ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова» Кафедра биотехнологии и бионанотехнологии «Принципы разработки готовых лекарственных форм » Проблемы туберкулеза. Подходы к созданию новых лекарственных форм противотуберкулезных препаратов Авторы: Сорокоумова Г.М. , 2013 Селищева А.А. ПЛАН ЛЕКЦИИ: 1. Рост заболеваемости туберкулезом во всем мире 2. Строение и свойства микобактерий туберкулеза ( МТ Б) 3. Влияние МТБ на свойства макрофага 4. Химиотерапия туберкулеза 5. Развитие устойчивости у МТБ к противотуберкулезным препаратам (ПТП) 6. Новые формы лекарственных препаратов 2 Туберкулез - «большая белая чума» (историческая справка) 5000 лет до н.э. – туберкулезные поражения позвоночника человека, жившего в каменном веке; 2750-2000 лет до н.э. – признаки ТБ в мумифицированных трупах египтян 400 лет до н.э. - Гиппократ– описал туберкулез и ввел термин «фтиза» (чахотка); Средневековье – эпидемия «большой белой чумы» 1882 г. - Микобактерия туберкулеза, открыта немецким ученым Робертом Кохом Конец XlX - начало XX –эпидемия во всех государствах Западной Европы. 1950 годы – открытие противотуберкулезных препаратов (ПТП), 1985г. – подъем заболеваемости, рост смертности. 3 Распространение туберкулеза в мире Заболеваемость туберкулезом в мире. Случаев на 100 тысяч жителей. Данные на 2010 г. > 300; 200 — 300; 100 — 200; 50— 100; < 50; нет данных. Уровень заболеваемости туберкулезом с множественной лекарственной устойчивостью в мире. Светло-желтым обозначены наименьшие, а темно-оранжевым – наивысшие показатели заболеваемости. 4 Чем вызвано такое распространение туберкулеза в мире? Причины 1. Социально-экономические в РФ, распространение СПИДа в Северной Америке, Западной Европе, Азии и Африке 2. Неэффективная диагностика заболевания 3. Сложность лечения туберкулеза – особенности биологии возбудителя (медленный рост, внутриклеточная локализация, существование латентных форм микобактерий) 4. Появление микобактерий резистентных ко многим лекарственным препаратам 5 Виды микобактерий Род Mycobacterium, включает следующие виды микобактерий: M. tuberculosis - вызывает туберкулез у человека (M. tuberculosis H37Rv) M. bovis, M. africanum, M. microti, M. avium, M. leprae - внутриклеточные патогены высших позвоночных, M. bovis, M. africanum вызывают заболевание у человека, клинически не отличающееся от классического туберкулеза. M. microti - непатогенна для человека, однако вызывает заболевание у мышей, напоминающее туберкулез. M. avium активно развивается у ВИЧ-инфицированных людей. M. africanum, M. microti, M. canettii, M. avium и M. smegmatis - группа микобактерий характеризуется выраженным генетическим сходством. M. smegmatis является непатогенной микобактерией 1919г. – французские ученые Кальметт и Жерен путем многократных (230) последовательных пассажей M. bovis получили штамм непатогенный для человека. 1921 г. Культура БЦЖ (бацилла Кальметта и Жерена ) – используется для вакцинации людей. 6 Характеристика микобактерий Микобактерии (Mycobacterium) – грамположительные; кислотоустойчивые; облигантые аэробы; факультативные внутриклеточные паразиты; M. tuberculosis – размножается с периодом удвоения 18-24 ч., сохраняет жизнеспособность при +80 С и при -30 С. Лиофилизирован. жизнеспособны до 30 лет. M. smegmatis Окраска по Циль-Нильсену : карболовым фуксином, с последующим обесцвечиванием раствором серной кислоты и доокрашиванием метиленовой синькой 7 SL TDM LOS P PIM LAM PGL Схема клеточной стенки микобактерий outer layer (~12 nm): phospholipids, complex catamphiles, phenolic glycolipids, sulfolipids, etc. electron transparent layer (~8 nm): mycolic acids cell wall skeleton (~13 nm): arabino galactan, peptidoglycan cytoplasmic membrane (~7 nm) PGL- фенольные гликолипиды, РIM-фосфатидилинозитманнозид, LAM-липоарабиноманнан, Р-белки-порины, LOS-липоолигосахарид, SL-сульфолипиды, TDM-димиколат трегалозы. 