Корнеева Валерия Алексеевна БИОРАЗНООБРАЗИЕ
advertisement
Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Биологический факультет на правах рукописи Корнеева Валерия Алексеевна БИОРАЗНООБРАЗИЕ СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ В КИСЛОРОД-СОДЕРЖАЩИХ ВОДАХ ЧЕРНОГО И БАЛТИЙСКОГО МОРЕЙ 03.02.03 – микробиология Диссертационная работа на соискание ученой степени кандидата биологических наук Научный руководитель: к.б.н., доц. Брюханов А.Л. Научный консультант: д.б.н. Пименов Н.В. Москва - 2015 г. 2 Содержание работы Введение………………………………………………………………………..……….6 Актуальность темы исследования и степень ее разработанности……………….….6 Цели и задачи исследования……………………………………………………..…….8 Научная новизна работы…………………………………………………………….....9 Практическая и теоретическая значимость работы………………………………...10 Апробация работы…………………………………………………………………….10 Обзор литературы……………………………………………………………………..12 Глава 1. Сульфатредуцирующие бактерии…………………………….…………….12 1.1 . История открытия и изучения сульфатредуцирующих бактерий………..……12 1.2. Общая характеристика физиологии сульфатредуцирующих бактерий……….14 1.2.1. Аэротолерантность сульфатредуцирующих бактерий…………………...…..17 1.3. Филогения сульфатредуцирующих бактерий…………………………………..18 1.4. Распространение сульфатредуцирующих бактерий……………………………19 1.4.1. Сульфатредуцирующие бактерии в морских экосистемах…………………..22 Глава 2. Обзор основных молекулярно-биологических методов, применяемых в микробной экологии……………………………………………………………….….26 2.1. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH)………………………………..….26 2.1.1. Принцип метода……………………………………………………………….28 2.1.2. Применение метода FISH в исследованиях сообществ СРБ различных местообитаний………………………………………………………………………...32 2.2. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР)………………………………...35 2.2.1. Применение метода полимеразной цепной реакции в изучении филогенетического разнообразия СРБ в различных сообществах…………...……39 2.3. Денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ)…………………..42 2.3.1. Применение денатурирующего градиентного гель-электрофореза в изучении филогенетического разнообразия СРБ в различных сообществах………………...45 Глава 3. Черное и Балтийское моря – общая характеристика водной толщи и сообществ СРБ………………………………………………………………………...47 3.1. Черное море………………………………………………………………….……47 3.1.1. Исследования сообществ сульфатредуцирующих бактерий в Черном море…………………………………………………………………………………….51 3.2. Балтийское море………………………………………………………………….55 3.2.1. Исследования сообществ сульфатредуцирующих бактерий в Балтийском море…………………………………………………………………………………….58 Глава 4. Материалы и методы исследования…………………………………..…….62 4.1. Отбор проб морской воды…………………………………………………..……62 4.2. Идентификация и определение численности микроорганизмов методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) ……………………………………..62 3 4.2.1. Микроскопический анализ и подсчет клеток, окрашенных ДАФИ и гибридизовавшихся с соответствующими FISH-зондами…………………...……..65 4.3. Выделение тотальной ДНК клеток из водных проб.…………………………...66 4.4. Детекция СРБ в водной толще с помощью ПЦР…………………………….…67 4.4.1. Вложенная ПЦР…………………………………………………………….…..68 4.4.2. Электрофоретическое разделение и визуализация продуктов ПЦР……..….69 4.4.3. Определение численности СРБ методом количественной ПЦР………….…69 4.5. Анализ участков гена dsrB с использованием денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ) с последующим секвенированием...............................70 4.5.1. Секвенирование участков гена dsrB с помощью дидезоксинуклеотидного метода…………………………………………………………………………………..72 4.5.2. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей и построение филогенетических дендрограмм……………………………………………………..73 4.6. Культивирование сульфатредуцирующих бактерий……………………………74 4.6.1. Выделение накопительных культур сульфатредуцирующих бактерий…..…74 4.6.2. Подбор оптимальных условий для роста накопительных культур из аэробной водной толщи Черного моря …………………………………………...…77 4.6.3. Очистка накопительных культур СРБ с целью получения чистых культур…………………………………………………………………………………79 4.6.4. Культивирование Desulfosporosinus sp…………………………………..…….79 4.6.5. Культивирование Desulfofrigus sp……………………………………………..80 4.6.6. Изучение способности Desulfofrigus sp. использовать различные доноры/акцепторы электронов и сбраживать субстраты………………………..….81 4.6.7. Определение оптимума рН для роста Desulfofrigus sp……………………….82 4.6.8. Кислородный стресс……………………………………………………………82 4.7. Световая и электронная микроскопия клеток СРБ……………………………..83 4.8. Измерение содержания сероводорода в растущих культурах СРБ………...….84 4.9. Определение скоростей сульфатредукции радиоизотопным методом………..85 4.9.1. Измерение скоростей сульфатредукции в пробах морской воды…………....85 4.9.2. Измерение скоростей сульфатредукции при росте культуры Desulfofrigus sp. на средах с различным содержанием кислорода в газовой фазе…………………...86 4.10. Определение жирных кислот в клетке.………………………………….……..87 Результаты и обсуждение………………………………………...…………………...88 Глава 5. Сообщества сульфатредуцирующих бактерий в подповерхностных кислород-содержащих водах Черного моря……………………………...…….……88 5.1. Содержание кислорода, сероводорода и интенсивность сульфатредукции в верхней водной толще Черного моря……………………………………………...…88 5.2. Исследование сообществ СРБ в верхних водных горизонтах Черного моря методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH)………………………..……91 4 5.2.1. Общая численность прокариот, бактерий и архей в подповерхностных водах Черного моря, определенная с помощью FISH………………………………...……91 5.2.2. Филогенетический состав сообществ сульфатредуцирующих бактерий подповерхностной водной толщи Черного моря, определенный с помощью FISH…………………………………………………………………………………….93 5.3. Обнаружение сульфатредуцирующих бактерий в пробах воды из подповерхностной водной толщи Черного моря с помощью ПЦР-анализа генов 16S рРНК и dsrB…………………………………………………………………….…96 5.3.1. Сообщества свободноживущих и ассоциированных с мелкой (≤1,2 мкм) взвесью сульфатредуцирующих бактерий…………………………………………..97 5.3.2. Сообщества сульфатредуцирующих бактерий, ассоциированных с крупной (≥1,2 мкм) взвесью …………………………………………………………………100 5.3.3. Численность СРБ в подповерхностной водной толще Черного моря, определенная методом количественной ПЦР……………………………………..101 5.4. ДГГЭ-анализ по гену dsrB сообществ СРБ подповерхностной водной толщи Черного моря.…………………………………………………………………….…..102 5.5. Секвенирование и филогенетический анализ последовательностей участков гена dsrB, выделенных и реамплифицированных из отдельных ДГГЭполос……………………………………………………………………………….....103 5.6. СРБ в накопительных культурах, выделенных из аэробных вод и зоны хемоклина Черного моря…………………………………………………………….108 5.6.1. Оптимизация состава питательной среды для роста накопительных культур СРБ из аэробной зоны Черного моря………………………………………….……110 5.7. Идентификация микроорганизмов в накопительной культуре СРБ, выделенной с глубины 70 м аэробной зоны водной толщи Черного моря……………………..113 5.8. Идентификация и описание чистой культуры СРБ, выделенной с глубины 30 м аэробной зоны водной толщи Черного моря……………………………………….114 5.8.1. Микробиологическое описание культуры Desulfofrigus sp. штамм SrB30……………………………………………………………………………………...115 5.8.2. Оптимум температур для роста культуры Desulfofrigus sp. штамм SrB30…………………………………………………………………………………….116 5.8.3. Оптимум рН для роста культуры Desulfofrigus sp. штамм SrB-30………....118 5.8.4. Изучение способности культуры Desulfofrigus sp. штамм SrB-30 использовать различные доноры/акцепторы электронов, а также сбраживаемые субстраты……………………………………………………………………….....….118 5.8.5. Состав жирных кислот в клетках Desulfofrigus sp. штамм SrB-30……..….120 5.9. Рост выделенной в чистую культуру СРБ Desulfofrigus euxinos штамм SrB-30 в присутствии различных концентраций кислорода.……………………………..…122 5 5.9.1. Влияние различных начальных концентраций кислорода в газовой фазе на численность клеток в культуре Desulfofrigus euxinos SrB-30……………………..122 5.9.2. Влияние различных начальных концентраций кислорода в газовой фазе на образование сероводорода культурой Desulfofrigus euxinos SrB-30……………...123 5.9.3. Влияние различных начальных концентраций кислорода в газовой фазе на скорость сульфатредукции (ССР) культур Desulfofrigus euxinos SrB-30………....124 Глава 6. Сообщества сульфатредуцирующих бактерий в кислород-содержащих водах Гданьской впадины Балтийского моря…………………..…………………..126 6.1. Гидрохимические параметры вод Гданьской впадины Балтийского моря…..126 6.2. Обнаружение СРБ в пробах воды из Гданьской впадины с помощью ПЦРанализа генов 16S рРНК и dsrB………………………………………………….….127 6.2.1. Сообщества свободноживущих и ассоциированных с мелкой (≤1,2 мкм) взвесью сульфатредуцирующих бактерий……………………………………….128 6.2.2. Сообщества сульфатредуцирующих бактерий, ассоциированных с крупной (≥1,2 мкм) взвесью …………………………………………………………………..128 6.3. ДГГЭ-анализ по гену dsrB сообществ СРБ водной толщи Гданьской впадины.…………………………………………………………………………...…130 6.4. Секвенирование и филогенетический анализ последовательностей участков гена dsrB, выделенных и реамплифицированных из отдельных ДГГЭ-полос. ……………………………………………………………………………………….131 6.5. Получение накопительных культур сульфатредуцирующих бактерий из водной толщи Гданьской впадины Балтийского моря……………………...……..136 Обсуждение …………………………………………………………………………136 Заключение………………………………………………………………………….155 Выводы……………………………………………………..………………………...157 Список цитированной литературы……………………………………………….....158 6 ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования и степень ее разработанности. К сульфатредуцирующим бактериям (СРБ) относят анаэробные микроорганизмы, использующие сульфат в качестве конечного акцептора электронов при окислении органических соединений местообитаниях СРБ, или наряду молекулярного с водорода. метаногенными археями, В анаэробных осуществляют терминальную деструкцию органических соединений, продуцируя при этом сероводород. Сульфатредуцирующие бактерии традиционно считаются строго анаэробными микроорганизмами, однако в последнее время показано, что многие из них обладают эффективными ферментативными системами антиокислительной защиты [Dolla et al., 2006; Brioukhanov et al., 2010], позволяющими им не только выживать, но и оставаться метаболически активными в окисленных слоях осадочных отложений, в циано-бактериальных матах, биопленках, активных илах сточных вод и других местообитаниях, подвергающихся периодическому воздействию кислорода [Canfield a. Des Marais, 1991; Krekeler et al., 1997; Jonkers et al., 2005]. Черное море – крупнейший в мире меромиктический водоем, где наблюдается существование несмешиваемых слоев воды (аэробные воды, зона хемоклина и анаэробные воды, содержащие значительные количества растворенного сероводорода) [Сорокин, 1982]. Хорошо известно, что сероводород в Черном море образуется, в основном, за счет деятельности сульфатредуцирующих бактерий в анаэробной водной толще и донных осадках [Сорокин, 1970; Леин и др., 1990; Гулин, 1991; Иванов и др., 1992]. В литературных источниках разными исследователями приводятся количественные оценки масштабов бактериальной сульфатредукции в анаэробных водах Черного моря [Сорокин, 1971; Леин и др., 1990; Albert, 1995]. С использованием молекулярно-биологических методов было подтверждено присутствие СРБ [Vetriani, 2003; Durisch-Kaiser et al., 2005; Lin et al., 2006; Neretin et al., 2007] в анаэробной водной толще и зоне хемоклина, а также в анаэробных матах [Basen et 7 al., 2011] Черного моря, но филогенетический состав сообществ черноморских СРБ оставался до конца не выясненным, кроме того, полностью отсутствовали данные о выделении, идентификации и описании чистых культур этих бактерий. Нет информации и о возможности протекания процесса сульфатредукции в аэробной водной толще, несмотря на то, что сотрудники Института океанологии им. П.П. Ширшова РАН более 20 лет назад обнаружили в аэробных водах Черного моря присутствие аналитически определяемых количеств восстановленных соединений серы [Волков и др., 1992], появление которых можно объяснить только протеканием биологических процессов восстановления сульфатов. Балтийское море представляет собой мелководный мезотрофный морской бассейн со присущими специфическими внутренним особенностями водоемам с гидрологического затрудненным режима, водообменом. Его поверхностные, сильно распресненные и более глубинные, соленые воды имеют разное происхождение: первые поступают со стоком рек, вторые – из Северного моря. Затрудненный водообмен в сочетании с достаточно высокой продуктивностью приводит к тому, что во впадинах Балтийского моря за счет деятельности микроорганизмов происходит быстрое исчезновение кислорода и формируется обширная зона сероводородного заражения водной толщи, обусловленная жизнедеятельностью СРБ [Fonselius, 1986; Андерсен и Паулак, 2007; Carstensen et al., 2014]. В анаэробной водной толще Готландской впадины Балтийского моря немецкими исследователями выявлены процессы сульфатредукции и молекулярными методами идентифицированы некоторые представители СРБ [Brettar et al., 2012], но данных о присутствии активных форм этих микроорганизмов в подповерхностных аэробных водах в литературе нет. В российском секторе Балтийского моря анаэробные придонные слои водной толщи практически постоянно наблюдаются в Гданьской впадине на глубинах свыше 80-85 м [Нефть и окружающая среда Калининградской области, 2012]. Высокая антропогенная нагрузка, которой подвержены внутриконтинентальные моря, окруженные промышленно развитыми регионами, 8 способствует значительному расширению площади постоянного или периодического заражения придонной водной толщи сероводородом, как это наблюдается в водной толще северо-западного шельфа Черного [Кондратьев и Внуков, 1999] и во впадинах Балтийского и Каспийского морей [Бруевич, 1937; Сапожников и Мордасова, 2007; Carstensen et al., 2014]. Большинство исследователей склоняются к гипотезе, что основным источником сероводорода во впадинах мелководных бассейнов являются донные осадки, где в условиях увеличения потока органического вещества резко усиливается интенсивность процесса сульфатредукции. Однако с учетом новых данных о СРБ, обладающих эффективными биохимическими и физиологическими способами защиты от окислительного стресса и способных в водной толще морей сохранять физиологическую активность в микроаэробных микронишах взвешенных частиц [Shanks a. Reeder, 1993], можно предположить, что СРБ аэробной водной толщи оказывают существенное воздействие на кислородный режим вод мезотрофных и эвтрофных морских водоемов. Таким образом, изучение филогенетического и функционального разнообразия сообществ сульфатредуцирующих бактерий в кислород-содержащей (подповерхностные воды и зона хемоклина) водной толще Черного и Балтийского морей с использованием комплекса молекулярно-биологических, биохимических и традиционных микробиологических методов является весьма актуальной и интересной научной задачей. Цели и задачи исследования. Целью работы было изучение филогенетического разнообразия сульфатредуцирующих бактерий в кислородсодержащей (подповерхностные воды и зона хемоклина) водной толще Черного и Балтийского морей с использованием комплекса молекулярно-биологических, биохимических и традиционных микробиологических методов. Для достижения поставленной цели решали следующие задачи: 1. Оценить с помощью стандартной и вложенной ПЦР с праймерами, 9 специфичными к генам 16S рРНК, распространение ассоциированных с взвесью и свободноживущих сульфатредуцирующих бактерий (СРБ) шести основных филогенетических подгрупп в гидрохимически различающихся слоях кислородсодержащей водной толщи Черного и Балтийского морей. 2. Определить численность СРБ на различных горизонтах кислородсодержащей водной толщи Черного моря методами флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) и количественной ПЦР. 3. Получить с использованием денатурирующего градиентного гельэлектрофореза (ДГГЭ) профили сообществ СРБ (по гену dsrB, кодирующему βсубъединицу диссимиляционной сульфитредуктазы) на различных глубинах кислород-содержащей водной толщи Черного и Балтийского морей, отсеквенировать участки гена dsrB, выделенные и реамплифицированные из отдельных ДГГЭ-полос, и провести полный филогенетический анализ сообществ СРБ по гену dsrB. 4. Получить накопительные культуры СРБ из подповерхностной водной толщи Черного и Балтийского морей. 5. Дать полное описание чистой культуры СРБ, выделенной из фотической зоны Черного моря, и дать оценку её способности выделенного штамма к росту и осуществлению процесса сульфатредукции в условиях кислородных стрессов. Научная новизна работы. Впервые с помощью комплекса современных молекулярно-биологических методов детально изучен филогенетический состав сообществ СРБ в подповерхностной водной толще Черного и Балтийского морей. Обнаружены физиологически активные клетки СРБ в аэробных морских водах, а также подтверждено их присутствие в зоне хемоклина Черного моря. Получены накопительные и чистая культуры СРБ из аэробной водной толщи Черного моря. Впервые выделенная из аэробной водной толщи (глубина – 30 м) Черного моря чистая культура психрофильной сульфатредуцирующей бактерии полностью охарактеризована и описана как новый вид Desulfofrigus euxinos. Показано, что данная бактерия обладает относительной аэротолерантностью, сохраняя 10 жизнеспособность при начальных концентрациях кислорода до 5,2% в газовой фазе над средой культивирования. Практическая и теоретическая значимость работы. Теоретическая значимость работы заключается в получении новых и принципиально важных данных о филогенетическом составе сообществ СРБ в кислород-содержащей водной толще Черного и Балтийского морей, а также о свойствах выделенной в чистую культуру черноморской СРБ. Полученные результаты дополняют накопленные к настоящему моменту знания о распространении сульфатредуцирующих бактерий в местообитаниях, подверженных воздействию кислорода, а также о составе микробных сообществ водной толщи исследуемых морей. С практической точки зрения, полученные данные о биоразнообразии сульфатредуцирующих бактерий в морских аэробных водах могут служить основой для разработки новых способов борьбы с биокоррозией металлических конструкций в морских водоемах, а также учитываться при заводнениях нефтяных пластов морской кислород-содержащей водой. Выделенная с глубины 70 м Черного моря накопительная культура, содержащая СРБ рода Desulfosporosinus и нуждающаяся для роста в присутствии бихромата калия в среде, потенциально может являться объектом для использования в биоремедиации различных соленых водных экосистем от загрязнений токсичными солями хрома, в том числе для очистки промышленных стоков с высоким содержанием хрома (гальваники, кожевенного производства и др.). Апробация работы. Результаты исследований были представлены на V, VI и VII молодежных школах-конференциях с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии» (Москва, 2009, 2010 и 2011 гг.), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Автотрофные микроорганизмы» (Москва, 2010 г.), XVII, XVIII, XIX и XXI международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» 11 (Москва, 2010, 2011, 2012 и 2014 гг.), 3-м Байкальском микробиологическом симпозиуме с международным участием «Микроорганизмы и вирусы в водных экосистемах» (Иркутск, 2011 г.), 4-м и 6-м конгрессах европейских микробиологов FEMS (Швейцария, Нидерланды;, 2011 и 2015 гг.), 16-й и 18-й международных Пущинских школах-конференциях молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2012 и 2014 гг.), Всероссийском симпозиуме «Современные проблемы микроорганизмов» (Москва, физиологии, 2014 г.), а экологии также на микробиологии биологического факультета МГУ (2015 г.). и биотехнологии заседании кафедры 12 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ ГЛАВА 1. СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИЕ БАКТЕРИИ На данный момент к сульфатредуцирующим бактериям (СРБ) относят анаэробные микроорганизмы, использующие акцептора электронов при окислении сульфат в качестве конечного органических соединений (преимущественно низкомолекулярных) или молекулярного водорода. Общая схема процесса сульфатредукции представлена на рис. 1. Рис. 1. Схема диссимиляционной и ассимиляционной сульфатредукции [https://www.studyblue.com/notes/note/n/lecture-9-energy-metabolism-ii/deck/8084468]. 1.1. История открытия и изучения сульфатредуцирующих бактерий Майер и Кон первыми еще в XIX веке определили, что продукция значительных концентраций сероводорода в морских местообитаниях связана с биологическим восстановлением сульфатов [Meyer, 1864; Cohn, 1867]. ГоппеЗейлер в 1886 г. показал, что при внесении CaSO4 в анаэробную накопительную культуру из ила происходит полное разложение целлюлозы, а сульфат, в свою 13 очередь, восстанавливается до сульфида [Hoppe-Seyler, 1886]. В 1895 г. в ходе изучения микробной продукции сульфида Бейеринк [Beijerinck, 1895] впервые выделил культуру сульфатредуцирующей бактерии (рис. 2), названной Spirillum desulfuricans (ныне – Desulfovibrio desulfuricans [Kluyver a. van Niel, 1936]). В дальнейшем изучение сульфатредуцирующих микроорганизмов продолжалось и развивалось. Первая термофильная СРБ, имеющая оптимальную для роста температуру 55°С, была описана в 1924 г. и названа Vibrio thermodesulfuricans [Elion, 1924]. Впоследствии данный микроорганизм стали рассматривать как штамм Desulfovibrio desulfuricans, адаптированный к высоким температурам [Baars, 1930; Kluyver a. Baars; 1932]. Первыми описанными спорообразующими СРБ были термофильные бактерии Clostridium nigrificans [Werkman a. Weaver, 1927] и Sporovibrio desulfuricans [Starkey, 1938], идентифицированные впоследствии как один вид – Desulfotomaculum nigrificans [Campbell et al., 1957; Campbell a. Postgate, 1965]. До начала 80-х годов XX века считалось, что сульфатредуцирующие микроорганизмы играют минорную роль в глобальном цикле углерода, поскольку на тот момент было только известно, что представители родов Desulfovibrio и Desulfotomaculum могут использовать в своем метаболизме водород и ряд органических соединений, таких как этанол, формиат, лактат, пируват, малат и сукцинат, окисляя их до ацетата [Muyzer a. Stams, 2008]. Однако благодаря исследованиям Фритца Видделя стало понятно, что СРБ являются важнейшими участниками биогеохимического цикла углерода в анаэробных экосистемах, в особенности, в морских осадках. Видделем были выделено и описано множество СРБ, способных к росту на таких органических субстратах, как коротко- и длинноцепочечные жирные кислоты и ароматические соединения (бензоат и фенол) [Widdel, 1980]. 14 Рис. 2. Vibrio desulfuricans – первая культура СРБ, выделенная Бейеринком в 1895 г. [Beijerinck, 1895; Muyzer a. Stams, 2008]. 1.2. Общая характеристика физиологии сульфатредуцирующих бактерий. За последние 30 лет была показана способность сульфатредуцирующих микроорганизмов использовать, помимо упомянутых выше, еще более широкий спектр органических субстратов, включающий в себя сахара [Ollivier et al., 1988; Sass et al., 2002], аминокислоты [Stams et al., 1985; Baena et al., 1998] и одноуглеродные соединения, такие, как метанол [Nanninga et al., 1987; Назина и др., 1988], СО [Parshina et al., 2005; Henstra et al., 2007] и метилмеркаптан [Tanimoto a. Bak, 1994]. Также СРБ могут расти, осуществляя дисмутацию 15 тиосульфата, сульфита и серы, приводящую к образованию сульфата и сульфида [Bak a. Pfennig, 1987; Bottcher et al., 2005]. Помимо бензоата и фенола СРБ также могут деградировать такие ароматические углеводороды, как толуол и этилбензол [Rabus et al., 1993; Harms, 1999; Morasch et al., 2004]. Более того, была описана способность СРБ использовать длинноцепочечные алканы [Aeckersberg et al., 1998; So a. Young, 1999; Cravo-Laureau et al., 2004; Davidova et al., 2006], алкены [Grossi et al., 2007], а также короткоцепочечные алканы [Kniemeyer et al., 2007]. При этом сульфатредукторы лишены возможности использовать напрямую в своем метаболизме полимерные органические соединения (крахмал, целлюлозу, белки, нуклеиновые кислоты и липиды). Таким образом, в природных местообитаниях СРБ находятся в тесной взаимосвязи с микроорганизмами, осуществляющими деструкцию сложных органических соединений (рис. 3). По физиологическим характеристикам сульфатредукторы могут быть разделены на две большие группы – микроорганизмы, осуществляющие неполное разложение органических субстратов до ацетата и полное разложение до углекислого газа. Как уже было сказано, основным акцептором электронов для СРБ является сульфат. Однако в его отсутствие многие сульфатредукторы могут использовать в качестве акцепторов электронов и другие соединения серы (тиосульфат, сульфит и элементарную серу), восстанавливая их до сульфида, а также нитраты и нитриты, восстанавливая их до аммония [Keith a. Herbert, 1983; Dalsgaard a. Bak, 1994; Moura et al., 1997; López-Cortés et al., 2006]. Помимо этого, для некоторых СРБ показана способность использовать в качестве акцепторов электронов соединения тяжелых металлов, например, Fe(III) [Lovley et al., 1993; Park et al., 2007], U(VI) [Lovley et al., 1992], Tc(VII) [Lloyd et al., 1999], Se(VI) [Tucker et al., 1998], Cr(VI) [Lovley et al., 1994] и As(VI) [Macy et al., 2000], однако данные процессы не всегда связаны с ростом культуры. Также акцепторами электронов для СРБ могут выступать и органические соединения, например, фумарат [Jonkers et al., 1996]. Некоторые морские сульфатредуцирующие бактерии используют в качестве акцептора электронов диметилсульфоксид [Lie et al., 1996]. 16 Рис. 3. Общая схема деградации органического вещества микробными сообществами в присутствии сульфата [Muyzer a. Stams, 2008]. 17 В пресноводных местообитаниях при низком содержании сульфатов СРБ играют большую роль в сбраживании и анаэробном окислении органических субстратов. Многие представители родов Desulfovibrio и Desulfomicrobium способны сбраживать пируват с образованием ацетата, углекислого газа и водорода [Muyzer a. Stams, 2008]. Также они способны окислять лактат и этанол, но только в том случае, если водород активно удаляется из системы синтрофными водород-использующими метаногенными археями [Bryant et al., 1977]. 1.2.1. Аэротолерантность сульфатредуцирующих бактерий. Традиционно считается, что сульфатредуцирующие бактерии относятся к строгим анаэробам и их рост ингибируется кислородом. Известно, что активные формы кислорода непосредственно инактивируют ключевые ферменты метаболизма сульфатредуцирующих бактерий, в частности, лактатдегидрогидрогеназу [Stams a. Hansen, 1982]. Однако в последнее время появились данные о том, что не все сульфатредукторы быстро погибают в присутствии кислорода, а многие из них даже обладают значительной аэротолерантностью [Hardy a. Hamilton, 1985]. Более того, некоторые виды Desulfovibrio spp. способны сохранять жизнеспособность даже при длительной (в течении нескольких часов) экспозиции на воздухе, потреблять кислород [Abdollahi a. Wimpenny, 1990; Dilling a. Cypionka, 1990] и возобновлять свой активный рост при наступлении благоприятных анаэробных условий [Cypionka, 2000]. Кроме того, СРБ всё чаще обнаруживают в местообитаниях, подверженных периодическому воздействию кислорода, таких, как верхние слои донных или циано-бактериальных матов [Canfield a. Des Marais, 1991; Krekeler et al., 1997; Jonkers et al., 2005], что косвенно свидетельствует о наличии в клетках СРБ систем антиокислительной защиты Среди способов защиты сульфатредуцирующих бактерий от окислительных стрессов можно выделить два типа – физиологический и биохимический. К физиологическим механизмам относится, например, наличие у подвижных форм СРБ отрицательного аэротаксиса. Такая способность показана 18 для Desulfovibrio oxyclinae, обитающего в циано-бактериальных матах [Krekeler et al., 1998], а у Desulfovibrio vulgaris даже обнаружен редокс-чувствительный белок, позволяющий чутко реагировать на изменение содержания кислорода в окружающей среде [Fu et al., 1994]. Многие СРБ формируют скопления клеток, способных к поглощению в O2 качестве эффективного механизма антиокислительной защиты. Также показано формирование микроколоний и консорциумов бактерий серного цикла, в которых серобактерии существуют в ассоциации с сульфатредукторами, что уменьшает доступ кислорода к клеткам последних [Dolla et al., 2006]. Биохимическая аэротолерантность клетки обеспечивается благодаря специальным ферментам. Помимо классических ферментов антиокислительной защиты (супероксиддисмутаза, различные пероксидазы, гемовые каталазы), которые присутствуют не у всех СРБ, в их клетках были обнаружены уникальные негемовые железосодержащие (десульфоферродоксин, белки, неелоредоксин) такие и как супероксидредуктазы НАДН-зависимые пероксидазы (рубреритрин и нигеритрин), весьма эффективно удаляющие активные формы кислорода (АФК) [Dolla et al., 2006; Brioukhanov et al., 2010]. Некоторые сульфатредуцирующие бактерии способны использовать кислород в качестве акцептора электронов для снижения его концентрации в окружающей среде. Так, у представителей рода Desulfovibrio показано наличие электрон-транспортной цепи (состоящей из рубредоксин : кислород оксидоредуктазы, цитохром с- и bd оксидаз), используемой ими в целях антиокислительной защиты, но не для получения энергии [Cypionka, 2000; Baumgarten et al., 2001; Lemos et al., 2001]. 1.3. Филогения сульфатредуцирующих бактерий. До начала 1980-х гг. систематика СРБ традиционно фенотипических характеристиках, таких, как базировалась на потребляемые субстраты, морфология клеток, химические и/или биохимические маркеры. Такими маркерами, к примеру, являются десульфовиридин, жирные кислоты мембранных 19 липидов или менахиноны [Rabus et al., 2006]. В настоящее время на основе анализа последовательностей гена 16S рРНК выделяют 7 филогенетических линий сульфатредуцирующих микроорганизмов – 5 внутри домена Bacteria и 2 внутри домена Archaea [Muyzer a. Stams, 2008]. Большинство СРБ принадлежит к 23 родам внутри классов Deltaproteobacteria (грамотрицательные мезофильные СРБ) и (грамположительные Clostridia спорообразующие СРБ). Три линии – Nitrospirae (род Thermodesulfovibrio), Thermodesulfobacteria (род Thermodesulfobacterium) и Thermodesulfobiaceae (род Thermodesulfobium) содержат исключительно термофильных СРБ. Сульфатредукторы также встречаются среди архей – к ним относятся представители рода Archaeoglobus в филуме Euryarchaeota и родов Thermocladium и Caldirvirga в филуме Crenarchaeota [Muyzer a. Stams, 2008]. Общая филогенетическая дендрограмма сульфатредуцирующих микроорганизмов представлена на рисунке 4. 1.4. Распространение сульфатредуцирующих бактерий. Сульфатредуцирующие бактерии не только обладают значительным спектром используемых доноров и акцепторов электронов, но также широко распространены в различных природных и антропогенных местообитаниях. Их обнаруживают и выделяют из морских осадков [Boschker et al., 1998; Ravenschlag et al., 2000; Mussmann et al., 2005; Webster et al., 2006], гидротерм [Jeanthon et al., 2002], углеводородных сипов [Knittel et al., 2003; Kniemeyer et al., 2007] и грязевых вулканов [Stadnitskaia et al., 2005], гиперсоленых микробных матов (в том числе и насыщенных кислородом) [Rissati et al., 1994; Minz et al., 1999], нефтяных месторождений [Nilsen et al., 1996]. Также сульфатредукторы были обнаружены в местообитаниях с экстремальными значениями рН, таких, как кислые шахтные воды (значения рН которых могут быть ниже 2) [Sen, 2001] и содовые озера (рН которых может достигать значений более 10) [Geets et al., 2006]. СРБ обнаруживают также в осадках пресноводных водоемов [Sass et al., 1998], ризосфере растений [Hines et al., 1999; Bahr et al., 20 Рис. 4. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основании анализа полных последовательностей гена 16S рРНК известных СРБ [Muyzer a. Stams, 2008]. 21 2005], водоносных горизонтах инженерных систем (например, заводов по очищению сточных вод) [Ramsing et al., 1993; Oude Elferink et al., 1994; Wawer et al., 1997; Dar et al., 2005; Dar et al., 2007; Ben-Dov et al., 2007]. Помимо участия в глобальных биогеохимических циклах серы и углерода, сульфатредуцирующие микроорганизмы также играют существенную роль в функционировании антропогенных экосистем. Поскольку серная кислота используется во многих производственных процессах, то соответствующие сточные воды обогащаются сульфатами, что, в свою очередь, приводит к нежелательному развитию сульфатредукторов. В частности, развитие СРБ в очистных сооружениях может приводить к снижению выхода метана, кроме того, сероводород, выделяемый ими, является зловонным, токсичным и коррозионноактивным соединением. Также процесс сульфатредукции вызывает проблемы и в нефтяной промышленности – сероводород провоцирует коррозионные процессы на металлических конструкциях нефтяных платформ и в трубопроводах, и из-за своей токсичности угрожает безопасности персонала, работающего на морских местах нефтедобычи, а образующиеся сульфиды могут снижать проницаемость нефтяных пластов [Mattorano et al., 1999]. Деятельность СРБ в составе биопленок, прибрежных осадков и в водной толще морей считается основной причиной биокоррозии стальных и железобетонных портовых сооружений, металлоконструкций буровых платформ, цистерн, индустриальных газо-, нефте- и водопроводов в анаэробных условиях изза образования клетками СРБ сероводорода (очень активного агента коррозии) и потребления ими водорода, образующегося на поверхности железа при его контакте с водой [Dinh et al., 2004; Beech a. Sunner, 2007]. Однако микробная коррозия металлоконструкций, по всей видимости, может достаточно интенсивно идти и в присутствии кислорода из-за высокой степени аэротолерантности многих СРБ. Однако сульфатредукторы также находят и важное практическое применение. СРБ, обладающих высокой металл-редуктазной активностью, применяют в очистке сточных вод от токсичных соединений тяжелых металлов, 22 металлоидов и радионуклидов [Hulshoff-Pol et al., 1998; Lloyd et al., 1999; Lens et al., 2007]. Помимо этого, сульфатредуцирующие микроорганизмы могут использоваться и в биоремедиации сточных вод от окисленных соединений серы [Buisman et al., 1990; Janssen et al., 2001]. Известно, что в условиях недостатка кислорода микроорганизмы, окисляющие сульфид, в основном, образуют элементную серу, а не сульфат. Используя последовательно два процесса – анаэробную сульфатредукцию и окисление сульфида в микроаэробных условиях – можно повысить эффективность очистки сточных вод от нежелательных окисленных компонентов серы. 1.4.1. Сульфатредуцирующие бактерии в морских экосистемах. В водных экосистемах возможность аэробного разложения органических веществ лимитируется ограниченной растворимостью кислорода в воде. При накоплении органического вещества в воде кислород расходуется достаточно быстро, а затем деградация органических веществ осуществляется анаэробными микробными сообществами, которые содержат, в том числе и сульфатредуцирующие микроорганизмы. Было установлено, что сульфатредукция обеспечивает до 50% минерализации органического углерода в морских отложениях, что свидетельствует о важности участия сульфатредукторов как в глобальном цикле серы, так и в цикле углерода [Jørgensen, 1982]. Нужно отметить, что в таких условиях СРБ конкурируют за доступные субстраты с бродильщиками, ацетогенными бактериями и метаногенными археями. Ключевым моментом в этой конкуренции является наличие в среде сульфата. Имея более высокое сродство к субстрату, сульфатредуцирующие микроорганизмы достаточно быстро и легко вытесняют из морских экосистем водород-использующих метаногенов и гомоацетогенных бактерий. Однако многие СРБ нуждаются в ацетате в качестве источника углерода и, в случае его отсутствия, могут сосуществовать с гомоацетогенами [Muyzer a. Stams, 2008]. Таким образом, процесс сульфатредукции преобладает в анаэробных местообитаниях с достаточной соленостью и высоким содержанием сульфатов. 23 Сульфатредуцирующие микроорганизмы широко распространены в различных морях по всему земному шару. В основном их обнаруживают в морских анаэробных донных осадках [Llobet-Brossa et al., 1998; Sass et al., 2002; Саввичев и др., 2003; Toffin et al., 2004], причем диапазон температур, в котором обитают и функционируют сульфатредукторы очень велик – от 0-3°С в арктических и антарктических экосистемах [Isaksen a. Jørgensen, 1996; Tarpgaard et al., 2006] до 50-110°С в глубоководных гидротермах [Jørgensen et al., 1992; Jeanthon et al., 2002]. Из глубоководных осадков Японского моря были выделены барофильные штаммы СРБ, филогенетически близкие Desulfovibrio spp., оптимальное давление для роста которых составляло от 10 до 15 МПа (100 и 150 атм соответственно) [Bale et al., 1997]. Сульфатредуцирующие бактерии являются симбионтами различных представителей морских эукариот, таких, как кольчатые черви [Cottrell a. Cary, 1999; Dubilier et al., 2001] и различные водоросли [Küsel et al., 1999]. В морских водоемах процесс сульфатредукции обычно происходит в придонных осадках, однако в некоторых морских местообитаниях восстановленные условия могут создаваться и в толще водоема. Характерными примерами таких водоемов являются Черное море и меромиктическая зона Карибского моря – бассейн Кариако, а также глубокие впадины Балтийского моря. Было показано, что в бассейне Кариако активные клетки СРБ присутствуют по всей водной толще, составляя от 2 до 6% от общего микробного числа. Для распределения клеток СРБ было характерно наличие двух пиков численности – в анаэробной водной толще, а также непосредственно над ней, в зоне хемоклина [Lin et al., 2006; Rodriguez-Mora et al., 2013]. В накопительных культурах, полученных из зоны хемоклина бассейна Кариако, были обнаружены СРБ, наиболее близкие по нуклеотидной последовательности участков гена 16S рРНК к представителям рода Desulfovibrio [Bozo-Hurtado et al., 2013]. Сульфатредуцирующие бактерии были детектированы также в водной толще Черного моря и различных впадин Балтийского моря [Vetriani et al., 2003; DurischKaiser et al., 2005; Lin et al., 2006; Labrenz et al., 2007; Neretin et al., 2007; Brettar et al., 2012], более подробно эта информация будет изложена в главе 3. 