снимает вопросы нормировки, нивелирует ошибки нормировки, сокращает количество маркеров, что существенно упрощает исследование. Специфика используемых в ПЦР праймеров для определения транскриптов состоит в отсутствии амплификации на геномной ДНК, что также упрощает исследование за счет исключения этапа обработки образцов ДНК-азой и исключения из тотального контроля отрицательных образцов, не прошедших через реакцию обратной транскрипции. Таким образом, уже в настоящее время предлагаемый метод оценки локальной воспалительной реакции существенно упрощен и адаптирован к использованию в рутинной практике, он сопоставим с определением ДНК инфекционных агентов. ПЦР-технологии продолжают совершенствоваться. Тенденции последнего времени состоят в уменьшении объемов реакционных смесей, создании мультиплексных систем, автоматизации большинства стадий реакции, возможности постановки в одной пробирке реакции обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции. Метод имеет большие 182 перспективы дальнейшего развития. Новые разработки в будущем еще больше упростят исследование и значительно понизят его стоимость. Помимо этого к преимуществу использования ПЦР и ОТ-ПЦР в рутинной практике можно отнести возможность идентификации в одном и том же клиническом образце ДНК микроорганизмов, маркеров локального воспаления, а при необходимости и факторов генетической предрасположенности к развитию инфекционных заболеваний. 4.1.7. Актуальность определения дисбиотических и воспалительных процессов во влагалище для прогнозирования и предупреждения акушерских осложнений В ходе проведенного исследования установлено, что дисбиотические и воспалительные процессы слизистой влагалища во время беременности приводят к акушерским осложнениям. Установлено, что осложнения родов и послеродового периода чаще возникали у пациенток с признаками воспаления слизистой влагалища (OR=3,7(1,3-10,5), p=0,01) и подгруппе 1В с Ureaplasma spp. в количестве более 104 ГЭ/мл (OR=4,1(1,2–13,3), p=0,016) по сравнению с подгруппой 1А (табл.26). Наиболее часто встречающимися осложнениями родового акта были преждевременное излитие околоплодных вод и разрывы мягких тканей родовых путей, послеродового периода – субинволюция матки, раневая инфекция, послеродовой эндометрит. У женщин с бессимптомным носительством грибов не было ни одного случая осложнений родов и послеродового периода. В то время как у женщин с кандидозным вагинитом осложнения родов и послеродового периода отмечались в 73% случаев (OR=73,5(2,9-1882), p=7,6х10-4). Полученные результаты согласуются беременности более, с чем литературными в 40% данными, случаях ВВК, что носит во время характер бессимптомного кандидоносительства и не вызывает осложнений [277]. Таким образом, Candida spp. может рассматриваться как фактор риска 183 осложнений родов и послеродового периода только при наличии локальной воспалительной реакции. Предлагаемый нами метод оценки транскрипционных профилей у беременных женщин перед родами, в частности интегральный критерий оценки локальной воспалительной реакции во влагалище, может быть полезным инструментом в акушерской практике с целью прогнозирования осложнений родов и послеродового периода и их предупреждения. 4.1.8. Генетически обусловленная пониженная экспрессия TNF-α и TGF-ß1 – фактор предрасположенности к развитию вагинитов С целью установления генетических факторов предрасположенности к развитию вагинитов были исследованы 23 полиморфизма генов цитокинов. При сравнении результатов у женщин с вагинитами выявлены достоверные различия в частоте встречаемости аллеля А локуса TNF –238 G>A (OR=0,21 (0,07-0,68), p=0,004) и аллеля С локуса TGFB1 -509 C>T (OR=1,8 (1,1-2,9) p=0,015), чем в группе сравнения (рис.40). В группе женщин с вагинитами достоверно реже отмечен редкий гетерозиготный генотип GA локуса TNF –238 G>A (OR=0,19 (0,06-0,64), p=0,0035, аутосомно-доминантная модель), чем в группе сравнения (рис.41). Аллель А локуса TNF –238 G>A является протективным в отношении вагинитов. Ген TNF картирован на хромосоме 6p21.3, имеет размер 2762 п.н. и содержит 4 экзона. Продукт этого гена является одним из основных медиаторов воспалительного процесса и активации лейкоцитов, индуцирует экспрессию молекул адгезии и хемокинов на эндотелии, стимулирует продукцию IL-1, IL-6, IL-8, IFN-γ, является одним из важных факторов защиты от внутриклеточных паразитов и вирусов, может индуцировать апоптоз клеток-мишеней [32]. Известны более 30 полиморфных вариантов гена, но только около половины из них влияют на экспрессию TNF-α in vitro. Два полиморфизма в промоторной области гена –238 G>A (rs361525) и 184 -308 G>A (rs1800629) по отношению к сайту начала транскрипции содержат замену гуанина на аденин. В исследованиях этих полиморфизмов in vitro показано увеличение продукции TNF-α в ответ на стимуляцию липополисахаридами [83; 192]. По-видимому, высокая экспрессия TNF-α в ответ на стимуляцию паттернами условно-патогенных микроорганизмов эффективно рекрутирует иммунокомпетентные клетки и способствует своевременной элиминации возбудителя на ранних стадиях заболевания. Помимо этого в группе женщин с вагинитами достоверно чаще отмечен гомозиготный генотип СC локуса TGFB1 -509 C>T (OR=2,3(1,2-4,4), p=0,016, аутосомно-рецессивная модель), чем в группе сравнения (рис.41). Генотип СС локуса TGFB1 -509 C>T является фактором риска развития вагинита. Ген TGFB1 картирован на хромосоме 19q13.1, имеет размер 23403 п.н. и содержит 7 экзонов. Продукт этого гена регулирует клеточные процессы пролиферации, дифференцировки, адгезии, апоптоза, миграции, воспаления, фиброза, заживления ран и ангиогенеза [201]. Рецепторы к TGF-ß1 расположены на многих клетках, поэтому данный пептид является одним из основных регуляторов экспрессии других ростовых факторов, выступая в роли как стимулирующего, так и ингибирующего фактора. По отношению к иммунным клеткам ведет себя, как иммуносупрессорный фактор. Полиморфный вариант Т локуса TGFB1 -509 С>T (rs1800469) содержит замену цитозина на тионин и приводит к повышению уровня экспрессии этого цитокина [135]. По-видимому, высокая экспрессия TGF-ß1 способствует своевременной остановке воспалительного процесса и не дает ему перейти в разряд патологических на поздних стадиях заболевания. Генетическая предрасположенность к пониженной экспрессии TNF-α (носительство аллельного варианта G) и TGF-ß1(носительство генотипа СС) являются факторами риска развития вагинита. Согласно гипотезе Simhan H.N. и соавт. для поддержания влагалищной экосистемы в норме 185 необходим сбалансированный иммунный ответ, недостаточность иммунного ответа может приводить к персистенции возбудителя [280]. Факторы риска развития воспалительных заболеваний ассоциированы с “дикими” и более распространенными в популяции аллелями, что возможно и обуславливает широкое распространение данной гинекологической патологии. Заключение: в результате проведенного исследования установлено, что исследование широкого спектра патогенных и условно-патогенных микроорганизмов при вульвовагинитах и бактериальном вагинозе является целесообразным для точной идентификации и количественной оценки этиологических агентов заболевания. Количественное определение лактобактерий также информативно для оценки стабильности состояния микробиоценоза влагалища. При доминировании в составе нормофлоры L.crispatus состояние системы наиболее стабильно, с доминированием L.iners и L.gasseri связаны риски развития дисбиотических процессов во влагалище. L.crispatus, L.iners, L.gasseri, а также L.jensenii чаще всего являются доминирующими видами в составе нормофлоры. Типирование и количественная оценка по меньшей мере этих 4 видов (L.crispatus, L.iners, L.gasseri и L.jensenii) представляется целесообразной. Виды лактобактерий, входящих в состав кисломолочных продуктов, в составе лактофлоры влагалища в доминирующем количестве встречаются редко, их типирование не целесообразно. Помимо определения микроорганизмов, способствующих развитию воспалительных заболеваний нижних отделов половых путей женщин, немаловажное значение имеет и оценка состояния мукозального иммунитета. К практическому использованию в целях диагностики локальной воспалительной реакции во влагалище предложены 4 молекулярногенетических маркера: TNF, TLR4, IL18 и GATA3. В качестве молекулярно-генетических маркеров предрасположенности к развитию вагинитов определены 2 из 23 исследованных полиморфизмов 186 генов иммунного ответа. Установлена генетическая предрасположенность к развитию воспалительных заболеваний нижних отделов половых путей у носителей генотипа СС локуса TGFB1 -509 C>T (OR=2,3(1,2-4,4), p=0,016, аутосомно-рецессивная модель) и протективная роль аллеля А локуса TNF –238 G>A в развитии воспалительных заболеваний нижних отделов половых путей (OR=0,21(0,07-0,68), p=0,004, аутосомно-доминантная модель). 4.2. Молекулярно-генетические маркеры при хроническом эндометрите 4.2.1. Особенности транскрипционного профиля генов иммунного ответа при фиброзе стромы эндометрия В результате проведенного исследования по экспрессии генов иммунного ответа при хроническом эндометрите установлено, что максимальные изменения транскрипционного профиля наблюдаются при выраженных процессах фиброза стромы эндометрия (табл. 32, рис.43). В подгруппе 2С хронического эндометрита повышается экспрессия мРНК практически всех исследованных генов IL1В, IL6, IL8, IL10, IL12А, TNF, TGFB1, Foxp3, IL2Ra, LIF, TLR9, изоформы 121 VEGFА, TLR2, IL18, IFNG и TLR4. Казалось бы, данное состояние стоило отнести к остаточным явлениям воспалительного процесса, тем не менее активация иммунокомпетентных клеток продолжается, и направлена она на процессы репарации. Данные литературы по фиброзу стромы и склерозу спиральных артерий эндометрия очень ограничены, однако патогенез фиброза, вероятно, достаточно универсален вне зависимости от места локализации процесса. Полагают, что механизмы патогенеза фиброза связаны с повреждением эпителиальных клеток иммунокомпетентных и клеток: привлечением классических в очаг воспаления макрофагов M1, иммуносупрессорных макрофагов М2, а также сдвигом баланса Th1 < Th2 лимфоцитов [301]. Активность привлеченных иммунокомпетентных клеток 187 сопровождается синтезом как провоспалительных IL-1ß, IL-6, IL-8, IL-12, TNF-α, так и иммуносупрессорных цитокинов IL-10 и TGF-ß1. Роль Трегуляторных клеток в данном процесса в настоящее время не выяснена. Полагают, что TGF-ß1 является одним из основных медиаторов формирования фиброза [301]. TGF-ß1 – это полифункциональный цитокин. Он синтезируется регуляторными Th3 и Tr1-клетками, вызывает усиление экспрессии Foxp3 и дифференцировку естественных Т-регуляторных клеток, тем самым ограничивая активацию клеток иммунной системы, не позволяя воспалительной реакции перейти в гиперергическую фазу [17]. С другой стороны, TGF-ß1 стимулирует выработку других ростовых факторов. Факторы роста фибробластов (FGF) стимулируют избыточную пролиферацию соединительной ткани, а сосудистый эндотелиальный ростовой фактор (VEGFA) способствуют ангиогенезу и усиливает сосудистую проницаемость. Кроме того TGF-ß1 является активатором транскрипции мРНК гиалуронсинтетазы, участвующей в синтезе гиалуроновой кислоты, которая вырабатывается в основном фибробластами. Гиалуроновая кислота — несульфированный гликозаминогликан, входящий в состав соединительной ткани, представляет собой один из основных компонентов внеклеточного матрикса. Накопление гиалуроновой кислоты может приводить к фиброзу и склерозу. Фиброз представляет собой процесс накопления протеинов внеклеточного матрикса и уплотнения соединительной ткани с появлением рубцовых изменений, а склероз — замену паренхимы органов плотной соединительной тканью [55]. Другой механизм фиброза может начинаться через активацию TLR-9, что было доказано для пациентов, склонных к быстро прогрессирующему идиопатическому фиброзу иммунокомпетентных легких. клетках Экспрессия пациентов с белка TLR-9 в прогрессирующим идиопатическим фиброзом легких была существенно выше, чем при медленно прогрессирующих формах и в нормальной ткани. Культуры клеток фибробластов, полученных из материала 188 биопсии пациентов с прогрессирующим идиопатическим фиброзом легких, на стимуляцию синтетическими CpG-олигонуклеотидами (CpG-ODN) реагировали и синтезировали целый ряд хемокинов PDGF-BB, CXCL8 (IL8), CXCL1, CCL5, CCL7, CCL11 и CCL2. CCL2, в частности, является мощным профибротическим посредником в легких [154]. Оба этих маркера мРНК генов TGFB1 и TLR9 были повышены в 5 раз в группе с фиброзом стромы эндометрия (p<0,001), чем в группе сравнения. Фиброз и склероз стромы эндометрия могут рассматриваться, как более тяжелые формы ХЭ, требующие наибольшего внимания. В связи с этим был разработан способ локального воспаления, сопровождающегося выраженными процессами фиброза стромы. Способ включает интегральную оценку экспрессии мРНК генов 6 цитокинов: IL1B, IL2, IL10, Foxp3, TLR9 и IL2Ra. Согласно полученным данным (рис.45) примерно 30% пациенток с хроническим эндометритом, гистологически верифицированным как полный симптомокомплекс ХЭ и лимфоидная инфильтрация стромы лимфоцитами, попадают в группы риска развития прогрессирующего фиброза. 4.2.2. Роль инфекционных агентов в патогенезе хронического эндометрита Несмотря на то, что инфекционные агенты рассматриваются в качестве основного этиологического и «пускового» фактора заболевания, по различным оценкам только в 39-76% случаев удается выявить возбудитель инфекционного процесса [44; 55; 112]. Предполагают, что антиген персистирующей инфекции «запускает» иммунный ответ, который далее реализуется, как реакция гиперчувствительности замедленного типа [44]. По данным Краснопольского В. И. и соавт., спектр микроорганизмов, выявленных при ПЦР-диагностике содержимого полости матки у пациенток с ХЭ, включает в себя: хламидиоз — в 14,9% случаев, генитальный герпес — в 33,6%, уреаплазмоз — в 37,8%, микоплазмоз — в 11,6%, ЦМВ — в 18,9% случаев [25]. 189 Рудакова Е.Б. и соавт. при микробиологическом исследовании содержимого полости матки пациенток с неудачами ЭКО и морфологически подтвержденым ХЭ в 76% случаев выявили возбудитель инфекционного процесса, в том числе Enterococcus fecalis — 20%, Staphylococcus spp. — 16%, Ureaplasma urealyticum— 24%, ВПГ — 12%, ЦМВ — 8%. В большинстве случаев они наблюдали ассоциации микроорганизмов. У 24% пациенток проведенное исследование не позволило выявить возбудитель [44]. Согласно полученным нами данным, частоты выявления данных микроорганизмов в биоптатах эндометрия существенно ниже (табл.29): C.trachomatis – 1,3%, Ureaplasma spp. – 15,2%, Mycoplasma spp. – 2,6%, CMV – 2,6%, HSV 1 и 2 типов - не выявлен. Положительные результаты на наличие микроорганизмов в биоптатах эндометрия получены нами в 45,3% случаев. Установлено, что ведущую роль в бактериальной обсемененности эндометрия играют условно-патогенные микроорганизмы: Enterobacteriaceae – 25,3%, Gardnerella vaginalis/ Prevotella spp./ Porphyromonas spp. – 17,7%, идентифицированы также такие микроорганизмы, как Streptococcus agalactiae – 2,6%, Staphylococcus spp. – 3,8%, Enrerococcus spp. -2,6%, Atopobium vaginae – 5,1%, Peptostreptococcus spp. – 1,3%, Eubacterium spp. – 6,3% и другие. Возможно, что более низкие частоты выявления микроорганизмов в биоптатах тканей эндометрия в нашем исследовании связаны с более тщательным взятием материала: санацией половых путей и использованием пайпеля с внутренним поршнем, не соприкасающимся со стенками влагалища. 