Возбудитель рака картофеля Synchytrium endobioticum (Schilb

1
На правах рукописи
ХЮТТИ Александр Валерьевич
МОНИТОРИНГ ПОПУЛЯЦИЙ ВОЗБУДИТЕЛЯ РАКА
КАРТОФЕЛЯ И ВЫЯВЛЕНИЕ ИСТОЧНИКОВ УСТОЙЧИВОСТИ
Специальность: 06.01.11 – защита растений
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург, 2008
2
Диссертационная работа выполнена во Всероссийском
научно-исследовательском институте защиты растений
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор
Афанасенко Ольга Сильвестровна
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор
Иващенко Владимир Гаврилович
доктор биологических наук
Трускинов Эрнст Валентинович
Ведущая организация:
Московский Государственный Университет
Защита диссертации состоится 11 июля 2008 г. в 12 часов на заседании
диссертационного совета Д 006.015.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте защиты растений по адресу: 196608, Санкт-Петербург,
Пушкин, шоссе Подбельского, д. 3
Факс (812) 470-51-10, E-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского НИИ
защиты растений
Автореферат разослан
июня 2008 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
кандидат биологических наук
Г.А. Наседкина
3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность работы. Возбудитель рака картофеля Synchytrium
endobioticum (Schilb.) Perc. – является карантинным объектом, включенным в
перечень карантинных видов 55 государств (Распространение по странам
мира…, 1987). Широкая географическая распространенность, способность
длительное время сохраняться в почве, трудность искоренения и образование
новых, приспособившихся к местным условиям агрессивных патотипов, свидетельствуют о высокой пластичности и большой опасности возбудителя рака
картофеля.
Потери урожая в очагах рака картофеля могут составлять 50-100%
(Hampson, 1993; Melnik, 1998). Например, в 1967 году в Ленинградской области на отдельных зараженных приусадебных участках потери урожая картофеля составили 45-96% (Тарасова, 1978).
На территории Российской Федерации первые очаги заболевания были зарегистрированы в Ленинградской области в 1940 году общей площадью заражения 1,4 га (Галанова, 1964). В Ленинградской области основное количество
очагов рака находится на приусадебных участках, где выращивались восприимчивые к заболеванию сорта картофеля (Справочник…, 2001, 2003, 2006).
На 2006 год в Ленинградской области возбудитель рака картофеля зарегистрирован в 9-ти районах общей площадью заражения 8,75 га (Справочник…,
2006).
В настоящее время в районах, где имеются очаги рака, должны выращиваться только высокоустойчивые к S. endobioticum сорта картофеля, которые
способствуют очищению почвы от патогена. Российское законодательство в
сфере карантина растений разрешает выращивание в очагах S. endobioticum
вне зависимости от степени инфекционной нагрузки любые устойчивые сорта
картофеля и любые сельскохозяйственные культуры (Тарасова, 1978;
Инструкция…, 1988). Стоит отметить, что вывоз выращиваемой сельскохозяйственной продукции, а также картофеля из очагов рака, должным образом
не контролируется и, более того, не известно, какие сорта (по степени устойчивости) выращиваются на карантинных участках.
В настоящее время необходимо проведение комплексного мониторинга карантинных очагов S. endobioticum, расположенных на территории Ленинградской области. Выявление возбудителя рака картофеля в зарегистрированных
очагах, особенно при малой зараженности почвы, представляет определенную
трудность, т.к. стандартная процедура отбора почвенных проб, а также стандартные методы ракодиагностики не дают 100% экстрагируемости зооспорангиев из почвы (Ефременко и др., 1985; Зеля и др., 2005; van Leeuwen et al.,
2005).
Помимо этого, определенную трудность представляет анализ почвы на
выявление зооспарангиев возбудителя рака картофеля, потому что необходимо отличать покоящиеся зооспорангии S. endobioticum от покоящихся
зооспорангиев сходных видов рода Synchytrium. В 1977 году на террито-
4
рии бывшего СССР было зарегистрировано 22 вида из рода Synchytrium,
причем 13 из них были распространены в Российской Федерации, главным образом, в Ленинградской и Московской областях (Кирюхина и др.,
1977).
Таким образом, очевидно, что в настоящее время остро стоит проблема
по созданию эффективного метода диагностики единичных зимних (покоящихся) зооспорангиев S. endobioticum.
Современная селекция картофеля ориентирована на получение сортов, сочетающих высокую продуктивность с устойчивостью к наиболее опасным патогенам. Обязательным требованием для включения в реестр селекционных
достижений новых сортов картофеля является устойчивость к возбудителю
рака. Создание сортов с групповой устойчивостью, в том числе и к раку,
крайне важно в системе защиты картофеля.
Помимо этого, для создания высокоустойчивых сортов картофеля к S.
endobioticum, необходимо четко представлять внутривидовой состав популяции патогена, даже в пределах обычного (D1) патотипа, географически отдаленные популяции возбудителя рака картофеля отличаются по агрессивности
к восприимчивым сорта картофеля (Воловик и др., 1968, 1975; Федотова,
1959; Федотова и др., 1969; Бондарь, 1989; Данченко, 1983, 1989; Ламеко и
др., 1991). Молекулярно-генетические исследования, которые могли бы служить основой для изучения микроэволюционных процессов в популяциях патогена, до настоящего времени не проводились.
Цель и задачи исследований. Целью исследований являлось выявление
возбудителя рака картофеля в зарегистрированных карантинных очагах Ленинградской области, характеристика географических популяций S.
endobioticum по вирулентности, агрессивности, ДНК-маркерам, а также выявление источников устойчивости картофеля.
Для достижения данной цели предстояло решить следующие задачи:
1. Провести мониторинг зарегистрированных карантинных очагов S.
endobioticum в Ленинградской области.
2. Разработать метод молекулярной диагностики возбудителя рака картофеля в почвенных образцах.
3. Провести идентификацию патотипного состава географических популяций S. endobioticum и охарактеризовать их агрессивность по отношению к
восприимчивым сортам картофеля.
4. Провести сравнительный анализ географических популяций возбудителя рака картофеля с использованием ДНК-маркеров.
5. Оценить устойчивость к S. endobioticum сложных межвидовых гибридов
картофеля селекции ГНЦ РФ ВНИИР.
Научная новизна исследований.
1. Впервые проведено молекулярное генотипирование 4-х образцов популяций S. endobioticum из Московской и Ленинградской областей, а также из
5
Белоруссии и Украины методами RAPD и УП-ПЦР. Выявлены генетические
различия между индивидуумами паразита внутри популяции, а также различия между популяциями.