8 Характеристика липидов микобактерий Общее содержание липидов в клетках микобактерии– 40% (от сухой биомассы) В клеточных стенках микобактерий содержится - 25-32% липидов • Нейтральные липиды – моно-, ди-, триглицериды, воска, эфиры вторичных спиртов с высшими жирными кислотами, менахиноны • Фосфолипиды - 4,5-6% -КЛ, ФЭ, ФК, ФИ, ФИ -маннозиты • Миколовые кислоты – кислоты, содержащие от 60 до 90 атомов углерода • Гликолипиды –гликозилдиглицериды и ацилированные сахара (микозиды, кордфактор – димиколат трегалозы), сульфолипиды • Пептидолипиды и пептидогликолипиды - «воск» D, микозиды 9 ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ M.tuberculosis С МАКРОФАГОМ 10 ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ МИКОБАКТЕРИЯ – МАКРОФАГ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ СОБЫТИЙ: Для макрофага •1.Активация макрофага: - индукция кислородного взрыва; - выброс цитокинов; - образование псевдоподий; •2. Образование фагосомы; •3. Созревание фагосом: - ФИ-цикл; - синтез белков слияния 1 и 2 стадии; - понижение рН; - изменение уровня Са; •4. Слияние с лизосомами; •5. Переваривание микобактерий Для микобактерии 1. Связывание с рецепторами макрофага; 2. Проникновение в макрофаг в составе фагосомы; 3. .Блокирование слияния ФАГОСОМА-ЛИЗОСОМА; 4 Секреция белков и пептидов микобактерий, влияющих на метаболизм макрофага; 5. Получение жирных кислот из фосфолипидов фагосомы; 6.Размножение в фагосоме 11 Химиотерапия туберкулеза Три группы противотуберкулезных препаратов (ПТП) (классификация Международного союза борьбы с туберкулезом): I группа включает препараты наиболее эффективные против МБТ: изониазид рифампицин O O NH NH2 O OH O OH O OH OH NH N N O (1951г.) МПК 0,01-1 мкг/мл OH O N O N (1970г.) МПК 0,1-10 мкг/мл 12 Противотуберкулезные препараты II группу составляют препараты средней эффективности: стрептомицин, канамицин, циклосерин, этамбутол, этионамид (протионамид), пиразинамид, NH H 2N NH H 2N C OH HO C NH OH N H N OH H O N H O CHO CH3 CH3 H OH OH O Этамбутол HOH2C O HO NHMe МПК 5-40 мкг/мл OH Стрептомицин (МПК 1,25-40 мкг/мл) III группа - препараты низкой эффективности: парааминосалициловая кислота (ПАСК), тиоацетазон 13 Схема химиотерапии туберкулеза Интенсивная фаза - 2 месяца Препараты – комбинированная таблетка: Изониазид /рифампицин/пиразинамид/этамбутол 60мг 120мг 200 мг 300 мг 4-5 таблеток (5 дней в неделю) Продолжение лечения – 4 месяца Препараты – комбинированная таблетка: Изониазид /рифампицин 150 мг 300мг 2 таблетки в день 14 Мишени, на которые направлено действие ПТП - Изониазид - Этамбутол - Пиразинамид - Рифампицин 15 Развитие устойчивости МТБ к ПТП Геном МБТ насчитывает 4,4 млн.пар основ., которые кодируют 4000 генов Антимикроб Механизм ный действия препарат Изониазид Ингибирование синтеза миколовых кислот Ингибирование Рифампицин ДНK-зависимой РНK-полимеразы Гены, ответственные за устойчивость Механизм устойчивости 1) katG (каталазапероксидаза) 1) Мутации в гене katG приводят к потере активности интермедиатов изониазида. 2) inhA (енол-АСРредуктаза) 2) Суперэкспрессия гена inhA обеспечивает продолжение синтеза миколовой кислоты и вызывает инактивацию активного интермедиата изониазида. 