4.2.3. Особенности транскрипционных профилей при полном симптомокомплексе хронического эндометрита и лимфоидной инфильтрации стромы В ходе проведенного исследования установлено, что в подгруппах с полным симптомокомплексом ХЭ (подгруппа 2А) и лимфоидной инфильтрацией стромы лимфоцитами и плазмоцитами (подгруппа 2В) 190 наблюдаются схожие изменения экспрессионного профиля (рис.43, табл.31) по сравнению с группой условно здоровых женщин. Они связаны с повышением экспрессии мРНК генов провоспалительных цитокинов IL1B, IL6, IL8, IL12А, TNF, иммуносупрессорных цитокинов IL10 и TGFB1, транскрипционного фактора Foxp3, толл-подобных рецепторов TLR2 и TLR9, а так же LIF, VEGFA и IL2Ra; экспрессия мРНК генов других цитокинов практически не изменяется IL18, IFNG, TLR4, а для IL2 характерна даже тенденция к снижению (р=0,12, р=0,14 в группах 2А и 2В соответственно). Похожие изменения экспрессии цитокинов в двух подгруппах 2А и 2В согласуются и подтверждают данные литературы о наличии полного симптомокомплекса и неполных форм ХЭ [27; 50; 58]. Женщин, у которых в результате гистологического исследования тканей эндометрия выявлена только лишь лимфоидная инфильтрация, можно рассматривать, как женщин с хроническим эндометритом. Повышение целого ряда цитокинов и отсутствие маркеров, снижающихся при ХЭ в подгруппах 2А и 2В, может быть связано с патогенетическими особенностями ХЭ и клеточными ассоциациями, участвующими в хроническом воспалительном процессе, в частности с увеличением общего пула иммунокомпетентных клеток в связи с инфильтрацией стромы лимфоцитами. Как полагают, наиболее информативным показателем наличия хронического эндометрита является присутствие в строме плазматических клеток [173]. Одним из ключевых цитокинов, поддерживающих функциональную активность плазматических клеток, является IL-4. При хроническом эндометрите с полным симптомокомплексом (подгруппа 2А) и лимфоидной инфильтрацией стромы лимфоцитами (подгруппа 2В) (рис.43, табл.31) отмечены тенденции к повышению данного маркера (р=0,068 и р=0,054). Синтезируется IL-4 Th2-лимфоцитами, расположенными по соседству с плазматическими клетками. IL-4 активен только в отношении Bлимфоцитов, стимулированных антигеном или другими индукторами. Он 191 способствует выработке плазмоцитами антител класса IgE и IgG4 [17]. Помимо этого IL-4 подавляет Th1-ответ. Возможно, это и определяет некоторое снижение синтеза IL-2, продуцируемого Th1-лимфоцитами. Учитывая разнонаправленный характер синтеза IL-2 и IL-4 при ХЭ, был посчитан индекс соотношения экспрессии [IL4]/[IL2] (рис.46). В подгруппе 2В данный индекс был достоверно выше и составил Me=0,11(0,06-0,021), p=0,012), чем в группе сравнения (Me=0,07(0,03-0,10)). Аналогичная тенденция отмечена и в подгруппе 2А (Me=0,13(0,04-0,21, p=0,06). Для хронического эндометрита, сопровождающегося фиброзом стромы данная тенденция не подтвердилась (Me=0,10 (0,02-0,16, p=0,61), что свидетельствует о другом функциональном состояние ткани в подгруппе 2С. Заключение: полученные в ходе исследования результаты позволяют расширить представление о патогенезе хронического эндометрита, и связать их не только с влиянием инфекционных агентов, но и с нарушением иммунных механизмов поддержания гомеостаза тканей эндометрия. К практическому следующие использованию молекулярно-генетические могут быть маркеры: рекомендованы полный спектр исследованных микроорганизмов и 6 мРНК-маркеров генов IL1B, IL2, IL10, Foxp3, TLR9, и IL2Ra для дискриминации образцов с выраженными процессами фиброза стромы эндометрия с целью выбора наиболее оптимальных схем терапии заболевания. Для идентификации на основе молекулярно-генетических маркеров эндометрита, с связанных других лимфоидной форм инфильтрацией лимфоцитами, требуются дальнейшие исследования. 192 хронического стромы ВЫВОДЫ 1. Для оценки транскрипционных профилей генов иммунного ответа разработаны 32 тест-системы на основе метода ОТ-ПЦР в реальном времени (IL1B, IL2, IL4, IL6, IL8, IL10, IL12A, IL12B, IL15, IL18, IL23, TNF, TGFB1, IFNG, LIF, VEGFA изоформы 121, 165, 189, TBX21, GATA3, RORC, Foxp3, TLR2, TLR4, TLR9, IL2Rα, CD45, CD68, B2M, HPRT1, TBP и GUSB). 2. Воспалительные процессы слизистой влагалища сопровождаются изменением транскрипционного профиля иммунокомпетентных клеток: повышается экспрессия мРНК генов IL1B, IL8, IL10, СD45, CD69, TLR2, TLR4, TNF от 1,5 до 9 раз (р<0,05), снижается экспрессия мРНК генов GATA3, CD68, IL12A, IL18, TGFB1, RORC от 2,2 до 10 раз (p<0,001). 3. Установлена генетическая предрасположенность к развитию воспалительных заболеваний нижних отделов половых путей у носителей генотипа СС локуса TGFB1 -509 C>T (OR=2,3(1,2-4,4), p=0,016, аутосомнорецессивная модель) и протективная роль аллеля А локуса TNF –238 G>A в развитии воспалительных заболеваний нижних отделов половых путей (OR=0,21 (0,07-0,68), p=0,004, аутосомно-доминантная модель). 4. Профиль экспрессии генов иммунного ответа в эндометрии зависит от фазы менструального цикла и наличия воспаления. При полном симптомокомплексе хронического эндометрита и лимфоидной инфильтрации стромы эндометрия повышен уровень экспрессии мРНК генов IL1В, IL6, TNF, LIF, IL10, TLR9, TGFB1, IL12А, IL2Ra, VEGFА от 1,5 до 2,9 раз (р<0,05). Склерозирование сосудов и фиброз стромы эндометрия сопровождаются более выраженным изменением цитокинового каскада: повышается экспрессия мРНК генов IL1В, IL6, TNF, IL8, LIF, IL10, TLR9, TGFB1, IL12A, IL18, IFNG, TLR2, Foxp3, IL2Ra, VEGF121, TLR4 от 1,7 до 16,6 раз (р<0,05). 5. Преобладание L. crispatus в составе лактофлоры ассоциировано с нормальным состоянием микробиоты влагалища. Доминирование в составе нормофлоры L. iners чаще отмечено при вагинитах (OR=4,4 (1,9-9,5), p=2,2x10-4), L. gasseri - при бактериальном вагинозе (OR=5,4 (3,1-13,6), 193 p=1,3x10-4). У условно здоровых женщин при доминировании L. iners в составе лактофлоры повышены уровни экспрессии мРНК генов IL8, TLR4, IL10, CD69, CD45 от 1,7 до 3,8 раза (p<0,05) и снижен IL18 в 1,7 (p=0,005) раза по сравнению с образцами, в которых доминирует L. crispatus. 6. При хроническом эндометрите общая бактериальная обсемененность полости матки составляет около 104 ГЭ/мл. Чаще всего флора представлена лактобактериями и условно-патогенными микроорганизмами, такими как Enterobacteriaceae (25,3%), Gardnerella vaginalis / Prevotella spp / Porphyromonas spp. (17,7%), Ureaplasma spp. (15,2%). 7. К практическому использованию предложен способ оценки вероятности наличия воспалительного процесса нижних отделов половых путей по двум индексам соотношения экспрессии мРНК 4 генов: [TNF]/[IL18] и [TLR4]/[GATA3]. Чувствительность и специфичность предложенного метода составляет 95,4% и 94,5% соответственно. 8. К практическому использованию предложен способ оценки фиброза стромы эндометрия. Данная форма хронического эндометрита может быть определена по 3 индексам отношения экспрессии мРНК 6 генов: [IL1B]/[IL2], [IL10]/[Foxp3] и [TLR9]/[IL2Ra]. Чувствительность и специфичность предложенного метода составляет 93,3% и 100% соответственно. 9. Разработан комплексный подход к диагностике вагинитов и хронического эндометрита, установлены наиболее показательные молекулярно-генетические маркеры воспалительного процесса, включающие количественную идентификацию широкого спектра микроорганизмов (30 маркеров), определение транскрипционного профиля генов иммунной системы (4 маркера при вагинитах и 6 маркеров при хроническом эндометрите) и генетические особенности организма (2 полиморфизма генов цитокинов). 194 СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых научных изданиях: 1. Донецкова А.Д., Шарова Н.И., Литвина М.М., Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю., Ярцев М.Н., Алексеев Л.П., Ярилин А.А. Регуляторные Тклетки при аллергии у детей. // Медицинская иммунология. - 2008. – Т.10. №2-3. – С.159-166. 2. Ярилин А.А., Козлов В.А., Бурменская О.В., Аметов А.С., Никонова М.Ф., Трофимов Д.Ю. Естественные регуляторные Т-клетки и связанные с ними цитокины при хроническом аутоиммунном тиреоидите. // Иммунология. – 2008. - №6. – С.357-361. 3. Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Батенева Е.И., Алексеев Л.П., Насонов Е.Л., Александрова Е.Н., Новиков А.А. Разработка комплекса тестсистем на основе ОТ-ПЦР в режиме «реального времени» для определения цитокинового профиля в мононуклеарных клетках крови и синовиальной жидкости при ревматоидном артрите. // Медицинская иммунология. - 2008. – Т.10. - №6. – С.563-570. 4. Савилова А.М., Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Алексеев Л.П., Хаитов Р.М. Метод оценки результатов РБТЛ с помощью количественной полимеразной цепной реакции. // Иммунология. - 2008. – Т.29. - №3. – С.178-182. 5. Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Донецкова А.Д., Батенева Е.И., Ярилин А.А., Алексеев Л.П. Разработка тест-системы для определения уровня экспрессии мРНК Foxp3 на основе ОТ-ПЦР в режиме реального времени. // Иммунология. - 2008. – Т.29. - №3. – С.182-187. 6. Шарова Н.И., Донецкова А.Д., Топтыгина А.П., Митин А.Н., Литвина М.М., Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю., Сухих Г.Т., Алексеев Л.П., Ярилин А.А. Экспрессия цитокиновых генов и секреция цитокинов эпителиальными и лимфоидными клетками Иммунология. - 2008. – Т.29. - №6. – С.329-334. 195 тимуса человека. // 7. Ярилин А.А., Козлов В.А., Бурменская О.В., Аметов А.С., Никонова М.Ф., Трофимов Д.Ю. Влияние терапии человеческим рекомбинантным ИЛ-2 (ронколейкином) на естественные регуляторные Тклетки и связанные с ними цитокины при хроническом аутоиммунном тироидите. // Иммунология. - 2009. - № 2. - С.120-123. 8. Байрамова Г.Р., Муравьева В.В., Донников А.Е., Бурменская О.В., Ворошилина Е.С., Тумбинская Л.В. Оценка эффективности комплексной терапии больных с хроническим рецидивирующим вульвовагинальным кандидозом. // Российский вестник акушера-гинеколога. - 2011. - №2. – С.86-89. 9. Fedenko E.S., Elisyutina O.G., Filimonova T.M., Boldyreva M.N., Burmenskaya O.V., Rebrova O.Y., Yarilin A.A., Khaitov R.M. Cytokine gene expression in the skin and peripheral blood of atopic dermatitis patients and healthy individuals. // Self/Nonself. - 2011. – Vol.2. - №2. – Р.120-124. 10. Филимонова Т.М., Елисютина О.Г., Феденко Е.С., Бурменская О.В., Болдырева М.Н. Влияние топических глюкокортикостероидов на экспрессию генов цитокинов в коже и периферической крови больных атопическим дерматитом. // Российский аллергологический журнал. - 2011. - №3. – С.19-30. 11. Бурменская О.В., Байрамова Г.Р. Непша О.С. Донников А.Е. Цитокиновый профиль иммунокомпетентных клеток влагалища при хроническом рецидивирующем вульвовагинальном кандидозе. // Уральский медицинский журнал. - 2011. - №3. – С.44-49. 12. Бурменская О.В., Байрамова Г.Р., Непша О.С., Трофимов Д.Ю., Муллабаева С.М., Донников А.Е., Екимов А.Н. Состояние локального иммунитета при хроническом рецидивирующем вульвовагинальном кандидозе. // Иммунология. - 2011. - №3. – С.154-159. 13. Филимонова Т.М., Елисютина О.Г., Ниязов Д.Д., Болдырева М.Н., Бурменская О.В., Реброва О.Ю. Локальный и системный иммунный ответ у 196 больных тяжелым атопическим дерматитом. // Российский аллергологический журнал. - 2011. - №5. – С.10-15. 14. Сухих Г.Т., Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Байрамова Г.Р., Непша О.С., Донников А.Е., Дуринян Э.Р., Бирюкова А.М. Профиль экспрессии мРНК генов цитокинов в вагинальных мазках женщин репродуктивного возраста при неспецифическом вагините и бактериальном вагинозе. // Акушерство и гинекология. - 2011. - №7-2. – С.33-38. 15. Кудинова Е.А., Бурменская О.В., Боженко В.К., Васкевич В.Ф., Непша О.С., Мельникова Н.В., Троценко И.Д., Трофимов Д.Ю., Сухих Г.Т. Экспрессия маркеров апоптоза при раке молочной железы. // Технологии живых систем. - 2011. – Т.8. - №7. – С.40-44. 16. Смольникова В.Ю., Краснощока О.Е., Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю., Калинина Е.А., Сухих Г.Т. Возможности прогнозирования исходов вспомогательных репродуктивных технологий по уровню спермальных мРНК. // Акушерство и гинекология. - 2012. - №2. – С.36-40. 17. Меджидова М.К., Бурменская О.В., Донников А.Е., Непша О.С., Трофимов Д.Ю., Тютюнник В.Л., Сухих Г.Т. Оценка локальной воспалительной реакции во влагалище по профилю экспрессии мРНК генов цитокинов у беременных накануне родов. // Акушерство и гинекология. 2012. - №3. – С.26-31. 18. Сухих Г.Т., Бурменская О.В., Смольникова В.Ю., Краснощока О.Е., Трофимов Д.Ю., Донников А.Е., Калинина Е.А. мРНК протаминов и фертилина как вспомогательных потенциальные биомаркеры репродуктивных технологий. исхода // программ Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2012. – Т.153. - №4. – С.513-515. 19. Болдырева М.Н., Царев С.В., Чулкина М.М., Савилова А.М., Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю., Ильина Н.И., Шартанова Н.В., Алексеев Л.П. Исследование экспрессии генов иммунной системы у 197 спортсменов высших достижений методом ПЦР в реальном времени. // Иммунология. - 2012. - №5. – С.231-236. 20. Чернуха Г.Е., Думановская М.Р., Бурменская О.В., Шубина Е.С., Коган Е.А., Трофимов Д.Ю. Экспрессия генов, регулирующих апоптоз, при разных типах гиперплазии эндометрия и эндометриоидной карциноме. // Акушерство и гинекология. - 2013. - №1. – С.63-69. 21. Думановская М.Р., Чернуха Г.Е., Бурменская О.В., Непша О.С., Павлович С.В., Коган Е.А., Трофимов Д.Ю. Особенности экспрессии маркеров пролиферации в гиперплазированном эндометрии. // Гинекология. - 2013. - №2. – С.4-8. 22. Бестаева Н.В., Назарова Н.М., Прилепская В.Н., Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Суламанидзе Л.А. Папилломавирусная инфекция: новые взгляды на диагностику и лечение. // Гинекология. - 2013. -№3. – С.4-7. 23. Прилепская В.Н., Назарова Н.М., Новикова Е.П., Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Безнощенко О.С. Иммунологические и молекулярнобиологические маркеры, ассоциированные с хроническим цервицитом. // Гинекология. - 2013. - №3. – С.46-51. 24. Bourmenskaya O., Shubina E., Trofimov D., Rebrikov D., Sabdulaeva E., Nepsha O., Bozhenko V., Rogovskaya S., Sukhikh G. Host gene expression profiling of cervical smear is eligible for cancer risk evaluation. // Journal of Clinical Pathology. - 2013. - Vol.66. - №4. – Р.282-285. 25. Бестаева Н.В., Назарова Н.М., Прилепская В.Н., Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Павлович С.В. Папилломавирусная инфекция, обусловленная ВПЧ 52 и 58 типов и ее роль в развитии цервикальных интраэпителиальных неоплазии. // Акушерство и гинекология. - 2013. - №7. – С.45-50. 26. Думановская М.Р., Чернуха Г.Е., Бурменская О.В., Донников А.Е., Трофимов Д.Ю. Вероятность неопластической трансформации при различных типах гиперплазии эндометрия. // Акушерство и гинекология. 2013. - №8. – С.56-62. 198 27. Тютюнник В.Л., Карапетян Т.Э, Донников А.Е., Кан Н.Е., Бурменская О.В. Изменения локального и системного иммунитета при оппортунистических инфекциях влагалища у беременных. // Акушерство и гинекология. - 2013. - №8. – С.25-29. 28. Ионов О.В., Никитина И.В., Бурменская О.В., Непша О.С., Трофимов Д.Ю., Донников А.Е., Митрохин Д.С., Припутневич Т.В., Любасовская Л.А., Дегтярев Д.Н. Роль метода ПЦР в диагностике врожденных и нозокомиальных инфекции у новорожденных. // Акушерство и гинекология.- 2013. - №11. – С.59-64. 29. Гомболевская Н.А., Бурменская О.В., Демура Т.А., Марченко Л.А., Коган Е.А., Трофимов Д.