24 Как уже было отмечено, среди сульфатредукторов представлены как мезофильные (бактерии), так и термофильные (бактерии и археи) микроорганизмы, но, поскольку оптимальными для роста последних являются температуры в диапазоне 64-92°С, то вероятность обнаружения их в водной толще морских экосистем невелика. Некоторые характеристики наиболее изученных родов СРБ, обнаруживаемых в морских экосистемах, представлены в таблице 1. Таблица 1. Некоторые характеристики основных родов сульфатредуцирующих бактерий, обнаруживаемых в морских экосистемах [Castro et al., 2000]. Подгруппа СРБ Форма клеток Содержание Окисление Подвижность ГЦ пар в ДНК, ацетата % Оптимальная температура роста, °С Грамотрицательные мезофильные сульфатредуцирующие бактерии Desulfomicrobium палочки +/- 52-67 неполное 25-40 Desulfomonas палочки - 66 неполное 30-40 Desulfovibrio вибрионы + 49-66 неполное 25-40 Desulfobacter палочки +/- 44-46 полное 20-33 Desulfobacterium палочки +/- 41-52 полное 20-35 Desulfonema нити скольжение 35-42 полное 28-32 Грамположительные спорообразующие сульфатредуцирующие бактерии прямые и Desulfotomaculum изогнутые палочки Для изучения + распространения, 48-52 неполное/ полное филогенетического большинство 25-40, некоторые 40-65 разнообразия и биохимической активности СРБ в морских местообитаниях широко применяются как классические микробиологические и биохимические, так и молекулярнобиологические методы. Одним из старейших методов изучения микроорганизмов 25 является выделение накопительных и чистых культур. Существенным ограничением данного подхода является тот факт, что только примерно 1% микроорганизмов из всего микробного разнообразия поддается культивированию. Другим классическим методом изучения разнообразия СРБ является анализ состава жирных кислот в клетке [Parkes, 1987], однако данный метод имеет невысокое таксономическое разрешение. В настоящее время наибольшее распространение в исследовании микроорганизмов природных и антропогенных экосистем получили молекулярнобиологические методы. Наиболее широко применяются полимеразная цепная реакция (ПЦР) с праймерами к участкам гена 16S рРНК и функциональных генов, а также разделение амплифицированных фрагментов ДНК с помощью денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ) с последующим секвенированием нуклеотидных последовательностей ДНК, выделенных и реамплифицированных из отдельных полос. Данные методы позволяют детектировать СРБ различных филогенетических подгрупп в естественной среде их обитания, а также сравнивать между собой состав сообществ различных биотопов, однако они не предоставляют информации о количественном соотношении различных групп микроорганизмов в исследуемых образцах [Muyzer a. Stams, 2008]. Для изучения численности представителей различных подгрупп СРБ в микробных сообществах могут быть использованы такие методы, как количественная ПЦР в реальном времени (qRT-PCR), позволяющая получать информацию о том, какое количество копий исследуемого маркерного гена соответствующих СРБ находится в экспериментальном образце, а также флуоресцентная in situ гибридизация (FISH), дающая возможность визуализировать и подсчитывать метаболически активные клетки определенных подгрупп СРБ в нативных пробах [Muyzer a. Stams, 2008]. Более подробно данные методы и их применение в изучении сульфатредуцирующих микроорганизмов в природных местообитаниях рассматриваются ниже. 26 ГЛАВА 2. ОБЗОР ОСНОВНЫХ МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ, ПРИМЕНЯЕМЫХ В МИКРОБНОЙ ЭКОЛОГИИ. С развитием микробиологии стало очевидно, что лишь небольшая часть всех микроорганизмов, обитающих на нашей планете, может быть выделена в чистые культуры и описана [Wayne et al., 1987; Ward et al., 1992]. Сравнительные исследования демонстрируют огромные расхождения в количестве культивируемых бактерий/архей и общей численности микроорганизмов в различных местообитаниях [Amann et al., 1995]. Одной из причин этого противоречия является невозможность создания в лаборатории оптимальных по всем физико-химическим параметрам условий для активного роста большинства микроорганизмов. Таким образом, для полноценного изучения комплексных микробных сообществ возникла необходимость в создании и развитии новых методов, которые дополняли бы традиционные подходы, основанные на культивировании микроорганизмов. В настоящее время для этих целей широко применяются различные молекулярно-биологические методы. Общая схема изучения структуры и функционирования микробных сообществ представлена на рис. 5. Часть этих методов, а именно, флуоресцентная in situ гибридизация, полимеразная цепная реакция, а также денатурирующий гель-электрофорез с последующим секвенированием отдельных реамплифицированных полос ДНК, и их применение в микробной экологии будут рассмотрены ниже. 2.1. Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH). В последнее время одним из наиболее часто применяемых в микробной экологии методов является флуоресцентная in situ гибридизация (FISH) с олигонуклеотидными зондами, специфичными для определенных последовательностей рибосомальной РНК. В ранних попытках проведения гибридизации in situ, выполненных в конце 1960-х гг., в качестве метки были использованы не флуоресцентные молекулы, а радиоизотопы. Первое применение флуоресцентного определения in situ было 27 Рис. 5. Блок-схема, описывающая различные способы изучения структуры и функционирования микробных сообществ [Muyzer a. Smalla, 1998]. 28 осуществлено в 1980 г., когда фрагмент молекулы РНК был непосредственно помечен на 3'-конце с помощью флуоресцентной молекулы [Bauman et al., 1980]. Метод FISH для выявления целевых последовательностей нуклеиновых кислот был разработан как альтернатива более ранним методам, использовавшим радиоактивно-меченые зонды. По сравнению с этими методами FISH позволила получить значительные улучшения в разрешении, скорости и безопасности работы, и впоследствии проложить путь к развитию методов одновременного обнаружения множественных мишеней, численного анализа и получения высококачественных изображений меченых клеток. 2.1.1. Принцип метода. Метод FISH с флуоресцентно-мечеными 16S рРНК-специфичными олигонуклеотидными зондами был разработан для in situ идентификации одиночных микробных клеток, и он является наиболее часто применяемым среди молекулярных методов в экологии, основанных не на принципе ПЦР. Типичный протокол для FISH включает четыре шага: фиксация и пермеабилизация образцов, гибридизация, отмывка для удаления несвязанного зонда и визуализация. Общая схема проведения FISH представлена на рис. 6. Микроорганизмы должны быть зафиксированы и пермеабилизованы, чтобы позволить флуоресцентно-меченому зонду проникнуть в клетки, а также для защиты РНК от разрушения эндогенными РНКазами. Образцы либо осаждают на мембранных фильтрах и обрабатывают фиксирующим агентом (спирт, формалин), либо смешивают с фиксирующим агентом, инкубируют, осаждают центрифугированием, ресуспендируют, переносят на специальное стеклянное предметное стекло с лунками и высушивают. Гибридизация должна проводиться в строго оптимизированных условиях для правильного отжига зонда с последовательностью молекулы-мишени. Точность гибридизации регулируется изменением концентрации формамида в гибридизационном буферном растворе и/или температуры гибридизации. Формамид снижает температуру плавления нуклеиновых кислот за счет 29 ослабления водородных связей, т.о. становится возможным использование более низких температур без ухудшения результатов гибридизации. Кроме того, в зависимости от концентрации формамида и температуры гибридизации подбирается концентрация NaCl в промывном буферном растворе. Гибридизацию проводят в темной влажной камере, обычно при температурах между 37 и 60°C. Время гибридизации варьируют от 30 мин до нескольких часов. Рис. 6. Принцип проведения флуоресцентной in situ гибридизации. Затем фильтры с образцами кратковременно отмывают в промывном буферном растворе для удаления несвязавшегося зонда. После отмывки образцы на фильтрах промывают водой, высушивают, обрабатывают специальными веществами для предотвращения уменьшения флуоресценции, после чего результаты визуализируют и документируют [Bottari et al., 2006]. Методы визуализации включают в себя эпифлуоресцентную микроскопию, лазерную сканирующую микроскопию и проточную цитометрию [DeLong et al., 1999]. 30 Флуоресцентно-меченые, 16S рРНК-специфичные олигонуклеотидные зонды используют для выявления различных представителей микробных сообществ. Специфичность зондов варьирует от рода до царства, в зависимости от области, выбранной на рРНК в качестве мишени. Такие зонды могут быть сконструированы и протестированы для определения наличия некультивируемых микроорганизмов в природных образцах, но интенсивность сигнала клеток, гибридизованных с олигонуклеотидным зондом, напрямую связана с количеством рРНК в клетке. Полинуклеотидные зонды, состоящие из практически полных последовательностей генов 16S и/или 23S рРНК и меченные несколькими флуорохромными молекулами, применяют для выявления большинства клеток микроорганизмов, представленных в природных образцах [DeLong et al., 1999]. Использование 16S рРНК-специфичных олигонуклеотидных зондов, ковалентно меченных одним флуорохромом, ограничивает чувствительность метода и затрудняет использование FISH для идентификации прокариот с низким содержанием рибосом в клетке. При выборе зондов для FISH нужно учитывать их специфичность, чувствительность и легкость проникновения в клетку [Bottari et al., 2006]. Олигонуклеотидные зонды, используемые для FISH, обычно имеют длину 15-30 нуклеотидов и ковалентно мечены на 5'-конце одной молекулой флуоресцентного красителя. В последнее время, в основном, применяются карбоцианиновые красители, такие, как Cy3 или Cy5 [Amann et al., 2001]. Молекулы рРНК являются главной мишенью при проведении FISH по нескольким причинам: их можно обнаружить во всех живых организмах, они относительно стабильны, как правило, находятся в клетке в большом числе копий (обычно несколько тысяч копий на клетку) и содержат как вариабельные, так и высококонсервативные последовательности домены нуклеотидов, последовательностей. уникальные для Ключевые выбранных групп микроорганизмов, варьирующих от филума до отдельных видов, могут быть определены путем сравнительного анализа последовательностей рРНК. В большинстве случаев применения FISH в качестве мишени для зондов используется 16S рРНК [Amman et al., 2001]. Действительно, сравнительный 31 анализ 16S рРНК на сегодня является наиболее часто используемым методом для изучения филогении микроорганизмов, такие рРНК последовательности в очень низких концентрациях могут быть обнаружены в природных и клинических образцах. Несмотря на все свои преимущества, метод FISH не лишен специфических проблем, таких как высокая фоновая флуоресценция, автофлуоресценция клеток (например, характерная для фотосинтезирующих микроорганизмов и метаногенных архей), неспецифическое связывание зонда с макромолекулами клетки, низкое содержание рибосом в клетках, ухудшающее их визуализацию Ограничить воздействие этих факторов на получаемый результат помогают тщательное соблюдение оптимизированного протокола проведения метода, постановка отрицательного контроля, энзиматический и другие способы усиления сигнала флуоресценции, использование полирибонуклеотидных зондов и т.д. Одной из разновидностей метода, позволяющей усилить флуоресцентный сигнал, является CARD-FISH (CARD – catalyzed reporter deposition – катализирующее репортерное осаждение) [Bobrow et al., 1989, 1991, 1992]. В этой модификации используют олигонуклеотидные зонды, к которым ковалентно присоединены молекулы пероксидазы хрена (ПХ), а также обрабатывают клетки флуоресцентно меченым тирамидом. В присутствии пероксида водорода ПХ превращает молекулы тирамида в высоко реакционноспособные интермедиаты, неспецифично связывающиеся с ароматическими компонентами клетки (например, аминокислотами тирозином и триптофаном). Данная реакция происходит исключительно в непосредственной близости к сайту связывания ПХ [Kubota, 2013]. В итоге на каждую молекулу рРНК, содержащую искомую нуклеотидную последовательность, приходится не одна молекула флуорохрома, а гораздо больше, что позволяет успешно визуализировать сигнал даже при весьма низком содержании рРНК в микробной клетке. 32 2.1.2. Применение метода FISH в исследованиях сообществ СРБ различных местообитаний. В настоящее время метод флуоресцентной in situ гибридизации широко применяется для исследования филогенетической структуры сообществ сульфатредуцирующих бактерий, как в природных, так и антропогенных местообитаниях. Метод FISH позволяет не только определить филогенетическую принадлежность микроорганизмов, но и оценить их численность, а также морфологию клеток. Кроме того, поскольку олигонуклеотидные зонды связываются непосредственно с рибосомальной РНК, предполагается, что с помощью данного метода выявляются преимущественно физиологически активные клетки. Лентини с соавторами с помощью FISH изучили вертикальное распределение микроорганизмов в меромиктическом озере Фаро в Италии [Lentini et al., 2012]. Сульфатредуцирующие бактерии составляли 1,5-12,5% от всей численности микробных клеток на различных глубинах. При этом наблюдалось характерное для меромиктических местообитаний увеличение численности СРБ с увеличением глубины, а также был обнаружен пик численности в зоне хемоклина (горизонта с максимальным значением вертикального градиента минерализации). При изучении распространения СРБ в меромиктическом озере Харутори в Японии с применением метода FISH было показано, что представители Deltaproteobacteria (к которым относятся большинство сульфатредукторов) составляли 7-22% от общего числа бактерий в анаэробных водах озера [Kubo et al., 2014]. При этом среди СРБ преобладали представители подгруппы DesulfosarcinaDesulfococcus, численность которых доходила до 67% от всех клеток класса Deltaproteobacteria на глубине 4,5 м. Основная часть клеток СРБ была представлена кокками, находящимися как в свободном состоянии, так и в небольших агрегатах. При исследовании донных осадков метод FISH также помогает определить вертикальное распределение сульфатредуцирующих бактерий. Так, при исследовании осадков Ваттового моря (мелководная часть 33 Северного моря) было установлено, что преобладающей подгруппой СРБ являются микроорганизмы кокковидной и палочковидной формы, родственные роду Desulfosarcina, составлявшие на некоторых горизонтах до 20% от общей численности клеток [Mußmann et al., 2005]. На представителей семейства Desulfobulbaceae приходилось до 3% от всех клеток в верхних слоях осадков, клетки часто находились в агрегатах и имели овальную форму. Представителей же широко распространенного в морских экосистемах рода Desulfovibrio в этих осадках обнаружено не было. Однако в исследованиях донных осадков южной части Северного моря с использованием метода FISH было показано присутствие представителей рода Desulfovibrio во всех анализируемых пробах [Bühring et al., 2005]. При этом на некоторых горизонтах их численность доходила до 11% от всех клеток микроорганизмов. Представители подгруппы Desulfosarcina-Desulfofaba- Desulfococcus-Desulfofrigus, в свою очередь, на некоторых горизонтах составляли до 43% от всех клеток, гибридизовавшихся с зондом, специфичным к 16S рРНК Bacteria. Гиттель с соавторами, в свою очередь, исследовали бедные сульфатом осадки приливной зоны Северного моря [Gittel et al., 2008]. В таких местообитаниях общая численность СРБ, определенная методом FISH, составляла от 2,4% до 6,8% от всех микробных клеток. При этом в отобранных пробах преобладали представители родов Desulfobacter, Desulfobacula и семейства Desulfobulbaceae. Одним из преимуществ метода FISH по сравнению с молекулярнобиологическими методами, основанными на принципе ПЦР, является возможность визуализации пространственной структуры комплексных микробных сообществ, таких как биопленки и микробные маты. Это позволило Рамсингу с соавторами уже в 1993 г. изучить структуру фотосинтезирующих биопленок, образующихся на поверхности фильтров завода по очистке сточных вод в Дании [Ramsing et al., 1993]. Было показано, что СРБ присутствуют во всех подобных биопленках, но их распределение неравномерно. 34 Авторам удалось установить, что в исследуемых образцах присутствуют клетки СРБ, имеющие форму маленьких и больших кокков, палочек и вибрионов. СРБ присутствовали во всех слоях биопленок, кроме самого верхнего слоя, где располагались цианобактерии). клетки Также представителей рода было что показано, Oscillatoria (филаментные пространственная структура сообществ СРБ была различной – в некоторых биопленках СРБ были представлены отдельными клетками в небольших количествах, в других же образовывали плотные агрегаты, содержащие тысячи клеток. Другими авторами были исследованы сообщества СРБ в биопленках, образующихся в безнапорных канализационных линиях в Дании [Ito et al., 2002]. Количество сульфатредуцирующих бактерий в таких биопленках было небольшим – до 4,8% от всех клеток микроорганизмов. Преобладающими среди СРБ являлись представители родов Desulfobulbus и Desulfovibrio. Кроме того, с помощью комбинации методов FISH и микрорадиоавтографии было показано, что до 27% клеток Desulfobulbus spp. могут потреблять пропионат в качестве субстрата, используя при отсутствии сульфата нитрат или даже кислород в качестве акцепторов электронов. Благодаря применению метода FISH также удалось доказать присутствие, наряду с метанотрофными бактериями, физиологически активных клеток СРБ в микробных матах, образующихся непосредственно рядом с метановыми сипами, а также наглядно показать структурную организацию этих сообществ [Schreiber et al., 2010]. Считается, что сульфатредуцирующие бактерии могут принимать участие в процессе анаэробного окисления метана [Valentine, 2002; Blumenberg et al., 2004]. Таким образом, метод флуоресцентной in situ гибридизации широко используется в микробной экологии для изучения филогенетической структуры сообществ и численности сульфатредуцирующих микроорганизмов в различных местообитаниях. Благодаря этому методу стало возможным определение не только состава сообществ и численности их представителей, но и пространственной структуры сложно организованных микробных сообществ, что может пролить 35 свет на ранее неизвестные взаимодействия микроорганизмов различных физиологических и филогенетических групп. 2.2. Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР). В 1983 г. американским биохимиком Кэри Муллисом был изобретен метод амплификации фрагментов ДНК – полимеразная цепная реакция (ПЦР). Этот метод позволяет добиться значительного увеличения количества отдельных фрагментов ДНК в пробе. Первая публикация о данном методе появилась в журнале Science в 1985 г. [Saiki et al., 1985], а в 1993 г. Кэри Муллис был удостоен за своё изобретение Нобелевской премии в области химии. Изначально метод ПЦР был разработан для повышения скорости и специфичности пренатальной диагностики серповидно-клеточной анемии, но сейчас он очень широко используется как в клинической диагностике, так и в фундаментальных исследованиях во многих областях биологических наук, в том числе, и в экологии микроорганизмов. Метод ПЦР обладает крайне высокой чувствительностью и теоретически позволяет обнаружить в пробе всего одну молекулу ДНК. В основе метода ПЦР лежит природный процесс репликации молекул ДНК, то есть комплементарного достраивания матричной цепи ДНК, осуществляемого ферментом ДНК-полимеразой. Как и репликация, ПЦР включает в себя три стадии: денатурация двухцепочечной молекулы ДНК, образование коротких двухцепочечных участков с олигонуклеотидными праймерами, которые служат «затравкой» для синтеза ДНК и, собственно, синтез новой цепи ДНК на матричной цепи. Для проведения ПЦР необходимы: - два синтетических олигонуклеотида, называемых праймерами (обычно около 20 нуклеотидов длиной), которые фланкируют нужную последовательностьмишень на матричной ДНК; - ДНК-матрица; - термостабильная ДНК-полимераза; - четыре дезоксирибонуклеозидтрифосфата (дНТФ). 36 ПЦР является циклической реакцией: каждый цикл содержит в себе три стадии, первой является тепловая денатурация, то есть разделение двух цепей ДНК (обычно при 94-95°С). После этого следует понижение температуры (обычно до 54-68°С) для специфической гибридизации олигонуклеотидных праймеров с соответствующими комплементарными участками молекулы-мишени (также эту стадию часто называют ренатурацией или отжигом праймеров). Конкретная температура, при которой происходит отжиг, определяется, исходя из нуклеотидного состава соответствующих праймеров. Далее следует инкубация реакционной смеси при 72°С, что является оптимальной температурой для работы Taq ДНК-полимеразы. В результате третьего этапа синтезируются участки обеих цепей ДНК, расположенные в 5′-3′ направлении от каждого праймера. Оптимальным для эффективной амплификации участка ДНК обычно является 2530 циклов реакции, длительность каждой стадии цикла составляет 0,5-1,5 мин. Началу циклической реакции обычно предшествует первичная денатурация при 94-95°С в течение 5-10 мин, а заканчивается реакция финальной элонгацией при 72°С в течение 7-10 минут, в ходе которой достраиваются все фрагменты ДНК, которые ранее начали синтезироваться в ходе реакции. Общая схема ПЦР представлена на рис. 7. На каждом этапе ПЦР для достижения определенных целей (улучшение отжига праймеров и т.д.) могут быть допущены изменения, как длительности, так и температуры, при которой осуществляется данный этап. ПЦР чаще всего проводят в тонкостенных микропробирках в специальных аппаратах, называемых амплификаторами, где быстрая смена температурных режимов и их точное поддержание на заданном уровне осуществляется автоматически с помощью элементов Пельтье. Визуализацию накопленных фрагментов ДНК проводят в агарозном геле после электрофоретического разделения продуктов реакции. Первое время метод ПЦР был малоэффективным и требовал достаточного большого количества времени из-за того, что перед началом каждого цикла после нагревания до 94-98°С в реакционную смесь приходилось вносить ДНКполимеразу, поскольку этот фермент инактивировался при высокой температуре, 37 необходимой для денатурации двухцепочечных фрагментов ДНК. Революционным изменением в процедуре метода явилось использование термостабильной ДНК-полимеразы, выделенной из археи Thermus aquaticus (Taq ДНК-полимераза), обитающего в горячих источниках. Это привело к упрощению метода, улучшению его специфичности, выхода продукта, чувствительности, а также к увеличению длины фрагмента ДНК, который мог быть амплифицирован [Saiki et al., 1988]. Рис. 7. Общая схема полимеразной цепной реакции [http://oceanexplorer.noaa.gov/explorations/04etta/background/dna/dna.html]. Сейчас широко применяются несколько типов термостабильных ДНКполимераз – уже упомянутая Taq ДНК-полимераза, Pfu ДНК-полимераза, 38 выделенная из археи Pyrococcus furiosus, Tth ДНК-полимераза из Thermus thermophilus. Одним из существенных недостатков Taq ДНК-полимеразы является отсутствие у нее 3′-5′-экзонуклеазной активности, что приводит к снижению точности репликации, поскольку не происходит замены некомплементарно встроенных нуклеотидов в новой синтезированной цепи. Это обуславливает невозможность использования Taq ДНК-полимеразы в экспериментах, требующих предельно точного воспроизведения цепочки ДНК (например, в случае высокоэффективного молекулярного клонирования). Коммерческие препараты Taq-полимеразы имеют вероятность ошибки 1 на 10000 пар оснований. Скорость амплификации при 72°С составляет 30-70 оснований в сек. В 1991 г. Люндбергом с соавторами из гипертермофильной археи Pyrococcus furiosus была выделена новая термостабильная ДНК-полимераза [Lundberg et al., 1991], обладающая, в отличие от Taq ДНК-полимеразы, 3′-5′-экзонуклеазной активностью и вследствие чего дающая меньшее количество мутантных продуктов в ходе ПЦР (доля мутантных продуктов при амплификации фрагмента длиной 1000 пар оснований Taq ДНК-полимеразой составляет 16%, в то время как для Pfu ДНК-полимеразы это значение составляет всего 2,6%). Коммерческие препараты Pfu ДНКполимеразы имеют вероятность ошибки 1 на 1300000 пар оснований. В то же время, одним из недостатков Pfu ДНК-полимеразы является низкая скорость амплификации (8-17 оснований в секунду). В некоторых экспериментах применяют смесь Pfu и Taq ДНК-полимераз, что обеспечивает одновременно как приемлемую скорость процесса амплификации, так и низкую частоту ошибочного встраивания нуклеотидов в синтезируемые цепи ДНК. Крайне важным фактором успешного проведения ПЦР является использование правильно сконструированных олигонуклеотидных праймеров. Они должны отвечать следующим условиям: - длина каждого праймера составляет 18-30 нуклеотидов; - температуры плавления (Tm, при которой половина ДНК-дуплекса праймер-матрица будет диссоциировать с образованием одноцепочечных молекул) обоих праймеров должны находиться в диапазоне 52-58°С; 39 - содержание Г/Ц в праймерах должно составлять 40-60% от общего количества нуклеотидов; - температура отжига (гибридизации праймера с ДНК-матрицей) обоих праймеров (Ta) должна находиться в диапазоне 55-65°С, для максимальной специфичности желательно, чтобы Ta составляла 62-72°С; - праймеры не должны образовать как внутренние, так и межмолекулярные вторичные структуры, такие, как шпильки внутри одного праймера, самодимеры (между праймерами одной направленности) или перекрестные димеры (между праймерами противоположной направленности); - праймеры должны быть специфичны к конкретному участку матричной ДНК, и ПЦР с ними не должна приводить к амплификации каких-либо иных участков, помимо заданного фрагмента ДНК. 2.2.1. Применение метода полимеразной цепной реакции в изучении филогенетического разнообразия СРБ в различных сообществах. Поскольку СРБ являются филогенетически неоднородной группой, то для их обнаружения в природных и антропогенных местообитаниях в качестве основного универсального генетического маркера чаще всего используют ген dsrB [Geets et al., 2006; Agrawal et al., 2009; Bagwell et al., 2009]. Этот ген кодирует β-субъединицу диссимиляционной (би)сульфитредуктазы (КФ 1.8.99.1) – ключевого фермента метаболизма всех сульфат- и сульфитредуцирующих микроорганизмов, катализирующего превращение сульфита в сульфид. Помимо упомянутых групп прокариот подобный фермент обнаружен только у фототрофной бактерии Allochromatium vinosum и облигатно хемолитотрофной бактерии Thiobacillus denitrificans, в клетках которых он, предположительно, участвует в окислении сульфида [Klein et al., 2001]. В 1989 г. Деверё с соавторами по результатам сравнения нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК двадцати двух видов СРБ выделили 7 подгрупп сульфатредуцирующих бактерий [Devereux et al., 1989]. Подгруппа 1 включала Desulfovibrio desulfuricans и другие виды рода Desulfovibrio, не 40 способные к деградации жирных кислот; подгруппа 2 – Desulfovibrio sapovorans, способный использовать жирные кислоты; подгруппа 3 – род Desulfobulbus; подгруппа 4 – род Desulfobacter; подгруппа 5 – род Desulfobacterium и Desulfococcus niacini; подгруппа 6 - Desulfococcus multivorans и Desulfosarcina variabilis; подгруппа 7 – Desulfovibrio baarsii, окисляющий жирные кислоты. Первые три подгруппы включали СРБ, осуществляющих неполное окисление органических веществ с образованием ацетата, четыре остальных подгруппы – СРБ, осуществляющих полное окисление органических веществ. Основываясь на этих исследованиях, Дэли с соавторами в 2000 г. уточнили данное разделение СРБ на подгруппы и разработали ПЦР-праймеры для детекции сульфатредуцирующих бактерий в различных местообитаниях. Используя известные к тому времени по базам данных последовательности гена 16S рРНК сульфатредуцирующих бактерий, исследователи выделили 6 основных филогенетических подгрупп СРБ [Daly et al., 2000]: подгруппа 1 – род Desulfotomaculum; подгруппа 2 – род Desulfobulbus; подгруппа 3 – род Desulfobacterium; подгруппа 4 – род Desulfobacter; подгруппа 5 – рода Desulfococcus-Desulfonema-Desulfosarcina; подгруппа 6 – рода DesulfovibrioDesulfomicrobium (рис. 8). Для всех шести подгрупп были разработаны и верифицированы олигонуклеотидные праймеры к специфическим участкам 16S рДНК. Кроме того, разработанные ПЦР-праймеры были применены авторами для поиска СРБ в сточных водах некоторых антропогенных местообитаний. После проведения прямой ПЦР было показано присутствие трех подгрупп СРБ (Desulfotomaculum, Desulfobacter и Desulfococcus-Desulfonema-Desulfosarcina) в различных исследуемых образцах. Специфичность используемых ПЦР-праймеров была подтверждена с помощью гибридизации полученных в реакции продуктов с олигонуклеотидными зондами, разработанными авторами [Daly et al., 2000]. Помимо прямой ПЦР авторы использовали метод вложенной ПЦР. Вложенная ПЦР включает в себя две стадии: на первой амлифицируется крупный фрагмент ДНК, специфичный для микроорганизмов таксона высокого ранга (в 41 Рис. 8. Филогенетическая дендрограмма, построенная на основании сравнения последовательностей 16S рДНК сульфатредуцирующих бактерий. Дендрограмма построена методом объединения соседних пар. Буквы G1-G6 обозначают основные филогенетические подгруппы СРБ [Daly et al., 2000]. 42 данном случае – ген 16S рРНК Bacteria), на второй стадии полученный ПЦРпродукт используется в качестве матрицы для амплификации со специфичными праймерами на аналогичный ген у микроорганизмов таксона более низкого порядка. С помощью данного подхода авторам удалось показать присутствие генетического материала СРБ ранее обнаруженных подгрупп в большем количестве образцов, чем это было продемонстрировано при использовании прямой ПЦР. Более того, вложенная ПЦР позволила детектировать в экспериментальных образцах СРБ двух подгрупп (Desulfobulbus и DesulfovibrioDesulfomicrobium), которые не были обнаружены методом прямой ПЦР. Предполагается, что прямой и вложенной ПЦР детектируются доминантные группы микроорганизмов в сообществе, тогда как микроорганизмы, обнаруживаемые исключительно вложенной ПЦР, представлены в исследуемых образцах в меньшем количестве [Daly et al., 2000]. Позднее Дар с соавторами использовали ПЦР-праймеры, разработанные Дэли, для изучения распространения сульфатредуцирующих бактерий в образцах активного ила [Dar et al., 2005]. При проведении прямой ПЦР авторам удалось обнаружить только ДНК представителей 6-й подгруппы СРБ – DesulfovibrioDesulfomicrobium. Однако присутствие исследуемых в проведение вложенной образцах ила ПЦР показало генетического также материала представителей Desulfotomaculum (подгруппа 1), Desulfobulbus (подгруппа 2) и Desulfococcus-Desulfonema-Desulfosarcina (подгруппа 5). Таким образом, метод ПЦР успешно применяется в микробной экологии при исследовании структуры сообществ сульфатредуцирующих бактерий. Кроме того, использование одновременно прямой и вложенной ПЦР с праймерами, специфичными к участкам гена 16S рРНК шести основных подгрупп СРБ, даже позволяет косвенно оценить их относительную численность в сообществе. 2.3. Денатурирующий градиентный гель-электрофорез (ДГГЭ). В отличие от обычного гель-электрофореза метод денатурирующего градиентного гель-электрофореза позволяет разделять короткие фрагменты ДНК, 43 имеющие одинаковую длину, но отличающиеся по нуклеотидному составу [Fischer a. Lerman, 1979; Myers at al., 1987]. Проведению ДГГЭ обычно предшествует амплификация нужного фрагмента ДНК с помощью полимеразной цепной реакции с праймерами, специфичными к анализируемому участку генома той или иной группы микроорганизмов. Разделение фрагментов ДНК с использованием ДГГЭ основано на снижении электрофоретической подвижности частично денатурированных двухцепочечных молекул ДНК в полиакриламидном геле, содержащем линейный концентрационный градиент денатурирующих агентов – мочевины и формамида. Когда двухцепочечный фрагмент ДНК достигает того места градиента, где происходит его частичная денатурация, он теряет подвижность. В итоге, в данном участке геля концентрируются полосы ДНК, содержащие фрагменты, денатурирующие в одном и том же градиенте мочевины и формамида. Общая схема данного процесса представлена на рис. 9. При использовании метода ДГГЭ могут быть разделены до 50% нуклеотидных последовательностей длиной до 500 пар оснований [Myers at al., 1985]. Эффективность разделения может быть повышена практически до 100% путем добавления ГЦ-богатого нуклеотидного участка длиной 30-50 нуклеотидов, называемого ГЦ-«скрепкой», с одного конца исследуемых фрагментов ДНК [Myers at al., 1985; Sheffield et al., 1992]. Это достигается за счет использования для амплификации праймеров, один из которых имеет ГЦ-богатый участок на 5'конце [Sheffield et al., 1989; Sheffield et al., 1992]. ГЦ-богатые участки выступают в качестве тугоплавких доменов, препятствующих полной денатурации двухцепочечной ДНК. Для повышения разрешающей способности метода можно варьировать концентрационный градиент денатурирующих агентов, а также продолжительность проведения ДГГЭ. Полосы ДНК в геле визуализируют с помощью интеркалирующих красителей бромистого этидия или SYBR Green. Анализ полос, содержащих частично денатурировавшую ДНК, в геле даже позволяет охарактеризовать количество и относительную численность основных 44 Рис. 9. Общая схема разделения двухцепочечных фрагментов ДНК при проведении денатурирующего или температурного градиентного гель- электрофореза. видов микроорганизмов, содержащихся в исследуемом образце. Метод ДГГЭ делает возможным отслеживать динамику одного и того же сообщества микроорганизмов во времени или сравнивать между собой состав различных микробных сообществ. Однако одним из ограничений метода является то, что при использовании ПЦР-праймеров, специфичных на таксоны высокого ранга (например, на ген 16S рРНК Bacteria), в комплексных микробных сообществах с большой численностью клеток ДГГЭ позволяет выявить только доминирующие группы микроорганизмов. При этом малочисленные, но, возможно, играющие важную роль в жизни сообщества группы микроорганизмов могут быть упущены 45 из внимания [Heuer et al., 1997]. 2.3.1. Применение денатурирующего градиентного гель-электрофореза в изучении филогенетического разнообразия СРБ в различных сообществах. При изучении структуры сообществ сульфатредуцирующих бактерий методом ДГГЭ чаще всего для разделения в полиакриламидном геле используют амплифицированные фрагменты генов диссимиляционной сульфитредуктазы, например, гена, кодирующего ее β-субъединицу (упоминавшийся выше ген dsrB). ДГГЭ в микробной экологии применяется как самостоятельный метод, так и, чаще, в совокупности с последующим секвенированием фрагментов ДНК, выделенных и реамплифицированных из отдельных полос в полиакриламидном геле. Например, таким способом были получены профили сообществ СРБ(по гену dsrB) загрязненных водоносных горизонтов вдоль берега Восточно-Китайского моря [Wu et al., 2009] и в почвах мангровых зарослей в Бразилии [Varon-Lopez at al., 2013]. По полученным профилям Ву с соавторами выявили горизонты, в которых сообщества СРБ были наиболее разнообразными. Также сравнение ДГГЭ-профилей показало, что состав сообществ СРБ коррелирует не с глубиной, на которой отбирали пробу, а с содержанием сульфата в данном образце. Причем при более высоких концентрациях сульфата разнообразие СРБ оказывалось меньше [Wu et al., 2009]. Для детального изучения филогенетического разнообразия СРБ в микробном сообществе после проведения ДГГЭ отдельные полосы ДНК вырезают из геля, элюируют из них ДНК, реамплифицируют и секвенируют исследуемые фрагменты. Такой подход является более быстрой и менее трудоемкой альтернативой созданию библиотек клонов, однако не лишен своих недостатков. Так, в 2007 г. Милетто с соавторами исследовали сообщества сульфатредуцирующих бактерий из почвы вдоль реки Рейн в Нидерландах [Miletto et al., 2007]. Секвенирование фрагментов ДНК, выделенных из полос ДГГЭ, показало присутствие в образцах гена dsrB сульфатредуцирующих бактерий, 46 близких по транслированным представителям семейств аминокислотным последовательностям к Desulfobulbaceae и Desulfobacteraceae, Syntrophobacteraceae, а также к конкретным видам – Desulfomonile tiedjei и Desulfobacterium anilini. При этом секвенирование участков гена dsrB, полученных из библиотек клонов, выявило, помимо этих групп, также присутствие в образцах нуклеотидных последовательностей, сходных с соответствующими последовательностями из генома Desulfobacca acetoxidans [Miletto et al., 2007]. При исследовании распространения СРБ в морских осадках вблизи Чилийского побережья с помощью ДГГЭ было обнаружено присутствие участков гена dsrB представителей семейств Desulfobacteraceae и Desulfobulbaceae, а используя метод молекулярного клонирования участков гена dsrB, дополнительно было показано присутствие в образцах генетического материала представителей Syntrophobacteraceae [Besaury et al., 2012]. Авторы отмечают, что такие результаты получаются, по всей видимости, изза того, что количество копий гена dsrB малочисленных представителей микробного сообщества СРБ находится ниже уровня чувствительности метода ДГГЭ [Miletto et al., 2007; Besaury et al., 2012]. Таким образом, ДГГЭ успешно применяется при изучении филогенетического разнообразия сульфатредуцирующих бактерий в различных природных и антропогенных сообществах, являясь более быстрым и менее затратным молекулярно-биологическим методом, чем методы, основанные на создании библиотек клонов. Известно, что малочисленные представители микробных сообществ могут быть не учтены при использовании данного метода, поскольку количество копий целевого участка их генома может находиться ниже уровня чувствительности ДГГЭ. Однако это не является существенным недостатком для большинства экологических исследований, поскольку ДГГЭ чаще всего применяется для сравнения микробных сообществ из различных местообитаний между собой, где чаще всего внимание ученых концентрируется именно на доминирующих представителях сообществ. 47 ГЛАВА ЧЕРНОЕ 3. И БАЛТИЙСКОЕ МОРЯ – ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВОДНОЙ ТОЛЩИ И СООБЩЕСТВ СРБ. 3.1. Черное море. Черное море лежит между параллелями 46°38′ и 40°54′ с. ш. и меридианами 27°21′ и 41°47′ в.д. и почти полностью окружено сушей, однако не изолировано от Мирового океана. На юго-западе через проливы Босфор и Дарданеллы оно имеет выход в Мраморное море и далее в Средиземное море Атлантического океана. С Азовским морем Черное море соединено Керченским проливом. Площадь поверхности Черного моря составляет 422 тыс. км2, объем водных масс – 555 тыс. км3, средняя глубина 1315 м, наибольшая глубина – 2210 м. Главной геологической особенностью котловины моря является сочетание обширной и довольно глубокой впадины с преимущественно крутыми склонами и значительного по площади мелководья в северо-западной части [Добровольский и Залогин, 1982]. Черное море является крупнейшим меромиктическим бассейном на Земле. При глубине его котловины более 2000 м только верхний слой толщиной 100-200 м содержит кислород и населен пелагическими и донными сообществами, состоящими как из про-, так и эукариотических организмов. Лежащая ниже водная толща, а также осадки континентального склона и центральной части Черного моря практически лишены всякой жизни, кроме микробной. Такие специфические гидрологические условия связаны с наличием пикно-галоклина (резких скачков плотности и солености), блокирующего вертикальное перемешивание водных масс и поступление кислорода в глубинные слои даже в период интенсивной вертикальной зимней конвекции [Зацепин и Флинт, 2002]. Важнейшую роль в формировании облика черноморской экосистемы играют биогеохимические процессы в области свала глубин и континентального склона, которые определяют взаимодействие шельфовой зоны и глубоководных районов моря. Черное море относится к числу наиболее изученных морских водоемов. Основные исследования в области гидрофизики, химии, биологии и геологии 48 бассейна были выполнены в период с начала 50-х до конца 80-х годов XX века. В 90-е годы прошлого века черноморские исследования в силу политических и экономических причин сильно сократились и носили фрагментарный характер. Впоследствии произошло возрождение комплексного подхода в изучении экосистемы Черного моря, в результате которого институтом океанологии им. П.