2. Разработан метод молекулярной диагностики возбудителя S.
endobioticum в почвенных образцах, который отличается от известных тем,
что ДНК паразита экстрагировалась, во время денатурации в первом цикле
ПЦР из целых зооспорангиев, помещенных до этого непосредственно в реакционную смесь.
3. Выявлена донорская способность клона Solanum chacoense 19759 в
передаче признака устойчивости к S. endobioticum потомству.
Практическая значимость работы. На основании мониторинга популяций
возбудителя рака картофеля в Ленинградской области определена степень
жизнеспособности S. endobioticum в зарегистрированных очагах рака. Эти
сведения необходимы для вывода карантинных очагов из-под регламента
контроля РОССЕЛЬХОЗНАДЗОРа. Предложен метод молекулярной диагностики возбудителя S. endobioticum в почвенных образцах.
Данные по агрессивности московской, белорусской и украинской популяций S. endobioticum могут быть использованы при подборе инокулюма для
оценки сортов и гибридов картофеля и выборе универсально восприимчивого
контроля.
Для практической селекции выявлены устойчивые к раку сложные гибриды картофеля, обладающие также устойчивостью к нематоде, фитофторозу и
Y вирусу (Хютти и др., 2007).
Апробация работы и публикации результатов исследования. Результаты
исследований были представлены на втором симпозиуме по агробиотехнологии: “Взаимоотношения почвенных микроорганизмов и растений” (Гамбург,
2006); на совещании: “Исследование эволюции взаимоотношений растений и
микроорганизмов” (Санкт-Петербург, 2007); на международной научно-практической конференции “Актуальные проблемы иммунитета и защиты сельскохозяйственных культур от болезней и вредителей” (Одесса, 2007); на II Вавиловской международной конференции “Генетические ресурсы культурных
растений в XXI веке. Состояние, проблемы, перспективы” (Санкт-Петербург,
2007); на годичной отчетной сессии ГНУ ВИЗР (Санкт-Петербург, 2008); на II
съезде микологов России “Современная микология России” (Москва, 2008).
Материалы исследований опубликованы в 6 печатных работах, из них 1
опубликована в рецензируемом журнале из перечня ВАК РФ.
Работа поддержана грантом РФФИ № 08-04-00447
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 225
страницах машинописного текста и состоит из введения, шести глав, выводов
и списка литературы. Работа иллюстрирована 32 рисунками и 23 таблицами.
Библиография включает 338 источников, из них 190 на иностранном языке.
6
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Глава 1. Обзор литературы
Приведены сведения по распространенности, вредоносности и биологическим особенностям возбудителя рака картофеля. Обобщены сведения по
структуре популяции патогена, устойчивости картофеля к возбудителю и методы диагностики и определения жизнеспособности S. endobioticum.
Глава 2. Материалы и методы
Растительный и инфекционный материал. Для определения патотипного
состава различных географических популяций S. endobioticum (московской,
белорусской и украинской) была создана и размножена коллекция сортовдифференциаторов картофеля из известных шести наборов (Салтыкова, 1988;
Мельник и др., 1999; Potoček et al., 1991; Stachewicz et al., 1998; OEPP/EPPO,
2004). К сожалению, мы не смогли найти некоторые сорта, вследствие чего
объединили в один набор имеющиеся: Альма, Лорх, Полесский розовый, Свитанок киевский, Львовский белый, Пролисок, Луговской, Антарес, Ора
(Мира), Аполло, Гиевонт, Фонтана, Кардула, Воловецкий, Незабудка, Спадщина, Барбара, Ресурс, Темп и Божедар. С использованием этого набора сортов-дифференциаторов возможно выявить патотипы, распространенные в
бывшем СССР и Украине (1 (D1), 11 (M1), 13 (R2), 16 (S1), 18 (I), 20, 21, 22), а
также частично идентифицировать патотипы, распространенные в Германии
(2 (G1), 4 (P1), 5 (K1), 6 (О1), 7 (S1), 8 (F1), 9 (R1), 10 (Е1), 18 (T1)), Норвегии
(2 (G1), 6 (О1), 18 (T1)) и Чехии (15 (P2), 16 (N1), 17 (M2)).
При создании объединенного набора, состоящего из 20 сортов-дифференциаторов, были использованы образцы мировой коллекции ВИР, а также сорта, полученные из Украинской научно-исследовательской станции карантина
растений УААН.
Для изучения агрессивности популяций S. endobioticum использовались
следующие восприимчивые сорта картофеля: Лиза, Лорх, Полесский розовый,
Тулунский, Альма и Свитанок киевский.
Для оценки на устойчивость к первому патотипу (D1) S. endobioticum (московской популяции) были испытаны 84 сложных межвидовых гибрида картофеля, любезно предоставленные к.б.н. Е.В. Рогозиной из отдела генетических
ресурсов картофеля ГНЦ РФ ВНИИР.
В качестве инфекционного материала для инокуляции растений в лабораторных условиях использовали образцы четырех географических популяций
возбудителя рака картофеля: московской (Россия, Московская обл., Люберецкий р-н, п. Коренево), ленинградской (Россия, Ленинградская область, Кировский р-н, п. Старая Малукса), белорусской (Белоруссия, Минская обл.,
Минский р-н, п. Самохваловичи) и украинской (Украина, Черновицкая обл.,
Новоселицкий р-н, с. Бояны).
Для размножения образцов популяций S. endobioticum, а также в качестве
контроля, использовали высоковосприимчивый сорт Лиза.
Методика отбора почвенных проб из зарегистрированных очагов рака
7
картофеля в Ленинградской области. Для отбора почвенных проб в очагах
рака картофеля в Ленинградской области использовали метод, предложенный
Научно-исследовательским институтом картофельного хозяйства (Воловик и
др., 1966). Данная методика предусматривает отбор почвенных проб по линиям, параллельным одной из сторон участка, с интервалом перехода меду линиями и местами взятия выемок по линии перехода 1,0 м.
Образцы почвенных проб из трех районов Ленинградской области (Бокситогорского, Подпорожского и Всеволожского) были предоставлены Пограничной Государственной инспекцией по карантину растений по Санкт-Петербургу и Ленинградской области в 2003-2005 гг. Из остальных 6 районов Ленинградской области образцы почвенных проб отбирали совместно с государственным инспектором Федеральной службы по ветеринарному и фитосанитарному надзору (РОССЕЛЬХОЗНАДЗОР) Е.В. Феклистовой в 2007 году.
Микроанализ почвы на выявление зимних (покоящихся) зооспорангиев возбудителя рака картофеля. При определении зараженности почвы возбудителем рака картофеля, необходим разрыв адсорбционных связей между зооспорангиями и частицами почвы. Мы использовали наиболее эффективный
экспресс-метод выявления возбудителя рака картофеля, предложенный Украинской научно-исследовательской станцией карантина растений УААН, который позволяет проводить микроанализ почв с различным механическим составом и одновременно определять жизнеспособность зооспорангиев (Мельник, 2000, 2005).