Ю., Сухих Г.Т. Оценка экспрессии мРНК генов цитокинов в эндометрии при хроническом эндометрите. // Акушерство и гинекология. - 2013. – №11. – С.35-40. 30. Бурменская О.В., Байрамова Г.Р., Непша О.С., Трофимов Д.Ю., Муравьева В.В., Абакарова П.Р., Стрельченко Д.А., Кряжева В.С., Сухих Г.Т. Видовой состав лактобактерий при неспецифических вагинитах и бактериальном вагинозе и его влияние на локальный иммунитет. // Акушерство и гинекология.- 2014. – №1. – С.41-45. 31. Пат. 2464570 Российская Федерация, МПК G01N33/53. Метод диагностики цервикальных интраэпителиальных неоплазий. / Боженко В.К., Кудинова Е.А., Близнюков О.П., Мельникова Н.В., Бурменская О.В.; заявитель и патентообладатель ФГУ "РНЦРР" Минздравсоцразвития России (RU). - № 2010147074/15; заявл. 19.11.2010; опубл. 20.10.2012, Бюл. №29 – 9 с. 32. Пат. 2417263 Российская Федерация, МПК C12Q1/68. Способ диагностики воспалительного процесса при раннем ревматоидном артрите. / Ребриков Д.В., патентообладатель Бурменская Закрытое О.В., Трофимов акционерное Д.Ю.; общество заявитель и "Научно- производственная фирма ДНК-Технология" (RU). - № 2009101460/15; заявл. 20.01.2009; опубл. 27.04.2011, Бюл. №12 – 20 с. 199 33. Пат. 2492244 Российская Федерация, МПК C12Q1/68, С12N5/00. Способ оценки степени пролиферации клеток с помощью маркерных генов методом полимеразной цепной реакции. / Савилова А.М., Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю., Ребриков Д.В.; заявитель и патентообладатель Закрытое акционерное общество "Научно-производственная фирма ДНК-Технология" (RU). - № 2008100303/10; заявл. 15.01.2008; опубл. 10.09.2013, Бюл. №25 – 16 с. Материалы симпозиумов и конференций: 34. Папуашвили М.Н., Петрова Т.В., Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю. Диагностическая значимость количественного определения РНК вируса иммунодефицита человека (ВИЧ-1) при альтернативной терапии у ВИЧинфицированных пациентов методом ОТ-ПЦР в режиме «реального времени». // Труды XIII Конгресса «Человек и лекарство». – Москва, 2006. Т.2. 35. Донецкова А.Д., Шарова Н.И., Бурменская О.В., Топтыгина А.П., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Ярилин А.А. Выработка цитокинов эпителиальными клетками тимуса человека. // Российский аллергологический журнал. - 2007. — №3-1. — С.70. 36. Донецкова А.Д., Бурменская О.В., Ярцев М.Н., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Ярилин А.А. Регуляторные Т-клетки при аллергии у детей. // Российский аллергологический журнал. - 2007. — №3-1 . — С.17. 37. Донецкова А.Д., Бурменская О.В., Ярцев М.Н., Трофимов Д.Ю., Ярилин А.А. Анализ экспрессии молекулярного маркера регуляторных клеток FOXP3 в норме и при аллергопатологии у детей. // Медицинская иммунология. - 2007. — Т.9. - № 2-3. — С.180. 38. Насонов Е.Л., Александрова Е.Н., Новиков А.А., Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В, Ребриков Д.В. Разработка комплексной технологии ранней диагностики воспалительных заболеваний на основе молекулярных маркеров иммунного ответа. // Сборник тезисов итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления 200 «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 20072012 годы». – Москва, 2007. – С.124-125. 39. Trophimov D.Y., Burmenskaya O.V, Ebzeeva M. V., Kalinina E.A., Mullabaeva S.M, Kuzjmichev L.N., Sukhikh G.T. Markers associated with success and failure of embryo transfer (ET) during IVF program. // 7th European Congress on Reproductive Immunology. / J Reprod Immunol. - 17-20 September, Marathon, Greece, 2009. - Vol.81. - P.157. 40. Vasilyev E.V., Burmenskaya O.V., Khoroshkeeva O.V., Tetruashvili N.K., Trofimov D.Y., Sukhikh G.T. Parental killer Ig-like receptor and HLA-C genotypes in couples with recurrent miscarriage.// 8th European Congress on Reproductive Immunology. / J Reprod Immunol. - 10-13 November, Munchen, Germany , 2010. – Vol.86. – P.108. 41. Байрамова Г.Р., Непша О.С., Бурменская О.В., Муллабаева С.М., Донников А.Е., Прилепская В.Н., Трофимов Д.Ю. Локальная экспрессия мРНК генов цитокинов у женщин с хроническим вульвовагинальным кандидозом. // Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье. Сборник материалов III междисциплинарной научно-практической конференции «Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия». - 3 июня, Санкт-Петербург, 2010. – С.15-16. 42. Краснощока О.Е., Бурменская О.В., Непша О.С., Смольникова В.Ю., Калинина Е.А., Трофимов Д.Ю. Роль спермальных мРНК генов PRM-1, PRM2, ADAM-2 в прогнозировании исхода программ ВРТ. // Материалы XI Всероссийского научного форума «Мать и Дитя». - 28 сентября – 1 октября, Москва, 2010. – С.411-412. 43. Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Байрамова Г.Р., Непша О.С., Муллабаева С.М., Екимов А.Н., Донников А.Е. Профиль экспрессии мРНК генов цитокинов у женщин с хроническим рецидивирующим вульвовагинальным кандидозом. // Материалы XI Всероссийского научного 201 форума «Мать и Дитя». – 28 сентября - 1 октября, Москва, 2010. - С.531-532. 44. Сабдулаева Э.Х., Роговская С.И., Бурменская О.В., Непша О.С., Трофимов Д.Ю. Молекулярные маркеры в диагностике цервикальной неоплазии шейки матки. // XI Всероссийский научный форум «Мать и дитя 2010». - 28 сентября - 1 октября, Москва, 2010. – C.491. 45. Смольникова Бурменская О.В., В.Ю., Калинина Трофимов Е.А. Д.Ю., Краснощока Молекулярно-генетический О.Е., профиль образцов фолликулярной жидкости, полученной при проведении программ ВРТ при селективном переносе одного эмбриона. // Новые технологии в диагностике и лечении гинекологических заболеваний: Международного Конгресса c курсом эндоскопии. материалы XXIV Москва, - 2011. – С.168-169. 46. Шубина Е.С., Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю., Непша О.С., Роговская С.И., Сабдулаева Э.Х., Сухих Г.Т. Маркеры предраковых состояний шейки матки. // Труды 54-й научной конференции МФТИ «Проблемы фундаментальных и прикладных естественных и технических наук в современном информационном обществе». Молекулярная и биологическая физика. - Москва: МФТИ, 2011. – С. 34-35. 47. Эбзеева М.В., Калинина Е.А., Бурменская О.В., Непша О.С., Трофимов Д.Ю. Экспрессия мРНК генов иммунной системы (цитокинов и HLA-G) в клетках фолликулярной жидкости. // Тезисы V Международного конгресса по репродуктивной медицине «Репродуктивное здоровье семьи». Москва, 2011.- С.119-120. 48. Cабдулаева Э.Х., Роговская С.И., Назарова Н.М., Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Непша О.С., Екимов А.Н., Оламова О.А. Выявляемость генотипов ВПЧ при предраковой патологии шейки матки. // IV междисциплинарная научно-практической конференции «Урогенитальные инфекции и репродуктивное здоровье: клинико-лабораторная диагностика и терапия»- 17-18 марта, Москва, 2011. – С.69-70. 49. Smolnikova V.Yu., Trofimov 202 D.Yu., Krasnoschoka O.E., Bourmenskaya O.V., Kalinina E.A. Diagnostic and predictive value of sperm mRNA profile. // Reproductive medicine and beyond: the best poster abstract and oral presentation on The 4th International IVI Congress. - 7-9 April, Valencia, Spain, 2011. – P.28, P-13. 50. Сабдулаева Э.Х., Роговская С.И., Назарова Н.М., Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Непша О.С., Екимов А.Н., Бадалова Л.А. Генотипирование ВПЧ у женщин с различными проявлениями ПВИ шейки матки. // Всероссийский конгресс «Амбулаторно-поликлиническая практика: проблемы и перспективы». - 22-25 мая, Москва, 2011. – С.318-319. 51. Smolnikova V.Yu., Trofimov D.Yu., Krasnosсhоka O.E., Bourmenskaya O.V., Kalinina E.A. Prognostic impact of sperm mRNA profile. // The 14th World Congress on Human Reproduction. - 30 November - 3 December, Melbourne, Australia, 2011. – P.71. 52. Smolnikova V.Yu., Trofimov D.Yu., Bourmenskaya O.V., Krasnoschoka O.E., Kalinina E.A., Sukhikh G.T. Prognostic impact of the follicular fluid mRNA profiling. The Ovary, Gametes, Embryo and Endometrium: poster abstract. // The 1st Biomarker Meeting in Reproductive medicine: emergence of a new field. 30-31 March, Valencia, Spain, 2012.– P.5. 53. Мельникова Н.В., Боженко В.К., Ашрафян Л.А., Антонова И.Б., Алешикова О.И., Бурменская О.В., Трофимов Д.Ю., Кудинова Е.А, Хунова Л.З., Двинских Н.Ю. Оценка экспрессии мРНК гена р16 при цервикальных интраэпителиальных неоплазиях и раке шейки матки. // Вестник РНЦРР. 2012. -№12. 54. Смольникова В.Ю., Краснощока О.Е., Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Калинина Е.А., Сухих Г.Т. Спермальные мРНК как прогностические маркеры исхода программ ВРТ. // Материалы VI международного конгресса по репродуктивной репродукции. - Москва, 2012. – С.48. 203 медицине. Проблемы СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 1. Абрамов Д.Д., Кофиади И.А., Хаитов М.Р., Сергеев И.В., Трофимов Д.Ю., Гудима Г.О., Кадочникова В.В., Гончарова Е.В., Рагимов А.А., Алексеев Л.П. Особенности полиморфизма генов, регулирующих различные компоненты иммунного ответа, в русской популяции. // Российский аллергологический журнал. - 2012. - №6.- С. 72-75. 2. Абрамов Д.Д., Кофиади И.А., Трофимов Д.Ю., Хаитов Р.М., Алексеев Л.П. Фундаментальные и прикладные аспекты иммуногенетики человека. Сообщение 4. Полиморфизм одиночных нуклеотидов в «не-HLA» генах иммунного ответа: биологический эффект и методы идентификации. // Физиология и патология иммунной системы. - 2010. - Т. 14.- №8.- С. 3-11. 3. Алёшкин В. А., Галимзянов Х.М., Афанасьев С.С., Караулов А.В., Несвижский Ю.В., Воропаева Е.А., Афанасьев М.С. Нарушение микробиоценозов у детей: многоцентровое исследование. Сообщение II. Микробиоценоз и дисбактериоз влагалища у девочек. // Астраханский медицинский журнал. – 2011. - Т. 6.- №1.- С. 222-225. 4. Анкирская A. C. Неспецифический вагинит. // Гинекология. - 2005 - Т. 4.С. 15-18. 5. Анкирская A. C., Муравьева В.В. Опыт микробиологической диагностики оппортунистических инфекций влагалища. // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001. - Т. 3.- №2.- С. 24-27. 6. Анкирская А. С. Бактериальный вагиноз. // Акушерство и гинекология. 2005. - №3.- С. 10-13. 7. Анкирская А. С., Муравьева В.В. Опыт микробиологической диагностики оппортунистических инфекций влагалища. // Москва: Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии РАМН. - 2006. - 9 c. 204 8. Байрамова Г. Р. Современные возможности диагностики и лечения бактериального вагиноза. // Consilium medicum. - 2012. - №6.- С. 44-47. 9. Болдырева М. Н., Липова Е.В., Витвицкая Ю.Г. Новый высокочувствительный способ диагностики дисбаланса нормо- и условнопатогенной биоты у женщин на ранних стадиях. // Consilium-medicum. - 2009. - Т. 11.- №6.- С. 47-51. 10. Ворошилина Е. С., Тумбинская Л.В., Донников А.Е., Плотко Е.С., Хаютин Л.В. Биоценоз влагалища с точки зрения количественной ПЦР: что есть норма? // Акушерство и гинекология. - 2011. - №1.- С. 57-65. 11. Гомболевская Н. А., Марченко Л.А. Современные критерии диагностики хронического эндометрита (обзор литературы). // Проблемы репродукции. 2012. - Т. 18.- №1.- С. 42-46. 12. Гомболевская Н. А., Муравьева В.В., Марченко Л.А., Анкирская А.С. Современные возможности этиологической диагностики хронического эндометрита. // Акушерство и гинекология. - 2013 - №8-1.- С. 40-45. 13. Демидов В. Н., Гус А. И. Патология полости матки и эндометрия. ВМК. Практическое пособие. / М., 2001. - 16-21 c. 14. Доброхотова Ю. Э., Затикян Н.Г. Современные представления о механизмах развития дисбиоза влагалища. // ОРЖИН. Акушерство гинекология репродукция. - 2008. - №1.- С. 7-9. 15. Долгушин И. И., Телешева Л.Ф., Савочкина А.Ю., Маркина О.В. Провоспалительные цитокины цервикального секрета и сыворотки крови у женщин с генитальной инфекцией. // Журн микробиол. - 2004. - №4.С. 43-46. 16. Долгушина В. Ф., Долгушин И.И. Состояние факторов местной иммунной защиты репродуктивного тракта при вагинозе у беременных. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2001. - №4. С.- 89-93. 205 17. Кетлинский С. А., Симбирцев А.С. Цитокины. / СПб: Фолиант, 2008. 550 c. 18. Кира Е. Ф. Бактериальный вагиноз (клиника, диагностика, лечение): автореф. дис. … д-ра мед.наук. / СПб, 1995.- 44 c. 19. Кира Е. Ф. Бактериальный вагиноз. / М.: МИА, 2012. - 472 c. 20. Кира Е. Ф., Артымук Н.В., Гайтукиева Р.А., Муслимова З.С. Биоценоз и функциональная активность эпителия влагалища при местном лечении аэробного вагинита полижинаксом и тержинаном. // Журнал акушерства и женских болезней. - 2010. - №5.- С. 127-135. 21. Кира Е. Ф., Муслимова С.З. Неспецифический вагинит и его влияние на репродуктивное здоровье женщины. // Проблемы репродукции. - 2008 - Т.5.С. 8-14. 22. Кисина В. И. Урогенитальные инфекции у женщин: клиника, диагностика, лечение. / под ред. Забиров К.И. / М: Медицинское информационное агентство, 2005. - 280 c. 23. Кофиади И. А., Кадочникова В.В., Абрамов Д.Д., Гончарова Е.В., Донников А.Е., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Хаитов Р.М. Частота встречаемости 100 клинически значимых однонуклеотидных полиморфизмов у здоровых представителей русской популяции. // Физиология и патология иммунной системы. - 2011 - №2.- С. 3-10. 24. Кофиади И. А., Кадочникова В.В., Абрамов Д.Д., Гончарова Е.В., Донников А.Е., Трофимов Д.Ю., Алексеев Л.П., Хаитов Р.М. Частота встречаемости 65 клинически значимых однонуклеотидных полиморфизмов у здоровых представителей русской популяции. // Молекулярная медицина. 2011. - №2.- С. 47-53. 25. Краснопольский В. И., Серова О.Ф., Туманова В.А., Зароченцева Н.В., Мельник Т.Н., Липовенко Л.Н., Позднякова Т.И. Влияние инфекций на 206 репродуктивную систему женщин. // Российский вестник акушера- гинеколога. - 2004. - Т.4.- №5.- С. 26-29. 26. Кремлева Е. А., Черкасов С.В. Продукция цитокинов вагинальными эпителиоцитами в ассоциативными процессе взамодействия микросимбионтами. // с доминантными Журнал и микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2012 - №4.- С. 114-118. 27. Кузнецова А. В. Хронический эндометрит. // Архив патологии. - 2000. Т.3.- №62.- С. 48-52. 28. Кулаков В. И., Шуршалина А. В. Хронический эндометрит. // Гинекология. - 2005. - Т.11.- №5.- С. 18-20. 29. Лебедева Т. Н. Иммунитет при кандидозе (обзор). // Проблемы медицинской микологии. - 2004 - Т.6.- №4.- С. 8-16. 30. Липова Е. В., Болдырева М.Н., Витвицкая Ю.Г. Новый способ выявления дисбаланса биоты урогенитального тракта. // Вестник последипломного медицинского образования. - 2009. - №1.- С. 47-48. 31. Манухин И. Б. Гинекология: национальное руководство. / Манухин И.Б., Сухих Г.Т., Савельева Г.М. / M: ГЭОТАР-Медиа, 2009. - 704 c. 32. Мейл Д., Бростофф Дж., Рот Д.Б., Рой А. Иммунология. / М: Логосфера, 2007. - 556 c. 33. Назаренко Т. А., Дубницкая Л.В. Хронический эндометрит: возможности диагностики и лечения. // Consilium Medicum. -2007. - №6.- С. 25-28. 34. Орлова В. С., Набережнев Ю.И. Нормоценоз влагалища у женщин репродуктивного возраста, механизмы его регуляции и дисбиотические варианты. // Российский вестник акушера-гинеколога. - 2007 - №4-. С. 36-39. 35. Пестрикова Т. Ю., Юрасов И.В., Юрасова Е.А. Воспалительные заболевания в гинекологии. / Москва: Литтерра, 2009. - 256 c. 207 36. Плотко Е. Э., Донников А.Е., Ворошилина Е.С., Хаютин Л.В., Тумбинская Л.В. Биоценоз влагалища с точки зрения количественной ПЦР: состояние во время беременности. // Уральский медицинский журнал. - 2010. - №3.- С. 103-107. 37. Побединский Н. М., Балтуцкая О.И., Омельяненко А.И. Стероидные рецепторы нормального эндометрия. // Акушерство и гинекология. - 2000. №3.- С. 5-8. 