П. Ширшова РАН были сформулированы и выполнены крупные мультидисциплинарные программы «Черное море-99» и «Черное море-2000». В условиях дефицита кислорода или его полного отсутствия распад органического вещества происходит в ходе различных реакций (например, денитрификации, сульфатредукции), и, кроме того, в зоне хемоклина (граница между аэробными и анаэробными водами) и в верхней анаэробной водной толще протекают реакции взаимодействия восстановленных и окисленных форм различных элементов, осуществляющиеся как химическим, так и микробиологическим путем. Редокс-зона (или зона хемоклина) располагается непосредственно под главным пикноклином (галоклином), до глубины которого осуществляется сезонное перемешивание, приводящее к поступлению хорошо аэрированных вод, богатых кислородом. Начало редокс-зоны может быть выделено по глубине расположения максимума концентрации нитратов, где располагается слой резкого падения концентраций растворенного кислорода (оксиклин), который ниже переходит в анаэробную зону. С редокс-зоной также связан слой повышенной мутности, максимум которой расположен вблизи уровня выклинивания концентрации глубинного сероводорода. Толщина зоны хемоклина, если принимать за ее верхнюю границу нижнюю часть максимума концентрации нитратов, а за нижнюю – появление сероводорода, практически постоянна как в центральной, так и в прибрежной части Черного моря, и составляет около 40-50 м, начинаясь на глубине 90-100 м (центральная часть моря) или 140-175 м (континентальный склон) [Murray et al., 1989; Якушев и др., 2002]. Слой резкого уменьшения кислорода (оксиклин) практически совпадает с главным пикноклином. Градиент кислорода в нем составляет 5,5 мкМ/м с увеличением в центральной части Черного моря относительно прибрежной. 49 Падение концентраций О2 в оксиклине происходит от 250-300 мкМ над главным пикноклином до 10-15 мкМ в районе залегания изопикны 15,50-15,60 усл. ед. по плотности и носит квазилинейный характер. Ниже градиент кислорода уменьшается до 0,25 мкМ/м и на уровне около 15,90-16,00 усл. ед. концентрации кислорода становятся нулевыми. Принято считать [Волков и др., 1992; Безбородов и Еремеев, 1993], что глубинный сероводород, за формальную границу появления которого принимается значение концентрации около 0,3 мкМ, распределен в зоне хемоклина квазилинейно с постоянным градиентом около 0,6-0,7 мкМ/м. Глубина выклинивания концентрации сероводорода составляет около 16,10-16,15 усл. ед. по плотности. Также наблюдается уменьшение градиентов сероводорода непосредственно на границе его выклинивания на ряде станций пробоотбора. В прибрежных районах Черного моря величина вертикального градиента сероводорода может опускаться до 0,21 мкМ/м. В редокс-зоне наблюдаются градиентные распределения и других веществ. Например, максимум нитратов наблюдается на нижней границе оксиклина (изопикна 15,50-15,60 усл. ед.), при этом глубже происходит резкое уменьшение содержания нитратов (максимальный градиент достигает 0,35-0,45 мкМ/м). Выклинивание концентрации нитратов происходит в районе изопикны 15,90-16,00 усл. ед., там же наблюдается нижний максимум нитритов (0,02-0,20 мкМ). С этой же глубины начинается рост концентраций аммонийного азота. Также в редоксзоне отмечается снижение суммы нитратов, нитритов и аммония, объясняемое денитрификацией [Безбородов и Еремеев, 1993] или потреблением в процессе хемосинтеза [Sorokin, 2001]. Распределение фосфатов в Черном море характеризуется наличием двух минимумов и двух максимумов, положение которых в поле плотности достаточно стабильно. Наиболее четкий минимум располагается на уровне изопикны в 15,9016,00 усл. ед. (примерно на 10-15 м выше уровня выклинивания сероводорода), а максимум – непосредственно на границе появления сероводорода или на 5-10 м ниже ее (на изопикнах 16,10-16,20 усл. ед.). Одной из причин такого 50 распределения считается потребление фосфатов на продукцию органического вещества при хемосинтезе, а возврат его в воду в слое концентрационного максимума связан с доминированием минерализации органического вещества ниже слоя осуществления активного хемосинтеза. Наибольшая качественная изменчивость в водных горизонтах Черного моря характерна для растворенного марганца. Максимальные концентрации наблюдаются на границе с сероводородной зоной (7-8 мкМ). Восстановленный двухвалентный марганец исчезает примерно на 10 м выше слоя появления глубинного сероводорода. В поверхностных водах наблюдается довольно низкое содержание марганца (менее 0,2 мкМ). Ниже редокс-зоны содержание марганца уменьшается до 5 мкМ на глубине около 500 м и в глубинных водах Черного моря наблюдается относительное постоянство концентраций Mn (4-5 мкМ). Фоновые значения метана в кислородном слое составляют около 0,006-0,009 мкМ. С 15,92 усл. ед. плотности начинается резкий рост концентраций метана и на нижней границе редокс-зоны (16,2 усл. ед.) содержание метана достигает 350500 нМ. Вертикальное распределение рН в редокс-зоне характеризуется понижением значений от 7,8-8,4 в оксиклине до 7,6-7,7 в редокс-зоне в слое с 15,10-16,10 усл. ед. плотности. Данный факт связывают с осуществлением процессов окисления восстановленных форм серы, азота, марганца и углерода [Безбородов и Еремеев, 1993]. Таким образом, основная характерная черта вертикальной структуры редокс-зоны Черного моря – наличие четко выраженных и постоянно существующих аномалий вертикального распределения химических веществ. Очень слабый вертикальный турбулентный перенос поставляет из поверхностных вод окислители (прежде всего кислород и нитраты), а из анаэробных вод – восстановители (сероводород, аммоний, метан, растворенный марганец). Органическое вещество поступает как с вышележащих горизонтов, так и активно формируется непосредственно в толще редокс-зоны. Здесь могут быть выделены слои воды с резко отличающимся химическим, биологическим и 51 микробиологическим составом [Безбородов и Еремеев, 1993], и существуют узкие плотностные рамки для протекания интенсивных реакций [Murray et al., 1989]. Вертикальная структура редокс-зоны является очень стабильной структурой в поле плотности, которую не затрагивают вихревая деятельность и сезонная изменчивость, климатическая же ее изменчивость в поле плотности говорит о подъеме всей системы на 0,05-0,10 усл. ед. плотности целиком, без нарушения ее относительных свойств. Общая микробная численность (ОМЧ) в водах Черного моря обычно не превышает 105-106 кл./мл. Суммируя результаты различных исследований [Мицкевич, 1979; Sorokin et al., 1995; Пименов и др., 2000], можно сказать, что довольно характерным является повышение ОМЧ в фотическом слое воды (глубины 20-60 м) и в зоне хемоклина (глубины 100-190 м), также глубоководные станции пробоотбора характеризуются четким минимумом численности клеток прокариот в холодном промежуточном слое (на глубине 70-100 м) – см. рис. 10. 3.1.1. Исследования сообществ сульфатредуцирующих бактерий в Черном море. Первоначально Ю.И. Сорокиным на основании экспериментов с использованием радиоактивного 35S-сульфата было высказано предположение, что основная масса сероводорода в Черном море образуется за счет процессов бактериальной сульфатредукции в донных осадках [Сорокин, 1970]. Однако позднее М.В. Иванову и А.Ю. Леин [Леин и др., 1990; Иванов и др., 1992], а также М.Б. Гулину [Гулин, 1991] удалось доказать, что сероводородное заражение черноморских вод происходит, преимущественно, за счет бактериального восстановления сульфатов непосредственно в водной толще. Первые работы по детекции СРБ в Черном море молекулярно- биологическими методами стали появляться в начале 2000-х гг. Ветриани с соавторами [Vetriani et al., 2003] в ходе изучения вертикального распределения бактериопланктона в зоне хемоклина Черного моря методом T-RFLP участков гена 16S рРНК обнаружили 4 филотипа Deltaproteobacteria в зоне хемоклина (89 м) и 52 Рис. 10. Типичное вертикальное распределение общей микробной численности в верхней водной толще континентального склона Черного моря (окрашивание универсальным ДНК-красителем ДАФИ). Пунктирной линией показана верхняя граница появления сероводорода [Pimenov a. Neretin, 2006]. анаэробной водной толще (217 и 364 м). Однако только один филотип (с глубины 364 м) имел непосредственное сходство с культивируемым представителем СРБ – Desulfobacterium anilini. некультивируемыми Остальные анаэробными три филотипа бактериями, имели способными гомологию с утилизировать углеводороды и, предположительно, участвующими в анаэробном окислении метана. В 2005 г. в ходе изучения микробных сообществ в районах черноморских газовых сипов методом FISH с использованием универсального зонда для 53 детекции СРБ (SRB385) было показано присутствие сульфатредуцирующих бактерий в водной толще Черного моря как в поверхностных (0-200 м), так и в глубинных (500-2000 м) слоях [Durisch-Kaiser et al., 2005]. Численность СРБ составляла 3-7% от общего количества клеток, окрашенных ДАФИ. При этом в районе газовых сипов активные клетки СРБ были обнаружены, только начиная с глубины 500 м, а в контрольных участках (не имеющих донных газовых высачиваний) непосредственно от самой поверхности. На мелководье, как в районе сипов, так и в контрольных участках, активные клетки СРБ отсутствовали. Позднее Лин с соавторами также использовали зонд SRB385 для обнаружения сульфатредуцирующих бактерий в водной толще Черного моря [Lin et al., 2006]. Численность СРБ составляла 2-8% от всех бактериальных клеток, при этом наблюдалось ее возрастание с увеличением глубины. Кроме того, в зоне хемоклина был обнаружен выбивающийся из общей картины пик численности активных клеток СРБ, доходивший почти до 8% от всех детектируемых клеток. С развитием метода количественной ПЦР стало возможным применение его и для исследования морских экосистем. И уже в 2007 г. впервые было изучено количественное распределение копий гена dsrA (кодирующего α-субъединицу диссимиляционной сульфитредуктазы) в водной толще западной части центрального бассейна Черного моря в зимний период [Neretin et al., 2007]. Численность СРБ составила в аэробной водной толще – 0,1%, в зоне хемоклина – 0,8-1,9% и в анаэробных водах – 1,2-4,7% от численности всех клеток Bacteria. Анализ последовательностей сульфатредуцирующих бактерий, участков полученных гена после 16S проведения рРНК ПЦР с праймерами на основные подгруппы СРБ и клонирования полученных фрагментов, позволил определить филогенетическую принадлежность СРБ, обитающих в глубинной водной толще Черного моря [Neretin et al., 2007]. Большая часть полученных клонов (18) образовывала отдельный кластер, наиболее близкий к Desulfosarcina variabilis и Desulfonema magnum. Также 5 клонов оказались близки по нуклеотидным последовательностям к некультивируемым представителям анаэробных бактерий, участвующих в 54 деградации углеводородных соединений и часто обнаруживаемых в осадках, богатых метаном. Предположительно, данные микроорганизмы могут быть наряду с метанотрофными археями (группа ANME) вовлечены в процесс анаэробного окисления метана, как в осадках, так и в водной толще Черного моря. Кроме того, последовательность одного из этих клонов находилась в одном кластере с тремя последовательностями, обнаруженными ранее в водной толще Черного моря [Vetriani et al., 2003]. Последовательности двух клонов не попадали ни в одну из вышеописанных подгрупп. Тем не менее, один клон был сходен по нуклеотидной последовательности с Desulfobacterium anilini, а также с соответствующим филотипом, описанным Ветриани с соавторами [Vetriani et al., 2003]. Еще один клон был наиболее близок к Desulfovibrio spp. Нельзя забывать, что водная толща Черного моря является не изолированной системой, а находится в тесной взаимосвязи с придонными осадками, а также c микробными матами, образующимися возле метановых сипов. Поэтому для полноты картины необходимо также кратко проанализировать имеющиеся исследования разнообразия СРБ в этих двух экосистемах. Одним из наиболее полно описывающим разнообразие СРБ в донных осадках Черного моря является исследование, в котором авторами были амплифицированы, клонированы и отсеквенированы последовательности двух функциональных генов сульфатредуцирующих бактерий – aprA (кодирующего αсубъединицу аденозин-5’-фосфосульфатредуктазы) и dsrA [Blazejack and Schippers, 2011]. Часть транслированных последовательностей участков гена aprA была наиболее сходна с соответствующими последовательностями Desulfococcus multivorans, Desulfomonile tiedjei и Desulfobacterium anilini, также на филогенетической дендрограмме были выявлены три отдельных кластера последовательностей, имевших наибольшую гомологию с соответствующими последовательностями СРБ родов Desulfacium и Desulfohabdus, а также с Desulfonema magnum и Desulfobulbus elongatus, Desulfomonile tiedjei и Desulfobacterium anilini, соответственно. Транслированные последовательности участков гена dsrA некоторых клонов были сходны с последовательностями 55 Desulfococcus oleovorans, Desulfobacterium autotrophicum, Desulfotalea psychrophila, Desulfoarculus baarsii и представителей рода Desulfomicrobium; также наблюдалось несколько кластеров, не имевших достоверного сходства с культивируемыми СРБ. Не бактерий меньший в интерес микробных Предположительно, СРБ вызывают сообщества матах, образующихся в находятся них в сульфатредуцирующих возле тесном метановых сипов. взаимодействии с метанотрофными археями групп ANME-1 и ANME-2, принимая участие в процессах анаэробного окисления метана. Многими исследователями [Michaelis et al., 2002; Blumenberg et al., 2004; Treude et al., 2005; Basen et al., 2011] отмечается, что в этих сообществах преобладают представители подгруппы DesulfosarcinaDesulfococcus. Суммируя все вышесказанное, можно констатировать, что численность СРБ в водной толще Черного моря обычно составляет 1-8% от общего числа прокариотических клеток, и при изучении морских сообществ СРБ с использованием молекулярно-биологических методов можно, как минимум, ожидать обнаружение генетического материала представителей родов Desulfosarcina, Desulfococcus и Desulfobacterium. 3.2. Балтийское море. Балтийское море лежит между параллелями 65°56′ и 54°46′ с. ш. и меридианами 9°57′ и 30°00′ в. д. Окруженное почти со всех сторон сушей, оно лишь в юго-западной части соединяется с Северным морем через датские проливы Зунд, Большой и Малый Бельты и далее через проливы Каттегат и Скагеррак. Рельеф дна Балтийского моря неоднороден и, при средней глубине моря 51 м, имеются как мелководные проливы (7-35 м), так и более глубокие впадины (с максимальной глубиной 470 м в Ландсортской котловине). Площадь поверхности Балтийского моря составляет около 415 тыс. км2, а объем водных масс 21,7 км3. В Балтийское море впадает около 250 крупных и малых рек, в среднем вливающих в море приблизительно 433 км3 воды. [Добровольский и 56 Залогин, 1982; Андерсен и Паулак, 2007]. Из-за неодинакового прогрева в течение года в различных районах Балтийского моря имеют место сезонные различия и пространственная неоднородность поверхностной температуры воды. В частности, зимой в прибрежных водах она ниже, чем в открытых частях моря, при этом у западного берега температура воды несколько выше, чем у восточного. Летом поверхностные воды Балтийского моря нагреваются наиболее сильно, но неодинаково в разных районах. Колебания температур поверхностных вод составляют от 0,5°С до 21°С. Однако ярко выраженные сезонные изменения охватывают только верхние 50-60 м, глубже температура воды понижается и остается практически постоянной (около 5°С) в течении всего года. В Балтийском море также, как и в Черном, существует холодный промежуточный слой (ХПС), сохраняющийся в том числе и летом [Добровольский и Залогин, 1982; Кудрявцева и др., 2012]. Соленость в Балтийском море также распределена неоднородно и изменяется от 1-2‰ на севере Ботнического залива до 30‰ у дна Датских проливов. С глубиной соленость, а соответственно, и плотность балтийских вод увеличивается, во многих впадинах и котловинах на горизонтах 50-70 м создается постоянный пикноклин. Над ним в подповерхностных горизонтах (20-30 м) образуется сезонный слой больших вертикальных градиентов плотности, обусловленный резким изменением температуры воды на этих горизонтах. Для Балтийского моря характерно явление гипоксии (уменьшения концентрации растворенного в воде кислорода) в придонных водах, одной из причин которой является эвтрофикация водоема [Андерсен и Паулак, 2007]. Гипоксия в Балтийском море возникала периодически в течение всего голоценового периода, однако в последнее время ее масштабы значительно увеличились в связи с активным антропогенным поступлением соединений азота и фосфора с речным стоком. В частности, если до 1950 г. площадь балтийских вод с гипоксией составляла менее 10000 км2, то уже к 2000 г. эта цифра увеличилась до 60000 км2 [Андерсен и Паулак, 2007; Carstensen et al., 2013]. 57 Увеличение концентраций доступного фосфора и азота в воде вызывает интенсификацию первичной продукции, что, в свою очередь, приводит к уменьшению содержания кислорода в воде или даже полному его отсутствию и накоплению сероводорода за счет активизации его выбросов из донных осадков. Кроме того, благодаря периодическому проникновению вод из Северного моря придонная водная толща Балтики обогащается более солеными (а, следовательно, и более плотными) водными массами, что уменьшает возможность вертикальной конвекции и обогащения придонных вод кислородом. На данный момент известно, что вблизи дна многих впадин Балтийского моря (в частности, Гданьской) существуют постоянные анаэробные условия [Андерсен и Паулак, 2007]. Гданьский бассейн располагается в юго-восточной части Балтийского моря, омывая с юга побережье Польши, а с востока – России и Литвы. Площадь его акватории составляет 22000 км2. В центре бассейна находится впадина с максимальной глубиной 114 м, отделенная от соседней Готландской впадины Гданьско-Готландским порогом с максимальной глубиной 86 м. Гданьский бассейн, как и всё Балтийское море, находится под влиянием неблагоприятных факторов, таких как ограниченный водообмен с Северным морем, а также наличие барьеров температуры и солености между поверхностными и придонными водами. Существование гидрологических барьеров, затрудняющих циркуляцию водных масс, в сочетании со значительными величинами первичной продукции способствуют формированию в придонных горизонтах Гданьской впадины обширных зон аноксии (полного отсутствия кислорода) [Кудрявцева и др., 2012]. Наиболее полное исследование численности, биомассы и продукции бактериопланктона в российском секторе Балтийского моря было проведено в 2007-2009 гг. Кудрявцевой с соавторами [Кудрявцева и др., 2012]. В летнее время численность и биомасса микроорганизмов в водной толще Балтийского моря сильно варьировали и составляли 0,09-11,23 × 106 кл./мл и 2-123 мгС/м3, соответственно. Также были установлены некоторые закономерности сезонного и 58 пространственного распределения микроорганизмов. Их численность и биомасса увеличивались в летнее время (по сравнению с зимним) и уменьшались по мере удаления исследованных точек пробоотбора от берега в открытое море. Летом в зоне ХПС наблюдалось снижение численности и биомассы микроорганизмов по сравнению с вышележащими водными слоями. В придонных водах, наоборот, наблюдалось увеличение этих параметров. Наблюдаемые клетки имели, в основном, кокковидную и палочковидную формы, в меньшем количестве выявляли вибрионы. Изредка попадались нитчатые формы, их количество увеличивалось в придонных слоях воды [Кудрявцева и др., 2012]. 3.2.1. Исследования сообществ сульфатредуцирующих бактерий в Балтийском море. До настоящего времени основные исследования сульфатредуцирующих бактерий в Балтийском море были сосредоточены на изучении их сообществ в донных осадках и участия СРБ в различных процессах, таких как деградация ацетата и пропионата, потребление соединений фосфора и т.д. Среди исследований бактериопланктона водной толщи Балтийского моря можно отметить лишь единичные работы, в которых было описано присутствие СРБ. В 2003 г. Лабренц с соавторами исследовали вертикальное распределение прокариот в водной толще центральной части Балтийского моря (Fårö Deep) по гену 16S рРНК с помощью методов анализа одноцепочечных конформационных полиморфизмов (SSCP) и ДГГЭ [Labrenz et al., 2007]. В ходе этой работы в пробах воды с глубин 85-180 м (что соответствует зоне хемоклина и анаэробной водной толще) были определены последовательности 16S рибосомальной кДНК пяти представителей Deltaproteobacteria, только одна из которых имела сходство 96% с соответствующей последовательностью Desulfobacula toluolica. Также авторы отметили, что участки гена 16S рРНК D. toluolica были обнаружены на глубинах 110-160 м, в то время как последовательности самой 16S рРНК, характеризующие присутствие метаболически активных клеток, были детектированы только на глубинах 110-120 м. В аэробных водах фрагменты генов 16S рРНК или 59 последовательности самой 16S рРНК представителей Deltaproteobacteria обнаружены не были [Labrenz et al., 2007]. Позже присутствие генетического материала Deltaproteobacteria исключительно в зоне хемоклина и анаэробной водной толще Балтийского моря (Готландская впадина, центральная часть моря, Финский залив) также было показано методом генетических отпечатков. Кроме того, в Готландской впадине были обнаружены фрагменты гена 16S рРНК двух представителей СРБ – Desulfobacula toluolica и Desulfocapsa sulfexigens [Brettar et al., 2012]. В ходе изучения распределения эндоспор термофильных Desulfotomaculum в донных осадках залива Орхус, расположенного между Балтийским и Северным морями, было показано присутствие жизнеспособных эндоспор термофильных СРБ данного рода также и в водной толще (на глубинах 1 и 14 м, при общей глубине в точке отбора 16 м) [de Rezende et al., 2013]. Таким образом, можно заключить, что, по крайней мере в центральной части Балтийского моря, генетический материал Deltaproteobacteria (к которым относятся большинство СРБ) стабильно обнаруживается в зоне хемоклина и анаэробной водной толще. Одним из видов СРБ, обитающих в водной толще Балтийского моря, вероятно, является Desulfobacula toluolica. Для получения более полной картины, описывающей распространение и разнообразие сульфатредуцирующих бактерий в Балтийском море, необходимо рассмотреть также имеющиеся в настоящее время данные о филогенетическом биоразнообразии СРБ в донных осадках Балтийского моря, поскольку трудно предположить, что эти сообщества могут существовать изолированно от сообществ СРБ водной толщи. В 1993 г. из осадков вблизи побережья города Саксильд (Дания) был выделен штамм СРБ, названный SAX, который по своим физиолого- биохимическим свойствам был предварительно отнесен авторами к новому виду рода Desulfoarculus [Drzyzga et al., 1993]. Впоследствии на основании анализа жирных кислот в липидах и последовательности гена 16S рРНК данный штамм был отнесен к новому роду Desulfotignum семейства Desulfobacteraceae с видовым 60 названием Desulfotignum balticum [Kuever et al., 2001]. В 2008 г. Шубенковой с соавторами были проведены молекулярнобиологические исследования состава микробного сообщества восстановленных осадков покмарка российского сектора Гданьской впадины Балтийского моря [Шубенкова и др., 2010]. После клонирования участков гена 16S рРНК с последующим секвенированием было показано присутствие в осадках генетического материала СРБ, наиболее близких к представителям семейств Syntrophaceae и Desulfobacteraceae. В накопительных культурах, выделенных из различных горизонтов осадочной толщи, преобладали представители порядка Desulfovibrionales [Шубенкова и др., 2010]. Наиболее детальным исследованием филогенетического разнообразия сульфатредуцирующих бактерий в осадках Балтийского моря можно считать работу Синкко с соавторами [Sinkko et al., 2011], в которой методами анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (T-RFLP) и клонирования участков гена 16S рРНК было показано присутствие в осадках Балтийского моря вблизи финского побережья генетического материала СРБ, принадлежащих к порядку Desulfobacterales, семейству Desulfobulbaceae и родам Desulfovibrio, Desulfobacterium, Desulfobacula. Впоследствии было показано, что в библиотеках клонов, полученных из осадков открытой части Балтийского моря, Deltaproteobacteria были представлены исключительно СРБ, в то время как в эстуариях преобладали представители других физиологичесих групп микроорганизмов [Sinkko et al., 2013]. Также было показано, что представители СРБ были многочисленными в прибрежных донных осадках и осадках центральной части моря даже в их поверхностном слое. При этом численность представителей рода Desulforhopalus (семейство Desulfobulbaceae) и, частично, Desulfobacula (семейство Desulfobacteriaceae) положительно коррелировала с концентрацией органических соединений азота и фосфора [Sinkko et al., 2013]. Как видно из вышеприведенной информации, экспериментальных данных о наличии и разнообразии СРБ в водной толще Гданьской впадины Балтийского 61 моря, где присутствуют меромиктические условия, на данный момент нет. Однако можно предположить, что генетический материал сульфатредуцирующих бактерий может быть обнаружен в зоне хемоклина и в анаэробной водной толще Гданьской впадины. Кроме того, можно ожидать обнаружение фрагментов генов представителей порядка Desulfovibrionales и семейства Desulfobacteraceae, поскольку они были обнаружены как в водной толще и донных осадках центральной части Балтийского моря, так и в донных осадках, находящихся непосредственно в российском секторе Гданьской впадины. 62 ГЛАВА 4. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 4.1. Отбор проб морской воды. Пробы воды с глубин от 30 до 600 м Черного моря отбирали в стерильные 50-мл пластиковые пробирки типа «Falcon» («Greiner Bio-One», Австрия) в мае 2007 г. и в июне 2008 г. с борта НИС «Акванавт» на станции c глубиной 1300 м (44о.458N, 37o.882Е), расположенной на свале глубин российского сектора Черного моря в 10-12 милях от Голубой бухты (континентальный склон в районе г. Геленджик). На той же станции в июле 2010 г. с борта НИС «Ашамба» пробы воды с глубин 30, 100, 145, 165, 180 и 200 м отбирали с помощью батометров и погружного насоса в стерильные 5-л пластиковые бутыли для последующей фильтрации и выделения тотальной ДНК. Также в марте 2009 г. отбирали водные пробы с борта НИС «Профессор Штокман» в российском секторе глубоководной зоны Черного моря (станция №20, 44о.052N, 36o.632Е, глубина 1940 м). Пробы воды с глубин от 0 до 110 м Гданьской впадины Балтийского моря в точке с координатами 54°.860N, 19°.333E (станция №22) отбирали в стерильные 5-л пластиковые бутыли в июле 2011 г. с борта малого рыболовного траулера МРТК-1073, используя батометры зондирующего комплекса типа «Rosette», оснащенного гидрофизическим зондом фирмы «Sea-Bird Electronics, Inc.» (США) с дополнительными датчиками содержания O2, температуры, мутности и Eh. 4.2. Идентификация и определение численности микроорганизмов методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH). При проведении метода FISH за основу брали стандартный протокол [Amann et al., 1992; Glockner et al., 1996; Pernthaler et al., 2002]. Сразу после отбора нативные водные пробы (50 мл) и пробы из накопительных культур (1 мл) фиксировали путем добавления 40%-ного раствора формальдегида (конечная концентрация формальдегида в пробе – 4%) и хранили в темноте при 4оС. Клетки микроорганизмов концентрировали (7-15 мл для водных проб и 40-400 мкл для накопительных культур) на черных поликарбонатных 63 мембранных фильтрах GTBP 2500 (диаметр 25 мм, размер пор 0,2 мкм) производства «Millipore» (США) с нитроцеллюлозной подложкой (диаметр 25 мм, размер пор 0,45 мкм) с помощью водоструйного насоса при давлении 50 кПа. Фильтры промывали смесью PBS : этанол (1 : 1), высушивали на воздухе и хранили при -20оС. Флуоресцентную in situ гибридизацию проводили на предметных стеклах, на которые помещали секции гибридизационного буферного фильтров, смоченные 9 раствора с добавлением 1 мкл свежего мкл раствора соответствующего 16S рРНК-специфичного олигонуклеотидного зонда (50 нг/мкл), меченного на 3’-конце флуоресцентным красителем карбоцианином 3 (Cy3). Гибридизационный буферный раствор имел следующий состав: 0,9 М NaCl; 0,01% додецилсульфата натрия; 20 мМ трис-HCl (pH 7,5); 0,2% блокирующего реагента («Roche Diagnostics», Швейцария) и оптимизированная для каждого зонда концентрация формамида («MP Biomedicals», США), определяющая специфичность и точность гибридизации [Amann et al., 1992; Glockner et al., 1996; Pernthaler et al., 2002]. Гибридизацию осуществляли во влажной камере в шкафетермостате BD 53 («Binder», Германия) при рекомендованной для каждого зонда температуре (Tпл) в течение 2 ч. Флуоресцентно-меченые олигонуклеотидные зонды («Синтол», Россия), использовавшиеся в исследовании, а также температуры гибридизации, концентрация формамида в гибридизационном буферном растворе и содержание NaCl в промывном буферном растворе для каждого зонда приведены в таблице 2. Применяли зонды для идентификации представителей домена Bacteria [Amann et al., 1990], домена Archaea [Stahl et al., 1995] и более специфичные – для дифференцировки подгрупп сульфатредуцирующих бактерий [Devereux et al., 1992; Manz et al., 1998; Hristova et al., 2000; Lücker et al., 2007]. Для поиска нужных зондов использовали также базу данных probeBase (http://www.microbialecology.net/probebase). Эффективность гибридизации была предварительно протестирована на чистых культурах Escherichia coli TG-1 («Stratagene», США), 64 Таблица 2. 16S рРНК-специфичные олигонуклеотидные зонды, меченные флуоресцентным красителем карбоцианином 3, использовавшиеся в исследовании. Зонд Филогенетическая специфичность EUB338 EUB338II ARCH344 ARCH915 DSB129 DSB985 DSV214 DSV698 DSV1292 Dtm229 SRB385 Большинство Bacteria Archaea Большинство Desulfobacter Desulfobacter, Desulfobacula, Desulfospira, Desulfotignum Большинство Desulfomicrobium Некоторые Desulfovibrio, Bilophila wadsworthia, Lawsonia intracellularis Некоторые Desulfovibrio, Bilophila wadsworthia Desulfotomaculum (кластер I), другие Firmicutes Большинство Desulfovibrionales, большинство СРБ группы δ-Proteobacteria Нуклеотидная последовательность (5’ → 3’) GCTGCCTCCCGTAGGAGT GCAGCCACCCGTAGGTGT Целевой фрагмент 16S рРНК 338-355 338-355 Tпл, о C 55 Формамид, %; NaCl, мМ 30; 102 TTCGCGCCTGSTGCRCCCCG GTGCTCCCCCGCCAATTCCT 344-363 915-934 58 58 20; 215 CAGGCTTGAAGGCAGATT 129-146 48 15; 308 CACAGGATGTCAAACCCAG 985-1003 51 CATCCTCGGACGAATGC 214-230 49 10; 440 GTTCCTCCAGATATCTACGG 698-717 52 35; 70 CAATCCGGACTGGGACGC 1292-1309 55 35; 70 AATGGGACGCGGATCCAT 229-246 50 15; 308 CGGCGTCGCTGCGTCAGG 385-402 59 35; 70 20; 215 Desulfotomaculum nigrificans ssp. salinus штамм 435 (лаборатория микробиологии антропогенных мест обитания, ИНМИ РАН) и Desulfovibrio vulgaris Hildenborough ATCC 29579 (DSMZ, Германия) в качестве положительного и отрицательного контролей. В качестве контроля на возможную автофлуоресценцию 65 микроорганизмов на секциях соответствующих фильтров проводили процедуру гибридизации без добавления зонда. После гибридизации секции фильтров промывали в темноте стерильной деионизованной водой и инкубировали при соответствующей температуре гибридизации (см. табл. 2) в предварительно подогретом промывном буферном растворе в течение 10 мин для удаления несвязавшегося зонда. Состав промывного буферного раствора: 5 мМ ЭДТА (pH 8,0); 20 мМ трисHCl (pH 7,5); 0,01% додецилсульфата натрия и 50-440 мМ NaCl (в зависимости от используемой для гибридизации концентрации формамида (см. табл. 2). Затем снова промывали секции фильтров стерильной деионизованной водой и высушивали в темноте на воздухе на чистых предметных стеклах. Общую численность микроорганизмов в пробах при проведении FISH оценивали с помощью окрашивания образцов раствором универсального ДНКкрасителя 4’,6-диамидино-2-фенилиндола (ДАФИ), который наносили после проведения FISH на секции фильтров по 10 мкл (0,5 нг/мкл). После инкубации при комнатной температуре в темноте в течение 15 мин секции фильтров промывали деионизованной водой и высушивали в темноте на воздухе. Затем наносили на предметное стекло несколько капель смеси Citifluor AF1 («Citifluor Ltd.», Великобритания) и Vectashield («Vector Laboratories», Канада) в соотношении 4 : 1 для предотвращения уменьшения флуоресценции во время хранения, накрывали длинным покровным стеклом и хранили препараты в темноте при -20оС. 4.2.1. Микроскопический анализ и подсчет клеток, окрашенных ДАФИ и гибридизовавшихся с соответствующими FISH-зондами. Микроскопический анализ проводили при увеличении ×1000 на эпифлуоресцентном микроскопе Axio Imager.D1 («Carl Zeiss», Германия) с цифровой камерой Axio Cam HRc, соответствующими светофильтрами (Zeiss 20 для Cy3-меченых зондов и Zeiss 49 для подсчета клеток, окрашенных ДАФИ) и компьютерным программным обеспечением Axio Vision. 66 Подсчет клеток вели в 25-30 полях зрения цифровой камеры (в среднем 100120 клеток, окрашенных ДАФИ, в поле зрения) на каждую секцию фильтра для статистической достоверности. Количество клеток (N) в мл пробы вычисляли по формуле N = n × (Sфильтра : Sполя зрения) : V, где n – среднее количество клеток в поле зрения, V – объем отфильтрованной пробы в мл, Sфильтра = 283,5 мм2, Sполя зрения = 5,76 × 10-3 мм2. 4.3. Выделение тотальной ДНК клеток из водных проб. Пробы воды из водной толщи Черного и Балтийского морей (объем каждой пробы – 5 крупнопористые л) последовательно фильтры GF/C фильтровали («Whatman», через стекловолоконные Великобритания) и нитроцеллюлозные мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм («Millipore», США) для отделения клеток, ассоциированных с крупными частицами взвеси размером ≥1,2 мкм, от мелких частиц, слизи и свободноживущих клеток. Фильтры хранили в смеси буферный раствор TE (pH 8,0) : этанол (1 : 1) при 4оС. В дальнейшем фильтры тщательно растирали пестиком в фарфоровой ступке в жидком азоте до состояния порошка, из которого выделяли ДНК с использованием набора Genomic DNA Purification Kit («Fermentas», Литва) в соответствии с нижеприведенным протоколом. 1. 200 мкл образца смешивали с 400 мкл лизирующего раствора и инкубировали при 65оС в течение 10 мин при периодическом перемешивании. 2. После инкубации немедленно добавляли 600 мкл хлороформа, аккуратно перемешивали 3-5 раз и центрифугировали при 10000 об/мин на микроцентрифуге MiniSpin («Eppendorf», Германия) в течение 2 мин. 3. Во время центрифугирования готовили осаждающий раствор, смешивая 720 мкл стерильной деионизованной воды с 80 мкл 10× концентрированного осаждающего раствора из набора. После центрифугирования верхнюю жидкую фазу, содержащую ДНК, переносили в новую микроцентрифужную пробирку, вносили 800 мкл свежеприготовленного осаждающего раствора, осторожно 67 перемешивали путем переворачивания пробирки в течение 1-2 мин при комнатной температуре и центрифугировали при 10000 об/мин на микроцентрифуге MiniSpin («Eppendorf», Германия) в течение 2 мин. 4. После центрифугирования полностью удаляли супернатант (не допуская высушивания осадка) и растворяли осадок ДНК в 100 мкл 1,2 М раствора NaCl при осторожном перемешивании. 5. Добавляли к образцу 300 мкл ледяного этанола, инкубировали при температуре -20оС в течение 1 ч, после чего отделяли осадок ДНК центрифугированием при 10000 об/мин на микроцентрифуге MiniSpin («Eppendorf», Германия) в течение 4 мин. Затем осадок ДНК однократно промывали 70%-ным ледяным этанолом и растворяли в 100 мкл деионизованной воды. 4.4. Детекция СРБ в водной толще с помощью ПЦР. Для анализа сообществ СРБ в Черном и Балтийском морях методом ПЦР использовали олигонуклеотидные праймеры, специфичные к участку гена dsrB (кодирующего β-субъединицу диссимиляционной сульфитредуктазы – ключевого фермента, характерного для всех представителей сульфат- и сульфитредуцирующих микроорганизмов), к участкам гена 16S рРНК шести основных филогенетических подгрупп СРБ, а также к участку гена 16S рРНК Bacteria в случае вложенной ПЦР (табл. 3). ПЦР амплификацию проводили в конечном объеме реакционной смеси 25 мкл в термоциклере GeneAmp PCR System 9700 («Applied Biosystems», США). Реакционная смесь содержала ~25 нг выделенной ДНК (или продукта амплификации гена 16S рРНК Bacteria в случае вложенной ПЦР); 400 мкМ дНТФ («Fermentas», Литва); 2,0 мМ MgCl2; 500 нМ каждого праймера и 2,5 ед. Taq ДНКполимеразы («Синтол», Россия). Все праймеры были синтезированы в компании «Синтол» (Россия). Амплификацию проводили в следующем режиме: 5 мин при 95оC; 35 циклов – 1 мин при 94оC, 1 мин при температуре отжига (Ta) соответствующей 68 пары праймеров, 1 мин при 72оC (6 мин в случае использования праймеров pA и pH'); 10 мин при 72оC. Таблица 3. Олигонуклеотидные ПЦР-праймеры, использованные в исследовании. Праймеры DSRp2060F DSR4R pA pH' DFM140 DFM842 DBB121 DBB1237 DBM169 DBM1006 DSB127 DSB1273 DCC305 DCC1165 DSV230 DSV838 Целевой фрагмент (ген 16S рРНК, позиции по карте E. coli) Размер продукта, по Филогенетическая специфичность Нуклеотидная последовательность (5’ → 3’) Ген dsrB *CAACATCGTTCATACCCAGGG GTGTAGCAGTTACCGCA AGAGTTTGATCTGGCTCAG AAGGAGGTGATCCAGCCGCA - // - 56 350 8–26 1542–1523 37 1530 TAGMCYGGGATAACRSYKG ATACCCSCWWCWCCTAGCAC 140–158 842–823 58 700 CGCGTAGATAACCTGTCYTCATG GTAGKACGTGTGTAGCCCTGGTC 121–143 1237–1215 66 1120 CTAATRCCGGATRAAGTCAG ATTCTCARGATGTCAAGTCTG 169–188 1006–986 64 840 GATAATCTGCCTTCAAGCCTGG CYYYYYGCRRAGTCGSTGCCCT 127–148 1273–1252 56 1150 GATCAGCCACACTGGRACTGACA GGGGCAGTATCTTYAGAGTYC 305–327 1165–1145 56 860 GRGYCYGCGTYYCATTAGC SYCCGRCAYCTAGYRTYCATC 230–248 838–818 54 610 Ген 16S рРНК Bacteria Ген 16S рРНК 1 подгруппы СРБ (Desulfotomaculum) Ген 16S рРНК 2 подгруппы СРБ (Desulfobulbus) Ген 16S рРНК 3 подгруппы СРБ (Desulfobacterium) Ген 16S рРНК 4 подгруппы СРБ (Desulfobacter) Ген 16S рРНК 5 подгруппы СРБ (Desulfococcus– Desulfonema– Desulfosarcina) Ген 16S рРНК 6 подгруппы СРБ (Desulfovibrio– Desulfomicrobium) Ta, о C Примечание. * – G/C-богатый участок 5'-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGGCCCGCCGCCCCCGCCCC-3' [Muyzer et al., 1993] был присоединен к 5'-концу праймера DSRp2060F для проведения ДГГЭ. 4.4.1. Вложенная ПЦР. Для повышения чувствительности обнаружения гена 16S рРНК минорных представителей сообщества сульфатредуцирующих бактерий применяли вложенную ПЦР. В этом случае сначала проводили амплификацию участка гена 69 16S рРНК Bacteria (пара праймеров рА – рН’ [Edwards et al., 1989]), а затем полученный продукт амплификации использовали в качестве матрицы для амплификации с праймерами, специфичными к участку гена 16S рРНК шести основных филогенетических подгрупп СРБ по описанному выше протоколу. 