Лабораторный метод биологической проверки почвы на наличие возбудителя рака картофеля. Для получения наиболее точных результатов, применялись два типа биопроверок: разработанной сотрудниками ВИЗР (Лабораторно-вегетационный метод…, 1983; Инструкция…, 1988) и рекомендованной
Европейской и Средиземноморской организацией по защите растений (ЕОЗР)
(OEPP/EPPO, 1999).
Методы лабораторной диагностики устойчивости картофеля к S.
endobioticum. Оценку картофеля на устойчивость к S. endobioticum осуществляли согласно методическим указаниям, разработанным сотрудниками
ВИЗР: В.И. Яковлевой, Л.П. Салтыковой (Лабораторная диагностика…, 1979)
и Л.П. Салтыковой, В.П. Тарасовой (Методические указания…, 1982), с небольшими модификациями. Данные методические указания удовлетворяют
всем международным нормам и требованиям, предъявляемым к оценке картофеля на ракоустойчивость. Лабораторная диагностика ракоустойчивости проводилась двумя методами: методом заражения ростков картофеля в “компосте”, содержащем зимние зооспорангии S. endobioticum, и методом заражения
ростков картофеля от свежих раковых наростов, содержащих быстропрорастающие летние зооспорангии патогена. По окончании лабораторных опытов
учитывали количество пораженных клубней и вес наростов (при заражении
растений картофеля в “компосте”) или степень заражения (при заражении
картофеля от свежих раковых наростов) по унифицированной шкале с подразделением образцов на группы: группа 1 – устойчивые. Защитный некроз охва-
8
тывает отдельные эпидермальные клетки или участки ткани. Могут встречаться единичные (до 5) зрелые зооспорангии без некроза; группа 2 – относительно устойчивые (полевая устойчивость). Зрелые зооспорангии расположены на ростках локально или рассеяны по ростку. Могут некротизироваться
клетки или отдельные участки ткани. Защитный некроз появляется поздно;
группа 3 – восприимчивые. Плотное заражение. Некроз отсутствует или незначительный. Образуются наросты или деформируются ростки. Результаты
испытания ракоустойчивости считались достоверными, если поражение
контрольных растений восприимчивого сорта составляло не менее 75%.
Методика выделения ДНК из растения-хозяина и раковых наростов различных географических популяций S. endobioticum и условия проведения ПЦР.
Для выделения ДНК использовали, как здоровые листья сорта Лиза, так и раковые наросты (20-30-ти суточного возраста), полученные от этого же сорта.
Для выделения ДНК из раковых наростов четырех образцов популяций (московской, ленинградской, белорусской и украинской) использовали известный
метод с небольшими модификациями (Bulat et al., 1998). Геноспецифичную
ПЦР с праймерами F49 и R502 проводили по протоколу van den Boogert et al.
(2005). Условия проведения ПЦР со случайными и универсальными праймерами подбирали экспериментальным путем. Праймеры, использованные в работе, приведены в таблице 2.1.
Таблица 2.1. Праймеры использованные при амплификации ДНК S. endobioticum
Наименование праймера
OPA-01
OPA-08
OPA-09
OPA-10
OPB-11
OPI-9
OPI-10
AS4
AS15inv
F49
R502
Последовательность
Случайные праймеры
5’- CAg gCC CTT C-3’
5’- gTg ACg TAg g-3’
5’- ggg TAA CgC C-3’
5’- gTg ATC gCA g-3’
5’- gTT TCg CTC C-3’
5’- Tgg AgA gCA g-3’
5’- ACA ACg CgA g-3’
Универсальные праймеры
5’- TgT ggg CgC TCg ACA C-3'
5’- CAT TgC Tgg CgA ATC gg-3’
Специфичные праймеры
5’ - CAA CAC CAT gTg AAC Tg – 3’
5’ - ACA TAC ACA ATT CgA gTT T - 3’
Ссылка
Operon Technologies, Inc.
(Alameda, CA).
Lubeck et al., 1999
Bulat et al., 2000
van den Boogert et al.,
2005
Глава 3. Распространение возбудителя рака картофеля в
Ленинградской области Российской Федерации
Результаты микроанализа образцов почвенных проб из Бокситогорского,
Подпорожского и Всеволожского районов Ленинградской области представлены в таблице 3.1. Полученные данные показывают, что в Подпорожском районе Ленинградской области девять очагов рака (г. Подпорожье, очаги № 1, 4, 5
и 6; п. Важины и д. Ярославичи, очаги № 1, 2, 4, 5, 6 и 7) содержат от 31 до
116 жизнеспособных зооспорангиев в 1 г почвы. Во Всеволожском районе (п.
9
Ириновка) при микроанализе почвенных образцов было выявлено не менее 45
жизнеспособных зооспорангиев в 1 г почвы. По данным Л.П. Салтыковой и
др. (Методические указания…, 1982) и R.P. Baayen et al. (2005) наличие 30-40
жизнеспособных зооспорангиев в 1 г почвы является оптимальной инфекционной нагрузкой для заражения возбудителем рака картофеля. В выявленных
очагах не следует возделывать даже устойчивые сорта картофеля, так как высокая инфекционная нагрузка представляет потенциальную опасность для появления более агрессивных патотипов.
Таблица 3.1. Наличие покоящихся зооспорангиев S. endobioticum в почвенных образцах, отобранных из карантинных очагов рака картофеля в Ленинградской области
Общая
Среднее количество зооспорангиев в 1 г почвы
площадь
Деформирован- Не жизнеспособзараже- Жизнеспособные
ные
ные
ния, га
Подпорожский р-н, г. Подпорожье
1
0,19
100,31
13,37
20,62
2
2
8,64
7,11
0,00
3
3
6,51
5,30
0,00
4
4
100,80
4,53
96,34
5
5
80,33
47,91
8,28
6
6
65,60
37,35
3,36
Подпорожский р-н, п. Важины и д. Ярославичи
1
0,70
37,81
67,60
9,50
2
2
34,93
5,82
0,00
3
3
2,42
1,00
0,00
4
4
116,30
8,26
40,35
5
5
59,66
2,32
10,40
6
6
31,64
9,43
11,61
7
7
59,38
2,82
10,03
Бокситогорский р-н, п. Ефимовский
1
0,22
6,23
0,00
0,00
Всеволожский р-н, п. Ириновка
1
0,06
45,00
13,01
18,68
Итого проанализировано:
Районов Площадью заражения, га
Очагов
Проб, шт
3
1,17
15
15
№ очага
Год регистрации очага
1947-1997
1980-1998
1985
1990
Навесок, шт
60
В Бокситогорском (п. Ефимовский) и Подпорожском (г. Подпорожье, очаги
№ 2 и 3) районах Ленинградской области при микроанализе почвы, отобранной из карантинных очагов, было выявлено от 6 до 8 жизнеспособных зооспорангиев в 1 г почвы. По многолетним данным Голландской NPPO 50% восприимчивых сортов картофеля образовывали наросты при наличии 1 зооспорангия в 1 г почвы, а при 5 зооспорангиях в 1 г почвы поражалось до 90%
растений (OEPP/EPPO, 2004). Поэтому, в вышеуказанных карантинных очагах
можно возделывать только высокоустойчивые сорта картофеля, способствующие очищению почвы от патогена.