38. Подзолкова Н. М., Бархина Т. Г., Осадчев В. Б. Роль панорамной и микрогистероскопии в диагностике хронического эндометрита. // Российский вестник акушера-гинеколога. - 2004. - №6. 39. Прилепская В. Н., Байрамова Г.Р. Вульвовагинальный кандидоз. Клиника, диагностика и принципы терапии. / М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 80 c. 40. Прилепская В. Н., Мирзабалаева А.К., Кира Е.Ф., Гомберг М.А., Аполихина И.А., Байрамова Г.Р. Федеральные клинические рекомендации. Диагностика и лечение заболеваний, сопровождающихся патологическими выделениями из половых путей женщин. / Москва, 2013. - 50 c. 41. Прилепская В. Н., Назарова Н.М., Новикова Е.П., Трофимов Д.Ю., Бурменская О.В., Безнощенко О.С. Иммунологические и молекулярнобиологические маркеры, ассоциированные с хроническим цервицитом. // Гинекология. - 2013. - №3.- С. 46-51. 42. Припутневич Т. В., Мелкумян А.Р., Анкирская А.С., Трофимов Д.Ю., Муравьева В.В., Завьялова М.Г. Использование современных лабораторных технологий в видовой идентификации лактобактерий при оценке состояния микробиоты влагалища у женщин репродуктивного возраста. // Акушерство и гинекология. - 2013 - №1.- С. 76-80. 43. Российское общество дерматовенерологов и косметологов. Ведение больных больных с инфекциями, передаваемыми половым путем, и 208 урогенитальными инфекциями: Клинические рекомендации. / М.: Деловой экспресс, 2012. - 112 c. 44. Рудакова Е. Б., Мозговой С. И., Пилипенко М. А., Бурова О. М., Лузин А. А., Богданова, О. Н., Лобода, О. А. Хронический эндометрит: от совершенствования диагностического подхода к оптимизации лечения. // Лечащий Врач. - 2008. - №10.- С. 6-10. 45. Сергеев А. Ю. Кандидоз. /под ред. А.Ю. Сергеев, Ю.В. Сергеев / М.: Триада-X, 2000. - 472 c. 46. Сергеев И.В., Хаитов М. Р., Трофимов Д.Ю., Абрамов Д.Д., Грудакова Е.Г., Гончарова Е.В., Алексеев Л.П. Разработка методов для проведения широкомасштабных исследований полиморфизма генов, регулирующих различные компоненты иммунного ответа. // Физиология и патология иммунной системы. - 2009. - Т. 13.- №4.- С. 21-25. 47. Серов В. Н. Рациональная терапия влагалищных инфекций. // Гинекология. - 2005. - Т.7- №2. 48. Серов В. Н. Особенности инфекции в акушерстве, гинекологии и перинатологии. // Рус мед журн. - 2006 - Т.14.- №1.- С. 2-5. 49. Сухих Г. Т., Прилепская В.Н., Трофимов Д.Ю, Донников А.Е., Айламазян Э.К., Савичева А.М, Шипицына Е.В. Применение метода полимеразной микробиоценоза цепной реакции урогенитального в реальном тракта у времени для оценки женщин (медицинская технология). / М.: ФГБУ «НЦАГиП им. В.И.Кулакова» Минздрава России, СПб: НИИАГ им. Д.О. Отта СЗО РАМН, 2012. - 38 c. 50. Сухих Г. Т., Шуршалина А. В. Хронический эндометрит: руководство. / М: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 64 c. 209 51. Теровская Т. Ю. Морфофункциональное состояние клеток вагинальной жидкости у женщин при оппортунистических инфекциях влагалища: автореф. дис. …канд. мед. наук. / Томск, 2009.- 23 c. 52. Точиева М. Х. Цитокиновый статус женщин с невынашиванием беременности при наличии генитального кандидоза: автореф. дис. …канд. мед. наук. / М., 2007.- 24 c. 53. Трофимов Д.Ю., Рагимов А. А., Абрамов Д.Д., Кадочникова В.В., Гончарова Е.В., Сергеев И.В., Хаитов Р.М., Алексеев Л.П. Популяционноиммуногенетическая характеристика русской популяции в части генетических полиморфизмов, значимых для иммунного статуса человека. // Физиология и патология иммунной системы. - 2009. - Т.13.- №2.- С. 3-7. 54. Трофимов Д. Ю. Создание отечественной инновационной технологической платформы для решения актуальных фундаментальных и прикладных задач современной иммунологии на основе ПЦР в реальном времени: автореф. дис. … д-ра биологич. наук. / М, 2009.- 44 c. 55. Унанян А. Л., Коссович Ю.М. Хронический эндометрит: этиопатогенез, диагностика, клиника и лечение. Роль антифиброзирующей терапии. // Лечащий врач. - 2012. - №11.- С. 35-40. 56. Шабашова Н. В. Иммунодефициты при хроническом кандидозе кожи и слизистых оболочек. // Проблемы медицинской микологии. - 2009 - Т.11.№1.- С. 3-10. 57. Шелковая Н. Г. Вульвовагинальный кандидоз: современный взгляд на проблему. // Новости медицины и фармации. - 2008. - Т. 252.- №15.- С. 12-16. 58. Шуршалина А. В. Клинико-морфологические особенности хронического эндометрита у женщин с нарушением репродуктивной функции: автореф. дис. …д-ра мед. наук. / М., 2007.- 38 c. 210 59. Яворовская К. А., Сеидова Л. А. Основы регуляции имплантации (молекулярно-биологические аспекты). // Репродуктивная медицина. - 2011. Т.1-2.- №6-7. С. 6-9. 60. Ярилин А. А. Иммунология: учебник. / М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. - 752 c. 61. Aagaard K., Petrosino J., Keitel W., Watson M., Katancik J., Garcia N., Patel S., Cutting M., Madden T., Hamilton H., Harris E., Gevers D., Simone G., McInnes P., Versalovic J. The Human Microbiome Project strategy for comprehensive sampling of the human microbiome and why it matters. // FASEB journal: official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. - 2013. - Vol. 27. - №3. - P. 1012-1022. 62. Abecasis G. R., Altshuler D., Auton A., Brooks L. D., Durbin R. M., Gibbs R.A., Hurles M. E., McVean G. A. A map of human genome variation from population-scale sequencing. // Nature. - 2010. - Vol. 467. - №7319. P. 1061-1073. 63. Achilles S. L., Amortegui A. J., Wiesenfeld H. C. Endometrial plasma cells: do they indicate subclinical pelvic inflammatory disease? // Sexually transmitted diseases. - 2005. - Vol. 32. - №3. - P. 185-188. 64. Allsworth J. E., Peipert J. F. Prevalence of bacterial vaginosis: 2001-2004 National Health and Nutrition Examination Survey data. // Obstetrics and gynecology. - 2007. - Vol. 109. - №1. - P. 114-120. 65. Alvarez-Olmos M. I., Barousse M. M., Rajan L., Van Der Pol B. J., Fortenberry D., Orr D., Fidel P. L., Jr. Vaginal lactobacilli in adolescents: presence and relationship to local and systemic immunity, and to bacterial vaginosis. // Sexually transmitted diseases. - 2004. - Vol. 31. - №7. - P. 393-400. 66. Amsel R., Totten P. A., Spiegel C. A., Chen K. C., Eschenbach D., Holmes K. K. Nonspecific vaginitis. Diagnostic criteria and microbial and epidemiologic associations. // The American journal of medicine, 1983. - Vol. 74. №1. - P. 14-22. 211 67. Ancelin M., Buteau-Lozano H., Meduri G., Osborne-Pellegrin M., Sordello S., Plouet J., Perrot-Applanat M. A dynamic shift of VEGF isoforms with a transient and selective progesterone-induced expression of VEGF189 regulates angiogenesis and vascular permeability in human uterus. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2002. - Vol. 99. - №9. P. 6023-6028. 68. Anderson M. R., Klink K., Cohrssen A. Evaluation of vaginal complaints. // JAMA : the journal of the American Medical Association. - 2004. - Vol. 291. №11. - P. 1368-1379. 69. Andrews W. W., Goldenberg R. L., Hauth J. C., Cliver S. P., Conner M., Goepfert A. R. Endometrial microbial colonization and plasma cell endometritis after spontaneous or indicated preterm versus term delivery. // American journal of obstetrics and gynecology. - 2005. - Vol. 193. - №3 Pt 1. - P. 739-745. 70. Andrews W. W., Hauth J. C., Cliver S. P., Conner M. G., Goldenberg R. L., Goepfert A. R. Association of asymptomatic bacterial vaginosis with endometrial microbial colonization and plasma cell endometritis in nonpregnant women. // American journal of obstetrics and gynecology. - 2006. - Vol. 195. - №6. P. 1611-1616. 71. Anton G., Rid J., Mylonas I., Friese K., Weissenbacher E. R. Evidence of a TH1-shift of local vaginal inflammatory response during bacterial vaginosis. // Infection. - 2008. - Vol. 36. - №2. - P. 147-152. 72. Antonio M. A., Rabe L. K., Hillier S. L. Colonization of the rectum by Lactobacillus species and decreased risk of bacterial vaginosis. // The Journal of infectious diseases. - 2005. - Vol. 192. - №3. - P. 394-398. 73. Anum E. A., Springel E. H., Shriver M. D., Strauss J. F., 3rd Genetic contributions to disparities in preterm birth. // Pediatric research. - 2009. - Vol. 65. - №1. - P. 1-9. 212 74. Arbour N. C., Lorenz E., Schutte B. C., Zabner J., Kline J. N., Jones M., Frees K., Watt J. L., Schwartz D. A. TLR4 mutations are associated with endotoxin hyporesponsiveness in humans. // Nature genetics. - 2000. - Vol. 25. №2. - P. 187-191. 75. Arruvito L., Sanz M., Banham A. H., Fainboim L. Expansion of CD4+CD25+and FOXP3+ regulatory T cells during the follicular phase of the menstrual cycle: implications for human reproduction. // Journal of immunology. 2007. - Vol. 178. - №4. - P. 2572-2578. 76. Babula O., Lazdane G., Kroica J., Linhares I. M., Ledger W. J., Witkin S. S. Frequency of interleukin-4 (IL-4) -589 gene polymorphism and vaginal concentrations of IL-4, nitric oxide, and mannose-binding lectin in women with recurrent vulvovaginal candidiasis. // Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. - 2005. - Vol. 40. - №9. - P. 1258-1262. 77. Balu R. B., Savitz D. A., Ananth C. V., Hartmann K. E., Miller W. C., Thorp J. M., Heine R. P. Bacterial vaginosis and vaginal fluid defensins during pregnancy. // American journal of obstetrics and gynecology. - 2002. - Vol. 187. №5. – P. 1267-1271. 78. Balu R. B., Savitz D. A., Ananth C. V., Hartmann K. E., Miller W. C., Thorp J. M., Heine R. P. Bacterial vaginosis, vaginal fluid neutrophil defensins, and preterm birth. // Obstetrics and gynecology. - 2003. - Vol. 101. - №5 Pt 1. P. 862-868. 79. Basso B., Gimenez F., Lopez C. IL-1beta, IL-6 and IL-8 levels in gynecoobstetric infections. // Infectious diseases in obstetrics and gynecology. - 2005. Vol. 13. - №4. - P. 207-211. 80. Bausero P., Cavaille F., Meduri G., Freitas S., Perrot-Applanat M. Paracrine action of vascular endothelial growth factor in the human endometrium: production 213 and target sites, and hormonal regulation. // Angiogenesis. - 1998. - Vol. 2. - №2. P. 167-182. 81. Bayer-Garner I. B., Korourian S. Plasma cells in chronic endometritis are easily identified when stained with syndecan-1. // Modern pathology: an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc 2001. Vol. 14. - №9. - P. 877-879. 82. Beigi R. H., Yudin M. H., Cosentino L., Meyn L. A., Hillier S. L. Cytokines, pregnancy, and bacterial vaginosis: comparison of levels of cervical cytokines in pregnant and nonpregnant women with bacterial vaginosis. // The Journal of infectious diseases. - 2007. - Vol. 196. - №9. - P. 1355-1360. 83. Bidwell J., Keen L., Gallagher G., Kimberly R., Huizinga T., McDermott M. F., Oksenberg J., McNicholl J., Pociot F., Hardt C., D'Alfonso S. Cytokine gene polymorphism in human disease: on-line databases. // Genes and immunity. - 1999. - Vol. 1. - №1. - P. 3-19. 84. Boomsma C. M., Kavelaars A., Bozkurt N., Eijkemans M. J., Fauser B. C., Heijnen C. J., Macklon N. S. Is bacterial vaginosis associated with a proinflammatory cytokine profile in endometrial secretions of women undergoing IVF? // Reproductive biomedicine online. - 2010. - Vol. 21. - №1. - P. 133-141. 85. Boskey E. R., Telsch K. M., Whaley K. J., Moench T. R., Cone R. A. Acid production by vaginal flora in vitro is consistent with the rate and extent of vaginal acidification. // Infection and immunity. - 1999. - Vol. 67. - №10. - P. 5170-5175. 86. Bradshaw C. S., Morton A. N., Garland S. M., Morris M. B., Moss L. M., Fairley C. K. Higher-risk behavioral practices associated with bacterial vaginosis compared with vaginal candidiasis. // Obstetrics and gynecology. - 2005. Vol. 106. - №1. - P. 105-114. 87. Capaldo C. T., Nusrat A. Cytokine regulation of tight junctions. // Biochimica et biophysica acta. - 2009. - Vol. 1788. - №4. - P. 864-871. 214 88. Carson D. D., Bagchi I., Dey S. K., Enders A. C., Fazleabas A. T., Lessey B. A., Yoshinaga K. Embryo implantation. // Developmental biology. 2000. - Vol. 223. - №2. - P. 217-237. 89. Cassol E., Cassetta L., Alfano M., Poli G. Macrophage polarization and HIV-1 infection. // Journal of leukocyte biology. - 2010. - Vol. 87. - №4. - P. 599-608. 90. Cassone A., De Bernardis F., Santoni G. Anticandidal immunity and vaginitis: novel opportunities for immune intervention. // Infection and immunity. - 2007. Vol. 75. - №10. - P. 4675-4686. 91. Cauci S., Driussi S., Guaschino S., Isola M., Quadrifoglio F. Correlation of local interleukin-1beta levels with specific IgA response against Gardnerella vaginalis cytolysin in women with bacterial vaginosis. // American journal of reproductive immunology. - 2002. - Vol. 47. - №5. - P. 257-264. 92. Cauci S., Guaschino S., De Aloysio D., Driussi S., De Santo D., Penacchioni P., Quadrifoglio F. Interrelationships of interleukin-8 with interleukin-1beta and neutrophils in vaginal fluid of healthy and bacterial vaginosis positive women. // Molecular human reproduction. - 2003. - Vol. 9. - №1. - P. 53-58. 93. Cauci S., Di Santolo M., Casabellata G., Ryckman K., Williams S. M., Guaschino S. Association of interleukin-1beta and interleukin-1 receptor antagonist polymorphisms with bacterial vaginosis in non-pregnant Italian women. // Molecular human reproduction. - 2007. - Vol. 13. - №4. - P. 243-250. 94. Cherpes T. L., Meyn L. A., Krohn M. A., Lurie J. G., Hillier S. L. Association between acquisition of herpes simplex virus type 2 in women and bacterial vaginosis. // Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. - 2003. - Vol. 37. - №3. - P. 319-325. 95. Cicinelli E., Resta L., Nicoletti R., Zappimbulso V., Tartagni M., Saliani N. Endometrial micropolyps at fluid hysteroscopy suggest the existence of chronic endometritis. // Human reproduction. - 2005. - Vol. 20. - №5. - P. 1386-1389. 215 96. Cicinelli E., De Ziegler D., Nicoletti R., Colafiglio G., Saliani N., Resta L., Rizzi D., De Vito D. Chronic endometritis: correlation among hysteroscopic, histologic, and bacteriologic findings in a prospective trial with 2190 consecutive office hysteroscopies. // Fertility and sterility. - 2008. - Vol. 89. - №3. P. 677-684. 97. Cohen C. R., Plummer F. A., Mugo N., Maclean I., Shen C., Bukusi E. A., Irungu E., Sinei S., Bwayo J., Brunham R. C. Increased interleukin-10 in the the endocervical secretions of women with non-ulcerative sexually transmitted diseases: a mechanism for enhanced HIV-1 transmission? // AIDS. - 1999. Vol. 13. - №3. - P. 327-332. 98. Critchlow C. W., Wolner-Hanssen P., Eschenbach D. A., Kiviat N. B., Koutsky L. A., Stevens C. E., Holmes K. K. Determinants of cervical ectopia and of cervicitis: age, oral contraception, specific cervical infection, smoking, and douching. // American journal of obstetrics and gynecology. - 1995. - Vol. 173. №2. - P. 534-543. 99. Cunningham A. L., Harman A., Kim M., Nasr N., Lai J. Immunobiology of dendritic cells and the influence of HIV infection. // Advances in experimental medicine and biology. - 2013. - Vol. 762. - P. 1-44. 100. Demirezen S., Safi Z., Beksac S. The interaction of trichomonas vaginalis with epithelial cells, polymorphonuclear leucocytes and erythrocytes on vaginal smears: light microscopic observation. // Cytopathology: official journal of the British Society for Clinical Cytology. - 2000. - Vol. 11. - №5. - P. 326-332. 101. Dheda K., Huggett J. F., Bustin S. A., Johnson M. A., Rook G., Zumla A. Validation of housekeeping genes for normalizing RNA expression in real-time PCR. // BioTechniques. - 2004. - Vol. 37. - №1. - P. 112-114, 116, 118-119. 