4.4.2. Электрофоретическое разделение и визуализация продуктов ПЦР. Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР проводили при напряжении 100 В в течение 1 ч в 1%-ном агарозном геле в 1× трис-ацетатном буферном раствором (ТАЕ) состава:40 мМ Трис (основной); 1,2 мМ Na2ЭДТА; 1,79 мл ледяной уксусной кислоты на 1 л раствора; pH 7,6. После проведения электрофореза гель окрашивали в водном растворе бромистого этидия (0,5 мкг/мл) в течение 15 мин и отмывали в дистиллированной воде в течение 5 мин. Анализировали и фотографировали гель под проходящим длинноволновым ультрафиолетовым светом (λ 254 нм) на трансиллюминаторе ECX-15.C («Vilber Lourmat», Франция). В качестве маркера для определения размера и концентрации амплифицированных фрагментов ДНК использовали MassRuler DNA Ladder Mix («Fermentas», Литва). 4.4.3. Определение численности СРБ методом количественной ПЦР. Подсчет количества копий участка гена dsrB проводился с использованием красителя SYBR Green [Wittwer et al., 1997]. Гены 16S рРНК прокариот и dsrB амплифицировали с праймерами Uni515F (5'-GTGBCAGCMGCCGCGGTAA-3') [Kublanov et al. 2009] - 806R (5'- GGACTACHVGGGTATCTAAT-3') [Walters et al. 2011] и DSRp2060F (5'CAACATCGTYCAYACCCAGGG-3') - DSR4R (5'-GTGTAGCAGTTACCGCA-3') (Dar et al. 2007), соответственно. Амплификацию проводили в следующем режиме: денатурация (3 мин при 95°C); 40 циклов – 20 с при 94ºC, 25 с при 55ºC для пары праймеров Uni515F - 806R и 59ºC для пары праймеров DSRp2060F DSR4R, 25 с при 72ºC. Абсолютное количество целевых генов в образце ДНК подсчитывали на основании калибровочных реакций. В качестве калибровки 70 использовали ДНК, выделенную из чистых культур Desulfovibrio vulgaris Hildenborough ATCC 29579 (DSMZ, Германия) [Heidelberg et al., 2004] и Melioribacter roseus [Podosokorskaya et al. 2013], размер генома и копийность целевых генов в геноме которых известна. Концентрацию ДНК определяли на флуориметре Qubit 2.0 («Invitrogen», США). Для построения калибровочные кривых использовали серию двукратных разведений ДНК до 2 20 разведения. Значения детерминации корреляции (R2) и эффективности реакции для калибровочных кривых были не ниже 0,99, а эффективность амплификации не ниже 70%. Конечное значение копийности целевого гена нормализовали на 1 нг выделенной ДНК. Все реакции проводили на амплификаторе StepOnePlus™ RealTime PCR System (Life Technologies, США) со смесью qPCRmix-HS ROX (Евроген, Россия). 4.5. Анализ участков гена dsrB с использованием денатурирующего градиентного гель-электрофореза (ДГГЭ) с последующим секвенированием. Для амплификации ДНК из исследуемых проб с целью последующего разделения участков гена dsrB с помощью ДГГЭ использовали праймеры DSRp2060F с прикрепленным к 5’-концу ГЦ-богатым участком и DSR4R (см. табл. 3). ПЦР-амплификацию проводили в соответствии с режимом, описанным выше. Полученные ПЦР-продукты очищали из агарозного геля с использованием коммерческого набора DNA Gel Extraction Kit («Fermentas», Литва) согласно нижеприведенному протоколу. 1. Проводили препаративный электрофорез, участки агарозы, содержащие ПЦР-продукт, вырезали стерильным скальпелем и помещали в пластиковые 2-мл микроцентрифужные пробирки. 2. Добавляли в каждую пробирку на 1 объем геля (1 г геля эквивалентен 1 мл) 3 объема связывающего раствора из набора и инкубировали 5 мин при 55 оС до полного растворения агарозы. 3. Вносили в каждую пробирку 5 мкл суспензии кварцевого порошка из 71 набора. Инкубировали смесь 5 мин при 55оС, перемешивая образцы на вортексе каждые 2 мин. 4. Центрифугировали пробы на настольной микроцентрифуге в течение 5 сек для осаждения комплекса ДНК/кварцевый порошок, супернатант удаляли. 5. Добавляли 500 мкл ледяного промывного буферного раствора, ресуспендировали осадок, центрифугировали пробы в течение 5 сек, супернатант удаляли. Повторяли данную процедуру три раза. После заключительного удаления супернатанта еще раз центрифугировали пробы на настольной микроцентрифуге для удаления остаточной жидкости, подсушивали осадок при комнатной температуре в течение 10-15 мин. 6. Осадок ресуспендировали в 20 мкл стерильной деионизованной воды и инкубировали 5 мин при 55оС. Центрифугировали пробы, супернатант переносили в новую стерильную микроцентрифужную пробирку, избегая попадания в нее кварцевого порошка. В зависимости от полученной концентрации ДНК в лунку полиакриламидного геля вносили 5-15 мкл пробы. ДГГЭ для разделения смеси полученных ПЦР-продуктов проводили в 6,5%ном полиакриламидном геле толщиной 1,5 мм с денатурирующим градиентом (от 40 до 70% мочевины и формамида) в 0,5× ТАЕ буферном растворе при температуре 60оС и постоянном напряжении 200 В в течение 6 ч на приборе DCode Universal Mutation Detection System (“Bio-Rad”, США). После электрофореза гель оставляли на 30 мин в буферном растворе TAE, содержащем 0,5 мкг/мл бромистого этидия, после чего промывали в TAE в течение 10 мин и фотографировали под длинноволновым УФ светом с использованием системы гель-документирования GelDoc (“Bio-Rad”, США). Индивидуальные полосы вырезали из геля под УФ светом (λ 320 нм) на трансиллюминаторе ECX-26MX (“Vilber Lourmat”, Франция). Элюцию ДНК осуществляли в стерильной деионизованной воде в течение 24 ч при температуре 4оС, которую затем использовали в качестве матрицы для ПЦР-реамплификации участков гена dsrB по стандартному протоколу для праймеров DSRp2060F- 72 DSR4R, описанному в подглаве 4. Реамплифицированный ПЦР-продукт очищали из агарозного геля в соответствии с протоколом, описанным выше. 4.5.1. Секвенирование участков гена с dsrB помощью дидезоксинуклеотидного метода. Секвенирование участков гена dsrB, полученных после реамплификации ДНК, выделенной из ДГГЭ-полос, проводили на автоматическом четырехкапиллярном секвенаторе ABI Prism 3130 («Applied Biosystems», США). Первым этапом проводили секвенсовые реакции каждой пробы с прямым (DSRp2060F) и обратным (DSR4R) праймерами к участку гена dsrB в термоциклере GeneAmp PCR System 9700 («Applied Biosystems», США). В ПЦРпробирки вносили 1,5 мкл соответствующего праймера (2,5 пкмоль/мкл) и 2 мкл исследуемой ДНК, разбавленной в 2-16 раз в зависимости от концентрации продукта в пробе. Полученную смесь высушивали при 55 оС. После высушивания в каждую пробирку вносили по 10 мкл реакционной смеси, содержащей 4 мкл раствора BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing PR-100 («Applied Biosystems», США), 2 мкл 10× буферного раствора с ЭДТА («Applied Biosystems», США) и 4 мкл стерильной деионизованной воды. Раствор BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing PR-100 оптимизированные («Applied для Biosystems», проведения дезоксинуклеотидтрифосфатов, США) секвенсовой содержит реакции себе количества флуоресцентно дидезоксинуклеотидтрифосфатов (так называемых в меченных терминаторов) и ДНК- полимеразы AmpliTaq Gold. Реакцию проводили при следующем режиме: 96ºС — 1 мин 98ºС — 10 сек 55ºС — 5 сек 25 циклов 60ºС — 4 мин После окончания реакции смесь переносили в пластиковые микроцентрифужные пробирки емкостью 1,5 мл и проводили очистку. Для этого к 73 каждой смеси добавляли 10 мкл XTerminator Solution («Applied Biosystems», США) и 45 мкл SAM Solution («Applied Biosystems», США), затем перемешивали на вортексе в течение 30 мин. После этого центрифугировали пробы 2 мин при 5000 об/мин на микроцентрифуге MiniSpin («Eppendorf», Германия). Препарат XTerminator Solution («Applied Biosystems», США) связывает оставшиеся в растворе терминаторы, а также свободные соли, которые могут препятствовать прочтению нуклеотидных последовательностей, SAM Solution («Applied Biosystems», США), в свою очередь, усиливает эффективность очистки и стабилизирует реакцию. После центрифугирования 20 мкл надосадочной жидкости переносили в специальную плашку, загружали ее в секвенатор и осуществляли секвенирование по протоколу для полимера 3130 POP-6 («Applied Biosystems», США),смеси BigDye Terminator v3.1 S v3.1 Cycle Sequencing PR-100 («Applied Biosystems», США) и капилляра длиной 36 см, время инъекции пробы составляло 12 сек. Первичный анализ полученных последовательностей на предмет качества прочтения осуществляли в программе BioEdit. Секвенирование по Сэнгеру фрагментов гена dsrB, полученных после реамплификации ДНК, выделенной из ДГГЭ-полос при анализе проб воды из Балтийского моря, проводили в центре «Биоинженерия» РАН, Россия. 4.5.2. Анализ полученных нуклеотидных последовательностей и построение филогенетических дендрограмм. Нуклеотидные последовательности участков гена dsrB были транслированы в аминокислотные. Первичный анализ сходства полученных аминокислотных последовательностей, кодируемых геном dsrB, с известными последовательностями из базы данных GenBank проводили с помощью программного пакета BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov). Филогенетическое дерево строили по методу ближайших соседей (neighbour-joining), реализованного в пакете программ TREECONW, используя референтные последовательности из GenBank. 74 4.6. Культивирование сульфатредуцирующих бактерий. Сульфатредуцирующих бактерий культивировали анаэробно, в соответствии с модифицированной техникой Хангейта [Bryant, 1972], на питательных средах, как правило содержавших в качестве акцептора электронов сульфат, а в качестве донора электронов и источника углерода – лактат натрия. Также обычно в питательные среды добавляли соли аммония, а не нитрата, поскольку именно ионы аммония являются наиболее быстро усваиваемым СРБ источником азота [Rabus et al., 2006]. Концентрацию хлорида натрия в питательной среде подбирали в зависимости от определенного оптимума (в случае чистых культур) или от солености места отбора проб (в случае накопительных культур). 4.6.1. Выделение накопительных культур сульфатредуцирующих бактерий. Накопительные культуры СРБ выделяли из водных проб, отобранных весной 2009 г. из глубоководной зоны Черного моря с глубин 30 и 70 м (аэробная зона), 120 м (зона хемоклина) и 165 м (анаэробные воды), и летом 2011 г. из водной толщи Гданьской впадины Балтийского моря с глубин 30 м (аэробные воды), 102 и 107 м (анаэробные воды). При получении первичных накопительных культур (из водных проб) 90-100 мл морской воды концентрировали на нитроцеллюлозных мембранных фильтрах (размер пор 0,2 мкм), которые вместе с 2 мл конечного объема жидкости над фильтром помещали в анаэробные пробирки Хангейта с заранее приготовленной питательной средой. Для культивирования СРБ использовали жидкую питательную среду Видделя для морских форм сульфатредуцирующих бактерий [Widdel et al., 1992] с добавлением микроэлементов [Pfennig, Lippert, 1966], витаминов [Widdel et al., 1981] и других растворов, состав которых приведен ниже. Состав жидкой среды Видделя (г/л): Na2SO4 – 3,0; KH2PO4 – 0,2; NH4Cl – 0,25; NaCl – 13,5 или 8 (для накопительных культур из Черного или Балтийского моря, соответственно); MgCl2 × 6H2O – 2,2; KCl – 0,5; CaCl2 × 2H2O – 0,15; рН 75 среды 7,4. Добавки готовили и стерилизовали отдельно. I. Растворы витаминов [Widdel et al., 1981]: 1. П-аминобензойная кислота – 4,0 мг; D(+)-биотин – 1,0 мг; цианкобаламин (В12) – 5,0 мг; никотиновая кислота – 10,0 мг; дистиллированная вода – до конечного объема 100 мл. 2. Холинхлорид – 200,0 мг; фолиевая кислота – 3,0 мг; мио-инозит – 150,0 мг; менадион-Na-бисульфит – 10,0 мг; пантотенат кальция – 5,0 мг; пиридоксальгидрохлорид – 3,0 мг; пиридоксамингидрохлорид – 15,0 мг; пиридоксолгидрохлорид – 5,0 мг; дистиллированная вода – до конечного объема 100 мл. 3. Гемин – 100,0 мг; раствор NaOH (50 мМ) – 100 мл. 4. DL-α-липоевая кислота – 1,0 мг; Na-фосфатный буферный раствор (50 мМ, рН 7,0) – 100 мл. 5. Рибофлавин – 5,0 мг; раствор уксусной кислоты (20 мМ) – 100 мл. 6. Тиаминхлорид – 10,0 мг; Na-фосфатный буферный раствор (200 мМ, pH 7,0) – 100 мл. Растворы 1, 4, 5 и 6 стерилизовали автоклавированием при 0,5 ати. Растворы 2 и 3 стерилизовали фильтрованием через стерильные мембранные фильтры фирмы «Millipore» (США) с размером пор 0,2 мкм. Использовали по 1 мл каждого раствора на 1 л среды. II. Раствор микроэлементов [Pfennig, Lippert, 1966]: Тритон Б – 500,0 мг; FeSO4 × 7H2O – 200,0 мг; ZnSO4 × 7H2O – 10,0 мг; MnCl2 × 4H2O – 3,0 мг; H3BO3 – 30,0 мг; CoCl2 × 2H2O – 20,0 мг; CuCl2 × 2H2O – 1,0 мг; NiCl2 × 6H2O – 2,0 мг; Na2MoO4 × 2H2O – 3,0 мг; дистиллированная вода – до конечного объема 100 мл; рН 3-4. Использовали 1 мл данного раствора на 1 л среды. Остальные добавки приведены в таблице 4. 76 Таблица 4. Компоненты, дополнительно вносимые в питательную среду Видделя для культивирования морских форм сульфатредуцирующих бактерий. Компонент Объем вносимого стокового раствора, мл/л среды (конечная концентрация в среде, г/л) Фосфатный буфер (рН 7,2) Na2HPO4 × 12H2O – 0,2 M NaH2PO4 × 2H2O – 0,2 M 1 Лактат натрия 2 (1) Бутират натрия 20 (1) Дрожжевой экстракт 10 (0,5) NaHCO3 10 (1) Na2S × 9H2O 10 (0,5) FeSO4 × 7H2O 0,25 (0,0125) Na2S2O4 30-50 мг/л Стоковый раствор* Смешивали 36 мл 0,2 М раствора Na2HPO4 × 12H2O и 14 мл 0,2 М раствора NaH2PO4 × 2H2O, доводили объем дистиллированной водой до 100 мл Готовый 50%-ный раствор лактата («Merck», Германия) 5%-ный раствор бутирата в дистиллированной воде 5%-ный раствор дрожжевого экстракта («Difco», США) в дистиллированной воде 10%-ный раствор NaHCO3 в дистиллированной воде 5%-ный раствор Na2S × 9H2O в 2%-ном растворе NaHCO3 5%-ный раствор FeSO4 × 7H2O в 2%-ной соляной кислоте Порошок, не стерилизуется Примечание: *Все растворы стерилизовали автоклавированием при 0,5 ати. Для приготовления сред использовали модифицированную анаэробную технику Хангейта [Hungate, 1969; Bryant, 1972]. Сначала готовили основную среду (минеральный фон) и стерилизовали автоклавированием при 1 ати. Перед использованием готовую стерильную среду кипятили для удаления кислорода, после чего быстро охлаждали (до 50оC) под струей воды и стерильно вносили требуемые добавки. После этого среду разливали в пенициллиновые пузырьки 77 объемом 12 мл, которые закрывали пробками из бутилированной резины и обжимали алюминиевыми колпачками, или в анаэробные пробирки Хангейта объемом 18 мл, не оставляя газовой фазы над средой. О степени восстановленности среды судили по её окраске (восстановленная среда имеет темный цвет за счет образования сульфидов, окисленная среда приобретает желтый цвет). Пробирки с накопительными культурами инкубировали при 22-23оС в течение 7-21 сут. Отбор культуры из пробирок для пересевов, определения количества сероводорода, микроскопирования и т.д. осуществляли с заменой культуральной жидкости на газообразный азот высокой степени очистки. Объем посевного материала при пересевах составлял 5% от объема питательной среды. В 2010 г. с глубин 30 и 100 м (аэробные воды), 145, 165 и 180 м (зона хемоклина) и 200 м (анаэробные воды) Черного моря накопительные культуры СРБ получали на четырех вариантах питательных сред. В первом варианте использовали стандартную среду Видделя для выделения морских форм СРБ, во втором варианте дополнительно в среду вносили раствор K2Cr2O7 (0,01 мкМ), в третьем – раствор MnSO4 (3 мкМ), в четвертом варианте лактат и бутират заменяли на этанол (10 мМ). 4.6.2. Подбор оптимальных условий для роста накопительных культур из аэробной водной толщи Черного моря. При подборе оптимальных условий для получения активно растущих накопительных культур из аэробной зоны Черного моря использовали дополнительные добавки. Неорганические вещества добавляли в стандартную питательную среду Видделя для выделения морских форм СРБ, состав которой описан выше, а органическими веществами заменяли лактат и бутират. Метан использовали в качестве газовой фазы над средой, остальные добавки вносили в среду из стоковых растворов, приведенных в таблице 5. 78 Таблица 5. Добавки, использованные при подборе оптимальных условий для роста накопительных культур СРБ из аэробной водной толщи Черного моря с глубин 30 и 70 м. Этанол Пропанол Концентрация в среде, мМ 10 5 Формиат 12 Ацетат 20 Пропионат 16 Валерианат 5 Каприлат 0,8 Пируват 10 Сукцинат 5 Фумарат 5 Бензоат 5 Глюкоза Фруктоза Тиосульфат натрия Нитрат натрия 5 5 1 М раствор этанола* 1 М раствор пропанола* 1 М раствор натриевой соли муравьиной кислоты* 2 М раствор натриевой соли уксусной кислоты* 2 М раствор натриевой соли пропионовой кислоты * 1 М раствор натриевой соли валериановой кислоты* 1 М раствор натриевой соли каприловой кислоты* 1 М раствор натриевой соли пировиноградной кислоты** 1 М раствор натриевой соли янтарной кислоты* 1 М раствор натриевой соли фумаровой кислоты* 1 М раствор натриевой соли бензойной кислоты* 0,5 М раствор глюкозы** 0,5 М раствор фруктозы** 12 1 М раствор Na2S2O3** 4 1 М раствор NaNO3* 0,01 М раствор CrCl3 × 6H2O в 20 мМ растворе лимонной кислоты** 0,1 М раствор KCr2O7 в 10 мМ растворе NaOH*** 0,01 М раствор Na2SeO3 × 5H2O в 10 мМ растворе NaOH*** 0,1 М раствор Na2MoO4 × 2H2O в 10 мМ растворе NaOH*** 0,1 М раствор KI в 10 мМ растворе NaOH*** Компонент Cr(III) 10-5 Cr(VI) 10-5 Se(IV) 10-5 Mo(VI) 10-4 Иодид калия 2 × 10-4 Стоковый раствор Примечание: * - растворы стерилизовали автоклавированием при 0,5 ати ** - растворы стерилизовали фильтрованием *** - растворы стерилизовали автоклавированием при 1 ати 79 4.6.3. Очистка накопительных культур СРБ с целью получения чистых культур. Для выделения чистых культур СРБ из накопительных использовали метод предельных разведений. Для этого готовили две колбы с жидкой средой Видделя, в одну из которых добавляли агар (до концентрации 1,5% вес/объем), среды стерилизовали автоклавированием при 1 ати. Агаризованную и жидкую среды кипятили и остужали до 50оС. В обе среды одновременно вносили необходимые добавки, как описано выше, после чего жидкую среду использовали для приготовления разведений посевного материала (до 10-9) в стерильных стеклянных пробирках. По 1 мл посевного материала из каждого разведения вносили в пустую стерильную пробирку, заливали агаризованной средой, закрывали резиновой пробкой и заматывали пленкой Parafilm («Pechiney Plastic Packaging Company», США). Через 7-14 сут выбирали пробирки, в которых были хорошо различимы отдельные колонии СРБ (обычно при разведении 10 -6-10-9). Пробирки аккуратно разбивали, агаризованный столбик переносили в стерильную чашку Петри, после чего наиболее характерные колонии (черного цвета с потемневшей вокруг них возможности освобождали средой) от стерильно агара и вырезали переносили в скальпелем, по предварительно подготовленные анаэробные пробирки Хангейта с жидкой средой Видделя. Через 7-14 сут оценивали рост культур по образованию сероводорода. Процедуру пересевов через агар повторяли несколько раз до получения предположительно чистой культуры (чистоту культуры оценивали визуально под микроскопом). После этого культуры отдавали в центр «Биоинженерия» РАН для проверки на чистоту путем секвенирования гена 16S рРНК. 4.6.4. Культивирование Desulfosporosinus sp. Культивирование выделенного в смешанную культуру Desulfosporosinus sp. проводили на среде Видделя для морских форм сульфатредуцирующих бактерий, описанной в подглаве 4.6.1, с добавлением K2Cr2O7 (0,01 мкМ) и раствора селенита/вольфрамата (NaOH – 0,5 г; Na2SeO3 × 5H2O – 3 мг; NaWO4 × 2H2O – 4 80 мг; дистиллированная вода до конечного объема 1 л; использовали 1 мл раствора на 1 л среды). Инкубацию проводили в течение 7-14 сут при 22-23оС. 4.6.5. Культивирование Desulfofrigus sp. Выделение чистой культуры Desulfofrigus sp. проводили на описанной выше питательной среде Видделя для морских форм сульфатредуцирующих бактерий с добавлением MnSO4 (0,2 мкМ). Дальнейшее культивирование Desulfofrigus sp. проводили на минеральном фоне среды Видделя с добавлением следующих компонентов: 1. Раствор микроэлементов (SL-10). Состав на 1 л: HCl (25%; 7,7 М) – 10 мл; FeCl2 × 4H2O – 1,5 г; ZnCl2 – 70 мг; MnCl2 × 4H2O – 100 мг; H3BO3 – 6 мг; CoCl2 × 6H2O – 190 мг; CuCl2 × 2H2O – 2 мг; NiCl2 × 6H2O – 24 мг; Na2MoO4 × 2H2O – 36 мг. Сначала навеску FeCl2 × 4H2O растворяли в соляной кислоте, затем добавляли и растворяли остальные соли, после чего дистиллированной водой доводили объем раствора до 1 л. Использовали 1 мл раствора SL-10 на 1 л среды. 2. Раствор селенита/вольфрамата: NaOH – 0,5 г; Na2SeO3 × 5H2O – 3 мг; NaWO4 × 2H2O – 4 мг; дистиллированная вода до конечного объема 1 л. Использовали 1 мл раствора на 1 л среды. 3. Раствор MnSO4: MnSO4 – 0,4 г; дистиллированная вода до 1 л. Использовали 1 мл раствора на 1 л среды. 4. Раствор витаминов по Вольфу (мг/л): биотин – 2; фолиевая кислота – 2; пиридоксина гидрохлорид – 10; тиамина гидрохлорид – 5; рибофлавин – 5; никотиновая кислота – 5; D-Ca-пантотенат – 5; витамин B12 – 0,1; парааминобензойная кислота – 5; липоевая кислота – 5; дистиллированная вода до конечного объема 1 л. Использовали 1 мл раствора на 1 л среды. 5. Лактат натрия – использовали 2 мл готового 50%-ного раствора лактата натрия («Merck», Германия) на 1 л среды. 6. Раствор Na2S – использовали 10 мл 5%-ного раствора сульфида натрия в 2%-ном растворе бикарбоната натрия на 1 л среды. 7. Дрожжевой экстракт – использовали 10 мл 5%-ного раствора дрожжевого 81 экстракта на 1 л среды. Среду для Desulfofrigus sp. стерилизовали автоклавированием при 1 ати, все добавки стерилизовали при 0,5 ати. Инкубацию проводили в течение 4-7 сут при 18–22оС либо в течение 10 сут при 4оС. 4.6.6. Изучение способности Desulfofrigus sp. использовать различные доноры/акцепторы электронов и сбраживать субстраты. Рост Desulfofrigus sp. с использованием различных доноров электронов оценивали на питательной среде, описанной выше, с сульфатом в качестве акцептора электронов, заменяя лактат на исследуемый субстрат. Все опыты осуществляли в трех повторностях. Использовали формиат (20 мМ), ацетат (10 мМ), бутират (5 мМ), пропионат (15 мМ), валерат (5 мМ), изовалерат (5 мМ), капрат (2 мМ), каприлат (3 мМ), сукцинат (10 мМ), фумарат (10 мМ), пальмитат (2 мМ), пируват (10 мМ), глутарат (10 мМ), метанол (10 мМ), этанол (10 мМ), пропанол (10 мМ), бутанол (10 мМ), глицин (10 мМ), аланин (10 мМ), серин (10 мМ), бетаин (10 мМ), L-пролин (10 мМ), D-сорбитол (5 мМ), D-маннитол (5 мМ), хлорид холина (10 мМ), H2/СО2 (80% : 20%) + ацетат (2 мМ), бензоат (5 мМ), глюкозу (5 мМ), фруктозу (5 мМ) и глицерин (10 мМ). Рост культур оценивали по образованию сероводорода. Возможность роста Desulfofrigus sp. с использованием различных акцепторов электронов тестировали на стандартной среде с лактатом, но с добавлением соответствующего акцептора электронов вместо сульфата: тиосульфата (10 мМ), сульфита (2 мМ), серы (2 мМ), цитрата железа (30 мМ), метагидроксида железа (4 мМ), хрома(III) (0,001 мМ) и нитрита натрия (10 мМ). Рост культур оценивали по увеличению оптической плотности при λ 575 нм. Для оценки роста на различных сбраживаемых субстратах (пируват, малат, лактат или фумарат в концентрации 10 мМ) в питательную среду не вносили акцептор электронов (сульфат), а также исключали из среды дрожжевой экстракт, как возможный источник акцепторов электронов. 82 Все используемые субстраты готовили в виде концентрированных растворов и стерилизовали автоклавированием при 0,5 ати. Перед посевом все вещества вносили в питательные среды анаэробно стерильными шприцами. 4.6.7. Определение оптимума рН для роста Desulfofrigus sp. Определение оптимума рН для роста Desulfofrigus sp. проводили на 18 вариантах среды Видделя (в 3-х повторностях), приготовленных на Na-фосфатном буферном растворе вместо воды. Готовили 0,2 М растворы Na2HPO4 × 12H2O и NaH2PO4 × 2H2O. Сочетанием разных объёмов этих растворов добивались различного значения рН питательной среды (от 4,5 до 9,5). Далее добавляли все перечисленные выше компоненты модифицированной среды Видделя для культивирования Desulfofrigus sp. Полученные среды точно подтитровывали концентрированными растворами NaOH или HCl до нужного значения рН, после чего продували инертным газом (в соответствии с модифицированной техникой Хангейта) и стерилизовали автоклавированием при 0,5 ати. 4.6.8. Кислородный стресс. В случае экспериментов с кислородными стрессами культуры Desulfofrigus sp. вначале культивировали на модифицированной питательной среде Видделя для морских СРБ (состав приведен выше): в анаэробную пробирку Хангейта с 9 мл жидкой среды Видделя вносили 1 мл посевного материала (оставшиеся 8 мл газовой фазы в пробирке Хангейта были заполнены бескислородным газом – азотом или аргоном), после чего культивировали в течение 1 сут до достижения ранней экспоненциальной фазы роста. Далее с помощью стерильных шприцев c мембранными фильтрами вносили в пробирки необходимое количество воздуха, перемешивали и продолжали культивирование. Для изучения влияния различных начальных концентраций кислорода в газовой фазе (от 0,5 до 13% О2 объем/объем) на рост культур Desulfofrigus sp. в анаэробные пробирки Хангейта объёмом 18 мл с 9 мл стерильной питательной среды Видделя (состав см. выше) и 9 мл газовой фазы (аргон) вносили 1 мл 83 посевного материала. Через 1 сут культивирования при 20оС, когда клетки СРБ достигали ранней экспоненциальной фазы роста, шприцами со стерильными мембранными фильтрами-насадками (диаметр пор – 0,22 мкм) вносили в пробирки воздух в необходимом объеме, предварительно стерильным шприцом откачав из пробирки соответствующий объем газовой фазы. В качестве контроля использовали культуру, растущую в строго анаэробных условиях. Далее через каждые сутки отбирали определенные объемы культуральной жидкости из пробирок Хангейта, фильтровали ее через мембранные фильтры (диаметр пор – 0,2 мкм), проводили окраску ДАФИ, после чего осуществляли подсчёт клеток на фильтрах в 25-30 полях зрения под эпифлуоресцентным микроскопом, как было описано выше (подглава 4.2.1.). Также в культурах измеряли содержание сероводорода в пробах по протоколу, описанному ниже (подглава 4.8.). 4.7. Световая и электронная микроскопия культур СРБ. Микроскопию препаратов «раздавленная капля» культуры Desulfofrigus sp. осуществляли на фазово-контрастном микроскопе Olympus BX41 («Olympus», Япония) при увеличении ×1000 с цифровой камерой Olympus С-7070 («Olympus», Япония) и компьютерным программным обеспечением Imagescope Lite («Системы для микроскопии и анализа», Россия). Микроскопию культур Desulfosporosinus sp. осуществляли на черных поликарбонатных мембранных фильтрах GTBP 2500 (диаметр 25 мм, размер пор 0,2 мкм) производства «Millipore» (США) при увеличении ×1000 на эпифлуоресцентном микроскопе Axio Imager.D1 («Carl Zeiss», Германия) с цифровой камерой Axio Cam HRc и компьютерным программным обеспечением Axio Vision. Исследование тонких структур клеток Desulfofrigus sp. проводили с помощью трансмиссионного электронного микроскопа JEM-100CX («Jeol», Япония). 84 4.8. Измерение содержания сероводорода в растущих культурах СРБ. Сероводород в растущих культурах сульфатредуцирующих бактерий определяли колориметрическим методом путем специального окрашивания проб из культур с последующим определением интенсивности окраски растворов на спектрофотометре [Trüper et al., 1964]. Колориметрический метод определения концентрации сероводорода и сульфидов основан на их способности в кислой среде образовывать с продуктами окисления N,N-диметил-п-фенилендиамина железоаммонийными квасцами продукты, имеющие синюю окраску, интенсивность которой пропорциональна содержанию в пробе сероводорода и сульфидов. Приготовление необходимых реактивов. 1. Раствор ацетата Zn: Zn(CH3COO)2 × 2H2O – 24 г; ледяная уксусная кислота – 1 мл. Уксусную кислоту доводили до концентрации 20%, добавляя 4 мл дистиллированной воды. Разбавленную уксусную кислоту по каплям добавляли к ацетату цинка. После этого доводили раствор дистиллированной водой до конечного объема 1000 мл. 2. Диаминовый реактив: N,N-диметил-1,4-фенилендиаммонийхлорид – 2 г; H2SO4 конц. – 200 мл; H2O дист. – 600 мл. Добавляли кислоту к воде, охлаждали смесь, после этого вносили парафенилендиамин. Раствор доводили дистиллированной водой до конечного объема 1000 мл. 3. Раствор трехвалентного железа (железоаммонийные квасцы): NH4Fe(SO4)2 × 12H2O – 10 г; H2SO4 конц. – 2 мл; H2O дист. – до конечного объема 100 мл. К квасцам добавляли по каплям H2SO4, затем большую часть H2O и проводили растворение при нагревании с перемешиванием. После охлаждения доводили водой до конечного объема. Все растворы хранили в хорошо закрытой темной посуде. Для непосредственного измерения количества образовавшегося 85 сероводорода в культуре шприцом на 1 мл отбирали из пробирки пробу (32 мкл) и помещали ее в пенициллиновый флакон с заранее подготовленным раствором ацетата цинка (625 мкл) для фиксации сероводорода. После этого в пробу добавляли 2,5 мл дистиллированной воды. В разбавленную пробу добавляли парафенилендиаминовый реактив (625 мкл) и сразу же раствор железоаммонийных квасцов (32 мкл). Пробу перемешивали и дожидались появления синей окраски в течение 2-3 мин. После этого добавляли в пробу еще 1,35 мл дистиллированной воды. Интенсивность окраски раствора измеряли на полуавтоматическом спектрофотометре Spekol 21 («Spekol», Германия) при λ 670 нм в кюветах с длиной оптического пути 1 см. Концентрацию сероводорода в мг/л определяли по калибровочной кривой с использованием Na2S (концентрации 1001000 мг/мл). 4.9. Определение скоростей сульфатредукции радиоизотопным методом. Измерение скоростей процесса сульфатредукции в пробах морской воды и культурах Desulfofrigus sp. проводили радиоизотопным методом с использованием 35 S-SO42- по методике, подробно описанной ранее [Пименов и др., 2000]. 4.9.1. Измерение скоростей сульфатредукции в пробах морской воды. Пробы воды отбирали в 30-мл стеклянные флаконы без воздушной фазы, закрывали пробками из бутилированной резины и обжимали колпачками. Субстрат (изотоп 35 алюминиевыми SO42-) вводили шприцом, прокалывая резиновую пробку (количество введенного субстрата – 0,1 или 0,2 мл), используя при этом компенсационную иглу. Инкубацию проб воды с меченым субстратом проводили в течение 2-3 сут при температуре 7-8оС и затем фиксировали 1 мл 2 н. NaOH. Конечная концентрация 35SO42- в пробе составляла 10 мкКи. Для предотвращения окисления образованных в процессе сульфатредукции восстановленных серных соединений перед внесением фиксатора в пробы добавляли по 0,2 мл 0,05 М Na2S. Количество образованного в процессе сульфатредукции измеряли на специальной установке для отгонки образованного 35 35 S-сульфида HS- [Pimenov а. 86 Bonch-Osmolovskaya, 2006]. Для этого в реакционную колбу объемом 300 мл наливали 100 мл водопроводной воды и продували аргоном или азотом (чистотой 99,99%) в течение 10 мин для удаления следов кислорода. Затем в колбу для отгонки добавляли фиксированную пробу и 0,1 мл 1%-ного водного раствора Na2S для полного выхода метки. В колбу через воронку по каплям добавляли 10 мл ортофосфорной кислоты (20 об.%), выделяющийся сероводород отгоняли при нагревании (до 50-60оС) в течение 1 ч в поглотительную смесь (β-фенилэтиламин : этанол : сцинтилляционная жидкость (Ultima Gold) в соотношении 1 : 2 : 7). По окончании отгонки жидкость из приемников сливали в сцинтилляционные пузырьки и измеряли радиоактивность на жидкостном сцинтилляционном счетчике. Формула для расчёта скорости микробной трансформации субстрата (35SO42-): I = (C × r) /(R × t), где I – скорость образования продукта (Н235S), C – исходная концентрация сульфат иона в пробе, r – радиоактивность образуемого продукта (в имп/мин), R – исходная радиоактивность вносимого субстрата (в имп/мин), t – время инкубации образца с 35S-сульфатом. 4.9.2. Измерение скоростей сульфатредукции при росте культуры Desulfofrigus sp. на средах с различным содержанием кислорода в газовой фазе. Для изучения влияния различных начальных концентраций кислорода в газовой фазе (2,6%, 5,2% и 13% объем/объем) на скорость сульфатредукции культуры Desulfofrigus sp. в анаэробные пробирки Хангейта объёмом 18 мл с 9 мл стерильной питательной среды Видделя (состав см. выше) и 9 мл газовой фазы (аргон) вносили 1 мл посевного материала. Через 1 сут культивирования при 20оС, когда клетки СРБ достигали ранней экспоненциальной фазы роста, шприцами со стерильными мембранными фильтрами-насадками (диаметр пор – 0,22 мкм) вносили в пробирки необходимый объем воздуха, предварительно стерильным шприцом откачав из пробирки соответствующий объем газовой фазы. После этого 87 вносили радиоактивную метку (0,1 мл дегазированного водного раствора 35SO42- в виде натриевой соли, конечная концентрация 10 мкКи в пробе). Эксперименты проводили в трех повторностях. Через 2 сут инкубации культуры Desulfofrigus sp. с меченым сульфатом пробы фиксировали 1 мл 2 н. NaOH и проводили измерение скорости сульфатредукции, как было описано выше. 4.10. Определение жирных кислот в клетке. Для определения жирных кислот в клетке культуры Desulfofrigus euxinos штамм SrB-30 и Desulfofrigus fragile (DSM 12345) культивировали до окончания экспоненциальной фазы роста и отправляли в DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Брауншвейг, Германия). Жирные кислоты экстрагировали по методу Миллера (1982), модифицированному Кюкендалем (1988), и определяли методом газовой хроматографии используя систему идентификации микроорганизмов (MIDI, Sherlock Version 6.1; база данных, TSBA40; газовый хроматограф, model 6890N, «Agilent Technology», США). 88 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ. ГЛАВА 5. СООБЩЕСТВА СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ В ПОДПОВЕРХНОСТНЫХ КИСЛОРОД-СОДЕРЖАЩИХ ВОДАХ ЧЕРНОГО МОРЯ. Черное море, как уникальный, постоянно стратифицированный водоем, в котором на глубине обитают преимущественно прокариотические организмы, является объектом исследования микробиологов уже несколько десятилетий. Особый интерес при исследовании Черного моря представляет зона хемоклина (граница разделения подповерхностных кислород-содержащих и глубинных бескислородных вод), где развитие микробных сообществ определяется потоками окисленных и восстановленных биогенных элементов, газов и металлов с переменной валентностью. Было показано, что в подповерхностных кислородсодержащих водах Черного моря величины потребления органических соединений гораздо выше, чем в глубинной анаэробной водной толще, а пики их концентраций совпадают с зонами повышенных микробных активностей, особенно в районе хемоклина [Mopper a. Kieber, 1991; Pimenov et al., 2000]. Непосредственно в зоне хемоклина наблюдается как возрастание численности клеток многих групп микроорганизмов [Vetriani et al., 2003; Lin et al., 2006], так и значительные величины активностей различных микробных процессов – темновой CO2-ассимиляции, окисления метана, сульфатредукции и т.д. [Пименов и др., 2000; Pimenov a. Neretin, 2006]. 5.1. Содержание кислорода, сероводорода и интенсивность сульфатредукции в верхней водной толще Черного моря. На рисунке 11 представлены профили распределения О2, H2S, а также скорости сульфатредукции в верхней водной толще континентального склона Черного моря (станция c координатами 44о.458N, 37o.882Е, максимальная глубина 1300 м). Максимальная концентрация О2 наблюдалась на глубине около 30 м и составляла 300 мкМ. Ниже этой глубины содержание кислорода в воде 89 постепенно снижалось до 200 мкМ (на глубине 80 м), а затем происходило резкое уменьшение его концентрации до 70 мкМ на глубине 100 м, что характерно для верхней части зоны хемоклина (рис. 11а). С дальнейшим увеличением глубины концентрация кислорода продолжала снижаться, и ниже 160 м он уже не обнаруживался методом Винклера. Первые следы присутствия сероводорода появлялись на глубине 153 м (1,2 мкМ), соответствующей нижней границе хемоклина (концентрация кислорода на данной глубине по нашим данным составляла 2,96 мкМ – предел чувствительности измерений по методу Винклера). С увеличением глубины наблюдалось увеличение содержания сероводорода, и на глубине 191 м его концентрация равнялась11,82 мкМ (рис. 11а). Аналогично предыдущим исследованиям [Пименов и др., 2000] в анаэробных водах на глубинах 190-400 м мы наблюдали повышенные скорости сульфатредукции, составлявшие около 0,8 мкмоль/(л × сут) (рис. 11в). Однако отдельные максимумы скоростей сульфатредукции были обнаружены нами не только в верней части хемоклина на глубине 150 м (1,06 мкмоль/(л × сут)), где концентрация растворенного O2 низка, но также и в аэробной зоне на глубине 100110 м (0,76-1,01 мкмоль/(л × сут)) и даже в подповерхностном слое воды (рис. 11б). В связи с обнаружением процесса сульфидогенеза в аэробных водах и зоне хемоклина нами было сделано предположение о присутствии на данных горизонтах метаболически активных сульфатредуцирующих бактерий. Для исследования на количественном и качественном уровнях структуры сообществ СРБ был применен комплекс молекулярно-биологических и традиционных микробиологических методов, включавший в себя флуоресцентную in situ гибридизацию (FISH), полимеразную цепную реакцию (прямую, вложенную, количественную в реальном времени) и денатурирующий градиентный гельэлектрофорез (ДГГЭ) реамплифицированных с из последующим отдельных секвенированием ДГГЭ-полос, а участков также накопительных и чистых культур сульфатредуцирующих бактерий. генов, получение 90 Рис. 11. Содержание кислорода, сероводорода и скорость сульфатредукции в водной толще глубоководной зоны Черного моря в районе г. Геленджик (44 о.458N, 37o.882Е, глубина 1300 м): а – содержание кислорода (1) и сероводорода (2) в подповерхностной водной толще; б – профиль скорости сульфатредукции (ССР) в подповерхностной водной толще (0-200 м); в – полный профиль ССР до глубины 1280 м [Брюханов и др., 2011]. 91 5.2. Исследование сообществ СРБ в верхних водных горизонтах Черного моря методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH). Метод флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) широко применяется для исследования филогенетической структуры сообществ сульфатредуцирующих бактерий, как в природных, так и в антропогенных местообитаниях, в том числе и в меромиктических водоемах [Durisch-Kaiser et al., 2005; Lin et al., 2006; Lentini et al., 2012; Kubo et al., 2014]. Метод FISH позволяет не только определить филогенетическую принадлежность целевых микроорганизмов, но и оценить их численность, а также морфологию клеток. Кроме того, поскольку олигонуклеотидные зонды связываются непосредственно с рибосомальной РНК, предполагается, что с помощью данного метода выявляются преимущественно метаболически активные клетки. 