3) ahpC (алкилгидроперокс идредуктаза) 3) Мутации в гене ahpC способствуют детоксикации активного интермедиата изониазида rpoВ (βсубъединица Мутации приводят к снижению способности РНKфермента связываться с рифампицином 16 полимеразы) Антимикробный препарат Механизм действия Гены, ответственные за устойчивость Механизм устойчивости Стрептомицин 1) rpsL (рибосомный Ингибирование белок S12) синтеза белка 2) rrs (16S рРНK) Мутации приводят к изменению структуры рибосом и снижению проницаемости внешних структур микробной клетки Этамбутол Ингибирование биосинтеза арабиногалакта на и липоарабиномн нана embAB (арабинозилтрансфераза) Высокий уровень экспрессии или мутация в гене embAB делает возможным продолжение синтеза арабина pcnA Потеря активности пиразинамидазы нарушает процесс превращения пиразинамида в пиразиновую кислоту gyrA (субъединица А ДНKгиразы) Снижение аффинности фермента к препаратам фторхинолоновой группы Пиразинамид Не известен Ингибирование ДНK-гиразы Фторхинолоны (топоизомеразы IV) 17 Пути повышения эффективности лечения туберкулеза 1. Разработка ускоренных методов диагностики заболевания и детекции резистентности микобактерий к ПТП (2004г.- биочип ИМБ для определения устойчивости МБТ к ПТП получил государственный сертификат.) 2. Получение новых противотуберкулезных препаратов. (ОРС-67683 – производное нитро - дигидроимидазооасазола, ИОС-41, R-207910 –диарилхинолин) 3. Разработка лекарственных препаратов направленного действия на основе уже известных ПТП (Изодекс –изониазид+декстран и т.п.) 4. Улучшение исполнительность пациентов в неблагополучных социальных группах при внедрении простых программ "непосредственно контролируемой терапии" 5. Разработка новых вакцинных препаратов 18 Новые противотуберкулезные препараты 19 ПТП нового поколения их мишени Механизм действия PA824 (нитроимидазооксазины) Подавление синтеза белка и липидов клеточной стенки, в т.ч. в анаэробных условиях; образование интермедиатов, высвобождающих активные оксиды азота Подавление синтеза липидов клеточной стенки и биосинтеза миколовых кислот Подавление синтеза АТФ F420-зависимая нитратредуктаза Мутация генов rv0407, rv3547, rv3261, rv3262 Нитратредуктаза Мутация гена rv3547 F0F1 АТФ-синтаза Мутация гена atpE Подавление синтеза клеточной стенки Н/д Н/д Н/д Н/д Н/д Подавление синтеза белка Рибосомы Н/д Подавление синтеза арабинана DprE1-субъедини-ца фермента декапренил-фосфорил-βО-рибозы 2‘эпимеразы Протеинкиназы PknA и PknB Мутация гена rv3790 ОРS67683 (нитроимидазооксазины) TMC207 (R207910) (диарилхинолины) SQ109 (диэтиамины) LL3858 (пирролы) Линезолид (оксазолидиноны) BTZ043 (нитробензотиазиноны) Тритразин-Н (азолотетразины) Ингибирование серинтреониновых протеинкиназ Мишень Механизм образования устойчивости Препарат (класс соединений) Н/д 20 Системы доставки противотуберкулезных препаратов 1. Липосомы 2. Микросферы (микрочастицы, наночастицы) на основе полимеров 3. Полимерные имплантанты 21 Системы доставки противотуберкулезных препаратов L.C.Toit, V.Pillay, M.P.Dancwerts Tuberculosis chemotherapy: current drug delivery approaches.// Respiratory research. 2006.V.7.P.118-135 22 Липосомные формы противотуберкулезных препаратов Преимущества перед традиционными лекарственными формами: 1.Защита препарата от деструкции, связанной с воздействием ферментов биологических жидкостей; 2. Пролонгированное действие препарата, вызванное постепенным высвобождением лекарства из ЛС; 3. Направленный транспорт лекарства к органумишени (липосома инфицированный макрофаг). 