102. Di Spiezio Sardo A., Guida M., Bettocchi S., Nappi L., Sorrentino F., Bifulco G., Nappi C. Role of hysteroscopy in evaluating chronic pelvic pain. // Fertility and sterility. - 2008. - Vol. 90. - №4. - P. 1191-1196. 216 103. Dimitriadis E., White C. A., Jones R. L., Salamonsen L. A. Cytokines, chemokines and growth factors in endometrium related to implantation. // Human reproduction. - 2005. - Vol. 11. - №6. - P. 613-630. 104. Dimova T., Nagaeva O., Stenqvist A. C., Hedlund M., Kjellberg L., Strand M., Dehlin E., Mincheva-Nilsson L. Maternal Foxp3 expressing CD4+ CD25+ and CD4+ CD25- regulatory T-cell populations are enriched in human early normal pregnancy decidua: a phenotypic study of paired decidual and peripheral blood samples. // American journal of reproductive immunology. 2011. - Vol. 66 Suppl. 1. - P. 44-56. 105. Dinarello C. A., Novick D., Kim S., Kaplanski G. Interleukin-18 and IL-18 Binding Protein. // Frontiers in immunology. - 2013. - Vol. 4. - P. 289. 106. Dolan S. M. Genetic and environmental contributions to racial disparities in preterm birth. // The Mount Sinai journal of medicine, New York. - 2010. Vol. 77. - №2. - P. 160-165. 107. Donati L., Di Vico A., Nucci M., Quagliozzi L., Spagnuolo T., Labianca A., Bracaglia M., Ianniello F., Caruso A., Paradisi G. Vaginal microbial flora and outcome of pregnancy. // Archives of gynecology and obstetrics. - 2010. Vol. 281. - №4. - P. 589-600. 108. Donders G. G., Bosmans E., Dekeersmaecker A., Vereecken A., Van Bulck B., Spitz B. Pathogenesis of abnormal vaginal bacterial flora. // American journal of obstetrics and gynecology. - 2000. - Vol. 182. - №4. P. 872-878. 109. Donders G. G., Vereecken A., Bosmans E., Dekeersmaecker A., Salembier G., Spitz B. Definition of a type of abnormal vaginal flora that is distinct from bacterial vaginosis: aerobic vaginitis. // BJOG: an international journal of obstetrics and gynaecology. - 2002. - Vol. 109. - №1. - P. 34-43. 217 110. Donders G. G., Vereecken A., Bosmans E., Spitz B. Vaginal cytokines in normal pregnancy. // American journal of obstetrics and gynecology. - 2003. Vol. 189. - №5. - P. 1433-1438. 111. Du Plessis E. M., Dicks L. M. Evaluation of random amplified polymorphic DNA (RAPD)-PCR as a method to differentiate Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus crispatus, Lactobacillus amylovorus, Lactobacillus gallinarum, Lactobacillus gasseri, and Lactobacillus johnsonii. // Current microbiology. - 1995. - Vol. 31. - №2. - P. 114-118. 112. Duff P., Gibbs R. S., Blanco J. D., St Clair P. J. Endometrial culture techniques in puerperal patients. // Obstetrics and gynecology. - 1983. - Vol. 61. №2. - P. 217-222. 113. Eckert L. O., Hawes S. E., Wolner-Hanssen P. K., Kiviat N. B., Wasserheit J. N., Paavonen J. A., Eschenbach D. A., Holmes K. K. Endometritis: the clinical-pathologic syndrome. // American journal of obstetrics and gynecology. - 2002. - Vol. 186. - №4. - P. 690-695. 114. Espinoza J., Erez O., Romero R. Preconceptional antibiotic treatment to prevent preterm birth in women with a previous preterm delivery. // American journal of obstetrics and gynecology. - 2006. - Vol. 194. - №3. - P. 630-637. 115. Evans A. L., Scally A. J., Wellard S. J., Wilson J. D. Prevalence of bacterial vaginosis in lesbians and heterosexual women in a community setting. // Sexually transmitted infections. - 2007. - Vol. 83. - №6. - P. 470-475. 116. Fahey J. V., Wright J. A., Shen L., Smith J. M., Ghosh M., Rossoll R. M., Wira C. R. Estradiol selectively regulates innate immune function by polarized human uterine epithelial cells in culture. // Mucosal immunology. - 2008. - Vol. 1. - №4. - P. 317-325. 117. Falsen E., Pascual C., Sjoden B., Ohlen M., Collins M. D. Phenotypic and phylogenetic characterization of a novel Lactobacillus species from human 218 sources: description of Lactobacillus iners sp. nov. // International journal of systematic bacteriology. - 1999. - Vol. 49 Pt 1. - P. 217-221. 118. Farage M. A., Miller K. W., Ledger W. J. Determining the cause of vulvovaginal symptoms. // Obstetrical & gynecological survey. - 2008. - Vol. 63. №7. - P. 445-464. 119. Feinen B., Jerse A. E., Gaffen S. L., Russell M. W. Critical role of Th17 responses in a murine model of Neisseria gonorrhoeae genital infection. // Mucosal immunology. - 2010. - Vol. 3. - №3. - P. 312-321. 120. Ferris M. J., Masztal A., Aldridge K. E., Fortenberry J. D., Fidel P. L., Jr. Martin D. H. Association of Atopobium vaginae, a recently described metronidazole resistant anaerobe, with bacterial vaginosis. // BMC infectious diseases. - 2004. - Vol. 4. - P. 5. 121. Fidel P. L., Jr. History and update on host defense against vaginal candidiasis. // American journal of reproductive immunology. - 2007. - Vol. 57. - №1. - P. 2-12. 122. Forsum U., Holst E., Larsson P. G., Vasquez A., Jakobsson T., MattsbyBaltzer I. Bacterial vaginosis--a microbiological and immunological enigma. // APMIS: acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. - 2005. Vol. 113. - №2. - P. 81-90. 123. Fortunato S. J., Menon R., Lombardi S. J. Role of tumor necrosis factor-alpha in the premature rupture of membranes and preterm labor pathways. // American journal of obstetrics and gynecology. - 2002. - Vol. 187. - №5. - P. 1159-1162. 124. Foster L. M., Tompkins T. A., Dahl W. J. A comprehensive post-market review of studies on a probiotic product containing Lactobacillus helveticus R0052 and Lactobacillus rhamnosus R0011. // Beneficial microbes. - 2011. - Vol. 2. - №4. - P. 319-334. 219 125. Foxman B., Rosenthal M. Implications of the human microbiome project for epidemiology. // American journal of epidemiology. - 2013. - Vol. 177. - №3. P. 197-201. 126. Friebe-Hoffmann U., Chiao J. P., Rauk P. N. Effect of IL-1beta and IL-6 on oxytocin secretion in human uterine smooth muscle cells. // American journal of reproductive immunology. - 2001. - Vol. 46. - №3. - P. 226-231. 127. Genc M. R., Vardhana S., Delaney M. L., Onderdonk A., Tuomala R., Norwitz E., Witkin S. S. Relationship between a toll-like receptor-4 gene polymorphism, bacterial vaginosis-related flora and vaginal cytokine responses in pregnant women. // European journal of obstetrics, gynecology, and reproductive biology. - 2004. - Vol. 116. - №2. - P. 152-156. 128. Genc M. R., Karasahin E., Onderdonk A. B., Bongiovanni A. M., Delaney M. L., Witkin S. S. Association between vaginal 70-kd heat shock protein, interleukin-1 receptor antagonist, and microbial flora in mid trimester pregnant women. // American journal of obstetrics and gynecology. - 2005. - Vol. 192. №3. - P. 916-921. 129. Giraldo P. C., de Carvalho J. B., do Amaral R. L., da Silveira Goncalves A. K., Eleuterio J., Guimaraes F. Identification of immune cells by flow cytometry in vaginal lavages from women with vulvovaginitis and normal microflora. // American journal of reproductive immunology. - 2012. - Vol. 67. №3. - P. 198-205. 130. Givan A. L., White H. D., Stern J. E., Colby E., Gosselin E. J., Guyre P. M., Wira C. R. Flow cytometric analysis of leukocytes in the human female reproductive tract: comparison of fallopian tube, uterus, cervix, and vagina. // American journal of reproductive immunology. - 1997. - Vol. 38. - №5. P. 350-359. 131. Goepfert A. R., Goldenberg R. L., Andrews W. W., Hauth J. C., Mercer B., Iams J., Meis P., Moawad A., Thom E., VanDorsten J. P., Caritis S. N., Thurnau 220 G., Miodovnik M., Dombrowski M., Roberts J., McNellis D. The Preterm Prediction Study: association between cervical interleukin 6 concentration and spontaneous preterm birth. National Institute of Child Health and Human Development Maternal-Fetal Medicine Units Network. // American journal of obstetrics and gynecology. - 2001. - Vol. 184. - №3. - P. 483-488. 132. Goepfert A. R., Varner M., Ward K., Macpherson C., Klebanoff M., Goldenberg R. L., Mercer B., Meis P., Iams J., Moawad A., Carey J. C., Leveno K., Wapner R., Caritis S. N., Miodovnik M., Sorokin Y., O'Sullivan M. J., Van Dorsten J. P., Langer O. Differences in inflammatory cytokine and Toll-like receptor genes and bacterial vaginosis in pregnancy. // American journal of obstetrics and gynecology. - 2005. - Vol. 193. - №4. - P. 1478-1485. 133. Goffinet F., Kayem G., Maillard F., Trebeden H., Cabrol D., Weill B., Batteux F. Detection of interleukin 6 mRNA by RT-PCR in vaginal secretions: association with preterm delivery and neonatal infection in women with preterm labour and intact membranes. // European journal of obstetrics, gynecology, and reproductive biology. - 2005. - Vol. 123. - №2. - P. 167-173. 134. Gomez L. M., Sammel M. D., Appleby D. H., Elovitz M. A., Baldwin D. A., Jeffcoat M. K., Macones G. A., Parry S. Evidence of a gene-environment interaction that predisposes to spontaneous preterm birth: a role for asymptomatic bacterial vaginosis and DNA variants in genes that control the inflammatory response. // American journal of obstetrics and gynecology. - 2010. - Vol. 202. №4. - P. 381-386. 135. Grainger D. J., Heathcote K., Chiano M., Snieder H., Kemp P. R., Metcalfe J. C., Carter N. D., Spector T. D. Genetic control of the circulating concentration of transforming growth factor type beta1. // Human molecular genetics. - 1999. - Vol. 8. - №1. - P. 93-97. 221 136. Grant-Tschudy K. S., Wira C. R. Paracrine mediators of mouse uterine epithelial cell transepithelial resistance in culture. // Journal of reproductive immunology. - 2005. - Vol. 67. - №1-2. - P. 1-12. 137. Grant K. S., Wira C. R. Effect of mouse uterine stromal cells on epithelial cell transepithelial resistance (TER) and TNFalpha and TGFbeta release in culture. // Biology of reproduction. - 2003. - Vol. 69. - №3. - P. 1091-1098. 138. Greendale G. A., Judd H. L. The menopause: health implications and clinical management. // Journal of the American Geriatrics Society. - 1993. - Vol. 41. №4. - P. 426-436. 139. Gutman R. E., Peipert J. F., Weitzen S., Blume J. Evaluation of clinical methods for diagnosing bacterial vaginosis. // Obstetrics and gynecology. - 2005. Vol. 105. - №3. - P. 551-556. 140. Hagberg H., Mallard C., Jacobsson B. Role of cytokines in preterm labour and brain injury. // BJOG: an international journal of obstetrics and gynaecology. 2005. - Vol. 112 Suppl 1. - P. 16-18. 141. Haggerty C. L., Hillier S. L., Bass D. C., Ness R. B. Bacterial vaginosis and anaerobic bacteria are associated with endometritis. // Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. - 2004. Vol. 39. - №7. - P. 990-995. 142. Hainer B. L., Gibson M. V. Vaginitis. // American family physician. - 2011. Vol. 83. - №7. - P. 807-815. 143. Haines B. P., Voyle R. B., Rathjen P. D. Intracellular and extracellular leukemia inhibitory factor proteins have different cellular activities that are mediated by distinct protein motifs. // Molecular biology of the cell. - 2000. Vol. 11. - №4. - P. 1369-1383. 222 144. Hakakha M. M., Davis J., Korst L. M., Silverman N. S. Leukorrhea and bacterial vaginosis as in-office predictors of cervical infection in high-risk women. // Obstetrics and gynecology. - 2002. - Vol. 100. - №4. - P. 808-812. 145. Hawes S. E., Hillier S. L., Benedetti J., Stevens C. E., Koutsky L. A., WolnerHanssen P., Holmes K. K. Hydrogen peroxide-producing lactobacilli and acquisition of vaginal infections. // The Journal of infectious diseases. - 1996. Vol. 174. - №5. - P. 1058-1063. 146. Hay P. E., Lamont R. F., Taylor-Robinson D., Morgan D. J., Ison C., Pearson J. Abnormal bacterial colonisation of the genital tract and subsequent preterm delivery and late miscarriage. // BMJ. - 1994. - Vol. 308. - №6924. P. 295-298. 147. Hayashi F., Means T. K., Luster A. D. Toll-like receptors stimulate human neutrophil function. // Blood. - 2003. - Vol. 102. - №7. - P. 2660-2669. 148. Hedges S. R., Barrientes, F., Desmond, R.A., Schwebke, J.R. Local and systemic cytokine levels in relation to changes in vaginal flora. // J Infect Dis. 2006. - Vol. 193. - P. 556–562. 149. Hickey D. K., Patel M. V., Fahey J. V., Wira C. R. Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract: stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections. // Journal of reproductive immunology. - 2011. - Vol. 88. - №2. P. 185-194. 150. Higuchi R. Simple and rapid preparation of samples for PCR. In: PCR technology: Principles and applications for DNA amplification (Erlich H, ed.). // Stockton Press, New York, NY, USA, 1989. - P. 31-38. 151. Hillier S. L. The vaginal microbial ecosystem and resistance to HIV. // AIDS research and human retroviruses. - 1998. - Vol. 14 Suppl 1. - P. S17-21. 223 152. Hladik F., Sakchalathorn P., Ballweber L., Lentz G., Fialkow M., Eschenbach D., McElrath M. J. Initial events in establishing vaginal entry and infection by human immunodeficiency virus type-1. // Immunity. - 2007. - Vol. 26. - №2. P. 257-270. 153. Ho I. C., Pai S. Y. GATA-3 - not just for Th2 cells anymore. // Cellular and molecular immunology. - 2007. - Vol. 4. - №1. - P. 15-29. 154. Hogaboam C. M., Trujillo G., Martinez F. J. Aberrant innate immune sensing leads to the rapid progression of idiopathic pulmonary fibrosis. // Fibrogenesis and tissue repair. - 2012. - Vol. 5 Suppl 1. - P. S3. 155. Hollmig S. T., Ariizumi K., Cruz P. D., Jr. Recognition of non-selfpolysaccharides by C-type lectin receptors dectin-1 and dectin-2. // Glycobiology. 2009. - Vol. 19. - №6. - P. 568-575. 156. Huggett J., Dheda K., Bustin S., Zumla A. Real-time RT-PCR normalisation; strategies and considerations. // Genes and immunity. - 2005. - Vol. 6. - №4. P. 279-284. 157. Hunjak B., Sabol I., Vojnovic G., Fistonic I., Erceg A. B., Persic Z., Grce M. Ureaplasma urealyticum and Ureaplasma parvum in women of reproductive age. // Archives of gynecology and obstetrics. - 2014. - Vol. 289. - №2. - P. 407-412. 158. Iijima N., Linehan M. M., Zamora M., Butkus D., Dunn R., Kehry M. R., Laufer T. M., Iwasaki A. Dendritic cells and B cells maximize mucosal Th1 memory response to herpes simplex virus. // The Journal of experimental medicine. - 2008. - Vol. 205. - №13. - P. 3041-3052. 159. Ildgruben A. K., Sjoberg I. M., Hammarstrom M. L. Influence of hormonal contraceptives on the immune cells and thickness of human vaginal epithelium. // Obstetrics and gynecology. - 2003. - Vol. 102. - №3. - P. 571-582. 160. Imseis H. M., Greig P. C., Livengood C. H., 3rd, Shunior E., Durda P., Erikson M. Characterization of the inflammatory cytokines in the vagina during 224 pregnancy and labor and with bacterial vaginosis. // Journal of the Society for Gynecologic Investigation. - 1997. - Vol. 4. - №2. - P. 90-94. 161. Ison C. A., Hay P. E. Validation of a simplified grading of Gram stained vaginal smears for use in genitourinary medicine clinics. // Sexually transmitted infections. - 2002. - Vol. 78. - №6. - P. 413-415. 162. Iwasaki A. Antiviral immune responses in the genital tract: clues for vaccines. // Nature reviews. Immunology. - 2010. - Vol. 10. - №10. - P. 699-711. 163. Jacobsson B., Pernevi P., Chidekel L., Jorgen Platz-Christensen J. Bacterial vaginosis in early pregnancy may predispose for preterm birth and postpartum endometritis. // Acta obstetricia et gynecologica Scandinavica. - 2002. - Vol. 81. №11. - P. 1006-1010. 164. Janeway C. A., Jr. The immune system evolved to discriminate infectious nonself from noninfectious self. // Immunology today. - 1992. - Vol. 13. - №1. P. 11-16. 