Результаты микроанализа почвенных проб, отобранных из Кировского,
10
Киришского, Всеволожского (г. Всеволожск), Гатчинского, Лужского и Приозерского районов Ленинградской области, представлены в таблице 3.2.
Из полученных данных видно, что в этих районах, среднее количество
жизнеспособных зооспорангиев в 1 г почвы составляет не более 5. Так, наибольшее количество очагов, в которых инфекционная нагрузка составляет от 3
до 5 жизнеспособных зооспорангиев, было выявлено в п. Старая Малукса (карантинные очаги № 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 и 11) и п. Новая Малукса (очаг № 2)
Кировского района. Важно отметить, что из отобранных почвенных проб в
очагах № 2, 3 и 6, п. Старая Малукса, было экстрагировано в среднем 3 жизнеспособных зооспорангия на 1 г почвы, но в некоторых навесках содержалось от 5 до 15 жизнеспособных зооспорангиев S. endobioticum. Кроме этого,
в очагах № 5, 8 и 9, где проведенный микроанализ показал наличие в среднем
не менее 5 жизнеспособных зооспорангиев патогена в 1 г зараженной почвы,
было выявлено большое содержание деформированных зооспорангиев (частично жизнеспособных), в среднем не менее 8 в 1 г почвы. В данных карантинных очагах следует возделывать только высокоустойчивые сорта картофеля и ни в коем случае не допускать наличия примеси слабоустойчивых или,
тем более, восприимчивых сортов, т.к. известно немало случаев, когда при небольшой инфекционной нагрузке наличие слабоустойчивых сортов картофеля
в последующем приводило к образованию высокоагрессивных патотипов с
измененной вирулентностью (Braun, 1942; Langerfeld et al., 1994). Данные
требования также относятся и к очагу, расположенному в г. Всеволожске Всеволожского района (наличие в среднем 4 жизнеспособных и 5 деформированных зооспорангиев в 1 г почвы).
В д. Гремячево (очаги № 1, 2 и 4) Киришского и п. Старая Малукса (очаги
№ 1 и 7) Кировского районов в 1 г почвы, в среднем, содержится от 1 до 2
жизнеспособных зооспорангиев возбудителя рака картофеля. Поэтому, в вышеуказанных очагах, необходимо строгое соблюдение комплекса карантинных правил, предотвращающих распространение S. endobioticum.
Очаги, расположенные в Гатчинском, Кировском (п. Старая Малукса, очаг
№ 12) и Приозерском районах содержат менее одного жизнеспособного зооспорангия в 1 г почвы. Однако, наличие в 1 г почвы, в среднем, 1, 3 и 12 деформированных зооспорангиев, для перечисленных очагов, соответственно,
определяют необходимость в продолжении карантинного надсмотра.
В Киришском (п. Будогощь; д. Гремячево, очаг № 3), а также Кировском
(п. Новая Малукса, очаг № 1) районах, при микроанализе почвы, не было обнаружено жизнеспособных зооспорангиев возбудителя рака картофеля. Кроме
этого, было выявлено незначительное количество деформированных зооспорангиев (табл. 3.2). В образцах почвенных проб, отобранных из очага, расположенного в Лужском районе Ленинградской области, не было обнаружено
жизнеспособных и деформированных зооспорангиев. В дальнейшем, при
проведении биологической проверки почвы, подтверждающей отсутствие S.
endobioticum, данный очаг может быть выведен из-под регламента контроля.
Таблица 3.2. Результаты молекулярной диагностики, микроанализа и
11
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
0,12
0,05
0,09
0,09
0,06
0,10
0,09
0,08
0,07
0,07
0,07
0,05
1
2
0,08
0,08
1
0,01
1
2
3
4
0,15
0,20
0,10
0,10
1
0,02
1
0,05
1
0,05
1
0,06
Районов
6
Микроанализ
Среднее количество зооспорангиев в 1 г
почвы
Жизнеспособные
Деформированные
Не жизнеспособные
Биопроверка*
по методам
ВИЗР
ЕОЗР
Молекулярная диагностика **
№ очага
Площадь очага, га
биологической проверки почвы на наличие возбудителя рака картофеля
Кировский р-н, п. Старая Малукса
11,78
120,14
–
–
+
7,50
46,12
–
–
+
1,50
15,08
–
–
+
5,00
15,00
–
–
+
8,62
31,62
–
–
+
9,80
116,00
–
–
+
17,25
173,60
–
–
+
9,75
46,50
–
–
+
8,25
79,75
–
–
+
9,50
24,50
–
–
+
5,00
42,50
–
–
+
3,75
52,25
–
–
+
Кировский р-н, п. Новая малукса
0,00
1,12
28,37
–
–
–
3,12
6,25
26,37
–
–
+
Киришский р-н, п. Будогощь
0,00
8,75
82,37
–
–
–
Киришский р-н, д. Гремячево (коллективный огород)
2,54
2,58
13,45
–
–
+
1,54
1,25
8,29
–
–
+
0,00
0,25
0,00
–
–
–
1,76
1,25
8,66
–
–
–
Всеволожский р-н, г. Всеволожск
4,25
5,00
36,00
–
–
+
Гатчинский р-н, п. Дивенский
0,31
1,06
16,18
–
–
+
Лужский р-н, д. Низовская
0,00
0,00
0,00
–
–
Приозерский р-н, п. Ларионово
0,62
12,87
19,50
–
–
+
Итого проанализировано:
Площадью
Навебиопроверок
почвенных
заражения,
Очагов
сок,
по методике
проб, шт
га
шт
ВИЗР
1,84
23
74
296
92
1,57
4,31
4,50
3,50
5,12
3,10
2,68
5,06
5,25
4,50
3,25
0,91
Год регистрации очага
2003
1986
2000
1982
-«-«-«-«-«-«-«1986
-«-«1999
1981-1982
-«-«-«1986
1958
1987
1997
биопроверок
по методике
ЕОЗР
69
Примечание: * “–” – результат отрицательный; ** “+” – наличие и “–“ отсутствие
фрагмента 472 п.о.