5.2.1. Общая численность прокариот, бактерий и архей в подповерхностных водах Черного моря, определенная с помощью FISH. Большинство прокариотических клеток, обнаруженных в аэробной зоне на глубине 30 м, относились к бактериям (гибридизация с зондами EUB338 + EUB338 II), их доля составляла примерно 75% от общего количества клеток, окрашенных флуоресцентным ДНК-специфичным красителем 4’,6-диамидино-2фенилиндолом (ДАФИ). Численность архей (зонды ARCH915 + ARCH344) в подповерхностных водах Черного моря не превышала 11% от общей численности микроорганизмов (рис. 12). На малых глубинах преобладали (около 90%) прокариотические клетки кокковидной формы или короткие палочки, нитевидные формы обнаружены не были. В пробах воды из зоны хемоклина (глубина 150 м) количество бактериальных клеток, среди которых по-прежнему преобладали кокковидные формы, снижалось с 75% до 40% от общей численности микроорганизмов (составлявшей 1,06 × 106 кл./мл, окраска ДАФИ – рис. 12), хотя по сравнению с аэробными водами отмечалось появление палочковидных форм, часто формирующих напоминающие нити цепочки. Причем с увеличением глубины в 92 Рис. 12. Общая численность клеток прокариот, определенная окрашиванием ДАФИ, и доля представителей доменов Bacteria и Archaea, определенная методом FISH, в водной толще континентального склона Черного моря. зоне хемоклина и глубже неё количество палочковидных форм бактерий постепенно увеличивалось до 30% и более. В пробах из зоны хемоклина, отобранных не летом, а зимой, также наблюдалось увеличение (на 27%) общей численности микроорганизмов (составлявшей 1,06 × 106 кл./мл, окраска ДАФИ) по сравнению с пробами из аэробной зоны. На глубине 600 м (бескислородная водная толща) на исследованных станциях, как в летний, так и в зимний период, наблюдалось снижение общей численности микроорганизмов по сравнению с зоной хемоклина (2,58 × 10 5 и 1,76 × 105 кл./мл для летних и зимних проб, соответственно). Данные, полученные с применением универсальных зондов на бактерий и архей, свидетельствовали о присутствии активных микроорганизмов (до 105 кл./мл) в глубинных водах Черного моря, хотя с увеличением глубины доля клеток, детектируемых зондами EUB338 + EUB338 II и ARCH344 + ARCH915, существенно падала (до 34-45%) 93 относительно окрашенных ДАФИ (рис. 12). При этом большую часть всех метаболически активных прокариотических клеток составляли бактерии (34% от всех клеток, окрашенных ДАФИ), а доля архей была незначительна (1,5% от всех клеток, окрашенных ДАФИ). 5.2.2. Филогенетический состав сообществ сульфатредуцирующих бактерий подповерхностной водной толщи Черного моря, определенный с помощью FISH. На глубине 30 м в аэробной зоне континентального склона Черного моря (содержание O2 – 300 мкМ) в летних пробах было обнаружено большое количество клеток СРБ родов Desulfotomaculum (22,8% от общей численности микроорганизмов, которая составляла 8,82 × 105 кл./мл по окраске ДАФИ) и Desulfovibrio (36%), а также около 5% Desulfobacter spp. (табл. 6). Представители тех же родов СРБ были обнаружены на аналогичной глубине и в центральной части Черного моря в зимних пробах, однако их относительное количество было меньше. Так, численность представителей рода Desulfotomaculum составляла 4,4% от общего количества микроорганизмов (составлявшего 5,6 × 105 кл./мл по окраске ДАФИ), а родов Desulfovibrio и Desulfobacter 12 и 2,5% соответственно (табл. 7). На бóльших глубинах активные клетки Desulfotomaculum spp. практически не обнаруживались (FISH-зонд Dtm229). В зоне хемоклина доминирующей филогенетической подгруппой СРБ, выявляемой в летних пробах с помощью FISH-зондов, являлись представители рода Desulfomicrobium, доля которых составляла от 9,3% до 13,4% от общей численности микроорганизмов (табл. 6). Клетки Desulfomicrobium spp. преобладали среди исследованных групп СРБ и на глубине 115 м (содержание O2 – 3 мкМ) в центральной глубоководной части Черного моря в зимнее время года – 2,75% от общей численности микроорганизмов, составлявшей 7,15 × 105 кл./мл (табл. 7). В кислород-содержащих подповерхностных водах, а также в бескислородных глубинных водах (как в летних, так и в зимних пробах) клетки Desulfomicrobium spp. практически не обнаруживались. 94 На глубине 157,5 м в водной толще континентального склона Черного моря, где уже появлялись следы сероводорода, также были выявлены СРБ рода Desulfomicrobium в количестве 9% от общей численности микроорганизмов, составлявшей 7,11 × 105 кл./мл. Кроме того, на этой глубине были детектированы представители рода Desulfovibrio (FISH-зонд DSV1292) в количестве 2,7% от общей численности микроорганизмов, тогда как зонд DSV698 (специфичный к 16S рРНК 14 видов рода Desulfovibrio) присутствия СРБ не выявлял (табл. 6). По всей видимости, это связано с большей универсальностью FISH-зонда DSV1292. В зимних пробах из центральной части Черного моря с глубины 120 м (соответствующей по гидрохимическим характеристикам глубине 157,5 м на континентальном склоне) представители рода Desulfomicrobium практически не детектировались. Однако также как и в летних пробах, наблюдалось появление сульфатредуцирующих бактерий рода Desulfovibrio различной морфологии (в количестве 2% от общей численности микроорганизмов, составлявшей 4,80 × 105 кл./мл) – табл. 7. Зонд DSV698 присутствия СРБ рода Desulfovibrio не выявлял. Зонд DSB985, специфичный к СРБ родов Desulfobacter, Desulfobacula, Desulfospira и Desulfotignum, положительного гибридизационного сигнала в зоне хемоклина практически не давал, как в летних, так и в зимних пробах. На глубине 600 м в летних и зимних водных пробах наблюдали только сигналы для зондов, специфичных к 16S рРНК СРБ родов Desulfomicrobium и Desulfovibrio (DSV214 и DSV1292 соответственно). 95 Таблица 6. Распределение сульфатредуцирующих бактерий в водной толще континентального склона Черного моря в июле 2008 г., определенное с помощью FISH. Количество клеток в 1 мл пробы Зонд 30 м, аэробная зона 150 м, зона хемоклина 157,5 м, зона хемоклина 167,5 м, анаэробная зона 210 м, анаэробная зона 600 м, анаэробна я зона ДАФИ 8,82 × 105 1,06 × 106 7,11 × 105 1,23 × 106 1,60 × 106 2,58 × 105 6,60 × 105 (74,8%) 4,24 × 105 (40,0%) 2,72 × 105 (38,2%) 5,62 × 105 (45,7%) 5,49 × 105 (34,3%) 8,80 × 104 (34,1%) 1,02 × 105 (11,6%) 4,77 × 105 (45,0%) 3,35 × 105 (47,1%) 4,47 × 105 (36,3%) 4,43 × 104 (2,8%) 3,87 × 103 (1,5%) 4,40 × 104 (5%) н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. 1,42 × 105 (13,4%) 6,60 × 104 (9,3%) н.о. 4,04 × 103 (0,25%) 2,40 × 103 (0,9%) 1,95 × 105 (22,1%) н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. 1,23 × 105 (13,9%) 4,10 × 104 (3,9%) 1,91 × 104 (2,7%) 2,58 × 104 (2,1%) 4,01 × 103 (0,25%) 3,3 × 103 (1,3%) 2,01 × 105 (22,8%) н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. EUB338 + EUB338 II Большинство Bacteria ARCH344 + ARCH915 Большинство Archaea DSB129 Большинство Desulfobacter spp. DSV214 Большинство Desulfomicrobium spp. DSV698 Некоторые Desulfovibrio spp., Bilophila wadsworthia, Lawsonia intracellularis DSV1292 Некоторые Desulfovibrio spp., Bilophila wadsworthia Dtm229 Desulfotomaculum spp. (кластер I), другие Firmicutes Примечания: 1) н.о. – практически не обнаружены или единичные клетки; 2) процентное соотношение для всех групп микроорганизмов приводится относительно общего количества клеток микроорганизмов, окрашенных ДАФИ. 96 Таблица 7. Распределение сульфатредуцирующих бактерий в водной толще центральной части Черного моря в марте 2009 г., определенное с помощью FISH. Количество клеток в 1 мл пробы Зонд 30 м, аэробная зона 115 м, зона хемоклина 120 м, зона хемоклина 200 м, анаэробная зона 600 м, анаэробная зона ДАФИ 5,62 × 105 7,15 × 105 4,80 × 105 5,00 × 105 1,76 × 105 DSB129 Большинство Desulfobacter spp. DSV214 Большинство Desulfomicrobium spp. DSV698 Некоторые Desulfovibrio spp., Bilophila wadsworthia, Lawsonia intracellularis DSV1292 Некоторые Desulfovibrio spp., Bilophila wadsworthia Dtm229 Desulfotomaculum spp. (кластер I), другие Firmicutes 1,40 × 104 (2,5%) н.о. н.о. н.о. н.о. н.о. 1,97 × 104 (2,75%) 1,23 × 103 (0,25%) 1,23 × 103 (0,25%) 1,63 × 103 (0,93%) 2,81 × 104 (5%) н.о. н.о. н.о. н.о. 3,93 × 104 (7%) н.о. 9,60 × 103 (2%) н.о. 6,56 × 103 (3,73%) 2,46 × 104 (4,38%) н.о. н.о. н.о. н.о. Примечания: 1) н.о. – практически не обнаружены или единичные клетки; 2) процентное соотношение для всех СРБ приводится относительно общего количества клеток микроорганизмов, окрашенных ДАФИ. 5.3. Обнаружение сульфатредуцирующих бактерий в пробах воды из подповерхностной водной толщи Черного моря с помощью ПЦР-анализа генов 16S рРНК и dsrB. Методом FISH было показано присутствие в подповерхностной кислородсодержащей водной толще Черного моря метаболически активных клеток СРБ. 97 Для подтверждения этих результатов нами было проведено исследование филогенетического состава сообществ СРБ на разных глубинах подповерхностных вод Черного моря с помощью более чувствительного и достоверного метода – полимеразной цепной реакции (ПЦР). Известно, что сульфатредуцирующие бактерии в водной толще морей могут обитать в различных взвешенных частицах, быть симбионтами морских беспозвоночных (таких, как копеподы и диатомовые водоросли) и находиться в пеллетном материале [Shanks a. Reeder, 1993]. Поскольку нас интересовало обнаружение СРБ, которые в аэробных водах и в зоне хемоклина Черного моря потенциально могут подвергаться воздействию кислорода и находиться либо в свободноживущем состоянии и слизи, либо внутри взвешенных органических частиц, мы применяли двухстадийную фильтрацию отобранных водных проб. На первой стадии водные пробы пропускали через крупнопористые стекловолоконные фильтры GF/C, задерживающие частицы размером ≥1,2 мкм, после чего фильтрат пропускали через мембранные фильтры с размером пор 0,22 мкм (см. раздел 4.3). Размеры копепод, их пеллетного материала и панцирей диатомовых водорослей обычно существенно превышают 1,2 мкм [De Troch et al., 2010; Shek a. Liu, 2010]. Таким образом, мы предполагали, что крупная взвесь, которая могла содержать в себе клетки СРБ, оседала преимущественно на фильтрах GF/C, а на бактериальных фильтрах концентрировались более мелкие частицы взвеси, легкораспадающиеся агрегаты, слизь и свободноживущие клетки микроорганизмов. Основное внимание в работе уделялось изучению филогенетического разнообразия сульфатредуцирующих бактерий во фракции клеток, оставшихся в пробах после фильтрации через крупнопористые фильтры, однако также был проведен ПЦР-анализ сообществ СРБ, ассоциированных с крупной взвесью. 5.3.1. Сообщества свободноживущих и ассоциированных с мелкой (≤1,2 мкм) взвесью сульфатредуцирующих бактерий. ПЦР-анализ тотальной ДНК с праймерами, специфичными к гену dsrB 98 (кодирующему β-субъединицу диссимиляционной сульфитредуктазы – ключевого фермента метаболизма сульфатредуцирующих микроорганизмов), показал присутствие генетического материала СРБ на всех исследованных глубинах – от 30 до 200 м. Методом прямой ПЦР с праймерами, специфичными к гену 16S рРНК шести основных филогенетических подгрупп сульфатредукторов, было выявлено присутствие на всех указанных выше глубинах (за исключением 145 м) соответствующих фрагментов ДНК представителей подгруппы DesulfococcusDesulfonema-Desulfosarcina, а также подгруппы Desulfovibrio-Desulfomicrobium. Фрагменты 16S рДНК остальных четырех подгрупп СРБ методом прямой ПЦР обнаружены не были. Непонятным оказалось отсутствие участков гена 16S рРНК представителей подгрупп Desulfotomaculum и Desulfobacter, поскольку с помощью метода FISH, позволяющего выявлять метаболически активные клетки микроорганизмов, нами было показано присутствие представителей данных родов в аэробных водах Черного моря, а значит, их ДНК в любом случае должна была присутствовать в водных пробах с соответствующих глубин. Для повышения чувствительности метода ПЦР мы воспользовались так называемой вложенной ПЦР (nested PCR) [Daly et al., 2000]. В случае вложенной ПЦР в качестве матрицы для проведения реакции используется не тотальная ДНК, а заранее амплифицированный участок ДНК, специфичный для более крупной таксономической группы, чем та, которую необходимо обнаружить. В нашем случае была проведена амплификация целого гена 16S рРНК домена Bacteria (пара праймеров pA-pH’ [Edwards et al., 1989]) для всех водных проб, после чего на полученных матрицах проводились стандартные ПЦР с парами праймеров, каждая из которых была специфична к 16S рРНК одной из шести основных филогенетических подгрупп СРБ. С использованием вложенной ПЦР было подтверждено присутствие участков гена 16S рРНК представителей подгруппы Desulfococcus-DesulfonemaDesulfosarcina на всех исследованных глубинах верхней водной толщи Черного моря, а также показано присутствие генетического материала Desulfotomaculum 99 Таблица 8. Результаты анализа филогенетического разнообразия свободноживущих и ассоциированных с мелкой взвесью сульфатредуцирующих бактерий в верхней водной толще Черного моря с использованием прямой и вложенной ПЦР. Специфичность ПЦРпраймеров Тип ПЦР Ген dsrB Ген 16S рРНК Desulfotomaculum (1-я подгруппа СРБ) Ген 16S рРНК Desulfobulbus (2-я подгруппа СРБ) Ген 16S рРНК Desulfobacterium (3-я подгруппа СРБ) Ген 16S рРНК Desulfobacter (4-я подгруппа СРБ) Ген 16S рРНК DesulfococcusDesulfonemaDesulfosarcina (5-я подгруппа СРБ) Глубина, м 30 100 145 165 180 200 Прямая ПЦР + + + + + + Прямая ПЦР - - - - - - Вложенная ПЦР + + + - + + Прямая ПЦР - - - - - - Вложенная ПЦР - - - - - - Прямая ПЦР - - - - - - Вложенная ПЦР - - - - - - Прямая ПЦР - - - - - - Вложенная ПЦР + - - - - + Прямая ПЦР + + + + + + Вложенная ПЦР + + + + + + Прямая ПЦР + + + + + Ген 16S рРНК DesulfovibrioDesulfomicrobium Вложенная ПЦР + + + + + + (6-я подгруппа СРБ) Примечание: 30 м и 100 м – аэробные воды; 145, 165 и 180 м – зона хемоклина; 200 м – анаэробные воды. Серым цветом отмечены различия между результатами прямой и вложенной ПЦР. spp. на всех глубинах (за исключением 165 м), и Desulfobacter spp. в подповерхностных аэробных (глубина 30 м) и анаэробных (глубина 200 м) водах (табл. 8). Ген 16S рРНК подгруппы Desulfovibrio-Desulfomicrobium с помощью вложенной ПЦР был обнаружен на всех глубинах, включая 145 м, где прямая ПЦР давала отрицательный результат. Гены 16S рРНК представителей 2-й и 3-й подгрупп СРБ (Desulfobulbus и Desulfobacterium соответственно) не были обнаружены ни на одном из исследованных горизонтов верхней водной толщи 100 Черного моря (табл. 8). Считается, что филогенетические группы, детектируемые как прямой, так и вложенной ПЦР, являются доминирующими в изучаемом сообществе [Daly et al., 2000; Dar et al., 2005]. Поскольку, как известно из литературных данных [Daly et al., 2000; Dar et al., 2005], а также показано в нашем исследовании, вложенная ПЦР является более чувствительным методом, то при изучении сообществ СРБ, ассоциированных с крупной взвесью Черного моря, а также сообществ СРБ водной толщи Гданьской впадины Балтийского моря, нами применялась только данная модификация метода (для ПЦР с праймерами на шесть основных филогенетических подгрупп СРБ). 5.3.2. Сообщества сульфатредуцирующих бактерий, ассоциированных с крупной (≥1,2 мкм) взвесью. Прямой ПЦР с праймерами, специфичными к гену dsrB, в пробах ДНК, выделенной из крупнопористых фильтров GF/C (то есть принадлежащей микроорганизмам, ассоциированным с крупными органическими частицами взвеси), было показано присутствие генетического материала СРБ на всех исследованных глубинах верхней водной толщи Черного моря. Вложенной ПЦР с праймерами на шесть основных филогенетических подгрупп СРБ было показано наличие участков генов 16S рРНК ассоциированных с крупной взвесью представителей подгрупп Desulfobacter, DesulfococcusDesulfonema-Desulfosarcina и Desulfovibrio-Desulfomicrobium на всех исследуемых глубинах верхней водной толщи Черного моря. Ген 16S рРНК Desulfotomaculum spp. обнаруживали во всех трех гидрохимически различающихся зонах, но не на всех глубинах, а только в пробах воды с 30, 145, 180 и 200 м. Гены 16S рРНК представителей 2-й и 3-й подгрупп СРБ (Desulfobulbus и Desulfobacterium соответственно) обнаружены не были. 101 Таблица 9. Результаты анализа филогенетического разнообразия ассоциированных с крупной взвесью сульфатредуцирующих бактерий в верхней водной толще Черного моря с использованием вложенной ПЦР. Специфичность ПЦР-праймеров Глубина, м 30 100 145 165 180 200 Ген dsrB + + + + + + Ген 16S рРНК Desulfotomaculum (1-я подгруппа СРБ) + - + - + + Ген 16S рРНК Desulfobulbus (2-я подгруппа СРБ) - - - - - - Ген 16S рРНК Desulfobacterium (3-я подгруппа СРБ) - - - - - - Ген 16S рРНК Desulfobacter (4-я подгруппа СРБ) + + + + + + Ген 16S рРНК DesulfococcusDesulfonema-Desulfosarcina (5-я подгруппа СРБ) + + + + + + Ген 16S рРНК Desulfovibrio+ + + + + + Desulfomicrobium (6-я подгруппа СРБ) Примечание: 30 м и 100 м – аэробные воды; 145, 165 и 180 м – зона хемоклина; 200 м – анаэробные воды. 5.3.3. Численность СРБ в подповерхностной водной толще Черного моря, определенная методом количественной ПЦР. По результатам анализа сообществ микроорганизмов Черного моря методом количественной ПЦР доля СРБ от всех микроорганизмов составляла от 0,065% в аэробной водной толще до 9% в верхней части анаэробных вод (таблица 10). Доля СРБ постепенно увеличивалась с глубиной с локальным пиком (0,78%) в зоне хемоклина на глубине 150 м. Абсолютная численность СРБ составляла 0,17-15,66 × 103 кл./мл, постепенно увеличиваясь от поверхности к анаэробным водам. Однако на глубине 110 м численность СРБ была практически равна таковой в подповерхностных водах (0,18 × 103 кл./мл). Это объясняется тем, что на глубине 110 м находится холодный промежуточный слой (ХПС), характеризующийся понижением общего 102 числа клеток. Таблица 10. Численность сульфатредуцирующих бактерий в верхней водной толще Черного моря, определенная методом количественной ПЦР. Численность % СРБ от всех СРБ, кл./мл микроорганизмов 30 0,17 × 103 0,065 50 0,413 × 103 0,125 110 0,182 × 103 0,13 150 0,585 × 103 0,78 170 1 × 103 0,48 200 15,66 × 103 9 Глубина, м 5.4. ДГГЭ-анализ по гену dsrB сообществ СРБ подповерхностной водной толщи Черного моря. По гену dsrB были получены ДГГЭ-профили сообществ СРБ верхней водной толщи Черного моря с шести исследуемых глубин (30, 100, 145, 165, 180 и 200 м). В полученных профилях наблюдались различия в количестве и интенсивности полос между тремя гидрохимически различными зонами – аэробной, хемоклином и анаэробной (рис. 13). В профилях из аэробных вод насчитывалось 6 и 7 полос (глубины 30 и 100 м соответственно), во всех трех профилях из зоны хемоклина насчитывалось по 5 полос, а общая интенсивность сигнала была меньше, чем в пробах из аэробной водной толщи. Наибольшее количество (8) и интенсивность полос наблюдались в пробе из верхней части анаэробной водной толщи, с глубины 200 м. 103 Рис. 13. ДГГЭ-профили по гену dsrB сообществ СРБ в подповерхностной водной толще Черного моря. Большими цифрами обозначены глубины: 1 – 30 м; 2 – 100 м; 3 – 145 м; 4 – 165 м; 5 – 180 м; 6 – 200 м. Маленькими цифрами обозначены порядковые номера полос, из которых участки гена dsrB были вырезаны, реамплифицированы и секвенированы. 5.5. Секвенирование и филогенетический анализ последовательностей участков гена dsrB, выделенных и реамплифицированных из отдельных ДГГЭ-полос. Всего были определены 32 нуклеотидные последовательности участков гена dsrB, которые были выверены и депонированы в GenBank (номера 104 последовательностей приведены в табл. Согласно 11). сравнению транслированных последовательностей, кодируемых геном dsrB, СРБ из верхней водной толщи Черного моря были представлены 5 отдельными кластерами (рис. 14). Большая часть кодируемых геном dsrB аминокислотных последовательностей со всех глубин подповерхностной водной толщи Черного моря формировала отдельный кластер на филогенетической дендрограмме, для которого в базе данных GenBank не было обнаружено аналогичных последовательностей (с гомологией 87% и выше) ни среди описанных видов СРБ, ни среди некультивируемых СРБ из разных местообитаний. Наиболее близкой к этому кластеру (с гомологией 85%) оказалась некультивируемая СРБ из покмарка Норвежского моря [Lazar et al., 2011]. Анализ транслированных нуклеотидных последовательностей участков гена dsrB показал, что СРБ на глубине 30 м были достаточно разнообразными и наиболее сходными с некультивируемыми СРБ из различных морских местообитаний: глубоководных донных осадков [Kaneko et al., 2007], покмарков Норвежского моря [Lazar et al., 2011], а также с коррозионно-активными СРБ у Атлантического побережья Франции (неопубликованные данные); наиболее близкими по последовательностям гена dsrB культивируемыми СРБ оказались Desulfobacula toluolica и Desulfonema limicola, но сходство с ними было довольно низким (менее 90%). Транслированные последовательности участков гена dsrB с глубины 100 м, на которой располагается ХПС, оказались наиболее сходными с соответствующими последовательностями некультивируемых СРБ глубоководных донных осадков разлома Нанкай [Kaneko et al., 2007], покмарков Норвежского моря [Lazar et al., 2011], осадков окраины континентального шельфа штата Вашингтон, США [Liu et al., 2003] и некультивируемых Desulfobulbus spp. [Oakley et al., 2012]. Некультивируемые представители рода Desulfobulbus, участки гена dsrB которых были обнаружены только в холодном промежуточном слое (100 м) и зоне хемоклина (145-185 м), могут участвовать в процессе анаэробного окисления метана в бескислородной водной толще [Lösekann et al., 2007]. 105 Согласно сравнению транслированных нуклеотидных последовательностей участков гена dsrB сообщество черноморских СРБ с глубины 145 м (верхняя зона хемоклина) были практически аналогичны сообществу СРБ вышележащего слоя (100 м); а СРБ с глубин 165 м (хемоклин) и 185 м (нижняя зона хемоклина) имели наибольшую гомологию с некультивируемыми Desulfobulbus spp. и СРБ из покмарков Норвежского моря [Lazar et al., 2011]. Транслированные последовательности участков гена dsrB из верхней анаэробной водной толщи Черного моря (глубина 200 м) также были наиболее сходны с соответствующими последовательностями некультивируемых СРБ из глубоководных донных осадков разлома Нанкай [Kaneko et al., 2007], покмарков Норвежского моря [Lazar et al., 2011], осадков окраины континентального шельфа штата Вашингтон, США [Liu et al., 2003] и мест биокоррозии стальных конструкций на Атлантическом побережье Франции (неопубликованные данные), предположительно принадлежащих к семейству Desulfobacteraceae, в частности, филогенетически близких к Desulfobacula toluolica. 106 Таблица 11. Распределение СРБ в подповерхностной водной толще Черного моря в соответствии с секвенированными нуклеотидными последовательностями участков гена dsrB, выделенных и реамплифицированных из отдельных ДГГЭ-полос. Глубина, м Номер полосы на ДГГЭпрофиле Номер последовательности, депонированной в GenBank Максимальная гомология % гомологии Некультивируемые СРБ глубоководных донных осадков Нанкайского желоба 93 Desulfobacula toluolica Некультивируемые СРБ покмарков Норвежского моря 30 1-6 Некультивируемые коррозионно-активные СРБ Атлантического побережья Франции (предположительно, принадлежащие к семейству Desulfobacteraceae) Некультивируемые СРБ глубоководных донных осадков Нанкайского желоба 7-8, 10-13 15-18 JX181950-JX181955 JX181956-JX181959 Некультивируемые Desulfobulbus spp. Некультивируемые СРБ покмарков Норвежского моря Некультивируемые СРБ донных осадков окраины континентального шельфа около побережья штата Вашингтон, США 165 185 19-22 24-27 JX181960-JX181963 JX181964-JX181967 Некультивируемые Desulfobulbus spp. Некультивируемые СРБ покмарков Норвежского моря Некультивируемые СРБ глубоководных донных осадков Нанкайского желоба 200 29-34, 36-37 85 JX181944-JX181949 Desulfonema limicola 100 145 85 JX181968-JX181975 85 84 92-93 86-87 85 85 86-87 85 92-93 Desulfobacula toluolica 85 Некультивируемые СРБ покмарков Норвежского моря 85 Некультивируемые СРБ донных осадков окраины континентального шельфа около побережья штата Вашингтон, США 85 Некультивируемые коррозионно-активные СРБ Атлантического побережья Франции (предположительно, принадлежащие к семейству Desulfobacteraceae) 85 107 0.10 89 79 Uncultured sulfate-reducing bacteria Desulfobacteraceae 100 145 meters DGGE band 15 (JX181956) 165 meters DGGE band 21 (JX181962) 165 meters DGGE band 20 (JX181961) 100 meters DGGE band 8 (JX181951) uncultured sulfate-reducing bacterium (JF906965) 94 uncultured sulfate-reducing bacterium (AY337212) 145 meters DGGE band 18 (JX181959) 70 97 100 meters DGGE band 12 (JX181954) 200 meters DGGE band 36 (JX181974) uncultured sulfate-reducing bacterium (AB263143) 78 200 meters DGGE band 37 (JX181975) 100 meters DGGE band 13 (JX181955) 30 meters DGGE band 6 (JX181949) Desulfofaba fastidiosa (AY268892) 68 Desulfonema limicola (AY626031) uncultured sulfate-reducing bacterium (EF065000) 82 Desulfobacula toluolica (CAD29755) Desulfobacter halotolerans (AF388256) uncultured bacterium (FR689676) 82 99 200 meters DGGE band 31 (JX181970) 30 meters DGGE band 2 (JX181945) Olavius ilvae endosymbiont (DQ058672) Рис. 14. Филогенетическая дендрограмма СРБ из подповерхностной водной толщи континентального склона Черного моря, построенная на основе сравнительного анализа аминокислотных последовательностей, кодируемых геном dsrB. Масштабная метка соответствует 10% расчетной дивергенции последовательностей. Desulfobulbaceae Desulfobacterium anilini - related group 200 meters DGGE band 30 (JX181969) 30 meters DGGE band 5 (JX181948) 100 meters DGGE band 11 (JX181953) 200 meters DGGE band 29 (JX181968) 200 meters DGGE band 34 (JX181973) 200 meters DGGE band 33 (JX181972) 185 meters DGGE band 27 (JX181967) 185 meters DGGE band 25 (JX181965) 100 meters DGGE band 10 (JX181952) 200 meters DGGE band 32 (JX181971) 165 meters DGGE band 22 (JX181963) 100 meters DGGE band 7 (JX181950) 30 meters DGGE band 4 (JX181947) 65 30 meters DGGE band 3 (JX181946) 76 30 meters DGGE band 1 (JX181944) 100 65 185 meters DGGE band 24 (JX181964) 145 meters DGGE band 17 (JX181958) 79 165 meters DGGE band 19 (JX181960) 92 uncultured sulfate-reducing bacterium (HM004730) Desulfobacterium anilini (AF482455 ) Desulfotomaculum thermosapovorans (AF271769) Desulfovibrio senezii (JF830006) 93 Desulfomicrobium apsheronum (AF418188) Delta proteobacterium AV-1 (HQ659547) Desulfovibrio oceani (FJ655910) 100 Desulfovibrio marinisediminis (AB218445) Desulfotomaculum ruminis (U58118) Desulfobulbus propionicus (AF218452) 100 uncultured sulfate-reducing bacterium (AB124936) uncultured Desulfobulbus sp. (FJ544799) 76 uncultured Desulfobulbus sp. (JN684080) 67 185 meters DGGE band 26 (JX181966) 98 145 meters DGGE band 16 (JX181957) 108 5.6. СРБ в накопительных культурах, выделенных из аэробных вод и зоны хемоклина Черного моря. На питательной среде Видделя для морских форм СРБ были получены анаэробные накопительные культуры сульфатредуцирующих бактерий из аэробных вод (с глубин 30 и 70 м), зоны хемоклина (глубина – 120 м) и верхних анаэробных вод (глубина – 200 м) центральной части Черного моря. Численность микроорганизмов и состав сообществ СРБ в полученных накопительных культурах были проанализированы с помощью метода FISH. Количество метаболически активных бактериальных клеток, идентифицируемых зондами EUB338 + EUB338 II, в накопительных культурах, полученных с глубин 30 и 70 м (аэробная зона), не превышало 39% от общего микробного числа, составлявшего 1,03 × 107 и 2,20 × 107 кл./мл соответственно (табл. 12). С глубин 120 м (нижняя граница хемоклина) и 165 м (верхняя анаэробная водная толща, уже содержащая сероводород) были получены более активные накопительные культуры, численность бактериальных клеток, детектируемых с помощью специфичных зондов, в которых достигала 63 и 67% от общего микробного числа, составлявшего 2,33 × 108 и 4,41 × 108 кл./мл соответственно. Согласно данным, полученным при использовании метода FISH, в накопительных культурах СРБ, выделенных из аэробной зоны (глубины – 30 и 70 м) Черного моря, преобладали представители родов Desulfomicrobium (2,3% и 7,7% от общей численности клеток соответственно; табл. 12). Накопительные культуры СРБ, полученные из водных проб нижней границы хемоклина центральной части Черного моря, содержали представителей родов Desulfovibrio (зонд DSV1292; 14,8%), Desulfotomaculum (зонд Dtm229; 4,85%) и Desulfomicrobium (зонд DSV214; 2,4%). Представители рода Desulfobacter в данных накопительных культурах обнаружены не были. Структура сообщества СРБ в накопительной культуре из верхних анаэробных вод Черного моря (глубина 165 м) была идентична таковой в накопительной культуре из зоны хемоклина (120 м), однако процент метаболически активных клеток СРБ был несколько ниже (табл. 12). 109 Таблица 12. Сульфатредуцирующие бактерии в накопительных культурах, выделенных из верхней водной толщи центральной части Черного моря. Количество клеток в 1 мл пробы Зонд 30 м, аэробная зона 70 м, аэробная зона 120 м, нижняя граница зоны хемоклина ДАФИ 1,03 × 107 2,20 × 107 2,33 × 108 4,41 × 108 EUB338 + EUB338 II 3,80 × 106 (36,9%) 8,60 × 106 (39,1%) 1,49 × 108 (63,9%) 2,96 × 108 (67,1%) 165 м, анаэробная зона Большинство Bacteria DSB129 2,20 × 105 7,90 × 104 Большинство н.о. н.о. (2,1%) (0,4%) Desulfobacter spp. DSV214 2,40 × 105 1,70 × 106 5,65 × 106 5,65 × 106 Большинство (2,3%) (7,7%) (2,4%) (1,3%) Desulfomicrobium spp. DSV698 Некоторые Desulfovibrio spp., н.о. н.о. н.о. н.о. Bilophila wadsworthia, Lawsonia intracellularis DSV1292 1,40 × 105 6,80 × 104 3,44 × 107 3,07 × 107 Некоторые Desulfovibrio spp., (1,35%) (0,3%) (14,8%) (7,0%) Bilophila wadsworthia Dtm229 1,60 × 105 2,80 × 105 1,13 × 107 1,32 × 107 Desulfotomaculum spp. (1,55%) (1,3%) (4,85%) (3,0%) (кластер I), другие Firmicutes Примечания: 1) н.о. – практически не обнаружены или единичные клетки; 2) процентное соотношение для бактерий (зонды EUB338 + EUB338 II) и СРБ приводится относительно общего количества клеток микроорганизмов, окрашенных ДАФИ. Выделенные накопительные культуры СРБ из аэробных вод оказались менее активными по сравнению с культурами из зоны хемоклина и анаэробных вод Черного моря не только по общей численности бактериальных клеток, но и по суммарному содержанию клеток СРБ. Клетки СРБ в накопительных культурах с 110 глубин 30 и 70 м составляли не более 10% от общей численности клеток, в то время как в накопительной культуре из зоны хемоклина их численность доходила до 22%. Крайне важно обратить внимание на тот факт, что структура сообществ сульфатредуцирующих бактерий в выделенных накопительных культурах сильно отличалась от такового в соответствующих нативных водных пробах (табл. 7 и 12). В пробах воды из подповерхностных кислород-содержащих вод центральной части Черного моря преобладали СРБ родов Desulfotomaculum и Desulfovibrio, тогда как в накопительных культурах, выделенных из этой аэробной водной толщи, преобладали представители рода Desulfomicrobium. Существенные различия между нативными водными пробами и накопительными культурами СРБ наблюдали и для зоны хемоклина. Например, в нативных водных пробах зонд DSV214 (на Desulfomicrobium spp.) детектировал до 2,75% клеток, а зонд DSV1292 (на Desulfovibrio spp.) – до 2%, тогда как в накопительных культурах преобладали представители рода Desulfovibrio (до 14,8% клеток от общего микробного числа). Кроме того, в зоне хемоклина зонд Dtm229 (на Desulfotomaculum spp.) не давал положительного сигнала для нативных проб, а в накопительной культуре из данного горизонта клетки данного рода им детектировались. 5.6.1. Оптимизация состава питательной среды для роста накопительных культур СРБ из аэробной зоны Черного моря. Как уже было отмечено, полученные накопительные культуры сульфатредуцирующих бактерий из аэробной зоны Черного моря содержали меньшее количество активных клеток СРБ, чем накопительные культуры из зоны хемоклина и анаэробных вод Черного моря. В связи с этим был проведен ряд экспериментов по подбору оптимального состава питательной среды для получения активных накопительных культур из аэробной зоны. Чаще всего при выделении культур СРБ в качестве донора электронов и источника углерода в среде используют такие органические соединения, как лактат и бутират, а в 111 качестве акцептора электронов – сульфат. Однако, благодаря исследованиям Ф. Видделя еще в 1980 г. было показано, что СРБ могут использовать очень широкий спектр низкомолекулярных органических субстратов как доноры электронов, а также некоторые другие акцепторы электронов помимо сульфата [Widdel, 1980]. Также было показано, что некоторые неорганические соединения могут стимулировать рост СРБ. Нами были выбраны и использованы соединения, которые, предположительно, могут служить субстратами и ростовыми факторами для СРБ из вод Черного моря (табл. 13). Рост и активность полученных накопительных культур оценивали колориметрически по количеству образуемого сероводорода. В результате, наиболее активные накопительные культуры были получены при добавлении в основную среду Видделя для морских форм сульфатредуцирующих бактерий солей Cr(VI) и Mo(VII), KI, а также при замене стандартных органических составляющих среды (лактата и бутирата) на бензоат или ацетат и при замене сульфата на тиосульфат в качестве акцептора электронов. Наибольшее образование накопительными культурами СРБ сероводорода наблюдалось при добавлении к основной среде K2Cr2O7 (10-5 мМ). К тому же, образование сероводорода в этом случае отмечалось уже через 7 сут после начала культивирования, тогда как в остальных случаях заметное образование сероводорода отмечалось чаще всего лишь на 14 сут. Нужно отметить, что наиболее активное образование сероводорода отмечалось при культивировании черноморских накопительных культур с глубины 70 м, кроме экспериментов с добавлением тиосульфата, где сульфатредукция наблюдалась в накопительных культурах с глубины 30 м, и с добавлением ацетата, где активными были накопительные культуры, выделенные из водных проб с обеих глубин. На всех остальных добавках, приведенных в разделе «Материалы и методы исследования», рост (образование сероводорода) либо отсутствовал, либо наблюдался только в первую неделю, после чего культура становилась неактивной. 112 Таблица 13. Рост накопительных культур СРБ из аэробной водной толщи Черного моря (глубины – 30 и 70 м) на различных субстратах и неорганических добавках. Субстрат (мМ) Рост Субстрат (мМ) Рост Этанол (10) + Глюкоза (5) - Пропанол (5) - Фруктоза (5) - Формиат (12) - Метан - Ацетат (20) + Неорганические добавки Пропионат (16) - Na2S2O3 (12) + Валерианат (5) - NaNO3 (4) - Каприлат (0,8) - CrCl3 (10-5) - Пируват (10) - K2Cr2O7 (10-5) + Сукцинат (5) - Na2SeO3 (10-4) - Фумарат (5) - Na2MoO4 (10-4) + Бензоат (5) + KI (2 × 10-4) + Впоследствии, для получения накопительных культур из аэробных вод Черного моря (с глубины 30 м) были использованы 4 варианта питательной среды Видделя для морских форм сульфатредуцирующих бактерий: стандартная среда, варианты с добавлением к стандартной среде K2Cr2O7 (10-5 мМ) и MnSO4 (2 × 10-4 мМ), а также среда, где лактат и бутират были заменены на этанол. Выбор данных вариантов был обусловлен тем, что ранее, как было сказано выше, наиболее активные накопительные культуры из аэробных вод Черного моря получили при добавлении в среду бихромата калия и при замене лактата и бутирата на этанол. Что же касается MnSO4 – известно, что в Черном море существует градиентное распределение марганца в водной толще и, по-видимому, он играет большую роль в геохимических процессах этого меромиктического морского водоема [Якушев и 113 др., 2002]. Наиболее активная накопительная культура СРБ была выделена с глубины 30 м на стандартной среде Видделя с добавлением соли MnSO4. Накопительные культуры СРБ, полученные при добавлении в питательную среду K2Cr2O7 и MnSO4, были использованы в дальнейшем для выделения чистых культур черноморских СРБ. 5.7. Идентификация микроорганизмов в накопительной культуре СРБ, выделенной с глубины 70 м аэробной зоны водной толщи Черного моря. Идентификация микроорганизмов в накопительной культуре СРБ, выделенной из Черного моря с глубины 70 м, проводилась в Центре «Биоинженерия» РАН методом молекулярного клонирования отдельных участков гена 16S рРНК с последующим их секвенированием. Всего были отсеквенированы последовательности участков гена 16S рРНК из 24 полученных клонов. Большинство клонов (16) по нуклеотидным последовательностям обладали наибольшей гомологией (91,5-91,8%) с Anaerobranca gottschalkii, относящейся к семейству Proteinivoraceae порядка Clostridiales. Меньшее число клонов (5) имело гомологию 93-97% с сульфатредуцирующей бактерией Desulfosporosinus lacus STP12T, относящейся к семейству Peptococcaceae порядка Clostridiales. Три клона были сходны на 91-93% с представителями Natronincola spp. семейства Clostridiaceae порядка Clostridiales. При микроскопическом анализе в накопительной культуре были обнаружены клетки разной длины, имеющие палочковидную форму. Часть клеток содержала споры. Известно, что Anaerobranca gottschalkii, в отличие от представителей рода Desulfosporosinus, не образует спор [Prowe a. Antranikian, 2001]. Род Desulfosporosinus относится к семейству Peptococcaceae порядка Clostridiales класса Clostridia и насчитывает 9 описанных видов. Представители данного рода были выделены из речных осадков [Alazard et al., 2010; Sánchez- 114 Andrea et al., 2014], шахтных вод с низкими значениями рН [Lee et al., 2009], загрязненных грунтовых вод [Robertson et al., 2001], вечной мерзлоты [Vatsurina et al., 2008], озерных отложений [Ramamoorthy et al., 2006]. Все представители рода характеризуются клеточной стенкой грамотрицательного типа, имеют форму палочек и образуют споры. По отношению к температуре эти СРБ являются мезофилами, по отношению к рН встречаются как нейтрофильные, так и ацидофильные микроорганизмы. Несмотря на то, что по результатам генетического анализа представители рода Desulfosporosinus составляли меньшую часть клеток в накопительной культуре, они стабильно сохраняются в ней при пересевах. Данная накопительная культура представляет интерес тем, что растет на питательной среде, содержащей бихромат калия, что свидетельствует о ее потенциальной возможности быть хорошим микробиологическим объектом для биоремедиации сточных вод и почв от загрязнений токсичными солями хрома и других тяжелых металлов. В данный момент продолжается работа по выделению этих микроорганизмов в чистую культуру. 5.8. Идентификация и описание чистой культуры СРБ, выделенной с глубины 30 м аэробной зоны водной толщи Черного моря. Из накопительной культуры, полученной с глубины 30 м аэробной зоны водной толщи Черного моря, была выделена чистая культура СРБ (рабочее название – штамм SrB-30). По результатам BLAST-анализа секвенированного участка гена 16S рРНК (размером 1400 пар нуклеотидов, номер KP455293 в GenBank) было установлено, что данная бактерия принадлежит к роду Desulfofrigus. При этом наиболее близкой (гомология 99%) к полученной последовательности оказалась последовательность гена 16S рРНК типового представителя данного рода – Desulfofrigus fragile штамм LSv21T [Knoblauch et al., 1999], выделенного из морских арктических осадков вблизи архипелага Шпицберген. При этом уровень гомологии при проведении ДНК-ДНК гибридизации, 115 осуществленной в DSMZ (Германия), исследуемого штамма SrB-30 и типового штамма Desulfofrigus fragile LSv21T составил всего 56%, что свидетельствует о принадлежности данных сульфатредуцирующих бактерий к разным видам, поскольку микроорганизмы считаются принадлежащими к одному виду, если уровень гомологии при ДНК-ДНК гибридизации ≥70% [Wayne et al.,1987]. Род Desulfofrigus относится к семейству Desulfobacteraceae порядка Desulfobacterales класса Deltaproteobacteria и содержит два описанных вида: Desulfofrigus fragile и Desulfofrigus oceanense [Knoblauch et al., 1999]. Выделение в чистую культуру Desulfofrigus sp. из кислород-содержащих вод Черного моря является важным фактом в исследованиях как самого меромиктического водоема (поскольку к настоящему времени не известно ни одного представителя СРБ, выделенного в чистую культуру из Черного моря), так и экологии СРБ рода Desulfofrigus (так как информация о распространении представителей данного рода в природе весьма скудна). 