165. Johansson E. L., Rudin A., Wassen L., Holmgren J. Distribution of lymphocytes and adhesion molecules in human cervix and vagina. // Immunology. - 1999. - Vol. 96. - №2. - P. 272-277. 166. Johnson M. D., Plantinga T. S., van de Vosse E., Velez Edwards D. R., Smith P. B., Alexander B. D., Yang J. C., Kremer D., Laird G. M., Oosting M., Joosten L. A., van der Meer J. W., van Dissel J. T., Walsh T. J., Perfect J. R., Kullberg B. J., Scott W. K., Netea M. G. Cytokine gene polymorphisms and the outcome of invasive candidiasis: a prospective cohort study. // Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. 2012. - Vol. 54. - №4. - P. 502-510. 167. Jones N. M., Holzman C., Friderici K. H., Jernigan K., Chung H., Wirth J., Fisher R. Interplay of cytokine polymorphisms and bacterial vaginosis in the etiology of preterm delivery. // Journal of reproductive immunology. - 2010. Vol. 87. - №1-2. - P. 82-89. 225 168. Kaplan M. H., Sun Y. L., Hoey T., Grusby M. J. Impaired IL-12 responses and enhanced development of Th2 cells in Stat4-deficient mice. // Nature. - 1996. Vol. 382. - №6587. - P. 174-177. 169. Kaushic C. W., C.R. Mucosal Immune Defense: Immunoglobulin A. // IgA and Reproductive Tract Immunity. - 2008. - P. 291-320. 170. Kawai T., Akira S. Toll-like receptors and their crosstalk with other innate receptors in infection and immunity. // Immunity. - 2011. - Vol. 34. - №5. P. 637-650. 171. Kilian M., Brown M. B., Brown T. A., Freundt E. A., Cassell G. H. Immunoglobulin A1 protease activity in strains of Ureaplasma urealyticum. // Acta pathologica, microbiologica, et immunologica Scandinavica. Section B, Microbiology. - 1984. - Vol. 92. - №1. - P. 61-64. 172. Kimber S. J. Leukaemia inhibitory factor in implantation and uterine biology. // Reproduction. - 2005. - Vol. 130. - №2. - P. 131-145. 173. Kitaya K., Yasuo T. Inter-observer and intra-observer variability in immunohistochemical detection of endometrial stromal plasmacytes in chronic endometritis. // Experimental and therapeutic medicine. - 2013. - Vol. 5. - №2. P. 485-488. 174. Klis F. M., de Groot P., Hellingwerf K. Molecular organization of the cell wall of Candida albicans. // Medical mycology. - 2001. - Vol. 39 Suppl 1. - P. 1-8. 175. Korn A. P., Hessol N., Padian N., Bolan G., Muzsnai D., Donegan E., Jonte J., Schachter J., Landers D. V. Commonly used diagnostic criteria for pelvic inflammatory disease have poor sensitivity for plasma cell endometritis. // Sexually transmitted diseases. - 1995. - Vol. 22. - №6. - P. 335-341. 176. Kornman K. S., di Giovine F. S. Genetic variations in cytokine expression: a risk factor for severity of adult periodontitis. // Annals of periodontology / the American Academy of Periodontology. - 1998. - Vol. 3. - №1. - P. 327-338. 226 177. Kutteh W. H., Mestecky J. Secretory immunity in the female reproductive tract. // American journal of reproductive immunology. - 1994. - Vol. 31. - №1. P. 40-46. 178. Kutteh W. H., Franklin R. D. Quantification of immunoglobulins and cytokines in human cervical mucus during each trimester of pregnancy. // American journal of obstetrics and gynecology. - 2001. - Vol. 184. - №5. P. 865-872. 179. Laird S. M., Tuckerman E. M., Dalton C. F., Dunphy B. C., Li T. C., Zhang X. The production of leukaemia inhibitory factor by human endometrium: presence in uterine flushings and production by cells in culture. // Human reproduction. - 1997. - Vol. 12. - №3. - P. 569-574. 180. Lamont R. F. Recent evidence associated with the condition of preterm prelabour rupture of the membranes. // Current opinion in obstetrics & gynecology. - 2003. - Vol. 15. - №2. - P. 91-99. 181. Lamont R. F., Taylor-Robinson D. The role of bacterial vaginosis, aerobic vaginitis, abnormal vaginal flora and the risk of preterm birth. // BJOG: an international journal of obstetrics and gynaecology. - 2010. - Vol. 117. - №1. P. 119-120. 182. Lamont R. F., Sobel J. D., Akins R. A., Hassan S. S., Chaiworapongsa T., Kusanovic J. P., Romero R. The vaginal microbiome: new information about genital tract flora using molecular based techniques. // BJOG: an international journal of obstetrics and gynaecology. - 2011. - Vol. 118. - №5. - P. 533-549. 183. Lazenby G. B., Soper D. E., Nolte F. S. Correlation of leukorrhea and Trichomonas vaginalis infection. // Journal of clinical microbiology. - 2013. Vol. 51. - №7. - P. 2323-2327. 184. LeBlanc D. M., Barousse M. M., Fidel P. L., Jr. Role for dendritic cells in immunoregulation during experimental vaginal candidiasis. // Infection and immunity. - 2006. - Vol. 74. - №6. - P. 3213-3221. 227 185. Ledee-Bataille N., Lapree-Delage G., Taupin J. L., Dubanchet S., Frydman R., Chaouat G. Concentration of leukaemia inhibitory factor (LIF) in uterine flushing fluid is highly predictive of embryo implantation. // Human reproduction. - 2002. - Vol. 17. - №1. - P. 213-218. 186. Lee J. K., Kim S. H., Lewis E. C., Azam T., Reznikov L. L., Dinarello C. A. Differences in signaling pathways by IL-1beta and IL-18. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2004. - Vol. 101. - №23. - P. 8815-8820. 187. Leitich H., Bodner-Adler B., Brunbauer M., Kaider A., Egarter C., Husslein P. Bacterial vaginosis as a risk factor for preterm delivery: a metaanalysis. // American journal of obstetrics and gynecology. - 2003. - Vol. 189. №1. - P. 139-147. 188. Lev-Sagie A., Nyirjesy P., Tarangelo N., Bongiovanni A. M., Bayer C., Linhares I. M., Giraldo P. C., Ledger W. J., Witkin S. S. Hyaluronan in vaginal secretions: association with recurrent vulvovaginal candidiasis. // American journal of obstetrics and gynecology. - 2009. - Vol. 201. - №2. - P. 201-205. 189. Libby E. K., Pascal K. E., Mordechai E., Adelson M. E., Trama J. P. Atopobium vaginae triggers an innate immune response in an in vitro model of bacterial vaginosis. // Microbes and infection. / Institut Pasteur. - 2008. - Vol. 10. №4. - P. 439-446. 190. Lieberman J. The ABCs of granule-mediated cytotoxicity: new weapons in the arsenal. // Nature reviews. Immunology. - 2003. - Vol. 3. - №5. - P. 361-370. 191. Lilic D., Gravenor I., Robson N., Lammas D. A., Drysdale P., Calvert J. E., Cant A. J., Abinun M. Deregulated production of protective cytokines in response to Candida albicans infection in patients with chronic mucocutaneous candidiasis. // Infection and immunity. - 2003. - Vol. 71. - №10. - P. 5690-5699. 192. Liu C., Wang J., Zhou S., Wang B., Ma X. Association between -238 but not 308 polymorphism of Tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) and unexplained 228 recurrent spontaneous abortion (URSA) in Chinese population. // Reproductive biology and endocrinology : RB&E. - 2010. - Vol. 8. - P. 114. 193. Livengood C. H. Bacterial vaginosis: an overview for 2009. // Reviews in obstetrics and gynecology. - 2009. - Vol. 2. - №1. - P. 28-37. 194. Lowe N. K., Neal J. L., Ryan-Wenger N. A. Accuracy of the clinical diagnosis of vaginitis compared with a DNA probe laboratory standard. // Obstetrics and gynecology. - 2009. - Vol. 113. - №1. - P. 89-95. 195. Macones G. A., Parry S., Elkousy M., Clothier B., Ural S. H., Strauss J. F., 3rd A polymorphism in the promoter region of TNF and bacterial vaginosis: preliminary evidence of gene-environment interaction in the etiology of spontaneous preterm birth. // American journal of obstetrics and gynecology. 2004. - Vol. 190. - №6. - P. 1504-1508; discussion 1503A. 196. Makela S. M., Strengell M., Pietila T. E., Osterlund P., Julkunen I. Multiple signaling pathways contribute to synergistic TLR ligand-dependent cytokine gene expression in human monocyte-derived macrophages and dendritic cells. // Journal of leukocyte biology. - 2009. - Vol. 85. - №4. - P. 664-672. 197. Mardis E. R. Next-generation DNA sequencing methods. // Annual review of genomics and human genetics. - 2008. - Vol. 9. - P. 387-402. 198. Markowitz V. M., Chen I. M., Chu K., Szeto E., Palaniappan K., Jacob B., Ratner A., Liolios K., Pagani I., Huntemann M., Mavromatis K., Ivanova N. N., Kyrpides N. C. IMG/M-HMP: a metagenome comparative analysis system for the Human Microbiome Project. // PloS one. - 2012. - Vol. 7. - №7. - P. e40151. 199. Martin H. L., Richardson B. A., Nyange P. M., Lavreys L., Hillier S. L., Chohan B., Mandaliya K., Ndinya-Achola J. O., Bwayo J., Kreiss J. Vaginal lactobacilli, microbial flora, and risk of human immunodeficiency virus type 1 and sexually transmitted disease acquisition. // The Journal of infectious diseases. 1999. - Vol. 180. - №6. - P. 1863-1868. 229 200. Marwood M., Visser K., Salamonsen L. A., Dimitriadis E. Interleukin-11 and leukemia inhibitory factor regulate the adhesion of endometrial epithelial cells: implications in fertility regulation. // Endocrinology. - 2009. - Vol. 150. - №6. P. 2915-2923. 201. Massague J., Gomis R. R. The logic of TGFbeta signaling. // FEBS letters. 2006. - Vol. 580. - №12. - P. 2811-2820. 202. Mattsby-Baltzer I., Platz-Christensen J. J., Hosseini N., Rosen P. IL-1beta, IL-6, TNFalpha, fetal fibronectin, and endotoxin in the lower genital tract of pregnant women with bacterial vaginosis. // Acta obstetricia et gynecologica Scandinavica. - 1998. - Vol. 77. - №7. - P. 701-706. 203. Medzhitov R., Janeway C. A., Jr. Innate immunity: the virtues of a nonclonal system of recognition. // Cell. - 1997. - Vol. 91. - №3. - P. 295-298. 204. Mei S., Tan J., Chen H., Chen Y., Zhang J. Changes of CD4+CD25high regulatory T cells and FOXP3 expression in unexplained recurrent spontaneous abortion patients. // Fertility and sterility. - 2010. - Vol. 94. - №6. - P. 2244-2247. 205. Meng W., Du R., Wang Y., Chen Z., Ding Y. Human beta-defensin messenger RNA is overexpressed in the cervical epithelia of patients with nongonococcal cervicitis. // Journal of lower genital tract disease. - 2013. - Vol. 17. - №4. - P. 440-445. 206. Menon R., Lombardi S. J., Fortunato S. J. TNF-alpha promotes caspase activation and apoptosis in human fetal membranes. // Journal of assisted reproduction and genetics. - 2002. - Vol. 19. - №4. - P. 201-204. 207. Menon R., Merialdi M., Betran A. P., Dolan S., Jiang L., Fortunato S. J., Williams S. Analysis of association between maternal tumor necrosis factor-alpha promoter polymorphism (-308), tumor necrosis factor concentration, and preterm birth. // American journal of obstetrics and gynecology. - 2006. - Vol. 195. - №5. P. 1240-1248. 230 208. Metzker M. L. Sequencing technologies - the next generation. // Nature reviews. Genetics. - 2010. - Vol. 11. - №1. - P. 31-46. 209. Mikolajczyk M., Wirstlein P., Skrzypczak J. Leukaemia inhibitory factor and interleukin 11 levels in uterine flushings of infertile patients with endometriosis. // Human reproduction. - 2006. - Vol. 21. - №12. - P. 3054-3058. 210. Mills R. E., Walter K., Stewart C., Handsaker R. E., Chen K., Alkan C., Abyzov A., Yoon S. C., Ye K., Cheetham R. K., Chinwalla A., Conrad D. F., Fu Y., Grubert F., Hajirasouliha I., Hormozdiari F., Iakoucheva L. M., Iqbal Z., Kang S., Kidd J. M., Konkel M. K., Korn J., Khurana E., Kural D., Lam H. Y., Leng J., Li R., Li Y., Lin C. Y., Luo R., Mu X. J., Nemesh J., Peckham H. E., Rausch T., Scally A., Shi X., Stromberg M. P., Stutz A. M., Urban A. E., Walker J. A., Wu J., Zhang Y., Zhang Z. D., Batzer M. A., Ding L., Marth G. T., McVean G., Sebat J., Snyder M., Wang J., Eichler E. E., Gerstein M. B., Hurles M. E., Lee C., McCarroll S. A., Korbel J. O. Mapping copy number variation by population-scale genome sequencing. // Nature. - 2011. - Vol. 470. №7332. - P. 59-65. 211. Ming L., Xiaoling P., Yan L., Lili W., Qi W., Xiyong Y., Boyao W., Ning H. Purification of antimicrobial factors from human cervical mucus. // Human reproduction. - 2007. - Vol. 22. - №7. - P. 1810-1815. 212. Mirmonsef P., Gilbert D., Zariffard M. R., Hamaker B. R., Kaur A., Landay A. L., Spear G. T. The effects of commensal bacteria on innate immune responses in the female genital tract. // American journal of reproductive immunology. - 2011. - Vol. 65. - №3. - P. 190-195. 213. Miyaura H., Iwata M. Direct and indirect inhibition of Th1 development by progesterone and glucocorticoids. // Journal of immunology. - 2002. - Vol. 168. №3. - P. 1087-1094. 231 214. Mjosberg J., Berg G., Jenmalm M. C., Ernerudh J. FOXP3+ regulatory T cells and T helper 1, T helper 2, and T helper 17 cells in human early pregnancy decidua. // Biology of reproduction. - 2010. - Vol. 82. - №4. - P. 698-705. 215. Mjosberg J., Bernink J., Golebski K., Karrich J. J., Peters C. P., Blom B., te Velde A. A., Fokkens W. J., van Drunen C. M., Spits H. The transcription factor GATA3 is essential for the function of human type 2 innate lymphoid cells. // Immunity. - 2012. - Vol. 37. - №4. - P. 649-659. 216. Moore S., Ide M., Randhawa M., Walker J. J., Reid J. G., Simpson N. A. An investigation into the association among preterm birth, cytokine gene polymorphisms and periodontal disease. // BJOG: an international journal of obstetrics and gynaecology. - 2004. - Vol. 111. - №2. - P. 125-132. 217. Mor G., Cardenas I. The immune system in pregnancy: a unique complexity. // American journal of reproductive immunology. - 2010. - Vol. 63. - №6. P. 425-433. 218. Mount S., Mead P., Cooper K. Chlamydia trachomatis in the endometrium: can surgical pathologists identify plasma cells? // Advances in anatomic pathology. - 2001. - Vol. 8. - №6. - P. 327-329. 219. Mselle T. F., Meadows S. K., Eriksson M., Smith J. M., Shen L., Wira C. R., Sentman C. L. Unique characteristics of NK cells throughout the human female reproductive tract. // Clinical immunology. - 2007. - Vol. 124. - №1. - P. 69-76. 220. Mullen A. C., High F. A., Hutchins A. S., Lee H. W., Villarino A. V., Livingston D. M., Kung A. L., Cereb N., Yao T. P., Yang S. Y., Reiner S. L. Role of T-bet in commitment of TH1 cells before IL-12-dependent selection. // Science. - 2001. - Vol. 292. - №5523. - P. 1907-1910. 221. Nakanishi K., Yoshimoto T., Tsutsui H., Okamura H. Interleukin-18 regulates both Th1 and Th2 responses. // Annual review of immunology. - 2001. - Vol. 19. P. 423-474. 232 222. Nakanishi Y., Lu B., Gerard C., Iwasaki A. CD8(+) T lymphocyte mobilization to virus-infected tissue requires CD4(+) T-cell help. // Nature. - 2009. - Vol. 462. - №7272. - P. 510-513. 223. Nakashima A., Ito M., Shima T., Bac N. D., Hidaka T., Saito S. Accumulation of IL-17-positive cells in decidua of inevitable abortion cases. // American journal of reproductive immunology. - 2010. - Vol. 64. - №1. - P. 4-11. 224. Nasu K., Narahara H. Pattern recognition via the toll-like receptor system in the human female genital tract. // Mediators of inflammation. - 2010. - Vol. 2010. P. 976024. 225. Nazli A., Chan O., Dobson-Belaire W. N., Ouellet M., Tremblay M. J., GrayOwen S. D., Arsenault A. L., Kaushic C. Exposure to HIV-1 directly impairs mucosal epithelial barrier integrity allowing microbial translocation. // PLoS pathogens. - 2010. - Vol. 6. - №4. - P. e1000852. 226. Ness R. B., Soper D. E., Holley R. L., Peipert J., Randall H., Sweet R. L., Sondheimer S. J., Hendrix S. L., Amortegui A., Trucco G., Songer T., Lave J. R., Hillier S. L., Bass D. C., Kelsey S. F. Effectiveness of inpatient and outpatient treatment strategies for women with pelvic inflammatory disease: results from the Pelvic Inflammatory Disease Evaluation and Clinical Health (PEACH) Randomized Trial. // American journal of obstetrics and gynecology. - 2002. Vol. 186. - №5. - P. 929-937. 