Таким образом, в результате мониторинга большинства зарегистрирован-
12
ных очагов рака в Ленинградской области, они были ранжированы по степени
опасности распространения болезни и, соответственно, необходимости карантинных мероприятий.
По Российскому законодательству (Инструкция…, 1988) независимо от
того, выявлены или нет покоящиеся зооспорангии S. endobioticum при проведении микроанализа почвенных образцов, в любом случае необходима биологическая проверка почвы на наличие возбудителя рака картофеля. Биологическая проверка почвы проводилась для очагов рака картофеля указанных в таблице 3.2.
Для всех почвенных образцов биопроверка показала отрицательный результат. По данным J. Potoček (1982) и Европейской и Средиземноморской организации по защите растений (ЕОЗР) (OEPP/EPPO, 1999), если в 1 г почвы
содержится не более 5 жизнеспособных зооспорангиев S. endobioticum, то
биологическая проверка почвы показывает отрицательный результат. Во всех
вышеуказанных районах среднее количество жизнеспособных зооспорангиев
в 1 г почвы составляло не более 5, следовательно, полученный результат был
ожидаемым.
Глава 4. Разработка метода ПЦР диагностики покоящихся зооспорангиев S. endobioticum, экстрагированных из почвенных образцов
Для выделения ДНК S. endobioticum требуется минимум 50-100 зооспорангиев, при этом большая часть ДНК теряется при ее очистке. В связи с этим
были проведены исследования по выявлению возможности молекулярной
диагностики возбудителя S. endobioticum в почвенных образцах путем экстрагирования ДНК из целых зооспорангиев, помещенных непосредственно в реакционную смесь для ПЦР. Для этой цели использовали единичные покоящиеся зооспорангии, предварительно выделенные из раковых наростов.
Зооспорангии по 1, 2, 5, 10 и 20 штук добавляли в пробирки объемом 0,2
мл, содержащие 25 мкл реакционной смеси, и проводили ПЦР с видоспецифичными праймерами. Пробирки с реакционной смесью для ПЦР при добавлении в них единичных зооспорангиев патогена стояли на специальной ледяной платформе и к моменту непосредственного проведения ПЦР содержимое
пробирок было замороженным. Начальная температура ПЦР составляла 95о С,
а температура замороженной реакционной смеси с зооспорангиями менее -3о
С, из-за резкого перепада температур происходило механическое разрушение
оболочек зооспорангиев.
В образцах, содержащих 1, 2 и 5 зооспорангиев, диагностический фрагмент 472 п.о. успешно амплифицировался. В образцах, которые содержали по
10 и 20 зооспорангиев, ДНК не амплифицировалась. Скорее всего, это связано
с тем, что амплификация ДНК S. endobioticum ингибируется примесями белков, полисахаридов и других веществ, находящихся в оболочках зооспорангиев и микрочастицах почвенной биоты.
Наиболее достоверным и надежным методом экстрагирования зооспорангиев из почвы является экспресс-метод, предложенный Украинской научно-
13
исследовательской станцией карантина растений УААН (Мельник, 2000,
2005). Данный метод успешно применялся нами для мониторинга зарегистрированных карантинных очагов S. endobioticum в Ленинградской области.
Поэтому дальнейшая разработка метода ПЦР диагностики зимних зооспорангиев S. endobioticum осуществлялась с использованием вышеуказанного метода. Поскольку в экспресс-методе для экстрагирования зооспорангиев применяется NaI, то первой нашей задачей было определить влияние этого вещества
на ПЦР.
Для этого в каждую пробирку “эппендорф” (0,2 мл), в 25 мкл реакционной
смеси добавляли по 1, 2 и 5 зооспорангиев без обработки NaI и такое же количество зооспорангиев, обработанных NaI (зооспорангии заранее были внесены в почву, а затем экстрагированы экспресс-методом). В агарозном геле после электрофореза, образовавшиеся продукты амплификации в образцах без
обработки NaI имели более яркое свечение, чем в тех образцах, где применялся NaI, однако это влияние было не существенным. В дальнейшем, для усиления интенсивности сигнала, были подобраны экспериментальным путем оптимальные условия ПЦР. Для осуществления более сильного механического
воздействия на оболочки зооспорангиев в результате перепада температур мы
проводили денатурацию ДНК при 94о С в течение 10 мин и отжиг праймеров
при 57о С - 50 с. Число циклов увеличили до 40.
Для молекулярной диагностики вида S. endobioticum использовали зимние
зооспорангии патогена, экстрагированные экспресс-методом из почвенных
проб, отобранных в карантинных очагах Ленинградской области в 2007 году
(табл. 3.2).
В ПЦР смесь для последующего анализа вносили 1-2 жизнеспособных
зооспорангиев, у которых четко просматривалась зернистая структура, а также было видно, что содержимое имеет равномерный желтый цвет из-за окрашивания NaI.
Согласно результатам молекулярной диагностики вида S. endobioticum,
практически для всех образцов, где по морфологическим признакам был
определен вид S. endobioticum, ПЦР анализ подтвердил наличие возбудителя.
Однако у образцов из Кировского р-на (п. Старая Малукса, очаг № 12) диагностический фрагмент амплифицировался не во всех случаях, только в одном образце из четырех. Возможно, это связано с тем, что в том месте, где находится карантинный очаг, в настоящее время выращивается клевер, на котором паразитирует вид Synchytrium trifolii Passer. Покоящиеся зооспорангии S.
trifolii напоминают зимние зооспорангии S. endobioticum и, кроме того, имеют
практически сходные размеры (Инструкция…, 1988). У образцов из Киришского р-на (п. Будогощь, очаг № 1; д. Гремячево, очаг № 4) и Кировского р-на
(п. Новая Малукса, очаг № 1) во всех повторностях не амплифицировался
диагностический фрагмент 472 п.о. Скорее всего, это связано с тем, что на
данных очагах произрастает большое количество сорняков разных видов (бодяк, сныть, лебеда и т.д.), на которых паразитирует Synchytrium aureum Schröt.
Данный вид распространен достаточно широко в Ленинградской области и
14
встречается на 134 видах цветковых растений (Кирюхина, 1977;
Инструкция…, 1988). Покоящиеся зооспорангии S. aureum округлые, янтарнокоричневые, с крупнозернистым содержимым и имеют размер от 50 до 200
мкм в диаметре, из-за чего существует высокая вероятность их неправильной
диагностики.
У некоторых образцов, содержащих нетипичные зооспорангии, которые
можно было бы отнести к другим видам рода Synchytrium, амплифмцировался
диагностический фрагмент 472 п.о. Из этого следует, что стандартные методы
микроанализа не всегда позволяют правильно диагностировать вид S.
endobioticum, особенно основываясь только на морфологических особенностях объекта.