5.8.1. Микробиологическое описание культуры Desulfofrigus sp. штамм SrB-30. Электронно-микроскопические исследования показали, что штамм SrB-30 представлен палочками с закругленными концами (размер 0,5-0,8 × 3,7-4,2 мкм). Спор обнаружено не было. Клеточная стенка грамотрицательного типа с четко выраженным липопротеидным слоем, под клеточной стенкой хорошо видна трехслойная цитоплазматическая мембрана. Нуклеоид большого размера, занимает почти всё внутреннее пространство клетки. Вокруг клеток были видны остатки защитных капсул (рис. 15). 116 Рис. 15. Электронная микрофотография ультратонкого среза клеток штамма SrB-30, поперечный срез: Н – нуклеоид, ЦМ – цитоплазматическая мембрана, НМ – наружная мембрана, К – капсула [Захарова и др., 2012]. 5.8.2. Оптимум температур для роста культуры Desulfofrigus sp. штамм SrB-30. Определение температурного оптимума для роста штамма SrB-30 показало, что наиболее активное образование сероводорода культурой происходит в диапазоне 12-23°С, резкий прирост количества H2S наблюдался уже на 7-е сут культивирования (рис. 16). При температуре 6°С также наблюдалось образование культурой сероводорода, но с некоторым удлинением лаг-фазы – скачок образования H2S наблюдался на 10-е сут. При температуре 4°С образование сероводорода было незначительным, при 27, 37 и 57°С развития культуры не происходило (рис. 16). Таким образом, описываемая СРБ Desulfofrigus sp. штамм SrB-30 является психрофильным микроорганизмом с оптимальной температурой для роста 15-18°С. 117 Рис. 16. Кривые роста культур Desulfofrigus sp. штамм SrB-30 при различных температурах в диапазоне 3,7-57°С. Рис. 17. Кривые роста культур Desulfofrigus sp. штамм SrB-30 на питательной среде с различными рН в диапазоне 4,5-9,5. 118 5.8.3. Оптимум рН для роста культуры Desulfofrigus sp. штамм SrB-30. По результатам измерения образования сероводорода при росте штамма SrB-30 на питательной среде с различными значениями рН было установлено, что оптимальным для роста исследуемой бактерии является значение рН 7,2, при этом рост культуры наблюдался также и в диапазоне рН от 6,6 до 7,8 (рис. 17). При рН ниже 6,6 и выше 7,8 образование сероводорода (сульфида) культурой отсутствовало. Нужно отметить, что рН подповерхностных черноморских вод, из которых была выделена данная культура, имеет слабощелочную реакцию и составляет 8,0-8,3 [Рябинин и Коновалов, 1987]. Однако известно, что СРБ способны к образованию различных клеточных флоков и агрегатов, в которых рН может снижаться за счет выделяемого сероводорода, кроме того, СРБ могут обитать внутри различных взвешенных органических частиц, где значения рН также могут отличаться от таковых в окружающих водных массах [Shanks a. Reeder, 1993]. 5.8.4. Изучение способности культуры Desulfofrigus sp. штамм SrB-30 использовать различные доноры/акцепторы электронов, а также сбраживаемые субстраты. Исследуемый штамм SrB-30 обладал по сравнению с типовыми штаммами рода Desulfofrigus значительно более широким спектром используемых доноров и акцепторов электронов, а также сбраживаемых субстратов (табл. 14). 119 Таблица 14. Рост Desulfofrigus sp. штамм SrB-30 при использовании различных доноров и акцепторов электронов, а также сбраживаемых субстратов, в сравнении с типовыми видами рода Desulfofrigus. Desulfofrigus Desulfofrigus Desulfofrigus sp. fragile LSv21 штамм SrB-30 oceanense [Knoblauch et ASv26 al., 1999] [Knoblauch et al., 1999] Формиат (20) Ацетат (10) Пропионат (15) Бутират (5) Валерат (5) Капроат (3) Капрат (2) Пальмитат (2) Лактат (10) Пируват (10) Малат (10) Сукцинат (10) Фумарат (10) Этанол (10) Пропанол (10) Бутанол (10) Глицерол (10) Глицин (10) Аланин (10) Серин (10) Н2/СО2 + ацетат (2) Изовалерат (5) Метанол (10) Глутарат (10) Бетаин (10) Хлорид холина (10) L-пролин (10) D-сорбитол (5) D-маннитол (5) Бензоат (1) Глюкоза (5) Фруктоза (5) Доноры электронов (мМ) + ++ – ++ – – + ++ – + ++ – ++ – ± – ++ ++ ++ + ++ ++ – – + – ++ ++ ++ ++ ++ ++ ++ ± – ± + – + ± – ± – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – – ++ ++ ± + ++ ++ + ++ ++ + + ++ + ++ ++ + ++ ± ± + + – + – ± + ± ± + + ++ ++ 120 Таблица 14. (продолжение) Desulfofrigus fragile LSv21 [Knoblauch et al., 1999] Сульфат (28) Тиосульфат (10) Сульфит (2) Сера (3) Цитрат железа III (30) Оксигидроксид железа III (4) Нитрат (5) Пируват (10) Малат (10) Лактат (10) Фумарат (10) Desulfofrigus oceanense ASv26 [Knoblauch et al., 1999] Desulfofrigus sp. штамм SrB-30 Акцепторы электронов (мМ) + + – + – + – – + + – + ± ++ ± – – – – – Сбраживаемые субстраты (мМ) + + + + – + – – + + + + + Примечание: ++ очень хороший рост, + хороший рост, ± слабый рост, – отсутствие роста. Серым цветом отмечены различия между выделенным и типовыми штаммами в потребляемых субстратах. 5.8.5. Состав жирных кислот в клетках Desulfofrigus sp. штамм SrB-30. Состав жирных кислот в клетках Desulfofrigus sp. SrB-30 представлен в таблице 15. Он отличался от типового штамма D. fragile LSv21T. Преобладающими жирными кислотами у штамма SrB-30 оказались C14:0 (11,46%), С16:0 (17,73%) и С16:1 w9c (35,96%) с четным числом атомов углерода в цепи, что свидетельствует об использовании ацетила-КоА в качестве предшественника при удлинении углеродной цепи в ходе синтеза жирных кислот [Taylor a. Parkes, 1983]. На основании обнаруженных генетических и физиолого-биохимических отличий от типового штамма D. fragile LSv21T впервые выделенный нами из кислород-содержащих вод Черного моря штамм сульфатредуцирующей бактерии SrB-30 был отнесен к новому виду рода Desulfofrigus и депонирован под видовым 121 названием Desulfofrigus euxinos штамм SrB-30 (от древнегреческого названия Черного моря Eúxeinos Póntos) в две международные коллекции микроорганизмов: DSMZ (Германия) и JCM (Япония). Таблица 15. Cостав жирных кислот в клетках Desulfofrigus sp. SrB-30 и D. fragile LSv21T. D. fragile LSv21T , % Жирные кислоты Штамм SrB-30, % C10:0 2,3 2,5 C12:0 1,27 0,6 Anteiso-C13:0 0,25 - C13:1 AT 12-13 0,5 - C14:0 11,46 5,0 C15:0 0,6 - Anteiso-C15:0 2,08 - С16:0 17,73 21,7 С16:1 w5c 1,14 - С16:1 w7c 6,58 3,0 С16:1 w9c 35,96 30,6 С16:1 w11c 1,23 0,5 С17:1 w9c 0,33 - Anteiso-С17:1 w9c 0,55 - С17:1 w8c 0,84 - C18:0 1,42 0,7 С18:1 w9c 7,12 8,6 С18:1 w7c 8,82 - С18:1 w11c - 18,5 C20:1 w13c - 0,3 [Knoblauch et al., 1999] Примечание: жирным шрифтом выделены преобладающие в составе клеток жирные кислоты. 122 5.9. Рост выделенной в чистую культуру СРБ Desulfofrigus euxinos штамм SrB-30 в присутствии различных концентраций кислорода. Поскольку штамм SrB-30 был выделен с глубины 30 м континентального склона Черного моря, где концентрация растворенного кислорода достигает 300 мкМ, мы предположили, определенным уровнем что данный микроорганизм аэротолерантности, а также, должен обладать возможно, иметь эффективные системы защиты от окислительных стрессов. Воздействие кислорода на рост культуры D. euxinos штамм SrB-30 оценивали по влиянию различных начальных концентраций кислорода в газовой фазе на три показателя: число клеток в жидкой культуре, количество продуцируемого культурой сероводорода и скорость сульфатредукции. Общая схема экспериментов описана в разделах 4.6.8 и 4.9.2. 5.9.1. Влияние различных начальных концентраций кислорода в газовой фазе на численность клеток в культуре Desulfofrigus euxinos SrB-30. В данном опыте рассматривалось влияние на увеличение количества клеток D. euxinos в жидкой культуре пяти различных начальных концентраций кислорода в газовой фазе – 2,6; 5,2; 7,8; 10,4 и 13% (рис. 18). Уже при начальном содержании кислорода 2,6% в газовой фазе наблюдали удлинение лаг-периода, а количество клеток к концу экспоненциальной фазы роста (на 4-е сут) составляло 1,8 × 108 кл./мл, что было в два раза меньше, чем в контрольном эксперименте при росте в условиях строгого анаэробиоза. При начальной концентрации кислорода в газовой фазе 5,2% количество клеток к концу экспоненциальной фазы роста снижалось в 3,4 раза относительно контроля, а при 7,8% O2 – в 5 раз. При начальной концентрации кислорода в газовой фазе 10,4 и 13% рост культуры D. euxinos подавлялся полностью (рис. 18). 123 Рис. 18. Численность клеток в культурах Desulfofrigus euxinos штамм SrB-30 при росте в присутствии различных начальных концентраций кислорода в газовой фазе. 5.9.2. Влияние различных начальных концентраций кислорода в газовой фазе на образование сероводорода культурой Desulfofrigus euxinos SrB-30. В данном опыте оценивали образование сероводорода культурой SrB-30 при семи различных начальных концентрациях кислорода в газовой фазе – 0,5; 1,3; 2,6; 5,2; 7,8; 10,4 и 13% (рис. 19). Внесение 0,5 и 1,3% кислорода в газовую фазу приводило к удлинению лагпериода роста культуры до 3-х сут и резкому, по сравнению с контролем (анаэробные условия культивирования), снижению образования сероводорода – более чем в 2 раза. Увеличение начальной концентрации кислорода в газовой фазе до 2,6 и 5,2% приводило к резкому падению образования сероводорода – более 124 чем в 4 раза по сравнению с контролем. При начальном содержании кислорода в газовой фазе более 7,8% образование сероводорода полностью подавлялось (рис. 19). Рис. 19. Образование сероводорода культурами Desulfofrigus euxinos штамм SrB-30 при росте в присутствии различных начальных концентраций кислорода в газовой фазе. 5.9.3. Влияние различных начальных концентраций кислорода в газовой фазе на скорость сульфатредукции (ССР) культуры Desulfofrigus euxinos SrB-30. Скорость сульфатредукции в культурах радиоизотопным методом с использованием количество образованного 35S-сульфида. 35 D. euxinos определяли S-SO42-, измеряя через 2 сут 125 Было показано, что при культивировании штамма SrB-30 с начальной концентрацией кислорода в газовой фазе 2,6% ССР практически не отличалась от таковой в контроле (культивирование в анаэробных условиях). Увеличение начальной концентрации кислорода в газовой фазе до 5,2% приводило к резкому снижению ССР – более чем в 4 раза по сравнению с контролем. Внесение же в начале экспоненциальной фазы роста культуры в газовую фазу 13% кислорода полностью ингибировало процесс сульфатредукции (рис. 20). Рис. 20. Скорость сульфатредукции в культурах Desulfofrigus euxinos штамм SrB-30 при различных начальных концентрациях кислорода в газовой фазе. 126 ГЛАВА 6. СООБЩЕСТВА СУЛЬФАТРЕДУЦИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ В КИСЛОРОД-СОДЕРЖАЩИХ ВОДАХ ГДАНЬСКОЙ ВПАДИНЫ БАЛТИЙСКОГО МОРЯ. Балтийское море, в отличие от Черного, не является постоянным меромиктическим водоемом, однако влияние таких факторов, как ограниченный водообмен с Северным морем, наличие барьеров температуры и солености между поверхностными и придонными водами, загрязнение вод соединениями азота и фосфора, приводящее к вспышкам «цветения» и последующему разложению фотосинтетической продукции, сопровождающемуся увеличением потребления кислорода, способствует формированию в балтийских впадинах анаэробных условий. К числу таких впадин, где в придонных горизонтах в последние годы постоянно наблюдается присутствие растворенного сероводорода, относится Гданьская впадина. Географическое расположение Балтийского моря способствует эвтрофикации этого водоема за счет значительного сброса взвешенного вещества как с речным стоком, так и с промышленными и бытовыми сточными водами. Мы предположили, что по аналогии с Черным морем, сульфатредуцирующие бактерии могут обитать не только в донных осадках и анаэробной водной толще впадин Балтийского моря, но и в их зоне хемоклина и поверхностных аэробных водах. 6.1. Гидрохимические параметры вод Гданьской впадины Балтийского моря. Анализ данных, полученных с помощью гидрофизического зонда, позволил выявить значительную неоднородность вод глубоководной зоны Гданьской впадины в период наших исследований (рис. 21). Содержание кислорода в интервале глубин 0-75 м составляло от 10,61 до 13,69 мл/л, а на глубине 80-90 м наблюдался хорошо выраженный оксиклин. На глубинах 97-100 м содержание кислорода снижалось до 0,05-0,22 мл/л, и появлялся свободный сероводород (0,79 мл/л на глубине 102 м). Обращает на себя внимание заметный скачок содержания кислорода в воде в 127 интервале глубин 40-75 м, который четко коррелирует с данными по температуре холодного промежуточного слоя (ХПС), формирующегося на этих глубинах. Интервал 20-30 м соответствует термоклину и галоклину, а также зоне контакта распресненных поверхностных вод с глубинными, более солеными водами. Сочетание данных факторов приводит к значительному развитию микробных и эукариотических сообществ на данных глубинах и, соответственно, к интенсификации потребления ими кислорода, в то время как ХПС обычно характеризуется невысокой численностью микроорганизмов и низкими интенсивностями микробных процессов. Рис. 21. Гидрохимические параметры водной толщи глубоководной зоны Гданьского залива Балтийского моря (станция № 22): содержание кислорода (1) и температура (2). 6.2. Обнаружение СРБ в пробах воды из Гданьской впадины с помощью ПЦР-анализа генов 16S рРНК и dsrB. По аналогии с исследованиями подповерхностных вод Черного моря 128 вначале мы осуществляли двухстадийную фильтрацию проб морской воды через крупнопористые фильтры GF/C, задерживающие частицы размером более 1,2 мкм, и мембранные фильтры с размером пор 0,22 мкм. С помощью ПЦР было показано наличие гена dsrB в образцах тотальной ДНК, выделенной из водных проб со всех исследуемых глубин водной толщи Гданьской впадины Балтийского моря (табл. 16). 6.2.1. Сообщества свободноживущих и ассоциированных с мелкой (≤1,2 мкм) взвесью сульфатредуцирующих бактерий. Вложенной ПЦР было показано присутствие участков гена 16S рРНК, специфических для представителей подгрупп Desulfococcus-Desulfonema- Desulfosarcina (5-я подгруппа СРБ) и Desulfovibrio-Desulfomicrobium (6-я подгруппа СРБ), на всех исследованных глубинах водной толщи Гданьской впадины Балтийского моря, а также присутствие генетического материала Desulfotomaculum spp. (1-я подгруппа СРБ) на всех глубинах, за исключением придонного слоя (107 м). Участки гена 16S рРНК, характерные для представителей рода Desulfobacter (4-я подгруппа СРБ), были выявлены только в пробах воды из аэробной водной толщи, за исключением пробы с глубины 50 м (табл. 16). 6.2.2. Сообщества сульфатредуцирующих бактерий, ассоциированных с крупной (≥1,2 мкм) взвесью. В образцах ДНК, выделенной из частичек крупной взвеси (фильтрация водных проб через GF/C фильтры), участки гена 16S рРНК, специфичные для 5-й и 6-й подгрупп СРБ, были обнаружены в пробах из всех исследуемых горизонтов водной толщи (глубины 0-107 м). Участки генов 16S рРНК ассоциированных с крупной взвесью представителей 1-й подгруппы СРБ отсутствовали в пробах из нижних аэробных вод и зоны хемоклина (50 м и 80 м соответственно). Участки генов 16S рРНК ассоциированных с крупной взвесью представителей 4-й подгруппы СРБ были выявлены только в придонных анаэробных водах (табл. 16). 129 Гены 16S рРНК ассоциированных со взвесью и свободноживущих представителей родов Desulfobulbus (2-я подгруппа СРБ) и Desulfobacterium (3-я подгруппа СРБ) не были обнаружены ни на одном из исследованных горизонтов водной толщи Гданьской впадины Балтийского моря. Таблица 16. Результаты ПЦР-анализа (вложенная ПЦР) филогенетического состава сообществ сульфатредуцирующих бактерий в водной толще Гданьской впадины Балтийского моря. Глубина Подгруппа СРБ Ген β-субъединицы диссимиляционной сульфитредуктазы (dsrB) Desulfotomaculum (1-я подгруппа СРБ) Desulfobulbus (2-я подгруппа СРБ) Desulfobacterium (3-я подгруппа СРБ) Desulfobacter (4-я подгруппа СРБ) DesulfococcusDesulfonemaDesulfosarcina (5-я подгруппа СРБ) DesulfovibrioDesulfomicrobium (6-я подгруппа СРБ) Тип фильтра 0м 10 м 30 м 50 м 80 м 102 м 107 м GF/C + + + + + + + 0,22 мкм + + + + + + + GF/С + + + - - + + 0,22 мкм + + + + + + - GF/C - - - - - - - 0,22 мкм - - - - - - - GF/C - - - - - - - 0,22 мкм - - - - - - - GF/C - - - - - + + 0,22 мкм + + + - - - - GF/C + + + + + + + 0,22 мкм + + + + + + + GF/C + + + + + + + 0,22 мкм + + + + + + + 130 6.3. ДГГЭ-анализ по гену dsrB сообществ СРБ водной толщи Гданьской впадины. По гену dsrB были получены ДГГЭ-профили сообществ СРБ Гданьской впадины Балтийского моря с пяти исследуемых глубин (0, 10, 30, 70 и 110 м), различавшихся по гидрохимическим характеристикам. Профили были практически идентичны по количеству (5-6) и расположению полос ДНК, однако в пробе из зоны хемоклина с глубины 70 м наблюдалась наибольшая интенсивность полос, что может косвенно свидетельствовать о большей численности СРБ на данной глубине (рис. 22). Рис. 22. ДГГЭ-профили по гену dsrB сообществ СРБ в водной толще Гданьской впадины Балтийского моря. Маленькими цифрами (1-28) обозначены порядковые номера полос, использованные для дальнейшего выделения, реамплификации и секвенирования участков гена dsrB. 131 6.4. Секвенирование и филогенетический анализ последовательностей участков гена dsrB, выделенных и реамплифицированных из отдельных ДГГЭ-полос. После разделения посредством ДГГЭ продуктов амплификации участков гена dsrB из водных проб с различных глубин Гданьской впадины Балтийского моря была определена 21 нуклеотидная последовательность, которые были выверены и депонированы в GenBank под номерами KJ796659-KJ796679 (табл. 17). Анализ транслированных аминокислотных последовательностей показал, что на всех исследуемых глубинах (кислород-содержащие воды, зона хемоклина и придонные сероводородные воды) Гданьской впадины присутствовали участки гена dsrB, наиболее сходные (87-95% гомологии) с соответствующими последовательностями некультивируемых СРБ из Арктических морских осадков в районе Шпицбергена, несульфидогенных тропических подвижных грязей, осадков в устье р. Янцзы и биопленок холодных сипов центральной части Красного моря (рис. 23, табл. 17). Также для некоторых последовательностей отмечался аналогичный уровень гомологии с транслированными участками гена dsrB морских коррозионно-активных некультивируемых СРБ (сиквенсы с глубин 0, 10 и 70 м), некультивируемых СРБ из морских осадков моря Яцусиро (сиквенсы с глубин 10, 30, 70 и 110 м), из глубоководных осадков Нанкайского желоба (сиквенсы с глубин 30 и 70 м), из зоны кислородного минимума осадков Аравийского моря (сиквенсы с глубин 30, 70 и 110 м) и из водной толщи Черного моря вблизи г. Геленджик (сиквенсы с глубин 70 и 110 м, см. подглаву 5.5). В то же время, на всех исследованных глубинах Гданьской впадины были обнаружены составляющие отдельный кластер на филогенетической дендрограмме (рис. 23) аминокислотные последовательности, кодируемые геном dsrB, для которых в базе данных GenBank не было обнаружено аналогичных последовательностей (с гомологией 87% и выше) ни среди известных видов СРБ, ни среди некультивируемых СРБ из разных местообитаний. 132 Таблица 17. Распределение сульфатредуцирующих бактерий в водной толще Гданьской впадины Балтийского моря в соответствии с секвенированными нуклеотидными последовательностями участков гена dsrB, выделенных и реамплифицированных из отдельных ДГГЭ-полос. Глубина, м 0 10 Номер полосы на ДГГЭпрофиле 1, 3 6-10 Номер последовательности, депонированной в GenBank KJ796659, KJ796660 KJ796661-KJ796665 Максимальная гомология % гомологии Некультивируемые СРБ из осадков в устье р. Янцзы 94 Некультивируемые СРБ из Арктических морских осадков в районе Шпицбергена 87-94 Некультивируемые СРБ из несульфидогенных тропических подвижных грязей 71-94 Некультивируемые СРБ из морских осадков в районе рыбных ферм в бухте Gokasho, Япония 81 Некультивируемые СРБ из морских глубоководных осадков Нанкайского желоба Некультивируемые СРБ из несульфидогенных тропических подвижных грязей 71 Некультивируемые СРБ из осадков в устье р. Янцзы 93 Морские некультивируемые коррозионноактивные СРБ 91 Некультивируемые СРБ из Арктических морских осадков в районе Шпицбергена 89-93 Некультивируемые СРБ из морских осадков в районе рыбных ферм в бухте Gokasho, Япония 84 Некультивируемые СРБ из загрязненных нефтью морских осадков в районе Прованса, Франция 75 93 133 Таблица 17. (продолжение) Глубина, м 30 70 Номер полосы на ДГГЭпрофиле 12-14,16, 17 18-21, 23 Номер последовательности, депонированной в GenBank Максимальная гомология % гомологии Некультивируемые СРБ из осадков в устье р. Янцзы 95 Некультивируемые СРБ из Арктических морских осадков в районе Шпицбергена 93-95 Некультивируемые СРБ из морских глубоководных осадков Нанкайского желоба 93 Desulfatibacillum alkenivorans 93 Некультивируемые СРБ из несульфидогенных тропических подвижных грязей 64-95 Некультивируемые СРБ из зоны кислородного минимума осадков Аравийского моря 87 Некультивируемые СРБ из вод нефтяного месторождения, Япония Некультивируемые СРБ из биопленок холодных сипов центральной части Красного моря 93 Некультивируемые СРБ из несульфидогенных тропических подвижных грязей 94 Некультивируемые СРБ из осадков в устье р. Янцзы 94 Морские некультивируемые коррозионноактивные СРБ 92 Некультивируемые СРБ из морских осадков в районе рыбных ферм в бухтах Shitaba и Gokasho, Япония 90 Некультивируемые СРБ из водной толщи Черного моря вблизи г. Геленджик, Россия 90 Некультивируемые СРБ из зоны кислородного минимума осадков Аравийского моря 90-94 Некультивируемые СРБ морских осадков сульфатных и метановых зон Черного моря 86 Некультивируемые СРБ из Арктических морских осадков в районе Шпицбергена 77-94 KJ796666-KJ796670 KJ796671-KJ796675 94 134 Таблица 17. (продолжение) Глубина, м 110 Номер полосы на ДГГЭпрофиле 24-26, 28 Номер последовательности, депонированной в GenBank KJ796676-KJ796679 Максимальная гомология % гомологии Некультивируемые СРБ из биопленок холодных сипов [Thuwal Seeps] центральной части Красного моря 94 Некультивируемые СРБ из Арктических морских осадков в районе Шпицбергена 94 Некультивируемые СРБ из несульфидогенных тропических подвижных грязей 94 Некультивируемые СРБ из осадков в устье р. Янцзы 94 Некультивируемые СРБ из морских осадков в районе рыбных ферм в бухтах Shitaba и Gokasho, Япония 79 Некультивируемые СРБ из кристаллических пород глубокой буровой скважины Outokumpu, Финляндия 75 Некультивируемые СРБ из содового озера в степи Кулунда, Россия 69 135 Рис. 23. Филогенетическая дендрограмма СРБ из водной толщи Гданьской впадины Балтийского моря, построенная на основе сравнительного анализа аминокислотных последовательностей, кодируемых геном dsrB. Масштабная метка соответствует 5% расчетной дивергенции последовательностей. 136 6.5. Получение накопительных культур сульфатредуцирующих бактерий из водной толщи Гданьской впадины Балтийского моря. Помимо изучения нативного состава сообществ СРБ в Гданьской впадине Балтийского моря молекулярно-биологическими методами, нами также были проведены эксперименты по получению накопительных культур СРБ из водной толщи Гданьской впадины. Были получены накопительные культуры с глубин 30 (кислород-содержащие воды), 102 и 107 м (бескислородные воды), сохраняющие активность в течение нескольких пересевов, что свидетельствует о том, что в водной толще Гданьской впадины Балтийского моря присутствует не только генетический материал, но и живые клетки сульфатредуцирующих бактерий. ОБСУЖДЕНИЕ Большую часть микроорганизмов, обнаруживаемых методом FISH в аэробной зоне Черного моря, составляли бактерии (рис. 12). Среди СРБ в данных горизонтах в летний период в значительных количествах были обнаружены представители родов Desulfotomaculum, Desulfovibrio и Desulfobacter (табл. 6). Похожая картина наблюдалась и в зимний период, однако как общая численность микроорганизмов, так и численность СРБ, зимой заметно снижались (табл. 7). При исследовании методом FISH сообществ микроорганизмов зоны хемоклина Черного моря было отмечено повышение общей численности микроорганизмов в его верхней части. Количество бактерий и архей было там примерно одинаковым (рис. 12). Кроме того, наблюдалось изменение структуры сообщества сульфатредуцирующих бактерий – в зоне хемоклина преобладали представители рода Desulfomicrobium, отсутствовавшие в аэробной и анаэробной зонах. Такая картина была характерна как для летнего, так и для зимнего периода, отличались лишь абсолютные значения численности клеток, которые, как и в аэробных водах, заметно снижались в зимний период (табл. 6 и 7). По результатам проведения FISH для проб из анаэробных вод Черного моря было отмечено как общее снижение численности микроорганизмов в сравнении с аэробными водами и зоной хемоклина, так и снижение доли метаболически 137 активных бактерий и архей (рис. 12). СРБ на глубине практически не детектировались (табл. 6 и 7). Это можно объяснить малым количеством рРНК в клетках микроорганизмов глубоководной зоны, обладавших низкой метаболической активностью в периоды отбора проб, а также вероятным присутствием прокариот иных филогенетических групп, которые не обнаруживаются с помощью примененных в настоящей работе стандартных FISHзондов. Полученные подповерхностных данные по распределению кислород-содержащих водах численности Черного прокариот моря в хорошо согласуются с результатами предыдущих исследований [Пименов и др., 2000; Durisch-Kaiser et al., 2005; Lin et al., 2006], где также отмечалась повышенная численность микроорганизмов в верхних аэробных водах (фотический слой на глубине 20-60 м) и зоне хемоклина Черного моря, причем, аналогично нашим данным, доминирующими являлись представители домена Bacteria – до 65-77% от всех клеток микроорганизмов. Использованные нами универсальные и специфические FISH-зонды на различные подгруппы СРБ показали значительно меньший процент гибридизации в глубоководной толще Черного моря (рис. 12, табл. 6 и 7), что согласуется с данными предыдущих исследований, где также отмечался низкий процент детекции прокариотических клеток в анаэробных водах Черного моря по сравнению с другими морскими водоемами [Lin et al., 2006]. Кроме того, существуют определенные ограничения по использованию метода FISH для обнаружения морских прокариот в зависимости от их метаболической активности [Karner a. Furner, 1997]. Высокая численность метаболически активных микроорганизмов в кислород-содержащих водах Черного моря связана, по всей видимости, с обогащением верхних горизонтов водной толщи доступным органическим веществом, которое образуется как в процессе фотосинтеза, так и поступает с речными стоками. Общее количество прокариотических клеток, обнаруживаемых методом FISH с использованием стандартных зондов на бактерии и на археи, было 138 несколько ниже, чем численность микроорганизмов в тех же водных пробах, оцененная с помощью универсального ДНК-красителя ДАФИ (рис. 12). Однако в аэробной зоне и зоне хемоклина использование упомянутых зондов, специфичных на уровне доменов, давало в ряде экспериментов суммарное значение численности микроорганизмов в районе 82-86% от общего количества клеток, определенного с помощью ДАФИ. Это свидетельствует о достаточно хорошем уровне достоверности при использовании метода FISH для общей количественной оценки микробных сообществ верхней части водной толщи Черного моря. По данным Лин с соавт. [Lin et al., 2006] количество клеток, определенных с помощью зондов EUB338 + ARCH915, по отношению к количеству клеток, окрашиваемых ДАФИ, в водной толще Черного моря составляло в среднем 55%, тогда как в меромиктическом морском бассейне Кариако Карибского моря эта величина равнялась 82%. Присутствие жизнеспособных СРБ в кислород-содержащих черноморских водах также хорошо согласуется с гидрохимическими данными [Волков и др., 1992], которые свидетельствовали о наличии следов восстановленных форм серы в аэробной зоне Черного моря, и с нашими результатами по измерению интенсивностей процесса сульфатредукции (рис. 11). Промежуточные восстановленные соединения серы в этом случае могут быть как продуктами неполного биологического или химического окисления сероводорода, так и промежуточными продуктами сульфатредукции [Вайнштейн и др., 1980]. Поэтому можно утверждать, что хотя СРБ, как строго анаэробные микроорганизмы, должны присутствовать только в глубинных бескислородных водах, они, на самом деле, встречаются и в подповерхностных аэробных горизонтах и в зоне хемоклина Черного моря, причем в метаболически активном состоянии. Предыдущие исследования Черного моря методом FISH с использованием только одного зонда SRB385 для общей детекции СРБ обнаружили пик их численности (без идентификации точной филогенетической принадлежности) сразу над верхней границей анаэробных сульфидных вод, т.е. в зоне хемоклина, что было расценено как парадоксальные результаты [Lin et al., 2006]. Однако в 139 настоящее время уже хорошо известно [Dolla et al., 2006; Brioukhanov et al., 2010], что наличие эффективных механизмов антиокислительной защиты у некоторых сульфатредукторов (в особенности, у представителей родов Desulfovibrio и Desulfotomaculum) позволяет им занимать различные экологические ниши, периодически подвергающиеся воздействию кислорода, и даже осуществлять сульфатредукцию в микроаэробных зонах гетерогенных местообитаний (к которым как раз и принадлежит зона хемоклина). Это обеспечивает конкурентные преимущества в борьбе за субстрат и выживание клеток СРБ в изменяющихся условиях окружающей среды. Еще одним возможным, но менее вероятным, объяснением присутствия СРБ в верхних горизонтах черноморской водной толщи могут быть гидрологические процессы, такие, как адвективное проникновение воды с глубины, приводящее к перемешиванию водных слоев и популяций микроорганизмов. В данной работе не использовались 16S рРНК-специфичные зонды для идентификации сульфатредуцирующих архей. В настоящее время пока не сконструированы олигонуклеотидные зонды, позволяющие достоверно детектировать исключительно клетки Archaeoglobus spp. методом FISH и, по литературным данным, эти гипертермофильные археи не были до настоящего времени обнаружены в водной толще меромиктических водоемов. Обращает на себя внимание тот факт, что по результатам экспериментов с применением метода FISH, суммарная доля СРБ в аэробных водах (глубина 30 м) составила 59,3% в летний период и 18,9% в зимний период (табл. 6 и 7). Полученные данные идут вразрез с исследованиями других авторов, обнаруживающих в водной толще Черного моря не более 9% СРБ, причем максимумы их численности были обнаружены либо в анаэробных водах, либо в зоне хемоклина [Durisch-Kaiser et al., 2005; Lin et al., 2006; Neretin et al., 2007]. Несмотря на то, что многие СРБ обладают достаточно эффективными системами защиты от окислительных стрессов, сложно представить, что в полностью аэробных местообитаниях они могут составлять около половины микробного сообщества. Скорее всего, завышенные данные по численности СРБ обусловлены 140 не абсолютной специфичностью и частичным перекрыванием FISH-зондов, применяемых в настоящее время для детекции представителей основных подгрупп СРБ [Hristova et al., 2000]. Кроме того, возможна неспецефическая адсорбция FISH-зондов на поверхности клеток нецелевых микроорганизмов в нативных пробах. При использовании более точного метода (количественной ПЦР) нами было установлено, что численность СРБ в подповерхностной водной толще Черного моря действительно не превышала 9% от всех прокариот, причем максимум численности находился в анаэробных водах (табл. 10). Полученные данные хорошо коррелируют с результатами предыдущих исследований, в которых методами FISH и количественной ПЦР было показано, что численность СРБ на различных горизонтах водной толщи Черного моря составляет от 0,1 до 8% от всех клеток микроорганизмов [Durisch-Kaiser et al., 2005; Lin et al., 2006; Neretin et al., 2007]. Увеличение доли СРБ с возрастанием глубины с локальным максимумом в зоне хемоклина отмечается во всех работах, посвященных изучению общей численности СРБ в Черном море и, по-видимому, является характерной особенностью распределения СРБ в данном меромиктическом водоеме. Необходимо отметить, что доля СРБ в подповерхностных аэробных водах Черного моря, определенная с помощью универсального FISH-зонда SRB385, специфичного к большинству СРБ, относящихся к δ-Proteobacteria [Durisch-Kaiser et al., 2005; Lin et al., 2006], была в несколько десятков раз выше, чем при определении методом количественной ПЦР (2-4% и 0,065-0,1% соответственно; рис. 24) [Neretin et al., 2007; настоящая работа]. В зоне хемоклина применение метода FISH также давало завышенные результаты: 2,75-8% [Durisch-Kaiser et al., 2005; Lin et al., 2006] против 0,48-1,9% [Neretin et al., 2007; настоящая работа], определенных методом количественной ПЦР (рис. 24). Вышесказанное ясно свидетельствует о том, что количественные результаты, получаемые с использованием метода FISH при исследовании сообществ микроорганизмов в нативных пробах, могут быть действительно завышены. 141 Рис. 24. Сравнение доли СРБ от общей численности микроорганизмов в трех гидрохимически различающихся зонах Черного моря по данным настоящей работы и других авторов [Durisch-Kaiser et al., 2005; Lin et al., 2006; Neretin et al., 2007]. Несмотря на завышенные данные по численности клеток СРБ, качественная структура черноморских сообществ СРБ, обнаруженная нами с помощью метода FISH в летний и зимний период, была практически идентичной – представители родов Desulfotomaculum и Desulfobacter присутствовали только в аэробных водах, рода Desulfovibrio – во всей водной толще, рода Desulfomicrobium – только в анаэробных водах (табл. 6 и 7). Наиболее высокие численности СРБ (как в летнее, так и в зимнее время) были обнаружены на глубине 30 м при использовании зондов DSV698 и DSV1292 (род Desulfovibrio) и Dtm229 (род Desulfotomaculum). 142 Всё вышесказанное позволяет рекомендовать стандартный метод FISH с использованием родоспецифичных зондов именно для качественного, но не для количественного анализа сообществ СРБ в нативных пробах, с четким контролем достоверности полученных результатов по численности клеток в каждом конкретном случае с помощью других молекулярно-биологических методов, например, количественной ПЦР. Результаты последующего ПЦР-анализа сообществ СРБ кислород- содержащей подповерхностной водной толщи Черного моря достаточно хорошо коррелируют с данными по филогенетическому разнообразию, полученными нами с применением метода FISH. Методом FISH было показано присутствие в верхних аэробных водах (глубина 30 м) представителей родов Desulfotomaculum (зонд Dtm229) и Desulfobacter (зонд DSB129), участки генов 16S рРНК этих филогенетических подгрупп СРБ были также детектированы на данной глубине с помощью метода ПЦР (табл. 6-9). Кроме того, суммарно клетки, гибридизовавшиеся с зондами DSV214 (специфичному к представителям рода Desulfomicrobium) и DSV1292 + DSV698 (специфичным к представителям рода Desulfovibrio), были представлены на всех горизонтах подповерхностной водной толщи, и при ПЦР-анализе водных проб участки гена 16S рРНК 6-й подгруппы СРБ (Desulfovibrio-Desulfomicrobium) были обнаружены также на всех этих исследуемых глубинах (табл. 6-9). В свою очередь, с помощью ПЦР было показано присутствие генетического материала СРБ, принадлежащих к роду Desulfotomaculum, не только в подповерхностных аэробных водах, но и практически по всей исследованной верхней водной толще Черного моря (за исключением глубины 165 м). Участки гена 16S рРНК СРБ, принадлежащих к роду Desulfobacter, также встречались не только в аэробных, но и в верхних анаэробных водах (глубина 200 м) (табл. 8-9). Эти данные не противоречат друг другу, так как FISH позволяет обнаруживать, в основном, только метаболически активные клетки, в то время как ПЦР выявляет просто целевые участки ДНК, которые могут принадлежать покоящимся или пережидающим неблагоприятные условия клеткам. 