227. Ness R. B., Hillier S. L., Richter H. E., Soper D. E., Stamm C., McGregor J., Bass D. C., Sweet R. L., Rice P. Douching in relation to bacterial vaginosis, lactobacilli, and facultative bacteria in the vagina. // Obstetrics and gynecology. 2002. - Vol. 100. - №4. - P. 765. 228. Ness R. B., Hillier S. L., Kip K. E., Soper D. E., Stamm C. A., McGregor J. A., Bass D. C., Sweet R. L., Rice P., Richter H. E. Bacterial vaginosis and risk of pelvic inflammatory disease. // Obstetrics and gynecology. - 2004. - Vol. 104. №4. - P. 761-769. 233 229. Netea M. G., Gow N. A., Munro C. A., Bates S., Collins C., Ferwerda G., Hobson R. P., Bertram G., Hughes H. B., Jansen T., Jacobs L., Buurman E. T., Gijzen K., Williams D. L., Torensma R., McKinnon A., MacCallum D. M., Odds F. C., Van der Meer J. W., Brown A. J., Kullberg B. J. Immune sensing of Candida albicans requires cooperative recognition of mannans and glucans by lectin and Toll-like receptors. // The Journal of clinical investigation. - 2006. Vol. 116. - №6. - P. 1642-1650. 230. Nikas G., Develioglu O. H., Toner J. P., Jones H. W. Endometrial pinopodes indicate a shift in the window of receptivity in IVF cycles. // Human reproduction. - 1999. - Vol. 14. - №3. - P. 787-792. 231. Nikas G. Endometrial receptivity: changes in cell-surface morphology. // Seminars in reproductive medicine. - 2000. - Vol. 18. - №3. - P. 229-235. 232. Nishimura H., Yajima T., Kagimoto Y., Ohata M., Watase T., Kishihara K., Goshima F., Nishiyama Y., Yoshikai Y. Intraepithelial gammadelta T cells may bridge a gap between innate immunity and acquired immunity to herpes simplex virus type 2. // Journal of virology. - 2004. - Vol. 78. - №9. - P. 4927-4930. 233. Nugent R. P., Krohn M. A., Hillier S. L. Reliability of diagnosing bacterial vaginosis is improved by a standardized method of gram stain interpretation. // Journal of clinical microbiology. - 1991. - Vol. 29. - №2. - P. 297-301. 234. Ocana V. S., Pesce De Ruiz Holgado A. A., Nader-Macias M. E. Characterization of a bacteriocin-like substance produced by a vaginal Lactobacillus salivarius strain. // Applied and environmental microbiology. - 1999. - Vol. 65. - №12. - P. 5631-5635. 235. Ocana V. S., Pesce de Ruiz Holgado A. A., Nader-Macias M. E. Selection of vaginal H2O2-generating Lactobacillus species for probiotic use. // Current microbiology. - 1999. - Vol. 38. - №5. - P. 279-284. 236. Ocana V. S., de Ruiz Holgado A. A., Nader-Macias M. E. Growth inhibition of Staphylococcus aureus by H2O2-producing Lactobacillus paracasei subsp. 234 paracasei isolated from the human vagina. // FEMS immunology and medical microbiology. - 1999. - Vol. 23. - №2. - P. 87-92. 237. Ochiel D. O., Ghosh M., Fahey J. V., Guyre P. M., Wira C. R. Human uterine epithelial cell secretions regulate dendritic cell differentiation and responses to TLR ligands. // Journal of leukocyte biology. - 2010. - Vol. 88. - №3. - P. 435-444. 238. Osman I., Young A., Ledingham M. A., Thomson A. J., Jordan F., Greer I. A., Norman J. E. Leukocyte density and pro-inflammatory cytokine expression in human fetal membranes, decidua, cervix and myometrium before and during labour at term. // Molecular human reproduction. - 2003. - Vol. 9. - №1. - P. 41-45. 239. Ovalle A., Gamonal J., Martinez M. A., Silva N., Kakarieka E., Fuentes A., Chaparro A., Gajardo M., Leon R., Ahumada A., Cisternas C. Relationship between periodontal diseases and ascending bacterial infection with preterm delivery. // Revista medica de Chile. - 2009. - Vol. 137. - №4. - P. 504-514. 240. Paik S., Shak S., Tang G., Kim C., Baker J., Cronin M., Baehner F. L., Walker M. G., Watson D., Park T., Hiller W., Fisher E. R., Wickerham D. L., Bryant J., Wolmark N. A multigene assay to predict recurrence of tamoxifentreated, node-negative breast cancer. // The New England journal of medicine. 2004. - Vol. 351. - №27. - P. 2817-2826. 241. Pappas P. G., Kauffman C. A., Andes D., Benjamin D. K., Jr., Calandra T. F., Edwards J. E., Jr., Filler S. G., Fisher J. F., Kullberg B. J., Ostrosky-Zeichner L., Reboli A. C., Rex J. H., Walsh T. J., Sobel J. D. Clinical practice guidelines for the management of candidiasis: 2009 update by the Infectious Diseases Society of America. // Clinical infectious diseases : an official publication of the Infectious Diseases Society of America. - 2009. - Vol. 48. - №5. - P. 503-535. 242. Patton D. L., Thwin S. S., Meier A., Hooton T. M., Stapleton A. E., Eschenbach D. A. Epithelial cell layer thickness and immune cell populations in the normal human vagina at different stages of the menstrual cycle. // American journal of obstetrics and gynecology. - 2000. - Vol. 183. - №4. - P. 967-973. 235 243. Piccinni M. P., Giudizi M. G., Biagiotti R., Beloni L., Giannarini L., Sampognaro S., Parronchi P., Manetti R., Annunziato F., Livi C. Progesterone favors the development of human T helper cells producing Th2-type cytokines and promotes both IL-4 production and membrane CD30 expression in established Th1 cell clones. // Journal of immunology. - 1995. - Vol. 155. - №1. - P. 128-133. 244. Pietrella D., Rachini A., Pines M., Pandey N., Mosci P., Bistoni F., d'Enfert C., Vecchiarelli A. Th17 cells and IL-17 in protective immunity to vaginal candidiasis. // PloS one. - 2011. - Vol. 6. - №7. - P. e22770. 245. Pioli P. A., Amiel E., Schaefer T. M., Connolly J. E., Wira C. R., Guyre P. M. Differential expression of Toll-like receptors 2 and 4 in tissues of the human female reproductive tract. // Infection and immunity. - 2004. - Vol. 72. - №10. P. 5799-5806. 246. Polisseni F., Bambirra E. A., Camargos A. F. Detection of chronic endometritis by diagnostic hysteroscopy in asymptomatic infertile patients. // Gynecologic and obstetric investigation. - 2003. - Vol. 55. - №4. - P. 205-210. 247. Pretorius C., Jagatt A., Lamont R. F. The relationship between periodontal disease, bacterial vaginosis, and preterm birth. // Journal of perinatal medicine. 2007. - Vol. 35. - №2. - P. 93-99. 248. Puren A. J., Fantuzzi G., Dinarello C. A. Gene expression, synthesis, and secretion of interleukin 18 and interleukin 1beta are differentially regulated in human blood mononuclear cells and mouse spleen cells. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 1999. - Vol. 96. №5. - P. 2256-2261. 249. Quayle A. J. The innate and early immune response to pathogen challenge in the female genital tract and the pivotal role of epithelial cells. // Journal of reproductive immunology. - 2002. - Vol. 57. - №1-2. - P. 61-79. 250. Racz E., Kurek D., Kant M., Baerveldt E. M., Florencia E., Mourits S., de Ridder D., Laman J. D., van der Fits L., Prens E. P. GATA3 expression is 236 decreased in psoriasis and during epidermal regeneration; induction by narrowband UVB and IL-4. // PloS one. - 2011. - Vol. 6. - №5. - P. e19806. 251. Ramachandran P., Lacher D. W., Pfeiler E. A., Elkins C. A. Development of a tiered multilocus sequence typing scheme for members of the Lactobacillus acidophilus complex. // Applied and environmental microbiology. - 2013. Vol. 79. - №23. - P. 7220-7228. 252. Ramathal C. Y., Bagchi I. C., Taylor R. N., Bagchi M. K. Endometrial decidualization: of mice and men. // Seminars in reproductive medicine. - 2010. Vol. 28. - №1. - P. 17-26. 253. Rampersaud R., Planet P. J., Randis T. M., Kulkarni R., Aguilar J. L., Lehrer R. I., Ratner A. J. Inerolysin, a cholesterol-dependent cytolysin produced by Lactobacillus iners. // Journal of bacteriology. - 2011. - Vol. 193. - №5. P. 1034-1041. 254. Rauk P. N., Friebe-Hoffmann U., Winebrenner L. D., Chiao J. P. Interleukin6 up-regulates the oxytocin receptor in cultured uterine smooth muscle cells. // American journal of reproductive immunology. - 2001. - Vol. 45. - №3. P. 148-153. 255. Ravel J., Gajer P., Abdo Z., Schneider G. M., Koenig S. S., McCulle S. L., Karlebach S., Gorle R., Russell J., Tacket C. O., Brotman R. M., Davis C. C., Ault K., Peralta L., Forney L. J. Vaginal microbiome of reproductive-age women. // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2011. - Vol. 108 Suppl 1. - P. 4680-4687. 256. Rein M. F., Shih L. M., Miller J. R., Guerrant R. L. Use of a lactoferrin assay in the differential diagnosis of female genital tract infections and implications for the pathophysiology of bacterial vaginosis. // Sexually transmitted diseases. - 1996. - Vol. 23. - №6. - P. 517-521. 257. Rey G., Skowronek F., Alciaturi J., Alonso J., Bertoni B., Sapiro R. Toll receptor 4 Asp299Gly polymorphism and its association with preterm birth and 237 premature rupture of membranes in a South American population. // Molecular human reproduction. - 2008. - Vol. 14. - №9. - P. 555-559. 258. Robertson J. A., Stemler M. E., Stemke G. W. Immunoglobulin A protease activity of Ureaplasma urealyticum. // Journal of clinical microbiology. - 1984. Vol. 19. - №2. - P. 255-258. 259. Romero R., Mazor M., Wu Y. K., Avila C., Oyarzun E., Mitchell M. D. Bacterial endotoxin and tumor necrosis factor stimulate prostaglandin production by human decidua. // Prostaglandins, leukotrienes, and essential fatty acids. - 1989. - Vol. 37. - №3. - P. 183-186. 260. Romero R., Chaiworapongsa T., Kuivaniemi H., Tromp G. Bacterial vaginosis, the inflammatory response and the risk of preterm birth: a role for genetic epidemiology in the prevention of preterm birth. // American journal of obstetrics and gynecology. - 2004. - Vol. 190. - №6. - P. 1509-1519. 261. Rose W. A., 2nd, McGowin C. L., Spagnuolo R. A., Eaves-Pyles T. D., Popov V. L., Pyles R. B. Commensal bacteria modulate innate immune responses of vaginal epithelial cell multilayer cultures. // PloS one. - 2012. - Vol. 7. - №3. P. e32728. 262. Rotstein O. D., Pruett T. L., Fiegel V. D., Nelson R. D., Simmons R. L. Succinic acid, a metabolic by-product of Bacteroides species, inhibits polymorphonuclear leukocyte function. // Infection and immunity. - 1985. Vol. 48. - №2. - P. 402-408. 263. Royse K. E., Kempf M. C., McGwin G., Jr., Wilson C. M., Tang J., Shrestha S. Toll-like receptor gene variants associated with bacterial vaginosis among HIV-1 infected adolescents. // Journal of reproductive immunology. - 2012. - Vol. 96. - №1-2. - P. 84-89. 264. Rydstrom A., Wick M. J. Monocyte recruitment, activation, and function in the gut-associated lymphoid tissue during oral Salmonella infection. // Journal of immunology. - 2007. - Vol. 178. - №9. - P. 5789-5801. 238 265. Saji F., Samejima Y., Kamiura S., Sawai K., Shimoya K., Kimura T. Cytokine production in chorioamnionitis. // Journal of reproductive immunology. 2000. - Vol. 47. - №2. - P. 185-196. 266. Sallusto F., Lanzavecchia A. The instructive role of dendritic cells on T-cell responses. // Arthritis research. - 2002. - Vol. 4 Suppl 3. - P. S127-132. 267. Sambrook J., Fritsch, E.F., Maniatis, T. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd ed. // N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, 1989. 268. Sanchez S., Garcia P. J., Thomas K. K., Catlin M., Holmes K. K. Intravaginal metronidazole gel versus metronidazole plus nystatin ovules for bacterial vaginosis: a randomized controlled trial. // American journal of obstetrics and gynecology. - 2004. - Vol. 191. - №6. - P. 1898-1906. 269. Sanger F., Coulson A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. // Journal of molecular biology. 1975. - Vol. 94. - №3. - P. 441-448. 270. Sanger F. The Croonian Lecture, 1975. Nucleotide sequences in DNA. // Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing papers of a Biological character. Royal Society, 1975. - Vol. 191. - №1104. - P. 317-333. 271. Schreiber C. A., Meyn L. A., Creinin M. D., Barnhart K. T., Hillier S. L. Effects of long-term use of nonoxynol-9 on vaginal flora. // Obstetrics and gynecology. - 2006. - Vol. 107. - №1. - P. 136-143. 272. Schultheiss T., Stolte-Leeb N., Sopper S., Stahl-Hennig C. Flow cytometric characterization of the lymphocyte composition in a variety of mucosal tissues in healthy rhesus macaques. // Journal of medical primatology. - 2011. - Vol. 40. №1. - P. 41-51. 273. Scurlock A. M., Frazer L. C., Andrews C. W., Jr., O'Connell C. M., Foote I. P., Bailey S. L., Chandra-Kuntal K., Kolls J. K., Darville T. Interleukin-17 239 contributes to generation of Th1 immunity and neutrophil recruitment during Chlamydia muridarum genital tract infection but is not required for macrophage influx or normal resolution of infection. // Infection and immunity. - 2011. Vol. 79. - №3. - P. 1349-1362. 274. Selsted M. E., Ouellette A. J. Defensins in granules of phagocytic and nonphagocytic cells. // Trends in cell biology. - 1995. - Vol. 5. - №3. - P. 114-119. 275. Service R. F. Gene sequencing. The race for the $1000 genome. // Science. 2006. - Vol. 311. - №5767. - P. 1544-1546. 276. Sha B. E., Zariffard M. R., Wang Q. J., Chen H. Y., Bremer J., Cohen M. H., Spear G. T. Female genital-tract HIV load correlates inversely with Lactobacillus species but positively with bacterial vaginosis and Mycoplasma hominis. // The Journal of infectious diseases. - 2005. - Vol. 191. - №1. - P. 25-32. 277. Sherrard J., Donders G., White D., Jensen J. S. European (IUSTI/WHO) guideline on the management of vaginal discharge, 2011. // International journal of STD & AIDS. - 2011. - Vol. 22. - №8. - P. 421-429. 278. Simhan H. N., Caritis S. N., Krohn M. A., Hillier S. L. Elevated vaginal pH and neutrophils are associated strongly with early spontaneous preterm birth. // American journal of obstetrics and gynecology. - 2003. - Vol. 189. - №4. P. 1150-1154. 279. Simhan H. N., Krohn M. A., Roberts J. M., Zeevi A., Caritis S. N. Interleukin-6 promoter -174 polymorphism and spontaneous preterm birth. // American journal of obstetrics and gynecology. - 2003. - Vol. 189. - №4. P. 915-918. 280. Simhan H. N., Caritis S. N., Krohn M. A., Martinez de Tejada B., Landers D. V., Hillier S. L. Decreased cervical proinflammatory cytokines permit subsequent upper genital tract infection during pregnancy. // American journal of obstetrics and gynecology. - 2003. - Vol. 189. - №2. - P. 560-567. 240 281. Sobel J. D. Vaginitis. // The New England journal of medicine. - 1997. Vol. 337. - №26. - P. 1896-1903. 282. Sobel J. D. Vulvovaginal candidosis. // Lancet. - 2007. - Vol. 369. - №9577. P. 1961-1971. 283. Sonoda Y., Abdel Mageed A. M., Isobe N., Yoshimura Y. Induction of avian beta-defensins by CpG oligodeoxynucleotides and proinflammatory cytokines in hen vaginal cells in vitro. // Reproduction. - 2013. - Vol. 145. - №6. - P. 621-631. 284. Spandorfer S. D., Neuer A., Giraldo P. C., Rosenwaks Z., Witkin S. S. Relationship of abnormal vaginal flora, proinflammatory cytokines and idiopathic infertility in women undergoing IVF. // The Journal of reproductive medicine. 2001. - Vol. 46. - №9. - P. 806-810. 285. Spear G. T., Kendrick S. R., Chen H. Y., Thomas T. T., Bahk M., Balderas R., Ghosh S., Weinberg A., Landay A. L. Multiplex immunoassay of lower genital tract mucosal fluid from women attending an urban STD clinic shows broadly increased IL1ss and lactoferrin. // PloS one. - 2011. - Vol. 6. - №5. P. e19560. 286. St John E., Mares D., Spear G. T. Bacterial vaginosis and host immunity. // Current HIV/AIDS reports. - 2007. - Vol. 4. - №1. - P. 22-28. 