Практически во всех районах Ленинградской области (кроме Гатчинского
р-на), где расположены карантинные очаги, были выявлены зооспорангии
сходных видов, которые не диагностировались молекулярным методом, что
позволяет предполагать наличие не вида S. endobioticum, а сходных видов из
рода Synchytrium.
Таким образом, применение экспресс-метода экстрагирования зимних зооспорангиев возбудителя рака картофеля в сочетании с разработанным молекулярным методом диагностики позволяют с большой точностью судить о состоянии карантинных очагов.
В таблице 3.2 представлены результаты молекулярной диагностики, микроанализа и биологической проверки почвы на наличие возбудителя рака
картофеля. В сравнительном аспекте видно, что в карантинных очагах, где методом микроанализа было доказано наличие жизнеспособных зимних зооспорангиев S. endobioticum, проведенная молекулярная диагностика вида S.
endobioticum, подтвердила данные микроанализа. Полученные данные указывают на то, что при получении отрицательных результатов биологической
проверки почвы не существует 100% гарантии, что S. endobioticum отсутствует в почве.
Глава 5. Изменчивость географических популяций
возбудителя рака картофеля
В задачу наших исследований входило изучение патотипного состава трех
географических популяций S. endobioticum (московской, белорусской и украинской). Для этого был использован объединенный тест-набор, состоящий из
сортов-дифференциаторов различного происхождения, на котором было возможно определить большинство известных патотипов S. endobioticum. При заражении ростков тест-сортов в “компосте”, было установлено, что все тестсорта устойчивые к первому (D1) патотипу возбудителя рака картофеля
(Львовский белый, Пролисок, Луговской, Антарес, Ора (Мира), Аполло, Гиевонт, Фонтана, Кардула, Воловецкий, Незабудка, Спадщина, Барбара, Ресурс,
Темп и Божедар) не были поражены ни одной популяцией. Однако реакция на
заражение различными популяциями восприимчивых сортов была неодинаковой. Так, все три популяции поразили восприимчивые сорта Лорх, Полесский
15
розовый и Альма. Количество пораженных клубней сорта Альма для белорусской и украинской популяций составляло 10 и 50%, соответственно, в то время как для московской популяции – 80%. Восприимчивый сорт Свитанок киевский оказался восприимчивым только к московской и украинской популяциям (80 и 60%, соответственно). Сорт Львовский белый, обладающий полевой устойчивостью, не поразила ни одна популяция.
Таким образом, белорусская популяция обладает самой слабой агрессивностью, так как может успешно развиваться и образовывать наросты только
на сортах Лорх и Полесский розовый.
При заражении ростков сортов-дифференциаторов от свежих раковых наростов все три географические популяции S. endobioticum поразили восприимчивые сорта (Лорх, Полесский розовый, Альма и Свитанок киевский), но
не поразили ни один из устойчивых тест-сортов. Важно отметить, что обладающий полевой устойчивостью сорт Львовский белый был поражен всеми исследованными популяциями. Однако, при микроанализе ростков данного сорта, зараженного московской и украинской популяциями, на срезе пораженной
ткани наблюдали многочисленные зрелые зооспорангии, рассеянные по всему
ростку, а некротизация наблюдалась только у отдельных клеток, в то время
как у клубней, зараженных белорусской популяцией, на ростках развивались
единичные, в основном не зрелые зооспорангии, и защитный некроз охватывал целые участки ткани. В обоих случаях защитный некроз проявлялся поздно (не раньше, чем на 21 сутки).
В заключение стоит отметить, что сорт Свитанок киевский, не поразившийся в “компосте”, при инокуляции от свежих раковых наростов белорусской популяцией, поразился на 30%. В то время как московская и украинская
популяции поразили тот же сорт на 80 и 90%, соответственно.
Таким образом, все протестированные географические популяции возбудителя рака картофеля принадлежат к первому (D1) патотипу, но отличаются по
агрессивности к восприимчивым сортам картофеля. Из всех популяций S.
endobioticum, только московская популяция поражала все восприимчивые сорта не менее чем на 80%.
В связи с этим была продолжена экспериментальная работа по изучению
агрессивности исследуемых популяций на расширенном наборе восприимчивых сортов картофеля: Лиза, Лорх, Полесский розовый, Тулунский, Альма и
Свитанок киевский.
При заражении любой популяцией патогена ростков восприимчивых сортов картофеля в “компосте” достоверно меньшее количество пораженных
клубней было у сортов Альма и Свитанок киевский. Важно отметить, что количество пораженных клубней для данных сортов у украинской популяции
составляло 44,3 и 63,7%, а у белорусской 12,6 и 0%, соответственно. Сорта
Лиза, Лорх, Полесский розовый и Тулунский хорошо поразились всеми популяциями, однако процент пораженных клубней белорусской популяцией у
сорта Тулунский был наименьший - 79,5% (рис. 5.1).
При заражении ростков восприимчивых сортов картофеля от свежих ра-
16
ковых наростов агрессивность белорусской и украинской популяций по сравнению с московской была достоверно ниже к восприимчивым сортам картофеля Альма и Свитанок Киевский. Однако стоит отметить, что украинская популяция поразила восприимчивый сорт Альма только на 63,5%. Сорта Лиза,
Лорх, Полесский розовый и Тулунский хорошо поразились (не менее 85%)
всеми популяциями (рис. 5.2).
При использовании метода заражения ростков картофеля в “компосте”
было установлено, что сорт Лиза поражается в меньшей степени, чем сорт
Лорх. Однако при использовании метода заражения ростков картофеля от свежих раковых наростов было установлено, что количество пораженных образцов у сорта Лиза больше, чем у сорта Лорх (рис. 5.1, 5.2).
100
80
60
40
20
0
московская
Лиза
Лорх
белорусская
Полесский розо вый
Т улунский
украинская
Альма
Свитанок киевский
Рис. 5.1. Количество пораженных клубней (%) при заражении ростков картофеля в
“компосте” популяциями S. endobioticum.
17
100
80
60
40
20
0
московская
Лиза
Лорх
белорусская
Полесский розо вый
Т улунский
украинская
Альма
Свитанок киевский
Рис. 5.2. Количество пораженных клубней (%) при заражении ростков картофеля
от свежих раковых наростов популяциями S. endobioticum.
Таким образом, количество пораженных клубней находится в прямой зависимости от используемого метода заражения. Так, в сравнительном аспекте
видно, что количество пораженных клубней больше при использовании в качестве инокулюма свежих раковых наростов не зависимо от популяции. Однако такие сорта как Альма и Свитанок киевский одинаково плохо поражаются
украинской (кроме заражения от свежих раковых наростов сорта Свитанок
киевский) и в особенности белорусской популяциями не зависимо от метода
оценки.