143 Согласно сравнению выверенных аминокислотных последовательностей, кодируемых геном dsrB, большая часть СРБ из верхней водной толщи Черного моря формируют один большой отдельный кластер на филогенетической дендрограмме, наиболее близкий к некультивируемой СРБ из покмарка Норвежского моря [Lazar et al., 2011] (рис. 14). Другим интересным фактом является наличие большого кластера, не содержащего культивируемых СРБ, который включает в себя черноморских СРБ из кислород-содержащих подповерхностных вод (30 м), холодного промежуточного слоя (100 м), верхней зоны хемоклина (145 м) и верхней анаэробной водной толщи (200 м) (рис. 14). Наиболее близкой по гомологии последовательности, кодируемой геном dsrB, к этому кластеру оказалась некультивируемая СРБ из осадков Нанкайского желоба [Kaneko et al., 2007]. Некультивируемые представители рода Desulfobulbus, обнаруженные только в холодном промежуточном слое (100 м) и зоне хемоклина (145-185 м), могут участвовать в процессе анаэробного окисления метана в анаэробной водной толще, в котором представители семейства Desulfobulbaceae играют значительную биогеохимическую роль [Lösekann et al., 2007]. До 2005 г. ген dsrB широко использовался для филогенетической идентификации СРБ [Wagner et al., 1998; Perez-Jimenez a. Kerkhof, 2005], но в настоящее время считается, что, в отличие от гена 16S рРНК (универсальных праймеров к которому для детекции всех СРБ не существует), по транслированным нуклеотидным последовательностям гена dsrB нельзя строить точные филогенетические дендрограммы из-за возможного латерального переноса данного гена [Zverlov et al., 2005; Dar et al., 2007]. Вероятно, именно поэтому при использовании ДГГЭ по гену dsrB с последующим секвенированием в Черном море нами не было обнаружено СРБ, близкородственных подгруппам Desulfotomaculum и Desulfovibrio-Desulfomicrobium, в отличие от методов FISH и ПЦР с 16S рДНК-специфичными праймерами. Тем не менее, анализ последовательностей участков гена dsrB, выделенных и реамплифицированных из ДГГЭ-полос [Geets et al., 2006; Dar et al., 2007; Miletto et al., 2007; Agrawal a. Lal, 144 2009] или полученных с помощью библиотек клонов [Leloup et al., 2007] может весьма эффективно использоваться для изучения различий в составе, разнообразии и динамики сообществ СРБ в различных местообитаниях, что как раз соответствует основной цели нашего исследования. При изучении водной толщи Черного моря ни Ветриани [Vetriani et al., 2003], ни Неретиным с соавторами [Neretin et al., 2007] не было обнаружено генетического материала представителей родов и Desulfotomaculum Desulfomicrobium, а также был идентифицирован только один клон, сходный по нуклеотидной последовательности 16S рРНК с представителями рода Desulfovibrio. В тоже время нами, совокупностью двух методов (FISH и вложенной ПЦР), было показано присутствие не только генетического материала, но и метаболически активных клеток представителей этих родов СРБ (табл. 6-9). Несмотря на то, что представители родов Desulfotomaculum, Desulfomicrobium и Desulfovibrio широко распространены в различных местообитаниях, даже при исследовании анаэробных осадков Черного моря ранее было показано только присутствие участков гена dsrA Desulfomicrobium spp. [Blazejack a. Schippers, 2011]. При этом участки гена aprA (кодирующего α-субъединицу аденозин 5’фосфосульфатредуктазы) данного рода в водных пробах обнаружены не были. В свою очередь, Ветриани и Неретин с соавторами [Vetriani et al., 2003; Neretin et al., 2007] высказывали предположение о присутствии в водной толще Черного море СРБ, сходных по нуклеотидным последовательностям гена 16S рРНК с Desulfobacterium anilinii. В наших исследованиях методом ПЦР генетический материал представителей рода Desulfobacterium не был обнаружен ни на одной глубине подповерхностной водной толщи Черного моря (табл. 8-9). Однако 18 последовательностей реамплифицированных из участков соответствующих гена dsrB, ДГГЭ-полос, выделенных и образовывали отдельный кластер, наиболее сходный (однако с малым процентом гомологии) из культивируемых СРБ только с Desulfobacterium anilinii (рис. 14). Также, в упомянутых выше исследованиях СРБ водной толщи Черного моря [Vetriani et al., 2003; Neretin et al., 2007] не было показано присутствия 145 нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, сходных с последовательностями представителей рода Desulfobulbus, обнаруженных в настоящем исследовании при секвенировании участков гена dsrB (рис. 14). Однако представители рода Desulfobulbus позже были детектированы другими исследователями в черноморских донных осадках [Blazejack a. Schippers, 2011]. Генетический материал представителей подгруппы Desulfococcus- Desulfonema-Desulfosarcina был обнаружен нами методом как вложенной, так и прямой ПЦР, на всех исследованных глубинах подповерхностной водной толщи Черного моря, что согласуется с обнаружением другими исследователями генетического материала представителей данных родов как в водной толще [Neretin et al., 2007], так и в донных осадках [Blazejack a. Schippers, 2011] Черного моря, а также с неоднократным обнаружением представителей подгруппы Desulfococcus-Desulfosarcina в микробных матах, образующихся вблизи метановых сипов [Michaelis et al., 2002; Blumenberg et al., 2004; Treude et al., 2005; Basen et al., 2011]. Вероятно, данная подгруппа является доминирующей во многих сообществах сульфатредуцирующих бактерий Черного моря. Исходя из сравнения результатов наших исследований и имеющихся литературных данных, становится очевидным, что использование разных молекулярно-биологических методов при изучении сообществ сульфатредуцирующих бактерий в Черном море иногда дает отличающиеся и не полностью перекрывающиеся результаты. По-видимому, для получения полного и максимально объективного представления о структуре сообществ микроорганизмов необходимо использовать комплексный подход, включающий в себя не только различные молекулярно-биологические методы, но и использование разных систем праймеров – как специфичных к участкам различных функциональных генов, так и к участкам 16S рРНК. Помимо идентификации сульфатредуцирующих бактерий в Черном море молекулярно-биологическими методами, нам также удалось получить активные накопительные культуры СРБ из кислород-содержащей водной толщи. Это свидетельствует о том, что в аэробных водах Черного моря присутствует не только 146 генетический материал, но и потенциально жизнеспособные клетки СРБ. Выявившиеся отличия в составе сообществ СРБ накопительных культур из кислород-содержащей водной толщи Черного моря от состава сообществ СРБ нативных водных проб с тех же глубин (при анализе методом FISH; табл. 6, 7 и 12) в очередной раз подтверждают общепринятое на данное время мнение, что традиционные микробиологические методы исследования природных местообитаний, основанные на культивировании, не позволяют получить достоверные данные о филогенетическом разнообразии микроорганизмов, обитающих в природе [Wayne et al., 1987; Amann et al., 1995]. Главным образом, это связано с невозможностью воспроизвести в используемых для выделения накопительных культур стандартных питательных средах реальные условия обитания микроорганизмов. По итогам экспериментов по подбору оптимального состава питательной среды для получения активных накопительных культур из аэробной зоны Черного моря мы рекомендуем при выделении накопительных культур СРБ из водной толщи водоемов использовать помимо стандартных питательных сред также среды с другими донорами и акцепторами электронов, а также с добавлением различных ростовых факторов, учитывая имеющиеся данные о содержании в соответствующих водах тех или иных химических соединений. Обе идентифицированные нами культуры – чистая Desulfofrigus euxinos и смешанная, содержащая Desulfosporosinus sp., – представляют определенный научный интерес. На текущий момент времени не известно ни одной чистой культуры сульфатредуцирующих микроорганизмов, выделенной из вод Черного моря (даже из его анаэробной водной толщи, содержащей сероводород). Накопительная культура, содержащая клетки Desulfosporosinus sp., представляет большой интерес тем, что растет на питательной среде с бихроматом калия (10-5 мМ) и потенциально может являться хорошим объектом для разработки технологии биоремедиации почв и сточных вод от загрязнений токсичными солями хрома и других тяжелых металлов. Несмотря на то, что по последовательностям гена 16S рРНК выделенная 147 нами в чистую культуру бактерия рода Desulfofrigus и типовой штамм Desulfofrigus fragile LSv21T [Knoblauch et al., 1999] были очень близки (гомология 99%), уровень гомологии при проведении ДНК-ДНК гибридизации этих штаммов составил всего 56%, что свидетельствует о принадлежности данных сульфатредуцирующих бактерий к разным видам, поскольку микроорганизмы считаются принадлежащими к одному виду, если уровень гомологии при ДНКДНК гибридизации ≥70% [Wayne et al., 1987]. Таблица 17. Сравнение выделенной чистой культуры Desulfofrigus sp. штамм SrB-30 и типового штамма Desulfofrigus fragile LSv21T по морфологическим признакам и отношению к физико-химическим параметрам культивирования. Desulfofrigus sp. Параметр штамм SrB-30 Desulfofrigus fragile штамм LSv21T [Knoblauch et al., 1999] Форма клеток Палочки Палочки Размер клеток, мкм 0,5-0,8 × 3,7-4,2 0,8 × 3,2-4,2 Оптимум рН 7,2 7,0-7,4 Диапазон pH 6,6-7,8 - // - Оптимум температур, °С 15-18 18 Диапазон температур, °С 4-26 -1,8-27 По морфологическим признакам и отношению к исследованным физикохимическим параметрам культивирования (температуре и pH) выделенная нами чистая культура была во многом сходна с типовым штаммом D. fragile LSv21T [Knoblauch et al., 1999] (табл. 17). Незначительно отличалась длина клеток – у типового штамма встречались и более мелкие клетки, однако максимальный размер клеток был одинаковым. Такое различие может объясняться использованием для измерения размера клеток культур, находящихся на разных стадиях роста. Оптимальная температура роста обоих представителей рода Desulfofrigus была одинаковой, но типовой штамм LSv21T обладал более широким 148 диапазоном температур, пригодных для роста (табл. 17). Содержание ГЦ у обоих штаммов было сходным – 52,0 и 52,1 мол.%. Выделенная нами в чистую культуру сульфатредуцирующая бактерия Desulfofrigus sp. штамм SrB-30 обладала значительно более широким спектром используемых доноров и акцепторов электронов, чем типовой штамм (табл. 14). Существенно различались также и составы жирных кислот в клетках штамма SrB-30 и типового штамма D. fragile LSv21T (табл. 15). Две жирные кислоты – С16:0 и С16:1 w9c преобладали в составе клеток как D. fragile LSv21T (21,7 и 30,6% соответственно), так и Desulfofrigus sp. SrB-30 (17,73 и 35,96% соответственно). Жирная кислота С18:1 w11c, обнаруживаемая в значительном количестве в клетках типового штамма LSv21T (18,5%), у черноморского штамма SrB-30 отсутствовала. В свою очередь, содержание жирной кислоты C14:0 в клетках штамма SrB-30 было в 2,3 раза больше, чем у типового штамма, а также в относительно большом количестве (8,82%) была обнаружена жирная кислота С18:1 w7c, отсутствующая у D. fragile LSv21T (табл. 15). На основании обнаруженных генетических и физиолого-биохимических отличий от типового штамма D. fragile LSv21T впервые выделенный нами из кислород-содержащих вод Черного моря штамм сульфатредуцирующей бактерии SrB-30 был отнесен к новому виду рода Desulfofrigus. Культура Desulfofrigus sp. штамм SrB-30 депонирована под видовым названием Desulfofrigus euxinos штамм SrB-30 (от древнегреческого названия Черного моря Eúxeinos Póntos) в две международные коллекции микроорганизмов: DSMZ (Германия) и JCM (Япония). Род Desulfofrigus содержит на данный момент всего два описанных вида СРБ – Desulfofrigus fragile и Desulfofrigus oceanense [Knoblauch et al., 1999], выделенных из морских осадков вблизи архипелага Шпицберген. Согласно литературным данным, помимо арктических осадков клетки Desulfofrigus sp. были обнаружены в накопительных культурах СРБ, выделенных из осадков зоны Бенгальского апвеллинга Атлантического океана около побережья Намибии [Kraft et al., 2012]. Также в накопительных культурах, выделенных из донных осадков в гавани г. Галифакс (Канада), содержащих следы тринитротолуола (последствие 149 мощнейшего взрыва транспортного судна 06.12.1917), были обнаружены последовательности гена 16S рРНК, на 98% сходные с соответствующими последовательностями Desulfofrigus fragile [Yang et al., 2009]. Отличительной чертой представителей данного рода от других СРБ является оптимальный рост при низких температурах [Bergey’s manual of systematic bacteriology, 2005]. От других же психрофильных СРБ представителей рода Desulfofrigus отличает неспособность использовать пропионат в своем метаболизме [Bergey, 2005]. По результатам экспериментов по культивированию D. euxinos с различными начальными концентрациями кислорода в газовой фазе было показано, что уже небольшие концентрации О2 влияют на численность клеток и количество образуемого культурой сероводорода. При начальной концентрации кислорода в газовой фазе 2,6% численность клеток снижалась почти в 2 раза, количество образуемого сероводорода – в 4,5 раза, при этом скорость сульфатредукции (ССР) снижалась незначительно. Однако повышение начальной концентрации О2 до 5,2% приводило к снижению ССР более чем в 4 раза по сравнению с анаэробным контролем. Увеличение начальной концентрации кислорода в газовой фазе до 7,8% сопровождалось снижением численности клеток в 4,5 раза и образованием культурой лишь незначительных концентраций сероводорода. Дальнейшее увеличение начального содержания О2 в газовой фазе полностью ингибировало рост культуры и процесс сульфатредукции. Общая тенденция такова, что увеличение начальной концентрации кислорода в газовой фазе влияет на образование сероводорода сильнее, чем на процесс деления клеток. Однако нужно принимать во внимание, что часть образуемого клетками сероводорода расходуется на восстановление содержащегося в питательной среде кислорода. Нужно отметить, что в данных экспериментах мы не осуществляли постоянное поддержание определенных концентраций растворенного кислорода в среде культивирования D. euxinos SrB-30 из-за сложности и дороговизны нужного оборудования (прецизионные смеситель газов и O2-детектор), а вносили однократно необходимый объем стерильного воздуха в газовую фазу над 150 питательной средой. Поскольку кислород восстанавливается сероводородом (что в наших экспериментах подтверждается более сильным снижением продукции сероводорода по сравнению с уменьшением численности клеток), а также может непосредственно поглощаться клетками СРБ, очевидно, что его содержание в питательной среде в течение культивирования уменьшалось. Однако снижение численности клеток и интенсивности процесса сульфатредукции в зависимости от количества внесенного воздуха во всех экспериментах в сравнении с контролем (культивирование в строго анаэробных условиях) свидетельствует о том, что клетки подвергались значительным кислородным стрессам. Численность клеток в проведенных экспериментах снижалась практически пропорционально концентрации вносимого кислорода в газовой фазе сосудов культивирования, что позволяет адекватно сравнивать между собой полученные результаты. Таким образом, выделенная нами из подповерхностных кислород- содержащих вод Черного моря культура сульфатредуцирующей бактерии, описанной как новый вид Desulfofrigus euxinos штамм SrB-30, обладает относительно высокой аэротолерантностью. Начальные концентрации кислорода в газовой фазе над средой культивирования вплоть до 8% приводят к значительному снижению скоростей роста и сульфатредукции культуры, однако не вызывают полной гибели клеток. По гидрохимическим характеристикам водная толща Гданьской впадины Балтийского моря сходна с таковой Черного моря. В обеих меромиктических экосистемах имеет место стратификация водных масс с ярко выраженным хемоклином, где наблюдается резкое уменьшение концентрации растворенного кислорода и появление растворенного сероводорода. Также в обоих морях в аэробных водах заметен локальный пик содержания кислорода, по-видимому, приходящийся на горизонты с меньшими интенсивностями биогеохимических процессов, а, следовательно, с меньшим потреблением растворенного в воде кислорода. По результатам ПЦР-анализа сообщества СРБ кислород-содержащей водной толщи обоих морских водоемов оказались достаточно схожи. Участки генов β- 151 субъединицы диссимиляционной сульфитредуктазы и 16S рРНК 5-й и 6-й подгрупп СРБ (Desulfococcus-Desulfonema-Desulfosarcina и Desulfovibrio- Desulfomicrobium соответственно) были обнаружены в обоих морях на всех исследованных глубинах (табл. 8, 9 и 16). Участки гена 16S рРНК представителей рода Desulfotomaculum (1-я подгруппа СРБ) присутствовали во всех гидрохимически различающихся слоях как Черного, так и Балтийского морей, однако в Черном море они не были обнаружены в середине зоны хемоклина (глубина – 165 м), а в Гданьской впадине – в придонном горизонте (глубина – 107 м). Генетический материал микроорганизмов рода Desulfobacter (4-я подгруппа СРБ) в обеих экосистемах был детектирован в верхних кислород-содержащих горизонтах (глубина 30 м в Черном море и 0-30 м в Гданьской впадине Балтийского моря), а в зоне хемоклина отсутствовал. При этом в Черном море последовательности гена 16S рРНК, специфичные для Desulfobacter spp., также были обнаружены в верхних горизонтах анаэробных вод (на глубине 200 м), а в Гданьской впадине Балтийского моря на обоих исследованных анаэробных горизонтах они отсутствовали (табл. 8, 9 и 16). Несколько большие различия наблюдались в сообществах СРБ, ассоциированных с крупной взвесью (≥1,2 мкм) (табл. 9 и 16). Так, гены 16S рРНК представителей 1-й подгруппы СРБ (род Desulfotomaculum) не были детектированы в зоне хемоклина Гданьской впадины Балтийского моря, в то время как в Черном море они были обнаружены в верхней и нижней частях хемоклина (глубины – 145 м и 165 м). Наибольшее различие наблюдалось в распределении по глубине участков генов 16S рРНК ассоциированных с взвесью представителей 4-й подгруппы СРБ (род Desulfobacter) – в Черном море было показано их присутствие во всей исследованной водной толще, а в Гданьской впадине Балтийского моря их обнаружили исключительно в анаэробных водах. Участки генов β-субъединицы диссимиляционной сульфитредуктазы (dsrB) и 16S рРНК представителей 5-й и 6-й подгрупп СРБ (Desulfococcus-Desulfonema-Desulfosarcina и Desulfovibrio-Desulfomicrobium соответственно), ассоциированных с крупной взвесью, как и в случае свободноживущих микроорганизмов были обнаружены в 152 обоих морях на всех исследованных горизонтах. Поскольку ассоциированные с взвесью представители СРБ находятся в тесной взаимосвязи с микроорганизмами других физиологических групп или являются симбионтами беспозвоночных животных и водорослей, то выявленные отличия могут объясняться различным составом микробных сообществ, флоры и фауны Черного и Балтийского морей. Выявление участков генов 16S рРНК, специфичных для представителей 5-й и 6-й подгрупп СРБ, во всей исследованной кислород-содержащей водной толще в обоих морях можно объяснить тем, что данные доминантные филогенетические подгруппы СРБ включают в себя не один, а несколько довольно обширных родов. Кроме того, на данный момент имеется много данных, подтверждающих наличие у бактерий рода Desulfovibrio весьма эффективных популяционных и ферментативных систем защиты от окислительных стрессов [Dolla et al., 2006; Brioukhanov et al., 2010], а представители подгруппы Desulfonema-Desulfococcus были обнаружены в верхних слоях микробных матов, подвергающихся интенсивному насыщению кислородом в светлое время суток [Krekeler et al., 1998] и, по-видимому, также обладают относительной устойчивостью к кислороду. Представители рода Desulfonema являются нитчатыми формами, возможно, имеющими слизистые чехлы, которые могут затруднять проникновение кислорода в клетки в аэробных морских водах. Генетический материал СРБ подгрупп 2 и 3 (рода Desulfobulbus и Desulfobacterium) не был обнаружен с помощью ПЦР ни в одной водной пробе, как среди свободноживущих, так и ассоциированных с крупной взвесью СРБ. По литературным данным [Lösekann et al., 2007; Chevalier et al., 2014] представители рода Desulfobulbus в морских экосистемах часто обнаруживаются в консорциумах с представителями групп ANME-1 и -2 и, по-видимому, играют определенную роль в анаэробном окислении метана. Можно предположить, что данные СРБ не обладают мощными системами антиокислительной защиты, либо нуждаются в обязательном присутствии метанотрофных архей, вследствие чего не выдерживают конкуренции с СРБ, более приспособленными к условиям зоны 153 хемоклина и аэробной водной толщи Черного и Балтийского морей. Однако нельзя забывать о том, что используемые праймерные системы для ПЦР могут не охватывать всего разнообразия СРБ данного рода, особенно, учитывая тот факт, что по результатам анализа транслированных аминокислотных последовательностей участков гена dsrB в водах Черного моря присутствует целый кластер последовательностей, гомологичных последовательностям гена dsrB некультивируемых представителей рода Desulfobulbus. ДГГЭ-профиль сообществ СРБ на различных горизонтах водной толщи Гданьской впадины Балтийского моря был более однородным по количеству и интенсивности полос ДНК по сравнению с таковым для Черного моря. Максимальная глубина в точке отбора проб в Черном море составляла около 2000 м, в то время как максимальная глубина Гданьской впадины – всего 110 м. Черное море является геохимически сформировавшейся стабильной меромиктической экосистемой, в то время как водная толща Балтийского моря и, в частности, Гданьской впадины, подвергается периодическим штормовым перемешиваниям, а так же массивным забросам придонных вод из Северного моря, что способствует обмену прокариотических и эукариотических планктонных сообществ из разных горизонтов и приводит к их большей однородности по глубине. При анализе транслированных аминокислотных последовательностей участков гена dsrB в обеих морских экосистемах на филогенетических дендрограммах (рис. 14 и 23) были выделены крупные кластеры, не имеющие высокой гомологии с известными на данный момент последовательностями гена dsrB как культивируемых, так и некультивируемых СРБ. Остальные проанализированные последовательности, в основном, хорошо кластеризовались с последовательностями гена dsrB некультивируемых СРБ из различных морских местообитаний. В том числе, несколько последовательностей из Гданьской впадины попали в кластер с последовательностями участка гена dsrB, полученными из вод Черного моря (с глубины 200 м; рис 23). И только шесть последовательностей из зон холодного промежуточного слоя (ХПС) и хемоклина Черного моря образовывали кластер с представителями рода Desulfobulbus. 154 Вероятно, некоторые виды морских СРБ являются космополитами, широко распространенными в Мировом океане, в том числе и в изучаемых нами меромиктических экосистемах. При этом как в Черном, так и в Балтийском морях, возможно, обитают уникальные сульфатредуцирующие бактерии, не встречающиеся (или не обнаруженные до сих пор) в других местообитаниях. Учитывая, что большая часть полученных в нашем исследовании транслированных последовательностей гена dsrB гомологична таковым для некультивируемых СРБ, становится очевидным, что меромиктические экосистемы имеют большой потенциал в плане выделения из них чистых культур сульфатредуцирующих бактерий, в том числе аэротолерантных. Помимо данных о последовательностях функционального гена dsrB, содержащихся в водной толще Черного и Балтийского морей, из кислородсодержащих вод обеих экосистем были получены активные накопительные (а в случае Черного моря – также бинарная и чистая) культуры сульфатредуцирующих бактерий. Данный факт подтверждает присутствие в аэробной водной толще Черного моря и Гданьской впадины Балтийского моря метаболически активных клеток анаэробных аэротолерантных СРБ. потенциально 155 Заключение. В настоящей работе впервые было детально изучено филогенетическое разнообразие сульфатредуцирующих бактерий в подповерхностной кислородсодержащей водной толще Черного и Балтийского морей. В исследованиях были использованы как традиционные микробиологические методы, основанные на выделении микроорганизмов, их культивировании в различных условиях и описании морфологии клеток, так и современные молекулярно-биологические методы анализа микробных сообществ (флуоресцентная in situ гибридизация, вложенная и количественная электрофорез с ПЦР, последующим денатурирующий секвенированием градиентный гель- выделенных и реамплифицированных участков ДНК), что позволило получить всестороннюю характеристику сообществ СРБ в гидрохимически различающихся слоях меромиктических зон обоих морей. Методом ПЦР было показано присутствие генетического материала СРБ четырех основных филогенетических подгрупп (Desulfotomaculum, Desulfobacter, Desulfococcus-Desulfonema-Desulfosarcina и Desulfovibrio-Desulfomicrobium) на различных глубинах кислород-содержащей подповерхностной водной толщи Черного моря и Гданьской впадины Балтийского моря. Результаты анализа транслированных аминокислотных последовательностей гена dsrB, кодирующего кодирующего ключевой фермент сульфатредуцирующих микроорганизмов – диссимиляционную сульфитредуктазу, свидетельствуют о том, что большинство СРБ в обеих меромиктических экосистемах наиболее сходны с некультивируемыми и неописанными к настоящему времени микроорганизмами, что представляет большой потенциал в плане выделения новых чистых культур аэротолерантных сульфатредуцирующих бактерий из обоих морей. Получение активных накопительных культур СРБ из кислород-содержащих вод Черного и Балтийского морей свидетельствует о присутствии там не только генетического материала, но и метаболически активных клеток СРБ. Способность впервые выделенной нами из аэробных вод Черного моря чистой культуры СРБ, описанной и депонированной как новый вид рода Desulfofrigus (Desulfofrigus 156 euxinos штамм SrB-30), выдерживать кислородные стрессы свидетельствует о её приспособленности к обитаниям в условиях, подвергающихся воздействию кислорода. Учитывая, что в обеих меромиктических экосистемах вертикальная циркуляция вод затруднена вследствие существования постоянных гало- и пикноклинов, и суммируя полученные в данной работе результаты, можно заключить, что в кислород-содержащей водной толще и зоне хемоклина Черного моря и Гданьской впадины Балтийского моря существуют сложившиеся сообщества СРБ, приспособленные к существованию в микроаэробных условиях. 157 Выводы. 1. Методом прямой и вложенной ПЦР в подповерхностных кислородсодержащих водах и в зоне хемоклина Черного и Балтийского морей (Гданьская впадина) обнаружены участки генов 16S рРНК сульфатредуцирующих бактерий, принадлежащих к филогенетическим Desulfococcus-Desulfonema-Desulfosarcina, подгруппам Desulfotomaculum, Desulfovibrio-Desulfomicrobium и Desulfobacter. 2. Доля СРБ в подповерхностной водной толще Черного моря в период исследований составляла от 0,065 до 9% от числа клеток всех прокариотных микроорганизмов. 3. По транслированным аминокислотным последовательностям гена dsrB сульфатредуцирующие бактерии, обитающие в подповерхностных водах и в зоне хемоклина Черного и Балтийского морей, имеют наибольшую гомологию с некультивируемыми СРБ из различных морских местообитаний. Кроме того, на каждой исследованной глубине в обеих меромиктических экосистемах были также обнаружены последовательности гена dsrB, не имевшие высокой (≥87%) гомологии с известными последовательностями гена dsrB из GenBank. 4. Из подповерхностной аэробной водной толщи и зоны хемоклина Черного моря, а также из кислород-содержащих вод Гданьской впадины Балтийского моря, были выделены активные накопительные культуры СРБ, что подтверждает жизнеспособность обнаруженных на исследованных водных горизонтах обоих морей сульфатредуцирующих бактерий. 5. Впервые выделенная из кислород-содержащих подповерхностных вод Черного моря чистая культура СРБ была полностью охарактеризована и описана как новый вид Desulfofrigus euxinos штамм SrB-30. Клетки D. euxinos SrB-30 обладают относительной аэротолерантностью и способны расти и осуществлять процесс сульфатредукции при начальных концентрациях кислорода в газовой фазе до 8%. 158 СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 1. Андерсен Э.Х., Паулак Д. Биогенные вещества и эвтрофикация в Балтийском море: причины, последствия, решения. ООО «Калининградский печатный двор», Калининград. – 2007. – 34 с. 2. Безбородов А.А., Еремеев В.Н. Черное море: Зона взаимодействия аэробных и анаэробных вод. МГИ АНУ, Севастополь. – 1993. – 299 с. 3. Бруевич С.В. Гидрохимия Среднего и Южного Каспия. Изд-во АН СССР, Москва. – 1937. – 352 с. 4. Брюханов А.Л., Корнеева В.А., Канапацкий Т.А., Захарова Е.Е., Менько Е.В., Русанов И.И., Пименов, Н.В. Изучение состава сообществ сульфатредуцирующих бактерий в аэробных водах и зоне хемоклина Чёрного моря с использованием метода FISH. // Микробиология. – 2011. – V.80(1). – С.112-120. 5. Брюханов А.Л., Нетрусов А.И. Аэротолерантность строго анаэробных микроорганизмов: факторы защиты от окислительного стресса. // Прикл. биохимия и микробиология. – 2007. – Т.43(6). – С.637-654. 6. Вайнштейн М.Б., Матросов А.Г., Баскунов Б.П., Зякун А.М., Иванов М.В. О тиосульфате как промежуточном продукте бактериальной сульфатредукции. // Микробиология. – 1980. – Т.49(6). – С.855-858. 7. Волков И.И., Розанов А.Г., Демидова Т.П. Зимнее состояние экосистемы открытой части Черного моря. В: Соединения неорганической восстановленной серы и растворенный марганец в воде Черного моря. Ред.: Виноградов М.Е. ИО РАН, Москва. – 1992. – C.38-50. 8. Гулин М.Б. Изучение бактериальных процессов сульфатредукции и хемосинтеза в водной среде Черного моря. Автореф. дисс. канд. биол. наук. ИНБЮМ, Севастополь. – 1991. – 25 с. 9. Добровольский А.Д., Залогин Б.С. Моря СССР. Изд-во МГУ, Москва. – 1982. – 192 с. 10. Иванов М.В., Леин А.Ю., Карначук О.В. Новые доказательства биогенной природы H2S в Черном море. // Геохимия. – 1992. – №8. – С.1186-1194. 11. Кондратьев С.И., Внуков Ю.Л. Структура вертикального распределения кислорода в водах приустьевого взморья Дуная в осенний период 1997 г. // Экологическая безопасность прибрежной и шельфовой зон и комплексное использование ресурсов шельфа. – 1999. – В.1. – С.125-137. 12. Кудрявцева Е.А., Саввичев А.С., Александров С.В., Канапацкий Т.А., Пименов Н.В. Бактериопланктон Гданьского бассейна Балтийского моря. // Микробиология. – 2012. – Т.81(3). – С.377-388 159 13. Леин А.Ю., Иванов М.В., Вайнштейн М.Б. Баланс сероводорода в глубоководной зоне Черного моря. // Микробиология. – 1990. – Т.59(4). – С.656665. 14. Мицкевич И.Н. Общая численность и биомасса микроорганизмов глубинах Черного моря. // Микробиология. – 1979. – №.3. – С.552-557. в 15. Назина Т.Н., Иванова А.Е., Канчавели Л.П., Розанова Е.П. Новая спорообразующая термофильная метилотрофная сульфатвосстанавливающая бактерия Desulfotomaculum kuznetsovii sp. nov. // Микробиология. – 1988. – Т.57(5). – С.823-828. 16. Нефть и окружающая среда Калининградской области. Т. II.: Море. // Ред. Сивков В.В. Терра Балтика, Калининград. – 2012. 17. Пименов Н.В., Русанов И.И., Юсупов С.К., Фридрих Ю., Леин А.Ю., Верли Б., Иванов М.В. Микробиологические процессы на границе аэробных и анаэробных вод в глубоководной зоне Черного моря. // Микробиология. –2000. – Т.69(4). – С.527-540. 18. Ребриков Д.В., Трофимов Д.Ю. ПЦР «в реальном времени»: подходы к анализу данных. // Прикл. биохимия и микробиология. – 2006. – Т.42(5). – С.520528. 19. Рябинин А.И., Коновалов С.К. Водородный показатель (рН) вод Черного моря. // Метеорология и гидрология. – 1987. – №10. – С.75-81. 20. Саввичев А.С., Русанов И.И., Юсупов С.К., Байрамов И.Т., Пименов Н.В., Леин А.Ю., Иванов М.В.. Процесс микробной сульфатредукции в осадках литорали Кандалакшского залива Белого моря. // Микробиология. – 2003. – Т.72(4). – С.535-546. 21. Сапожников В.В., Мордасова Н.В. Опыт уникального мониторинга изменений экосистемы Каспийского моря после подъёма уровня. // Вопросы промысловой океанологии. Ред.: Алексеева А.П., Кочикова В.Н., Масленникова В.В.. Изд-во ВНИРО, Москва. – 2007. – В.4(1). – С.132-143. 22. Сорокин Ю.И. Экспериментальное исследование редукции сульфатов в Черном море с помощью 35S. // Океанология. – 1970. – Т.11. – С.51-61. 23. Сорокин Ю.И. Экспериментальные данные о скорости окисления сероводорода в Черном море. // Океанология. – 1971. – Т.11(3). – С.423-431. 24. Сорокин Ю.И. Черное море: Природа, ресурсы. // «Наука», Москва. – 1982. – 216 с. 160 25. Шубенкова О.В., Лихошвай А.В., Канапацкий Т.А., Пименов Н.В. Микробное сообщество восстановленных осадков покмарка Гданьской впадины Балтийского моря. // Микробиология. – 2010. – Т.79(6). – С.801-811. 26. Якушев Е.В., Лукашев Ю.Ф., Часовников В.К., Чжу В.П. Современное представление о вертикальной гидрохимической структуре редокс-зоны Черного моря. В: Комплексные исследования северо-восточной части Черного моря. Ред.: Зацепин А.Г., Флинт М.В. «Наука», Москва. – 2002. – С.119-133. 27. Abdollahi H., Wimpenny J.W.T. Effects of oxygen on the growth of Desulfovibrio desulfuricans. // J.gen.Microbiol. – 1990. – V.136. P.1025-1030. 28. Aeckersberg F., Rainey F. A., Widdel, F. Growth, natural relationships, cellular fatty acids and metabolic adaptation of sulfate-reducing bacteria that utilize long-chain alkanes under anoxic conditions. // Arch. Microbiol. – 1998. – V.170. – P.361-369. 29. Agrawal A., Lal B. Rapid detection and quantification of bisulfite reductase genes in oil field samples using real-time PCR. // FEMS Microbiol. Ecol. – 2009. –V.69(2). – P.301-312. 30. Alazard D., Josep M., Battaglia-Brunet F., Cayol J.L., Ollivier B. Desulfosporosinus acidiphilus sp. nov.: a moderately acidophilic sulfate-reducing bacterium isolated from acid mining drainage sediments. // Extremophiles. – 2010. – V.14(3). – P.305-312. 31. Albert D.B., Taylor C., Martens C.S. Sulfate reduction rates and low molecular weight fatty acid concentrations in the water column and surficial sediments of the Black Sea. // Deep Sea Research Part I: Oceanographic Research Papers. – 1995. – V.42(7). – P.1239-1260. 32. Amann R.I., Binder B.J., Olson R.J., Chisholm S.W., Devereux R., Stahl D.A. Combination of 16S rRNA-targeted oligonucleotide probes with flow cytometry for analyzing mixed microbial populations. // Appl. Environ. Microbiol. – 1990. – V.56(6). – P.1919-1925. 33. Amann R., Fuchs B.M., Behrens S. The identification of microorganisms by fluorescence in situ hybridisation. // Curr. Opin. Biotechnol. – 2001. – V.12(3) . – P.231236. 34. Amann R.I., Ludwig W., Schleifer K.H. Fluorescent-oligonucleotide probing of whole cells for determinative, phylogenetic and environmental studies in microbiology. // J. Bacteriol. – 1995. – V.172. – P.762-770. 35. Amann R.I., Zarda B., Stahl D.A., Schleifer K.H. Identification of individual prokaryotic cells by using enzyme-labeled, rRNA-targeted oligonucleotide probes. // Appl. Environ. Microbiol. – 1992. – V.58(9). – P.3007-3011. 161 36. Baars J.K. Over sulfaatreductie door Bacterien. // Dissertation, W. D. Meinema, N. V., Delft, Holland. – 1930. – 169 p. 37. Baena S., Fardeau M.L., Labat M., Ollivier B., Garcia J.L., Patel, B.K.C. Desulfovibrio aminophilus sp. nov., a novel amino acid degrading and sulphatereducing bacterium from an anaerobic dairy wastewater lagoon. // J. Syst. Appl. Microbiol. – 1998. – V.21. – P.498-504. 38. Bagwell C.E., Formolo M., Ye Q., Yeager C.M., Lyons T.W., Zhang C.L. Direct analysis of sulfate reducing bacterial communities in gas hydrate-impacted marine sediments by PCR-DGGE. // J. Basic. Microbiol. – 2009. – V.49(1). – P.87-92. 39. Bahr M., Crump B.C., Klepac-Ceraj V., Teske A., Sogin M.L., Hobbie J.E. Molecular chacterization of sulfatereducing bacteria in a New England salt marsh. // Environ. Microbiol. – 2005. – V.7. – P.1175-1185. 40. Bak F., Pfennig, N. Chemolithotrophic growth of Desulfovibrio sulfodismutans sp. nov. by disproportionation of inorganic compounds. // Arch. Microbiol. – 1987. – V.147. – P.184-189. 41. Bale S.J., Goodman K., Rochelle P.A., Marchesi J.R., Fry J.C., Weightman A.J., Parkes R.J. Desulfovibrio profundus sp. nov., a novel barophilic sulfate-reducing bacterium from deep sediment layers in the Japan Sea. // Int. J. Syst. Bacteriol. – 1997. – V.47(2). – P.515-521. 42. Basen M., Krüger M., Milucka J., Kuever J., Kahnt J., Grundmann O., Meyerdierks A., Widdel F., Shima S. Bacterial enzymes for dissimilatory sulfate reduction in a marine microbial mat (Black Sea) mediating anaerobic oxidation of methane. // Environ. Microbiol. – 2011. – V.13(5). – P.1370-1379. 43. Bauman J.G., Wiegant J., Borst P., van Duijn P. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochrome labelled RNA. // Exp. Cell Res. – 1980 . – V.128(2). – P.485-490. 44. Baumgarten A., Redenius I., Kranczoch J., Cypionka H. Periplasmic oxygen reduction by Desulfovibrio species. // Arch. Mikrobiol. – 2001. – V.176(4). – P.306-309. 45. Beech I.B., Sunner I.A. Sulphate-reducing bacteria and their role in corrosion of ferrous materials. In Sulphate-Reducing Bacteria: Environmental and Engineered Systems. Eds: Barton L. L., Hamilton, W. A. Cambridge Univ. Press, Cambridge, United Kingdom. – 2007. – P.459-482. 46. Beijerinck W. M. Über Spirillum desulphuricans als Ursache von Sulfatreduktion. // Zentralb. Bakteriol. Parasitk. Infekt. Abt. II. – 1895. – V.1. – P.49-59 47. Ben-Dov E., Brenner A., Kushmaro A. Quantification of sulfate-reducing bacteria in industrial wastewater by real-time polymerase chain reaction (PCR) using dsrA and apsA genes. // Microb. Ecol. – 2007. – V.54. – P.439-451. 162 48. Bergey’s manual of systematic bacteriology. V.2.: The Proteobacteria. Part C: The Alpha-, Beta-, Delta-, and Epsilonproteobacteria. Ed.: Garrity G.M. Springer, Dordrecht. – 2005. – 1388 p. 49. Besaury L. Marty F., Buquet S., Mesnage V., Muyzer G., Quillet L. Culturedependent and independent studies of microbial diversity in highly copper-contaminated Chilean marine sediments. // Microb. Ecol. – 2013. – V.65(2). – P.311-324. 50. Blazejak A., Schippers A. Real-Time PCR quantification and diversity analysis of the functional genes aprA and dsrA of sulfate-reducing prokaryotes in marine sediments of the Peru Continental Margin and the Black Sea. // Front. Microbiol. doi: 10.3389/fmicb.2011.00253. eCollection 2011. – 2011. 51. Blumenberg M., Seifert R., Reitner J., Pape T., Michaelis W. Membrane lipid patterns typify distinct anaerobic methanotrophic consortia. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 2004. – V.101(30). – P.11111-11116. 52. Bobrow M.N., Harris T.D., Shaughnessy K.J., Litt G.J. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. Application to immunoassays. // J. Immunol. Methods. – 1989. – V.125. – P.279-285. 53. Bobrow M.N., Litt G.J., Shaughnessy K.J., Mayer P.C., Conlon J. The use of catalyzed reporter deposition as a means of signal amplification in a variety of formats. // J. Immunol. Methods. – 1992. – V.150. – P.145-149. 54. Bobrow M.N., Shaughnessy K.J., Litt G.J. Catalyzed reporter deposition, a novel method of signal amplification. // J. Immunol. Methods. – 1991. – V.137. – P.103-112. 55. Boschker H.T.S., Nold S.C., Wellsbury P., Bos D., De Graaf W., Pel R., Parkes R.J., Cappenberg, T.E. Direct linking of microbial populations to specific biogeochemical processes by 13C-labelling of biomarkers. // Nature. – 1998. – V.392(6678). – P.801-805. 56. Bottari B., Ercolini D., Gatti M., Neviani E. Application of FISH technology for microbiological analysis: current state and prospects. // Appl. Microbiol. Biotechnol. – 2006. – V.73(3). – P.485-494. 57. Bottcher M.E., Thamdrup B., Gehre M., Theune A. S34/S32 and O18/O16 fractionation during sulphur disproportionation by Desulfobulbus propionicus. // Geomicrobiol. J. – 2005. – V.22. – P.219-226. 58. Bozo-Hurtado L., García-Amado M.A., Chistoserdov A., Varela R., Narvaez J.J., Colwell R., Suárez P. Identification of bacteria in enrichment cultures of sulfate reducers in the Cariaco Basin water column employing Denaturing Gradient Gel Electrophoresis of 16S ribosomal RNA gene fragments. // Aquat. Biosyst. – 2013. – V.9(1). – P.17. 163 59. Brettar I., Christen R., Höfle M.G. Analysis of bacterial core communities in the central Baltic by comparative RNA-DNA-based fingerprinting provides links to structure-function relationships. // ISME J. – 2012. –V.6(1) – P.195-212. 60. Brioukhanov A.L., Pieulle L., Dolla A. Antioxidative defense systems of anaerobic sulfate-reducing microorganisms. In: Current Research, Technology and Education Topics in Applied Microbiology and Microbial Biotechnology. Ed. By Mendez-Vilas A. Microbiology Book Series. Badajoz: Formatex Research Center. – 2010. –V.1. – P.148-159. 61. Bryant M.P. Commentary on the Hungate technique for culture of anaerobic bacteria. // Am. J. Clin. Nutr. – 1972. – V.25. – P.1324-1328. 62. Bryant M.P., Campbell L.L., Reddy C.A., Crabill M.R. Growth of Desulfovibrio in lactate or ethanol media low in sulfate in association with H 2-utilizing methanogenic bacteria. // Appl. Environ. Microbiol. – 1977. – V.33. – P.1162-1169. 63. Bühring S.I., Elvert M., Witte U. The microbial community structure of different permeable sandy sediments characterized by the investigation of bacterial fatty acids and fluorescence in situ hybridization. // Environ. Microbiol. – 2005. – V.7(2). – P.281293. 64. Buisman C.J.N., Geraats B.G., Ijspeert P., Lettinga G. Optimisation of sulphur production in a biotechnological sulphide-removing reactor. // Biotechnol. Bioeng. – 1990. – V.35. – P.50-56. 65. Campbell L.L., Frank H.A., Hall R.E. Studies on thermophilic sulfate-reducing bacteria. I. Identification of Sporovibrio desulfurican as Clostridium nitrificans. // J. Bacteriol. – 1957. – V.73. – P.516-521. 66. Campbell L.L., Postgate J.R. Classification of the spore-forming sulfate-reducing bacteria. // Bacteriol. Rev. – 1965. – V.29(3). – P.359-363. 