23 Распределение "пустых" липосом в организме экспериментальных животных Состав липосом Процент введенной дозы через 1 ч после инъекции Печень Селезенка Легкие I ФХ/ХС II ФХ/ХС/О-САП III ФХ/ХС/О-САП/ДЦФ IV ФХ/ХС/О-САП/ДЦФ/GM1 30,3 ± 1,7 1,7 ± 0,5 29,7± 1,5 V ФХ/ХС/ОСАП/ДЦФ/ДСФЭ-ПЭГ 27,1 ± 0,4 3,2 ± 0,9 28,0± 0,4 VI ФХ/ХС + ФХ/ХС/ОСАП/ДЦФ/ДСФЭ-ПЭГ 17,3 ± 0,5 1,0 ± 0,05 37,3± 0,5 60,0 ±1,73 3,70± 1,62 53,6 ± 3,1 4,0 ± 0,5 4,70± 1,06 19,0± 2,0 47,1 ± 1,8 2,56 ± 0,5 23,0± 2,0 ФХ-фосфатидилхолин,ХС-холестерин, О-САП-стеариламинопектин, ДЦФ – дицетилфосфат ДСФЭ-ПЭГ-дистеароилфосфатидилэтеноламинполиэтиленгликоль, GM1- моносиало24 ганглиозид Влияние фосфолипидного состава на степень включения рифампицина в липосомы 22 Cтепень включения РФ, % 20 18 16 14 12 10 8 6 4 2 0 ФХ Ф Х :К Л 1 0 :1 Ф Х :л Ф Х 1 0 :1 Ф Х :Х С 4 :1 Ф Х :Ф Э :л Ф Х 7 :1 :0 ,3 концентрация рифампицина 7 мг/мл, фосфолипидов 40 мг/мл 25 Жизнеспособность Mycobacterium smegmatis внутри макрофагов (in vitro) и после аэрозольного введения липосомного рифампицина in vivo % жизнеспособности Биосистема Исходная жизнеспособность M. smegmatis 76,0 ± 5,6 Макрофаги + M. smegmatis 69,5 ± 5,2 Свободный рифампицин (РФ) + макрофаги + M. Smegmatis 45,7 ± 4,7 Липосомы (ФХ:ХЛ+РФ) smegmatis M. 31,6 ± 3,8 Липосомы (ФХ:ХЛ+РФ с ДЦФ) + макрофаги + M. Smegmatis 21,6 ± 3,1 Липосомы, (ФХ:ХЛ+РФ с МА)+ макрофаги + M. Smegmatis 10,9 ± 2,1 Липосомы, (ФХ:ХЛ+РФ с О-САП) + макрофаги + M. Smegmatis 7,1 ± 1,6 + макрофаги + 26 АНТИБАКТЕРИАЛЬНАЯ АКТИВНОСТЬ ЛИПОСОМАЛЬНОГО РИФАМПИЦИНА in vivo Схема эксперимента: Мышей заражали внутривенным введением M. tuberculosis Н37Rv в ретроорбитальный синус глаза в дозе 5х10^5 КОЕ; лечение осуществляли через 2 недели после заражения, ежедневно, в течение 2-х месяцев; Липосомальную форму рифампицина вводили ингаляцион., изониазид - внутрижелудочно Количество высеваемых M.tuberculosis из органов зараженных мышей через 2 месяца лечения Препарат КОЕ / селезенка 1.Контроль (7,2±0.5)х10^5 2.Изониазид+рифампицин 3.Изониазид 0 (2.3± ±0.6)*10^3 4. Изониазид +липосомы с РФ (ингаляционно) 0 КОЕ /легкое Х±SD (3.9±0.5)х10^6 0 (4.3± ±0.6)*10^3 0 ДОЗА РИФАМПИЦИНА В ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ФОРМЕ В 15 РАЗ МЕНЬШЕ ДОЗЫ РАСТВОРА РИФАМПИЦИНА, ВВОДИМОГО ВНУТРИЖЕЛУДОЧНО, И НЕ ВЫЗЫВАЕТ ТОКСИЧНЫХ ЭФФЕКТОВ 27 Фторхинолоны – применяемые в лечении туберкулеза офлоксацин левофлоксацин ломефлоксацин 28 Метод активной загрузки фторхинолонов (ОФ, ЛФ и ЛМ) в липосомы Влияние липидного состава липосом на эффективность включения ОФ, ЛФ и ЛМ Раствор липидов в хлороформе Упаривание, диспергирование раст вором 0,3М (NH4)2SO4 Фторхинолоны Состав липидов ФХ (10 мг/мл) Эффективно Эффективно Размер масса АБ, сть сть Загрузки липосом, мг включения, препарата, нм % % 0,8 225 55 7 0,8 235 58 6 1 269 60 10 4:1:1 по массе(15 мг/мл) 1 235 58 6 ФХ (10 мг/мл) 0,2 225 50 1 0,2 202 54 1 МЛВ ОФ ФХ/ХОЛ 4:1 по массе (10 мг/мл) ОЛВ ФХ/ХОЛ гельхроматография липосомы ЛФ (NH4)2SO4 + АБ в 1% CH3COOH Инкубировали при температуре 50°С до 2040мин ЛМ 4:1 по массе (10 мг/мл) ФХ/ХОЛ/КЛ ФХ/ХОЛ 4:1 по массе (10 мг/мл) Влияние липосомальной формы левофлоксацина на рост штамма Mycobacterium tuberculosis CN-37 (ШЛУ) Зависимость начала роста клеток M. tuberculosis CN-37 (105 КОЕ/мл) от вносимого препарата Состав липосом | Конц. КЛ. , мкг/мл Конц. ЛФ, мкг/мл Контроль рост МТБ (ШЛУ) ЛФ ФХ/ХОЛ/КЛ (4:1:1 по массе) ФХ/ХОЛ/КЛ (5,5:1:0,5 по массе) ФХ/ХОЛ (5:1 по массе) 100 50 0 Начало роста (сутки) 8 0 8 1 9 2 4 0 10-11 нет роста 17 (нет роста) 1 2 нет роста нет роста 4 нет роста 0 8-9 1 9 2 нет роста 4 нет роста 0 8 1 8 2 4 9 нет роста Благодарю за внимание!