Средняя масса наростов, полученная при заражении клубней различными
географическими популяциями, была неодинаковой. Так, наибольшая масса
наростов была получена на высоковосприимчивых сортах Лиза и Лорх, вне
зависимости от популяции. Кроме того, средняя масса наростов при заражении ростков картофеля в “компосте” была больше, чем при заражении от свежих раковых наростов, вне зависимости от сорта картофеля и популяции S.
endobioticum. Несмотря на то, что средняя масса наростов для каждой конкретной популяции сильно варьирует, проведенный анализ данных позволяет
утверждать, что наилучшие результаты при инокуляции всех шести восприимчивых сортов достигались при использовании московской популяции возбудителя рака картофеля.
Таким образом, московская, белорусская и украинская популяции возбудителя рака картофеля различаются по агрессивности. Это необходимо учитывать при составлении инокулюма для создания инфекционного фона при сортоиспытании картофеля на ракоустойчивость.
Сравнительный анализ географических популяций возбудителя рака
картофеля с использованием ДНК-маркеров.
Возбудитель рака картофеля является сложным объектом для популяцион-
18
ных исследований. Молекулярно-генетические исследования этого важного
карантинного объекта касались только разработки молекулярной диагностики
S. endobioticum в почве и растении (Levesque et al., 2005; Niepold &
Stachewicz, 2004; van den Boogert et al., 2005; Abdullahi et al., 2005). Молекулярно-генетические исследования, которые могли бы служить основой для
изучения микроэволюционных процессов в популяциях патогена, отсутствуют.
С образцами ДНК, выделенной из раковых наростов сорта Лиза четырех образцов популяций (московской, ленинградской, белорусской и украинской), а также из
здоровых листьев этого же сорта, был проведен RAPD и УП-ПЦР анализ.
Для проведения ПЦР со случайными и универсальными праймерами были
подобраны экспериментальным путем оптимальные условия. Условия ПЦР со
случайными праймерами: денатурация ДНК при 93о С – 45 с (в первом цикле
денатурация при 95о С – 4 мин), отжиг праймеров 37,5 о С – 45 с, синтез ДНК
при 72 о С – 90 с (в последнем цикле синтез совершается при 72 о С – 10 мин).
Всего 35 циклов. Условия ПЦР с универсальными праймерами: денатурация
ДНК при 93о С – 50 с (в первом цикле денатурация при 95о С – 4 мин), отжиг
праймеров 50 о С – 70 с, синтез ДНК при 72 о С – 60 с (в последнем цикле синтез совершается при 72 о С – 3 мин). Всего 35 циклов.
ДНК из раковых наростов является смесью ДНК паразита и растения-хозяина. Наличие ДНК паразита в смешанных образцах ДНК было доказано методом ПЦР с видоспецифичными для S. endobioticum праймерами (van den
Boogert et al., 2005), с помощью которой диагностические для паразита продукты амплификации размером 472 п.о. были обнаружены только в образцах
ДНК раковых наростов, но отсутствовали в здоровом растении (рис. 5.3).
Рис. 5.3. Молекулярная диагностика вида S. endobioticum в образцах ДНК раковых наростов (смешанных образцах ДНК паразита и
растения-хозяина). Дор. 1 и 2 –
маркеры молекулярных масс. Продукты амплификации с видоспецифичными праймерами: дор. 3 –
лист здорового растения картофеля, 4, 5, 6 и 7 – раковые наросты
украинской, московской, ленинградской и белорусской популяций,
соответственно. Стрелкой обозначен диагностический фрагмент размером 472 п.о.
Ряд праймеров был тестирован на способность давать продукты амплифи-
19
кации геномной ДНК паразита. В результате были отобраны три случайных
(OPA-09, OPA-10, OPI-10) и один универсальный праймер AS4, которые в
дальнейшем использовали в работе. На рисунке 5.4 представлены продукты
амплификации ДНК из листьев картофеля сорта Лиза и раковых наростов, полученных при инокуляции того же сорта. Продукты амплификации раковых
наростов, отсутствующие в “контрольных” спектрах ДНК здорового растения,
можно считать результатом амплификации ДНК паразита. При анализе 4-х
популяций патогена с 4 отобранными праймерами было получено всего 6 полиморфных продуктов амплификации, наличие (или отсутствие) которых характеризует генотип паразита, доминирующий в анализируемом наросте.
На рис. 5.4 приведен пример выявления полиморфного продукта амплификации с помощью случайного праймера OPI-10 у образцов из раковых наростов, который отсутствовал в ДНК спектре растения (обозначен стрелкой).
В таблице 5 представлены данные по “генотипированию” раковых наростов 4-х образцов популяций патогена. Всего среди 38 взятых в анализ раковых наростов выявлено 19 генотипов, которые неравномерно распределились между популяциями.
Рис. 5.4. Пример генотипирования украинской популяции S. endobioticum методом
RAPD с праймером OPI-10. Дор. 1 и 10 – растение, 2-9 – раковые наросты. Боковая дорожка - маркер молекулярных масс (1 kb). Стрелкой обозначен полиморфный ДНК
фрагмент размером 0,62 п.о
Таблица 5. Распределение генотипов (RAPD праймеры ОРА-09, ОРА-10, OPI-10 и
универсальный праймер AS4) в популяциях S. endobioticum из Белоруссии (Б),
Украины (У), Московской (М) и Ленинградской (Л) областей
20
Генотипы по 6 ДНК маркерам
Генотип
1G
2G
3G
4G
5G
6G
7G
8G
9G
10 G
11 G
12 G
13 G
14 G
15 G
16 G
17 G
18 G
19 G
OPAOPAOPAOPIAS4
AS4
10
09
09
10
Наличие (1) или отсутствие (0) продукта амплификации
с молекулярной массой (kb)
0,75
0,70
0,73
0,62
0,6
0,5
0
0
0
0
0
0
1
0
0
0
0
0
0
0
0
0
1
1
1
1
0
0
0
0
1
1
1
1
1
1
1
0
0
0
1
0
0
0
0
1
1
0
0
0
0
0
1
0
1
1
1
0
1
0
1
1
0
0
1
1
1
0
1
0
0
0
1
0
1
0
0
1
1
0
1
1
0
1
0
0
0
1
1
1
0
1
1
0
1
1
1
1
1
0
1
1
0
0
1
0
1
1
1
1
0
0
0
1
0
1
0
0
0
1
Число генотипов в
популяции
Б
У
М
Л
1
3
1
3
2
1
3
2
1
1
1
1
1
1
1
1
5
2
1
1
1
1
1
1
1
Глава 6. Оценка межвидовых гибридов картофеля селекции
ГНЦ РФ ВНИИР на устойчивость к S. endobioticum
При оценке 84 клонов сложных межвидовых гибридов картофеля селекции ГНЦ РФ ВНИИР на устойчивость к возбудителю рака картофеля выделено 7 высокоустойчивых к S. endobioticum образцов. Высокой устойчивостью
отличалось потомство, полученное от скрещивания Solanum okadae × S.
chacoense 19759 (8-1-2004 (137), 8-8-2004 (137), 135-5, 8-5-2004 (138) и 135-32005) и Bobr × S. chacoense 19759 (94-5 и 99-10-1). Вероятно, что признак
устойчивости унаследован от образца S. chacoense 19759, так как известно,
что большинство образцов вида S. chacoense устойчиво к обычному и агрессивным патотипам рака (Камераз, 1973; Салтыкова и др., 1973; Горбатенко,
2006).