67. Canfield D.E., Des Marais D.J. Aerobic sulfate reduction in microbial mats. // Science. – 1991. – V.251. – P.1471-1473. 68. Carstensen J., Conley D.J., Bonsdorff E., Gustafsson B.G., Hietanen S., Janas U., Jilbert T., Maximov A., Norkko A., Norkko J., Reed D.C., Slomp C.P., Timmermann K., Voss M. Hypoxia in the Baltic Sea: biogeochemical cycles, benthic fauna, and management. // Ambio. – 2014. – V.43(1). – P.26-36. 69. Castro H.F., Williams N.H., Ogram A. Phylogeny of sulfate-reducing bacteria. // FEMS Microb. Ecol. – 2000. – V.31. – P.1-9. 70. Chevalier N., Bouloubassi I., Birgel D., Taphanel M.H., López‐García P. Microbial methane turnover at Marmara Sea cold seeps: a combined 16S rRNA and lipid biomarker investigation. // Geobiology. – 2013. – V.11(1). – P.55-71. 164 71. Cohn F. Beiträge zur Physiologie der Phycochromaeen unf Florideen. // M. S.-P. Institut Archiv für Mikroskopische Anatomie Max Cohen & Sohn Bonn. – 1867. – V.3. – P.1-60. 72. Cottrell M.T., Cary S.C. Diversity of dissimilatory bisulfite reductase genes of bacteria associated with the deep-sea hydrothermal vent polychaete annelid Alvinella pompejana. // Appl. Environ. Microbiol. – 1999. – V.65(3). – P.1127-1132. 73. Cravo-Laureau C., Matheron R., Cayol J.L., Joulian C., Hirschler-Réa A. Desulfatibacillum aliphaticivorans gen. nov., spec. nov., and n-alkane and n-alkene degrading, sulphate-reducing bacterium. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. – 2004. – V.54. – P.77-83. 74. Cypionka H. Oxygen respiration by Desulfovibrio species. // Annu. Rev. Microbiol. – 2000. – V.54. – P.827-848. 75. Dalsgaard T., Bak F. Nitrate reduction in a sulfatereducing bacterium, Desulfovibrio desulfuricans, isolated from rice paddy soil: sulphide inhibition, kinetics, and regulation. // Appl. Environ. Microbiol. – 1994. – V.60. – P.291-297. 76. Davidova I.A., Duncan K.E., Choi O.K., Suflita J.M. Desulfoglaeba alkanexedens gen. nov., sp. nov., an n-alkane degrading, sulphate-reducing bacterium. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. – 2006. – V.56. – P.2737-2742. 77. Daly K., Sharp R.J., McCarthy A.J. Development of oligonucleotide probes and PCR primers for detecting phylogenetic subgroups of sulfate-reducing bacteria. // Microbiology. – 2000. – V.146(7). – P.1693-1705. 78. Dar S.A., Kuenen J.G., Muyzer G. Nested PCR denaturing gradient gel electrophoresis approach to determine the diversity of sulfate-reducing bacteria in complex microbial communities. // Appl. Environ. Microbiol. – 2005. – V.71.– P.23252330. 79. Dar S.A., Yao L., Dongen U.V., Kuenen J.G., Muyzer G. Analysis of diversity and activity of sulfate-reducing bacterial communities in sulfidogenic bioreactors using 16S rRNA and dsrB genes as molecular markers. // Appl. Environ. Microbiol. – 2007. – V.73(2). – P.594-604. 80. DeLong E.F., Taylor L.T., Marsh T.L., Preston C.M. Visualization and enumeration of marine planktonic archaea and bacteria by using polyribonucleotide probes and fluorescent in situ hybridization. // Appl. Environ. Microbiol. – 1999. – V.65(12). – P.5554-5563. 81. de Rezende J.R., Kjeldsen K.U., Hubert C.R., Finster K., Loy A., Jørgensen B.B. Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years. // ISME J. – 2013. –V.7(1). – P.72-84. 165 82. De Troch M., Cnudde C., Willems A., Moens T., Vanreusel A. Bacterial colonization on fecal pellets of harpacticoid copepods and on their diatom food. // Microb. Ecol. – 2010. – V.60(3). – P.581-591. 83. Devereux R., Delaney M., Widdel F., Stahl D.A. Natural relationships among sulfate-reducing eubacteria. // J. Bacteriol. – 1989. – V.171(12). – P.6689-6695. 84. Devereux R., Kane M.D., Winfrey J., Stahl D.A. Genus- and group-specific hybridization probes for determinative and environmental studies of sulfate-reducing bacteria. // Syst. Appl. Microbiol. – 1992. – V.15(4). – P.601-609. 85. Dilling W., Cypionka H. Aerobic respiration in sulfate-reducing bacteria. // FEMS Microbiol. Lett. – 1990. – V.71. – P.123-128. 86. Dinh H.T., Kuever J., Mussmann M., Hassel A.W., Stratmann M., Widdel F. Iron corrosion by novel anaerobic microorganisms. // Nature. – 2004. – V.427(6977). – P.829-832. 87. Dolla A., Fournier M., Dermoun Z. Oxygen defense in sulfate-reducing bacteria. // J. Biotechnol. – 2006. – V.126(1). – P.87-100. 88. Durisch-Kaiser E., Klauser L., Wehrli B., Schubert C. Evidence of intense archaeal and bacterial methanotrophic activity in the Black Sea water column. // Appl. Environ. Microbiol. – 2005. – V.71(12). – P.8099-8106. 89. Drzyzga O., Küver J., Blotevogel K.H. Complete oxidation of benzoate and 4hydroxybenzoate by a new sulfate-reducing bacterium resembling Desulfoarculus. // Arch. Microbiol. – 1993. – V.159(2). – P.109-113. 90. Dubilier N., Mülders C., Ferdelman T., de Beer D., Pernthaler A., Klein M., Wagner M., Erséus C., Thiermann F., Krieger J., Giere O., Amann R. Endosymbiotic sulphate-reducing and sulphide-oxidizing bacteria in an oligochaete worm. // Nature. – 2001. – V.411(6835). – P.298-302. 91. Elion L. A thermophilic sulphate-reducing bacterium. // Centr. Bakteriol. Parasitenk. II Abt. – 1924. – V.63. – P.58-67. 92. Edwards U., Rogall T., Blöcker H., Emde M., Böttger E.C. Isolation and direct complete nucleotide determination of entire genes. Characterization of a gene coding for 16S ribosomal RNA. // Nucleic Acids Res. – 1989. – V.17(19). – P.7843-7853. 93. Fischer S.G., Lerman L.S. Length independent separation of DNA restriction fragments in two dimensional gel electrophoresis. // Cell. – 1979. – V.16. – P.191-200. 94. Fonselius S.H. On long-term variations of dissolved oxygen in the deep water of the Baltic Sea: Baltic Monitoring Symposium, Tallin. – 1986. Proc. 166 95. Fu R., Wall J.D., Voordouw G. DcrA, a c-type heme-containing methyl-accepting protein from Desulfovibrio vulgaris Hildenborough, senses the oxygen concentration or redox potential of the environment. // J. Bacteriol. – 1994. – V.176(2). – P.344-350. 96. Geets J., Borremans B., Diels L., Springael D., Vangronsveld J., van der Lelie D., Vanbroekhoven K. DsrB gene-based DGGE for community and diversity surveys of sulfate-reducing bacteria. // J. Microbiol. Meth. – 2006. – V.66(2). – P.194-205. 97. Gittel A., Mußmann M., Sass H., Cypionka H., Könneke M. Identity and abundance of active sulfate-reducing bacteria in deep tidal flat sediments determined by directed cultivation and CARD-FISH analysis. // Environmen. Microbiol. – 2008. – V.10(10). – P.2645-2658. 98. Glockner F.O., Amann R., Alfreider A., Pernthaler J., Psenner R., Trebesius K., Schleifer K.-H. An in situ hybridization protocol for detection and identification of planctonic bacteria. // Syst. Appl. Microbiol. – 1996. – V.19(3). – P.403-406. 99. Grossi V., Cravo-Laureau C., Méou A., Raphel D., Garzino F., Hirschler-Réa A. Anaerobic 1-alkene metabolism by the alkane- and alkene-degrading sulfate reducer Desulfatibacillum aliphaticivorans strain CV2803T. // Appl. Environ. Microbiol. – 2007. – V.73(24). – P.7882-7890. 100. Hardy J.A., Hamilton W.A. The oxygen tolerance of sulfate-reducing bacteria isolated from North Sea waters. // Curr. Microbiol. – 1985. – V.6. – P.259-262. 101. Harms G., Zengler K., Rabus R., Aeckersberg F., Minz D., Rosselló-Mora R., Widdel F. Anaerobic oxidation of o-xylene, m-xylene, and homologous alkylbenzenes by new types of sulfate-reducing bacteria. // Appl. Environ. Microbiol. – 1999. – V.65(3). – P.999-1004. 102. Heidelberg J.F., Seshadri R., Haveman S.A., Hemme C.L., Paulsen I.T., Kolonay J.F., Eisen J.A., Ward N., Methe B., Brinkac L.M., Daugherty S.C., Deboy R.T., Dodson R.J., Durkin A.S., Madupu R., Nelson W.C., Sullivan S.A., Fouts D., Haft D.H., Selengut J., Peterson J.D., Davidsen T.M., Zafar N., Zhou L., Radune D., Dimitrov G., Hance M., Tran K., Khouri H., Gill J., Utterback T.R., Feldblyum T.V., Wall J.D., Voordouw G., Fraser C.M. The genome sequence of the anaerobic, sulfate-reducing bacterium Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. // Nat. Biotechnol. – 2004. – V.22(5). – P.554-559. 103. Henstra A.M., Dijkema C., Stams, A.J.M. Archaeoglobus fulgidus couples CO oxidation to sulphate reduction and acetogenesis with transient formate accumulation. // Environ. Microbiol. – 2007. – V.9. – P.1836-1841. 104. Heuer H., Krsek M., Baker P., Smalla K., Wellington E.M.H. Analysis of actinomycete communities by specific amplification of genes encoding 16S rRNA and gel electrophoretic separation in denaturing gradients. // Appl. Environ. Microbiol. – 1997. – V.63. – P.3233-324. 167 105. Hines M.E., Evans R.S., Sharak Genthner B.R., Willis S.G., Friedman S., Rooney-Varga J.N., Devereux R. Molecular phylogenetic and biogeochemical studies of sulfate-reducing bacteria in the rhizosphere of Spartina alterniflora. // Appl. Environ. Microbiol. – 1999. – V.65. – P.2209-2216. 106. Hoppe-Seyler F. Ueber Gährung der Cellulose mit Bildung von Methan und Kohlensäure. // Zeitschrift für physiologische Chemie. – 1886. – V.10(3). – P.201-217. 107. Hristova K.R., Mau M., Zheng D., Aminov R.I., Mackie R.I., Gaskins H.R., Raskin L. Desulfotomaculum genus- and subgenus-specific 16S rRNA hybridization probes for environmental studies. // Environ. Microbiol. – 2000. – V.2(2). – P.143-159. 108. Hulshoff-Pol L.W., Lens P.N.L., Stams A.J.M., Lettinga G. Anaerobic treatment of sulphate-rich wastewaters. // Biodegradation. – 1998. – V.9. – P.213-224. 109. Hungate R.E. A role of tube method for cultivation of strict anaerobes. In Methods in microbiology. Eds: Norris J.R., Ribbons, D.W. Academic Press, New York. – 1969. – V.3B. – P.117-309. 110. Isaksen M.F., Jørgensen B.O.B.. Adaptation of psychrophilic and psychrotrophic sulfate-reducing bacteria to permanently cold marine environments. // Appl. Environ. Microbiol. – 1996. – V.62(2). – P.408-414. 111. Ito T., Nielsen J.L., Okabe S., Watanabe Y., Nielsen P.H. Phylogenetic identification and substrate uptake patterns of sulfate-reducing bacteria inhabiting an oxic-anoxic sewer biofilm determined by combining microautoradiography and fluorescent in situ hybridization. // Appl. Environ. Microbiol. – 2002. – V.68(1). – P.356-364. 112. Janssen A.J.H., Ruitenberg R., Buisman C.J.N. Industrial applications of new sulphur biotechnology. // Water Sci. Technol. – 2001. – V.44. – P.85-90. 113. Jeanthon C., L'Haridon S., Cueff V., Banta A., Reysenbach A.L., Prieur D. Thermodesulfobacterium hydrogeniphilum sp. nov., a thermophilic, chemolithoautotrophic, sulfate-reducing bacterium isolated from a deep-sea hydrothermal vent at Guaymas Basin, and emendation of the genus Thermodesulfobacterium. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. – 2002. – V.52(3). – P.765772. 114. Jonkers H.M., Koh I. O., Behrend P., Muyzer G., de Beer D. Aerobic organic carbon mineralization by sulfate-reducing bacteria in the oxygen-saturated photic zone of a hypersaline microbial mat. // Microb. Ecol. – 2005. – V.49(2). – P.291-300. 115. Jonkers H.M., van der Maarel M.J.E.C., van Gemerden H., Hansen T.A. Dimethylsulfoxide reduction by marine sulphate-reducing bacteria. // FEMS Microbiol. Lett. – 1996. – V.136. – P.283-287. 168 116. Jørgensen B.B. Mineralization of organic matter in the sea bed – the role of sulphate reduction. // Nature. – 1982. – V.296. – P.643-645. 117. Jørgensen B.B., Isaksen M.F., Jannasch H.W. Bacterial sulfate reduction above 100 C in deep-sea hydrothermal vent sediments. // Science – 1992. – V.258(5089). – P.1756-1757. 118. Kaneko R., Hayashi T., Tanahashi M., Naganuma T. Phylogenetic diversity and distribution of dissimilatory sulfite reductase genes from deep-sea sediment cores. // Mar. Biotechnol. – 2007. – V.9(4). – P.429-436. 119. Karner M., Furner J. Determination of active marine bacterioplankton: a comparison of universal 16S rRNA probes, autoradiography, and nucleoid staining. // Appl. Environ. Microbiol. – 1997. – V.63(4). – P.1208-1213. 120. Keith S.M., Herbert R.A. Dissimilatory nitrate reduction by a strain of Desulfovibrio desulfuricans. // FEMS Microbiol. Lett. – 1983. – V.18. – P.55-59. 121. Klein M., Friedrich M., Roger A.J., Hugenholtz P., Fishbain S., Abicht H., Blackall L.L., Stahl D.A., Wagner M. Multiple lateral transfers of dissimilatory sulfite reductase genes between major lineages of sulfate-reducing prokaryotes. // J. Bacteriol. – 2001. – V.183(2). – P.6028-6035. 122. Kluyver A.J., Baars J.K. On some physiological artefacts. // Proc. Koninkl. Akad. Westenschap. Amsterdam. – 1932. – V.35. – P.370-378. 123. Kluyver A.J., van Niel C.B. Prospects for a natural system of classification of bacteria. // Zentr. Bakteriol. Parasitenk. Abt. II. – 1936. – V.94. – P.369-403. 124. Kniemeyer O., Musat F., Sievert S.M., Knittel K., Wilkes H., Blumenberg M., Michaelis W., Classen A., Bolm C., Joye S.B., Widdel F. Anaerobic oxidation of shortchain hydrocarbons by marine sulphate-reducing bacteria. // Nature. – 2007. – V.449(7164). – P.898-901. 125. Knittel K., Boetius A., Lemke A., Eilers H., Lochte K., Pfannkuche O., Linke P., Amann R. Activity, distribution, and diversity of sulfate reducers and other bacteria in sediments above gas hydrate (Cascadia Margin, Oregon). // Geomicrobiology Journal. – 2003. – V.20(4). – P.269-294. 126. Knoblauch C., Sahm K., Jørgensen, B.B. Psychrophilic sulfate-reducing bacteria isolated from permanently cold Arctic marine sediments: description of Desulfofrigus oceanense gen. nov., sp. nov., Desulfofrigus fragile sp. nov., Desulfofaba gelida gen. nov., sp. nov., Desulfotalea psychrophila gen. nov., sp. nov. and Desulfotalea arctica sp. nov. // Int. J. Syst. Evo.l Microbiol. – 1999. – V.49(4). – P.1631-1643. 127. Kraft B., Engelen B., Goldhammer T., Lin Y.S., Cypionka H., Könneke M. Desulfofrigus sp. prevails in sulfate-reducing dilution cultures from sediments of the Benguela upwelling area. // FEMS Microbiol. Ecol. – 2013. – V.84(1). – P.86-97. 169 128. Krekeler D., Sigalevich P., Teske A., Cypionka H., Cohen Y. A sulfate-reducing bacterium from the oxic layer of a microbial mat from Solar Lake (Sinai), Desulfovibrio oxyclinae sp. nov. // Arch. Mikrobiol. – 1997. – V.167(6). – P.369-375. 129. Krekeler D., Teske A., Cypionka H. Strategies of sulfate-reducing bacteria to escape oxygen stress in a cyanobacterial mat. // FEMS Microbiol. Ecol. – 1998. – V.25(2). – P.89-96. 130. Kublanov I.V., Perevalova A.A., Slobodkina G.B., Lebedinsky A.V., Bidzhieva S.K., Kolganova T.V., Kaliberda E.N., Rumsh L.D., Haertlé T., Bonch-Osmolovskaya E.A. Biodiversity of thermophilic prokaryotes with hydrolytic activities in hot springs of Uzon Caldera, Kamchatka (Russia). // Appl. Environ. Microbiol. – 2009. – V.75(1). – P.286-291. 131. Kubo K., Kojima H., Fukui M. Vertical distribution of major sulfate-reducing bacteria in a shalloweutrophic meromictic lake. // Syst. Appl.Microbiol. – 2014. – V.37(7). – P.510-519. 132. Kubota K. CARD-FISH for environmental microorganisms: technical advancement and future applications. // Microbes Environ. – 2013. – V.28(1). – P.3-12. 133. Kuever J., Könneke M., Galushko A., Drzyzga O. Reclassification of Desulfobacterium phenolicum as Desulfobacula phenolica comb. nov. and description of strain SaxT as Desulfotignum balticum gen. nov., sp. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. – 2001. – V.51(1). – P.171-177. 134. Küsel K., Pinkart H.C., Drake H.L., Devereux R. Acetogenic and sulfate-reducing bacteria inhabiting the rhizoplane and deep cortex cells of the sea grass Halodule wrightii. // Appl. Environ. Microbiol. – 1999. – V.65(11). – P.5117-5123. 135. Labrenz M., Jost G., Jürgens K. Distribution of abundant prokaryotic organisms in the water column of the central Baltic Sea with an oxic–anoxic interface. // Aquat. Microb. Ecol. – 2007. – V.46. – P.177–190. 136. Lazar C.S., Dinasquet J., L’Haridon S., Pignet P., Toffin L. Distribution of anaerobic methane-oxidizing and sulfate-reducing communities in the G11 Nyegga pockmark, Norwegian Sea. // Antonie van Leeuwenhoek, Int. J. Gen. Mo.l Microbiol. – 2011. – V.100(4). – P.639-653. 137. Lee Y.J., Romanek C.S., Wiegel J. Desulfosporosinus youngiae sp. nov., a sporeforming, sulfate-reducing bacterium isolated from a constructed wetland treating acid mine drainage. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. – 2009. – V.59(11). – P.2743-2746. 138. Leloup J., Loy A., Knab N.J., Borowski C., Wagner M., Jørgensen B.B. Diversity and abundance of sulfate-reducing microorganisms in the sulfate and methane zones of a marine sediment, Black Sea. // Environ. Microbiol. – 2007. – V.9(3). – P.131-142. 170 139. Lemos R.S., Gomes C.M., Santana M., LeGall J., Xavier A.V., Teixeira M. The ‘strict’anaerobe Desulfovibrio gigas contains a membrane-bound oxygen-reducing respiratory chain. // FEBS letters. – 2001. – V.496(1). – P.40-43. 140. Lens P.N.L., Vallero M., Esposito R. Bioprocess engineering of sulphate reduction for environmental technology. In Sulphate-Reducing Bacteria: Environmental and Engineered Systems. Eds: Barton L.L., Hamilton W.A. Cambridge Univ. Press, Cambridge, United Kingdom. – 2007. – P.283-404. 141. Lentini V., Gugliandolo C., Maugeri T.L. Vertical distribution of Archaea and Bacteria in a meromictic lake as determined by fluorescent in situ hybridization. // Curr. Microbiol. – 2012. – V.64(1). – P.66-74. 142. Lie T.J., Pitta T., Leadbetter E.R., Godchaux W. 3rd, Leadbetter J.R. Sulfonates: novel electron acceptors in anaerobic respiration. // Arch. Microbiol. – 1996. – V.166. – P.204-210. 143. Lin X., Wakeham S.G., Putnam I.F., Astor Y.M., Scranton M.I., Chistoserdov A.Y., Taylor G.T. Comparison of vertical distributions of prokaryotic assemblages in the anoxic Cariaco Basin and Black Sea by use of fluorescence in situ hybridization. Appl. Environ. Microbiol. – 2006. – V.72(4). – P.2679-2690. 144. Liu X., Bagwell C.E., Wu L., Devol A.H., Zhou J. Molecular diversity of sulfatereducing bacteria from two different continental margin habitats. // Appl Environ. Microbiol. – 2003. – V.69(10). – P.6073-6081. 145. Llobet-Brossa E., Rosselló-Mora R., Amann R.. Microbial community composition of Wadden Sea sediments as revealed by fluorescence in situ hybridization. // Appl. Environ. Microbiol. – 1998. – V.64(7). – P.2691-2696. 146. Lloyd J.R., Ridley J., Khizniak T., Lyalikova N.N., Macaskie, L.E. Reduction of technetium by Desulfovibrio desulfuricans: biocatalyst characterization and use in a flowthrough bioreactor. // Appl. Environ. Microbiol. – 1999. – V.65. – P.2691-2696. 147. López-Cortés A., Fardeau M.L., Fauque G., Joulian C., Ollivier B. Reclassification of the sulphate- and nitrate-reducing bacterium Desulfovibrio vulgaris subsp. oxamicus as Desulfovibrio oxamicus sp. nov., comb. nov. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. – 2006. – V.56. – P.1495-1499. 148. Lösekann T., Knittel K., Nadalig T., Fuchs B., Niemann H., Boetius A., Amann, R. Diversity and abundance of aerobic and anaerobic methane oxidizers at the Haakon Mosby Mud Volcano, Barents Sea. // Appl. Environ. Microbiol. – 2007. – V.73(10). – P.3348-3362. 149. Lovley D.R., Phillips E.J. Reduction of uranium by Desulfovibrio desulfuricans.// Appl. Environ. Microbiol. – 1992. – V.58. – P.850-856. 171 150. Lovley D.R., Phillips E.J. Reduction of chromate by Desulfovibrio vulgaris and its c3 cytochrome. // Appl. Environ. Microbiol. – 1994. – V.60. – P.726-728. 151. Lovley D.R., Roden E.E., Phillips E.J.P., Woodward J.C. Enzymatic iron and uranium reduction by sulphate reducing bacteria. // Mar. Geol. – 1993. – V.113. – P.4153. 152. Lücker S., Steger D., Kjeldsen K.U., MacGregor B.J., Wagner M., Loy A. Improved 16S rRNA-targeted probe set for analysis of sulfate-reducing bacteria by fluorescence in situ hybridization. // J. Microbiol. Methods. – 2007. – V.69(3). – P.523528. 153. Lundberg K.S., Shoemaker D.D., Adams M.W., Short J.M., Sorge J.A., Mathur E.J. High-fidelity amplification using a thermostable DNA polymerase isolated from Pyrococcus furiosus. // Gene. – 1991. – V.108(1). – P.1-6. 154. Macy J.M., Santini J.M., Pauling B.V., O'Neill A.H., Sly L.I. Two new arsenate/sulfate-reducing bacteria: mechanisms of arsenate reduction. // Arch. Microbiol. – 2000. – V.173(1). – P.49-57. 155. Manz W., Eisenbrecher M., Neu T.R., Szewzyk U. Abundance and spatial organization of Gram-negative sulfate-reducing bacteria in activated sludge investigated by in situ probing with specific 16S rRNA targeted oligonucleotides. // FEMS Microbiol. Ecol. – 1998. – V.25(1). – P.43-61. 156. Mattorano D.A., Merinar T. Respiratory protection on offshore drilling rigs. // Appl. Occup. Environ. Hyg. – 1999. – V.14. – P.141-148. 157. Meyer L. Chemische Untersuchung der Thermen zu Landeck in der Grafschaft Glatz. // Erdmann, O. L. J. praktische Chemie, Heidelberg. – 1864. – V.91. – P.1-15. 158. Michaelis W., Seifert R., Nauhaus K., Treude T., Thiel V., Blumenberg M., Knittel K., Gieseke A., Peterknecht K., Pape T., Boetius A., Amann R., Jørgensen B.B., Widdel F., Peckmann J., Pimenov N.V., Gulin M.B. Microbial reefs in the Black Sea fueled by anaerobic oxidation of methane. // Science. – 2002. – V.297(5583). – P.1013-1015. 159. Miletto M., Bodelier P.L.E., Laanbroek H.J. Improved PCR-DGGE for high resolution diversity screening of complex sulfate-reducing prokaryotic communities in soils and sediments. // J. Microbiol. Meth. – 2007. – V.70(1). – P.103-111. 160. Minz D., Flax J.L., Green S.J., Muyzer G., Cohen Y., Wagner M., Rittmann B.E., Stahl D.A. Diversity of sulfate-reducing bacteria in oxic and anoxic regions of a microbial mat characterized by comparative analysis of dissimilatory sulfite reductase genes. // Appl. Environ. Microbiol. – 1999. – V.65.– P.4666-4671. 161. Mopper K., Kieber D.J. Distribution and biological turnover of dissolved organic compounds in the water column of the Black Sea. // Deep Sea Res. Part A – Oceanograph. Res. Papers. – 1991. – V.38. – P.1021-1047. 172 162. Morasch B., Schink B., Tebbe C.C., Meckenstock R.U. Degradation of o-xylene and m-xylene by a novel sulphate-reducer belonging to the genus Desulfotomaculum. // Arch. Microbiol. – 2004. – V.181. – P.407-417. 163. Moura I., Bursakov S., Costa C., Moura J.J.G. Nitrate and nitrite utilization in sulphate-reducing bacteria. // Anaerobe. – 1997. – V.3. – P.279-290. 164. Murray J.W., Jannash H.W., Honjo S., Anderson R.F., Reeburgh W.S., Top Z., Friederich G.E., Codispoti L.A., Izdar E. Unexpected changes in the oxic/anoxic interface in the Black Sea. // Nature. –1989. – V.338. – P.411-413. 165. Mußmann M., Ishii K., Rabus R., Amann R. Diversity and vertical distribution of cultured and uncultured Deltaproteobacteria in an intertidal mud flat of the Wadden Sea. // Environ. Microbiol. – 2005. – V.7(3). – P.405-418. 166. Muyzer G., Stams A.J.M. The ecology and biotechnology of sulphate-reducing bacteria. // Nat. Rev. Microbiol. – 2008. – V.6(6). – P.441-454. 167. Myers R.M., Fischer S.G., Lerman L.S., Maniatis T. Nearly all single base substitutions in DNA fragments joined to a GC-clamp can be detected by denaturing gradient gel electrophoresis. // Nucleic Acids Res. – 1985. – V.13. – P.3131-3145. 168. Nanninga H.J., Gottschal J.C. Properties of Desulfovibrio carbinolicus sp. nov. and other sulfate reducing bacteria isolated from an anaerobic purification plant. // Appl. Environ. Microbiol. – 1987. – V.53. – P.802-809. 169. Neretin L.N., Abed R.M., Schippers A., Schubert C.J., Kohls K., Kuypers M.M. Inorganic carbon fixation by sulfate-reducing bacteria in the Black Sea water column. // Environ. Microbiol. – 2007. – V.9(12). – P.3019-3024. 170. Nilsen R.K., Beeder J., Thostenson T., Torsvik T. Distribution of thermophilic marine sulfate reducers in North Sea oil field waters and oil reservoirs. // Appl. Environ. Microbiol. – 1996. – V.62.– P.1793-1798. 171. Oakley B.B., Carbonero F., Dowd S.E., Hawkins R.J., Purdy K.J. Contrasting patterns of niche partitioning between two anaerobic terminal oxidizers of organic matter. // ISME J. – 2012. – V.6(5). – P.905-914. 172. Ollivier B., Cord-Ruwisch R., Hatchikian E.C., Garcia J.L. Characterization of Desulfovibrio fructosovorans sp. nov. // Arch. Microbiol. – 1988. – V.149. – P.447-450. 173. Oude Elferink S.J.W.H., Visser A., Hulshoff-Pol L.W., Stams A.J.M. Sulphate reduction in methanogenic bioreactors. // FEMS Microbiol. Rev. – 1994. – V.15.– P.119136. 174. Park H.S., Lin S., Voordouw G. Ferric iron reduction by Desulfovibrio vulgaris Hildenborough wild type and energy metabolism mutants. // Antonie van Leeuwenhoek. – 2007. – V.93. – P.79-285. 173 175. Parkes R.J. Analysis of microbial communities within sediments using biomarkers. In Ecology of microbial communities. Eds: Fletcher M., Gray T.R., Jones J.G. Cambridge University Press, Cambridge. – 1987. – P.147-177. 176. Parshina S.N., Sipma J., Nakashimada Y., Henstra A.M., Smidt H., Lysenko A.M., Lens P.N., Lettinga G., Stams A.J. Desulfotomaculum carboxydivorans sp. nov., a novel sulfate-reducing bacterium capable of growth at 100% CO. // Int J. Syst. Evol. Microbiol. – 2005. – V.55(5). – P.2159-2165. 177. Perez-Jimenez J.R., Kerkhof L.J. Phylogeography of sulfate-reducing bacteria among disturbed sediments. Disclosed by analysis of the dissimilatory sulfite reductase genes (dsrAB). // Appl. Environ. Microbiol. – 2005. – V.71(2). – P.1004-1011. 178. Pernthaler A., Pernthaler J., Amann R. Fluorescence in situ hybridization and catalyzed reporter deposition for the identification of marine bacteria. Appl. Environ. Microbiol. – 2002. – V.68(6). – P.3094-3101. 179. Pfennig N., Lippert K.D. Uber das Vitamin B12-Bedfirfnis phototropher Schwefelbakterien. // Arch. Mikrobiol. – 1966. – V.55. – P.245-256. 180. Pimenov N.V., Bonch-Osmolovskaya E.A. In situ activity studies in thermal environments. In Methods in Microbiology. Eds.: Oren A., Rainey F. Elsevier. – 2006. – P.27-52. 181. Pimenov N.V., Neretin L.N. Composition and activities of microbial communities involved in carbon, sulfur, nitrogen and manganese cycling in the oxic/anoxic interface of the Black Sea. Past and Present Water Column Anoxia. In: Nato Science Series: IV: Earth and Environmental Sciences. Ed. by Neretin L.N. Springer, Dordrecht. – 2006. – V.64(4). – P.501-521. 182. Podosokorskaya O.A., Kadnikov V.V., Gavrilov S.N., Mardanov A.V., Merkel A.Y., Karnachuk O.V., Ravin N.V., Bonch-Osmolovskaya E.A., Kublanov I.V. Characterization of Melioribacter roseus gen. nov., sp. nov., a novel facultatively anaerobic thermophilic cellulolytic bacterium from the class Ignavibacteria, and a proposal of a novel bacterial phylum Ignavibacteriae. // Environ. Microbiol. – 2013. – V.15(6). – P.1759-1771. 183. Prowe S.G., Antranikian G. Anaerobranca gottschalkii sp. nov., a novel thermoalkaliphilic bacterium that grows anaerobically at high pH and temperature. // Int. J. Syst. Evo.l Microbiol. – 2001. – V.51(2). – P.457-465. 184. Rabus R., Hansen T.A., Widdel F. Dissimilatory sulfate- and sulfur-reducing prokaryotes. In: Prokaryotes. Ed. By Dworkin M., Falkow S., Rosenberg E., Schleifer K.-H., Stackebrandt E. Springer New York. – 2006. – V.2. – P.659–768. 174 185. Rabus R., Nordhaus R., Ludwig W., Widdel F. Complete oxidation of toluene under strictly anoxic conditions by a new sulfate-reducing bacterium. // Appl. Environ. Microbiol. – 1993. – V.59. – P.1444-1451. 186. Ramamoorthy S., Sass H., Langner H., Schumann P., Kroppenstedt R. M., Spring S., Overmann J., Rosenzweig R. F. Desulfosporosinus lacus sp. nov., a sulfate-reducing bacterium isolated from pristine freshwater lake sediments. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. – 2006. – V.56(12). – P.2729-2736. 187. Ramsing N.B., Kühl M., Jørgensen B.B. Distribution of sulfate-reducing bacteria, O2, and H2S in photosynthetic biofilms determined by oligonucleotide probes and microelectrodes. // Appl. Environ. Microbiol. – 1993. – V.59(11). – P.3840-3849. 188. Ravenschlag K., Sahm K., Knoblauch C., Jørgensen B.B., Amann R. Community structure, cellular rRNA content, and activity of sulfate-reducing bacteria in marine Arctic sediments. // Appl. Environ. Microbiol. – 2000. – V.66. – P.3592–3602. 189. Rissati J.B., Capman W.C., Stahl D.A. Community structure of a microbial mat: the phylogenetic dimension. // Proc. Natl Acad. Sci. USA. – 1994. – V.91. – P.1017310177. 190. Robertson W.J., Bowman J.P., Franzmann P.D., Mee B.J. Desulfosporosinus meridiei sp. nov., a spore-forming sulfate-reducing bacterium isolated from gasolenecontaminated groundwater. // Int. J. Syst. Evo.l Microbiol. – 2001. – V.51(1). – P.133140. 191. Rodriguez-Mora M.J., Scranton M.I., Taylor G.T., Chistoserdov A.Y. Bacterial community composition in a large marine anoxic basin: a Cariaco Basin time-series survey. // FEMS Microbiol. Ecol. – 2013. – V.84(3). – P.625-639. 192. Saiki R.K., Gelfand D.H., Stoffel S.J., Scharf S.J., Higuchi R., Horn G.T., Mullis K.B., Erlich H.A. Primer directed enzymatic amplifcation of DNA with thermostable DNA polymerase. // Science. – 1988. – V.239. – P.487-491. 193. Saiki R.K., Scharf S., Faloona F., Mullis K.B., Horn G.T., Erlich H.A., Arnheim N. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia. // Science. – 1985. – V.230(4732). – P.13501354. 194. Sánchez-Andrea I., Stams A.J., Hedrich S., Ňancucheo I., Johnson D. B. Desulfosporosinus acididurans sp. nov.: an acidophilic sulfate-reducing bacterium isolated from acidic sediments. // Extremophiles. – 2015. – V.19(1). – P.39-47. 195. Sass A., Rutters H., Cypionka H., Sass H. Desulfobulbus mediterraneus sp. nov., a sulphatereducing bacterium growing on mono- and disaccharides. // Arch. Microbiol. – 2002. – V.177. – P.468-474. 175 196. Sass H., Wieringa E., Cypionka H., Babenzien H.D., Overmann J. High genetic and physiological diversity of sulfate-reducing bacteria isolated from an oligotrophic lake sediment. // Arch. Microbiol. – 1998. – V.170.– P.243-251. 197. Schreiber L., Holler T., Knittel K., Meyerdierks A., Amann R. Identification of the dominant sulfate-reducing bacterial partner of anaerobic methanotrophs of the ANME-2clade. // Environ. Microbiol. – 2010. – V.12(8). – P.2327-2340. 198. Sen A.M. Acidophilic Sulphate Reducing Bacteria:Candidates for Bioremediation of Acid Mine Drainage Pollution. // Thesis, Univ. Wales. Bangor. – 2001. 199. Shanks A.L., Reeder M.L. Reducing microzones and sulfide production in marine snow. // Mar. Ecol. Prog. Ser. – 1993. – V.96. – P.43-47. 200. Sheffield V.C., Beck J.S., Stone E.M., Myers R.M. A simple and efficient method for attachment of a 40base pair, GC-rich sequence to PCR amplified DNA. // BioTechniques. – 1992. – V.12. – P.386-387. 201. Sheffield V.C., Cox D.R., Myers R.M. Attachment of a 40bp G+C rich sequence (GCclamp) to genomic DNA fragments by polymerase chain reaction results in improved detection of single base changes. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1989. – V.86. – P.232-236. 202. Shek L., Liu H. Oxygen consumption rates of fecal pellets produced by three coastal copepod species fed with a diatom Thalassiosira pseudonana. // Mar. Pollut. Bull. – 2010. – V.60(7). – P.1005-1009. 203. Sinkko H., Lukkari K., Jama A.S., Sihvonen L.M., Sivonen .K, Leivuori M., Rantanen M., Paulin L., Lyra C. Phosphorus chemistry and bacterial community composition interact in brackish sediments receiving agricultural discharges. // PLoS One. – 2011. – V.6(6). – P.e21555. 204. Sinkko H., Lukkari K., Sihvonen L.M., Sivonen K., Leivuori M., Rantanen M., Paulin L., Lyra C. Bacteria contribute to sediment nutrient release and reflect progressed eutrophication-driven hypoxia in an organic-rich continental sea. // PLoS One. – 2013. – V.8(6). – P.e67061. 205. So C.M., Young, L.Y. Isolation and characterization of a sulfate-reducing bacterium that anaerobically degrades alkanes. // Appl. Environ. Microbiol. – 1999. – V.65. – P.2969-2976. 206. Sorokin D.Y., Kuenen J.G., Jetten M.S. Denitrification at extremely high pH values by the alkaliphilic, obligately chemolithoautotrophic, sulfur-oxidizing bacterium Thioalkalivibrio denitrificans strain ALJD. // Arch. Microbiol. – 2001. – V.175(2). – P.94-101. 176 207. Sorokin Y.I., Sorokin P.Y., Avdeev V.A., Sorokin D.Y., Ilchenko S.V. Biomass, production and activity of bacteria in the Black Sea, with special reference to chemosynthesis and the sulfur cycle. // Hydrobiologia. – 1995. – V.308(1). – P.61-76. 208. Stadnitskaia A., Muyzer G., Abbas B., Coolen M.J.L., Hopmans E.C., Baas M., van Weering T.C.E., Ivanov M.K., Poludetkina E., Damsté J.S. Biomarker and 16S rDNA evidence for anaerobic oxidation of methane and related carbonate precipitation in deep-sea mud volcanoes of the Sorokin Trough, Black Sea. // Mar. Geol. – 2005. – V.217. – P.67-96. 209. Stahl D.A., Amann R.I., Poulsen L.K., Raskin L., Capman W.C. Use of fluorescent probes for determinative microscopy of methanogenic Archaea. In: Archaea: methanogens: a laboratory manual. Eds.: Sowers K.R., Schreier H.J. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press. – 1995. – V.63(4). – P.111-121. 210. Stams A.J.M., Hansen T.A. Oxygen-labile l(+) lactate dehydrogenase activity in Desulfovibrio desulfuricans. // FEMS Microbiol. Lett. – 1982. – V.13. – P.389-394. 211. Stams A.J.M., Hansen T.A., Skyring G.W. Utilization of amino acids as energy substrates by two marine Desulfovibrio strains. // FEMS Microbiol. Ecol. – 1985. – V.31. – P.11-15. 212. Starkey R.L. A study of spore formation and other morphological characteristics of Vibrio desulfuricans. // Arch. Mikrobiol. – 1938. – V.9. – P.2680-304. 213. Tanimoto Y., Bak, F. Anaerobic degradation of methylmercaptan and dimethyl sulfide by newly isolated thermophilic sulfate-reducing bacteria. // Appl. Environ. Microbiol. – 1994. – V.60. – P.2450-2455. 214. Tarpgaard I.H., Boetius A., Finster K. Desulfobacter psychrotolerans sp. nov., a new psychrotolerant sulfate-reducing bacterium and descriptions of its physiological response to temperature changes. // Antonie van Leeuwenhoek, Int. J. Gen. Mol. Microbiol. – 2006. – V.89(1). – P.109-124. 215. Taylor J., Parkes, R.J. The cellular fatty acids of the sulphate-reducing bacteria, Desulfobacter sp., Desulfobulbus sp. and Desulfovibrio desulfuricans. // J. Gen. Microbiol. – 1983. – V.129. – P.3303-3309. 216. Toffin L., Webster G., Weightman A.J., Fry J.C., Prieur D. Molecular monitoring of culturable bacteria from deep-sea sediment of the Nankai Trough, Leg 190 Ocean Drilling Program. // FEMS Microbiol. Ecol. – 2004. – V.48(3). – P.357-367. 217. Treude T., Knittel K., Blumenberg M., Seifert R., Boetius A. Subsurface microbial methanotrophic mats in the Black Sea. // Appl. Environ. Microbiol. – 2005. – V.71(10). – P.6375-6378. 177 218. Trüper H.G., Schlegel H.G. Sulphur metabolism in Thiorhodaceae. 1. Quantitative measurements on growing cells of Chromatium okenii. // Antonie Leeuwenhoek. – 1964. – V.30. – P.225-238. 219. Tucker M.D., Barton L.L., Thompson B.M. Reduction of Cr, Mo, Se and U by Desulfovibrio desulfuricans immobilized in polyacrylamide gels. // J. Ind. Microbiol. Biotechnol. – 1998. – V.20. – P.13-19. 220. Valentine D.L. Biogeochemistry and microbial ecology of methane oxidation in anoxic environments: a review. //Antonie van Leeuwenhoek. – 2002. – V.81(1-4). – P.271-282. 221. Varon-Lopez M., Dias A.C., Fasanella C.C., Durrer A., Melo I.S., Kuramae E.E., Andreote F.D. Sulphur-oxidizing and sulphate-reducing communities in Brazilian mangrove sediments. // Environ. Microbiol. – 2014. – V.16(3). – P.845-855. 222. Vatsurina A., Badrutdinova D., Schumann P., Spring S., Vainshtein M. Desulfosporosinus hippei sp. nov., a mesophilic sulfate-reducing bacterium isolated from permafrost. // Int. J. Syst. Evo.l Microbiol. – 2008. – V.58(5). – P.1228-1232. 223. Vetriani C., Tran H.V., Kerkhof L.J. Fingerprinting microbial assemblages from the oxic/anoxic chemocline of the Black Sea. // Appl. Environ. Microbiol. – 2003. – V.69(11). – P.6481-6488. 224. Wagner M., Roger A.J., Flax J.L., Brusseau G.A., Stahl D.A. Phylogeny of dissimilatory sulfite reductases supports early origin of sulfate respiration. // J. Bacteriol. – 1998. – V.180(11). – P.2975-2982. 225. Walters W.A., Caporaso J.G., Lauber C.L., Berg-Lyons D., Fierer N., Knight R. PrimerProspector: de novo design and taxonomic analysis of barcoded polymerase chain reaction primers. // Bioinformatics. – 2011. – V.27(8). – P.1159-1161. 226. Wawer C., Jetten M.S., Muyzer G. Genetic diversity and expression of the NiFe hydrogenase large-subunit gene of Desulfovibrio spp. in environmental samples. // Appl. Environ. Microbiol. – 1997. – V.61. – P.4360-4369. 227. Wayne L.G., Brenner D.J., Colwell R.R., Grimont P.A.D., Kandler O., Krichevsky M.I., Moore L.H., Moore W.E.C., Murray R.G.E. & other authors. Report of the ad hoc committee on reconciliation of approaches to bacterial systematics. Int. J. Syst. Bacteriol. – 1987. – V.37. – P.463-464. 228. Webster G., Watt L.C., Rinna J., Fry J.C., Evershed R.P., Parkes R.J., Weightman A.J. A comparison of stable-isotope probing of DNA and phospholipid fatty acids to study prokaryotic functional diversity in sulfate-reducing marine sediment enrichment slurries. // Environ Microbiol. – 2006. – V.8(9). – P.1575–1589. 229. Werkman, C.H., Weaver H.J. Studies in the bacteriology of sulphur stinker spoilage of canned sweetcorn. // Iowa State Coll. J. Sci. – 1927. – V.2. – P.57-67. 178 230. Widdel F. Anaerober Abbau von Fettsäuren und Benzoesäure durch neu Isolierte Arten Sulfatreduzierender Bakterien. // Thesis, Göttingen Univ., Germany. – 1980. 231. Widdel F., Bak F. Gram-negative mesophilic sulfate-reducing bacteria. The Prokaryotes, 2nd edn., vol. 4. Eds: Balows A., Truper H.G., Dworkin M., Harder W., and Schleifer K.-H. Berlin: Springer-Verlag. – 1992. – P. 3352-3378. 232. Widdel F., Pfennig N. Studies on dissimilatory sulfate-reducing bacteria that decompose fatty acids. Isolation of new sulfate-reducing bacteria enriched with acetate from saline environments. Description of Desulfobacter postgatei gen. nov., sp. nov. // Arch. Microbiol. – 1981. – V.129(5). – P.395-400. 233. Wittwer C.T., Herrmann M.G., Moss A.A., Rasmussen R.P. Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification. // Biotechniques. – 1997. – V.54(6). – P.314-320. 234. Wu X.J., Pan J.L., Liu X.L., Tan J., Li D.T., Yang H. Sulfate-reducing bacteria in leachate-polluted aquifers along the shore of the East China Sea. // Can. J. Microbiol. – 2009. – V.55(7). – P.818-828 235. Yang H., Zhao J.S., Hawari J. Effect of 2,4-dinitrotoluene on the anaerobic bacterial community in marine sediment. // J. Appl. Microbiol. – 2009. – V.107(6). – P.1799-1808. 236. Zverlov V., Klein M., Lücker S., Friedrich M.W., Kellermann J., Stahl D.A., Loy A., Wagner M. Lateral gene transfer of dissimilatory (bi)sulfite reductase revisited. // J. Bacteriol. – 2005. – V.187(6). – P.2203-2208.