287. Starkey P. M., Clover L. M., Rees M. C. Variation during the menstrual cycle of immune cell populations in human endometrium. // European journal of obstetrics, gynecology, and reproductive biology. - 1991. - Vol. 39. - №3. P. 203-207. 288. Stern A. S., Gubler U., Presky D. H., Magram J. Structural and functional aspects of the IL-12 receptor complex. // Chemical immunology. - 1997. - Vol. 68. - P. 23-37. 241 289. Strobl H., Knapp W. Myeloid cell-associated lysosomal proteins as flow cytometry markers for leukocyte lineage classification. // Journal of biological regulators and homeostatic agents. - 2004. - Vol. 18. - №3-4. - P. 335-339. 290. Sturm-Ramirez K., Gaye-Diallo A., Eisen G., Mboup S., Kanki P. J. High levels of tumor necrosis factor-alpha and interleukin-1beta in bacterial vaginosis may increase susceptibility to human immunodeficiency virus. // The Journal of infectious diseases. - 2000. - Vol. 182. - №2. - P. 467-473. 291. Subtil D., Denoit V., Le Goueff F., Husson M. O., Trivier D., Puech F. The role of bacterial vaginosis in preterm labor and preterm birth: a case-control study. // European journal of obstetrics, gynecology, and reproductive biology. - 2002. Vol. 101. - №1. - P. 41-46. 292. Sullivan D. A., Wira C. R. Hormonal regulation of immunoglobulins in the rat uterus: uterine response to multiple estradiol treatments. // Endocrinology. 1984. - Vol. 114. - №2. - P. 650-658. 293. Tan J., Paria B. C., Dey S. K., Das S. K. Differential uterine expression of estrogen and progesterone receptors correlates with uterine preparation for implantation and decidualization in the mouse. // Endocrinology. - 1999. Vol. 140. - №11. - P. 5310-5321. 294. Tang Q., Bluestone J. A. The Foxp3+ regulatory T cell: a jack of all trades, master of regulation. // Nature immunology. - 2008. - Vol. 9. - №3. - P. 239-244. 295. Tang Q., Bluestone J. A., Kang S. M. CD4(+)Foxp3(+) regulatory T cell therapy in transplantation. // Journal of molecular cell biology. - 2012. - Vol. 4. №1. - P. 11-21. 296. Tempera G., Furneri P. M. Management of aerobic vaginitis. // Gynecologic and obstetric investigation. - 2010. - Vol. 70. - №4. - P. 244-249. 297. Thomas S. Doderlein’s Bacillus: Lactobacillus Acidpohilus. // J Infect Dis. 1928. - Vol. 43. - P. 218–227. 242 298. Tibbetts T. A., Mendoza-Meneses M., O'Malley B. W., Conneely O. M. Mutual and intercompartmental regulation of estrogen receptor and progesterone receptor expression in the mouse uterus. // Biology of reproduction. - 1998. Vol. 59. - №5. - P. 1143-1152. 299. Tortorella C., Piazzolla G., Matteo M., Pinto V., Tinelli R., Sabba C., Fanelli M., Cicinelli E. Interleukin-6, interleukin-1beta, and tumor necrosis factor alpha in menstrual effluents as biomarkers of chronic endometritis. // Fertility and sterility. - 2013. 300. Turnbaugh P. J., Ley R. E., Hamady M., Fraser-Liggett C. M., Knight R., Gordon J. I. The human microbiome project. // Nature. - 2007. - Vol. 449. №7164. - P. 804-810. 301. Ueha S., Shand F. H., Matsushima K. Cellular and molecular mechanisms of chronic inflammation-associated organ fibrosis. // Frontiers in immunology. 2012. - Vol. 3. - P. 71. 302. Vallor A. C., Antonio M. A., Hawes S. E., Hillier S. L. Factors associated with acquisition of, or persistent colonization by, vaginal lactobacilli: role of hydrogen peroxide production. // The Journal of infectious diseases. - 2001. Vol. 184. - №11. - P. 1431-1436. 303. van de Veerdonk F. L., Kullberg B. J., van der Meer J. W., Gow N. A., Netea M. G. Host-microbe interactions: innate pattern recognition of fungal pathogens. // Current opinion in microbiology. - 2008. - Vol. 11. - №4. P. 305-312. 304. van der Graaf C. A., Netea M. G., Verschueren I., van der Meer J. W., Kullberg B. J. Differential cytokine production and Toll-like receptor signaling pathways by Candida albicans blastoconidia and hyphae. // Infection and immunity. - 2005. - Vol. 73. - №11. - P. 7458-7464. 305. Vandesompele J., De Preter K., Pattyn F., Poppe B., Van Roy N., De Paepe A., Speleman F. Accurate normalization of real-time quantitative RT243 PCR data by geometric averaging of multiple internal control genes. // Genome biology. - 2002. - Vol. 3. - №7. 306. Varner M. W., Esplin M. S. Current understanding of genetic factors in preterm birth. // BJOG: an international journal of obstetrics and gynaecology. 2005. - Vol. 112 Suppl 1. - P. 28-31. 307. Venter J. C., Adams M. D., Myers E. W., Li P. W., Mural R. J., Sutton G. G., Smith H. O., Yandell M., Evans C. A., Holt R. A., Gocayne J. D., Amanatides P., Ballew R. M., Huson D. H., Wortman J. R., Zhang Q., Kodira C. D., Zheng X. H., Chen L., Skupski M., Subramanian G., Thomas P. D., Zhang J., Gabor Miklos G. L., Nelson C., Broder S., Clark A. G., Nadeau J., McKusick V.A., Zinder N., Levine A. J., Roberts R. J., Simon M., Slayman C., Hunkapiller M., Bolanos R., Delcher A., Dew I., Fasulo D., Flanigan M., Florea L., Halpern A., Hannenhalli S., Kravitz S., Levy S., Mobarry C., Reinert K., Remington K., AbuThreideh J., Beasley E., Biddick K., Bonazzi V., Brandon R., Cargill M., Chandramouliswaran I., Charlab R., Chaturvedi K., Deng Z., Di Francesco V., Dunn P., Eilbeck K., Evangelista C., Gabrielian A. E., Gan W., Ge W., Gong F., Gu Z., Guan P., Heiman T. J., Higgins M. E., Ji R. R., Ke Z., Ketchum K. A., Lai Z., Lei Y., Li Z., Li J., Liang Y., Lin X., Lu F., Merkulov G. V., Milshina N., Moore H. M., Naik A. K., Narayan V. A., Neelam B., Nusskern D., Rusch D. B., Salzberg S., Shao W., Shue B., Sun J., Wang Z., Wang A., Wang X., Wang J., Wei M., Wides R., Xiao C., Yan C., Yao A., Ye J., Zhan M., Zhang W., Zhang H., Zhao Q., Zheng L., Zhong F., Zhong W., Zhu S., Zhao S., Gilbert D., Baumhueter S., Spier G., Carter C., Cravchik A., Woodage T., Ali F., An H., Awe A., Baldwin D., Baden H., Barnstead M., Barrow I., Beeson K., Busam D., Carver A., Center A., Cheng M. L., Curry L., Danaher S., Davenport L., Desilets R., Dietz S., Dodson K., Doup L., Ferriera S., Garg N., Gluecksmann A., Hart B., Haynes J., Haynes C., Heiner C., Hladun S., Hostin D., Houck J., Howland T., Ibegwam C., Johnson J., Kalush F., Kline L., Koduru S., Love A., Mann F., May D., McCawley S., McIntosh T., McMullen I., Moy M., Moy L., 244 Murphy B., Nelson K., Pfannkoch C., Pratts E., Puri V., Qureshi H., Reardon M., Rodriguez R., Rogers Y. H., Romblad D., Ruhfel B., Scott R., Sitter C., Smallwood M., Stewart E., Strong R., Suh E., Thomas R., Tint N. N., Tse S., Vech C., Wang G., Wetter J., Williams S., Williams M., Windsor S., Winn-Deen E., Wolfe K., Zaveri J., Zaveri K., Abril J. F., Guigo R., Campbell M. J., Sjolander K. V., Karlak B., Kejariwal A., Mi H., Lazareva B., Hatton T., Narechania A., Diemer K., Muruganujan A., Guo N., Sato S., Bafna V., Istrail S., Lippert R., Schwartz R., Walenz B., Yooseph S., Allen D., Basu A., Baxendale J., Blick L., Caminha M., Carnes-Stine J., Caulk P., Chiang Y. H., Coyne M., Dahlke C., Mays A., Dombroski M., Donnelly M., Ely D., Esparham S., Fosler C., Gire H., Glanowski S., Glasser K., Glodek A., Gorokhov M., Graham K., Gropman B., Harris M., Heil J., Henderson S., Hoover J., Jennings D., Jordan C., Jordan J., Kasha J., Kagan L., Kraft C., Levitsky A., Lewis M., Liu X., Lopez J., Ma D., Majoros W., McDaniel J., Murphy S., Newman M., Nguyen T., Nguyen N., Nodell M., Pan S., Peck J., Peterson M., Rowe W., Sanders R., Scott J., Simpson M., Smith T., Sprague A., Stockwell T., Turner R., Venter E., Wang M., Wen M., Wu D., Wu M., Xia A., Zandieh A., Zhu X. The sequence of the human genome. // Science. - 2001. - Vol. 291. - №5507. - P. 1304-1351. 308. Verstraelen H., Verhelst R., Claeys G., De Backer E., Temmerman M., Vaneechoutte M. Longitudinal analysis of the vaginal microflora in pregnancy suggests that L. crispatus promotes the stability of the normal vaginal microflora and that L. gasseri and/or L. iners are more conducive to the occurrence of abnormal vaginal microflora. // BMC microbiology. - 2009. - Vol. 9. - P. 116. 309. Vicetti Miguel R. D., Chivukula M., Krishnamurti U., Amortegui A. J., Kant J. A., Sweet R. L., Wiesenfeld H. C., Phillips J. M., Cherpes T. L. Limitations of the criteria used to diagnose histologic endometritis in epidemiologic pelvic inflammatory disease research. // Pathology, research and practice. - 2011. Vol. 207. - №11. - P. 680-685. 245 310. Vigil P., Cortes M. E., Zuniga A., Riquelme J., Ceric F. Scanning electron and light microscopy study of the cervical mucus in women with polycystic ovary syndrome. // Journal of electron microscopy. - 2009. - Vol. 58. - №1. - P. 21-27. 311. Watari M., Watari H., DiSanto M. E., Chacko S., Shi G. P., Strauss J. F., 3rd Pro-inflammatory cytokines induce expression of matrix-metabolizing enzymes in human cervical smooth muscle cells. // The American journal of pathology. 1999. - Vol. 154. - №6. - P. 1755-1762. 312. Weber A., Wasiliew P., Kracht M. Interleukin-1 (IL-1) pathway. // Science. signaling 2010. - Vol. 3. - №105. 313. Weinberg E. D. Pregnancy-associated depression of cell-mediated immunity. // Reviews of infectious diseases. - 1984. - Vol. 6. - №6. - P. 814-831. 314. Weissenbacher T. M., Witkin S. S., Gingelmaier A., Scholz C., Friese K., Mylonas I. Relationship between recurrent vulvovaginal candidosis and immune mediators in vaginal fluid. // European journal of obstetrics, gynecology, and reproductive biology. - 2009. - Vol. 144. - №1. - P. 59-63. 315. Wennerholm U. B., Holm B., Mattsby-Baltzer I., Nielsen T., PlatzChristensen J. J., Sundell G., Hagberg H. Interleukin-1alpha, interleukin-6 and interleukin-8 in cervico/vaginal secretion for screening of preterm birth in twin gestation. // Acta obstetricia et gynecologica Scandinavica. - 1998. - Vol. 77. - №5. - P. 508-514. 316. Wetendorf M., DeMayo F. J. The progesterone receptor regulates implantation, decidualization, and glandular development via a complex paracrine signaling network. // Molecular and cellular endocrinology. - 2012. - Vol. 357. №1-2. - P. 108-118. 317. White H. D., Crassi K. M., Givan A. L., Stern J. E., Gonzalez J. L., Memoli V. A., Green W. R., Wira C. R. CD3+ CD8+ CTL activity within the human female reproductive tract: influence of stage of the menstrual cycle and menopause. // Journal of immunology. - 1997. - Vol. 158. - №6. - P. 3017-3027. 246 318. White H. D., Prabhala R. H., Humphrey S. L., Crassi K. M., Richardson J. M., Wira C. R. A method for the dispersal and characterization of leukocytes from the human female reproductive tract. // American journal of reproductive immunology. - 2000. - Vol. 44. - №2. - P. 96-103. 319. Wiesenfeld H. C., Hillier S. L., Krohn M. A., Landers D. V., Sweet R. L. Bacterial vaginosis is a strong predictor of Neisseria gonorrhoeae and Chlamydia trachomatis infection. // Clinical infectious diseases: an official publication of the Infectious Diseases Society of America. - 2003. - Vol. 36. - №5. - P. 663-668. 320. Wiggins R., Hicks S. J., Soothill P. W., Millar M. R., Corfield A. P. Mucinases and sialidases: their role in the pathogenesis of sexually transmitted infections in the female genital tract. // Sexually transmitted infections. - 2001. Vol. 77. - №6. - P. 402-408. 321. Wilton L., Kollarova M., Heeley E., Shakir S. Relative risk of vaginal candidiasis after use of antibiotics compared with antidepressants in women: postmarketing surveillance data in England. // Drug safety : an international journal of medical toxicology and drug experience. - 2003. - Vol. 26. - №8. P. 589-597. 322. Wira C. R., Sullivan D. A. Estradiol and progesterone regulation of immunoglobulin A and G and secretory component in cervicovaginal secretions of the rat. // Biology of reproduction. - 1985. - Vol. 32. - №1. - P. 90-95. 323. Wira C. R., Fahey J. V., Sentman C. L., Pioli P. A., Shen L. Innate and adaptive immunity in female genital tract: cellular responses and interactions. // Immunological reviews. - 2005. - Vol. 206. - P. 306-335. 324. Wira C. R., Fahey J. V., Ghosh M., Patel M. V., Hickey D. K., Ochiel D. O. Sex hormone regulation of innate immunity in the female reproductive tract: the role of epithelial cells in balancing reproductive potential with protection against sexually transmitted pathogens. // American journal of reproductive immunology. 2010. - Vol. 63. - №6. - P. 544-565. 247 325. World Health Organization Department of HIV/AIDS. Global prevalence and incidence of selected curable sexually transmitted infections: overview and estimates. / Geneva: World Health Organization, 2001. - 26-29 р. 326. Yamamoto T., Zhou X., Williams C. J., Hochwalt A., Forney L. J. Bacterial populations in the vaginas of healthy adolescent women. // Journal of pediatric and adolescent gynecology. - 2009. - Vol. 22. - №1. - P. 11-18. 327. Yan D. H., Lu Z., Su J. R. Comparison of main lactobacillus species between healthy women and women with bacterial vaginosis. // Chinese medical journal. 2009. - Vol. 122. - №22. - P. 2748-2751. 328. Yano J., Noverr M. C., Fidel P. L., Jr. Cytokines in the host response to Candida vaginitis: Identifying a role for non-classical immune mediators, S100 alarmins. // Cytokine. - 2012. - Vol. 58. - №1. - P. 118-128. 329. Yasodhara P., Raghunath M., Sreeramulu D., Venu L., Hemalatha R., Krishna T. P. Local immunity in Indian women with bacterial vaginosis. // Journal of reproductive immunology. - 2006. - Vol. 70. - №1-2. - P. 133-141. 330. Yeaman G. R., Guyre P. M., Fanger M. W., Collins J. E., White H. D., Rathbun W., Orndorff K. A., Gonzalez J., Stern J. E., Wira C. R. Unique CD8+ T cell-rich lymphoid aggregates in human uterine endometrium. // Journal of leukocyte biology. - 1997. - Vol. 61. - №4. - P. 427-435. 331. Yoshimoto T., Mizutani H., Tsutsui H., Noben-Trauth N., Yamanaka K., Tanaka M., Izumi S., Okamura H., Paul W. E., Nakanishi K. IL-18 induction of IgE: dependence on CD4+ T cells, IL-4 and STAT6. // Nature immunology. 2000. - Vol. 1. - №2. - P. 132-137. 332. Young A., Thomson A. J., Ledingham M., Jordan F., Greer I. A., Norman J. E. Immunolocalization of proinflammatory cytokines in myometrium, cervix, and fetal membranes during human parturition at term. // Biology of reproduction. - 2002. - Vol. 66. - №2. - P. 445-449. 248 333. Yudin M. H., Hillier S. L., Wiesenfeld H. C., Krohn M. A., Amortegui A. A., Sweet R. L. Vaginal polymorphonuclear leukocytes and bacterial vaginosis as markers for histologic endometritis among women without symptoms of pelvic inflammatory disease. // American journal of obstetrics and gynecology. - 2003. Vol. 188. - №2. - P. 318-323. 334. Zariffard M. R., Novak R. M., Lurain N., Sha B. E., Graham P., Spear G. T. Induction of tumor necrosis factor- alpha secretion and toll-like receptor 2 and 4 mRNA expression by genital mucosal fluids from women with bacterial vaginosis. // The Journal of infectious diseases - 2005. - Vol. 191. - №11. - P. 1913-1921. 335. Zhang D., Liu Z. H., Liao Q. P., Ma J. M., Sun Y. F., Fan S. R., Hu L. N., Jia H. J., Di W., Wang W. [Study of local immunity of lower genital tract infections]. // Zhonghua fu chan ke za zhi. - 2009. - Vol. 44. - №1. - P. 13-15. 336. Zhou X., Westman R., Hickey R., Hansmann M. A., Kennedy C., Osborn T. W., Forney L. J. Vaginal microbiota of women with frequent vulvovaginal candidiasis. // Infection and immunity. - 2009. - Vol. 77. - №9. P. 4130-4135. 249