Кроме этого, полученные результаты позволяют выделить 4 клона сложных межвидовых гибридов картофеля, обладающих групповой устойчивостью к ряду патогенов. Это устойчивые к раку образцы: 97-159-3, которые
также отличаются устойчивостью к фитофторозу листьев и клубней, Y вирусу
и 99-10-1, 88-2, 94-5, которые также отличаются устойчивостью к нематоде, Y
вирусу (Хютти и др., 2007). Такие образцы с групповой устойчивостью к патогенам и комплексом агрономически значимых признаков являются ценным
исходным материалом для селекции.
ВЫВОДЫ
21
1. Микроанализ почвы из 38 зарегистрированных карантинных очагов S.
endobioticum в Ленинградской области показал, что в Подпорожском и Всеволожском районах Ленинградской области 11 очагов содержат от 31 до 116
жизнеспособных зимних зооспорангиев патогена в 1 г почвы, что является
оптимальным для заражения возбудителем рака картофеля. В этих очагах не
следует возделывать даже устойчивые сорта картофеля, так как высокая инфекционная нагрузка представляет потенциальную опасность для появления
более агрессивных рас. В Бокситогорском, Подпорожском и Кировоском районах Ленинградской области при микроанализе зараженной почвы, отобранной из 13 карантинных очагов, было выявлено от 3 до 8 жизнеспособных зооспорангиев в 1 г почвы. Для вышеуказанных очагов необходимо строгое
соблюдение комплекса карантинных правил, предотвращающих распространение S. endobioticum. Возбудитель рака картофеля не выявлен в д. Низовская
Лужского района. Данный очаг можно считать свободным от S. endobioticum и
согласно Российскому законодательству он может быть выведен из-под регламента контроля.
2. Разработан метод молекулярной диагностики возбудителя S.
endobioticum в почвенных образцах, который отличается от известных тем,
что ДНК паразита экстрагировалась, во время денатурации в первом цикле
ПЦР из целых зооспорангиев, помещенных до этого непосредственно в реакционную смесь.
3. Молекулярная диагностика вида S. endobioticum с использованием специфических праймеров в основном подтвердила данные микроанализа почвы.
Показано, что ДНК зооспорангиев морфологически сходных с видом S.
endobioticum из четырех карантинных очагов, расположенных в Киришском и
Кировском районах Ленинградской области, не амплифицировалась с видоспецифичными праймерами, что позволяет отнести их к другим видам р. Synchitrium.
4. При внутривидовой идентификации патотипного состава трех географически отдаленных популяций (московской, белорусской и украинской) возбудителя рака картофеля на объединенном наборе из 20 сортов-дифференциаторов было установлено, что все популяции принадлежат к первому (D1) патотипу. Несмотря на это, выявлена их различная агрессивность по отношению к
восприимчивым сортам картофеля. Только московская популяция поражала
все восприимчивые сорта (Лиза, Лорх, Полесский розовый, Тулунский, Альма
и Свитанок киевский) не менее, чем на 80%. Агрессивность белорусской и
украинской популяций была достоверно ниже к восприимчивым сортам
картофеля Альма и Свитанок Киевский.
5. Показано, что ДНК, выделенная из раковых наростов состоит из ДНК
патогена и растения-хозяина, что затрудняет генотипирование ДНК S. endobioticum. Увеличение доли ДНК патогена было достигнуто использованием в
процессе ее выделения отдельных зооспорангиев, полученных из раковых наростов. Подобраны оптимальные условия получения ДНК и ее очистки, с использованием абразивных керамических сфер для механического разрушения
22
оболочек зооспорангиев на приборе Fast-Prep 24.
6. Выявлено генетическое разнообразие изолятов, принадлежащих к первому патотипу. С помощью молекулярных методов генотипирования (RAPD и
УП-ПЦР) выявлены существенные генетические различия как между индивидуумами паразита внутри популяций, так и между популяциями.
7. При оценке 84 клонов сложных межвидовых гибридов картофеля селекции ГНЦ РФ ВНИИР на устойчивость к возбудителю рака картофеля выделено семь высокоустойчивых к S. endobioticum образцов, полученных от скрещивания клона Solanum chacoense 19759 с образцами S. okadae и сортом
Bobr, что свидетельствует о донорской способности данного клона в передаче
признака устойчивости.
8. Выделены 4 клона сложных межвидовых гибридов картофеля, обладающих групповой устойчивостью к ряду патогенов. Образец 97-159-3 отличался
устойчивостью к раку, фитофторозу листьев и клубней и Y вирусу; образцы
99-10-1, 88-2, 94-5 были устойчивы к раку, нематоде, Y вирусу.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
Для инспекции по карантину растений даны рекомендации по регистрации
очагов рака картофеля в Ленинградской обл. Количество инокулюма в 11 очагах рака в Подпорожском и Всеволожском районах является оптимальным для
заражения возбудителем рака картофеля. В этих очагах не следует возделывать даже устойчивые сорта картофеля, так как высокая инфекционная нагрузка представляет потенциальную опасность для появления более агрессивных рас. В Бокситогорском, Подпорожском и Кировоском районах Ленинградской области, в 13 карантинных очагах, необходимо строгое соблюдение
комплекса карантинных правил, предотвращающих распространение S.
endobioticum. Очаг в д. Низовская Лужского района может быть выведен изпод регламента контроля.
Для карантинных лабораторий и научно-исследовательских учреждений
предложен метод молекулярной диагностики возбудителя S. endobioticum в
почвенных образцах. Данные по агрессивности московской, белорусской и
украинской популяций S. endobioticum могут быть использованы при подборе
инокулюма для оценки сортов и гибридов картофеля и выборе универсально
восприимчивого контроля.
Для практической селекции могут быть рекомендованы образцы картофеля с групповой устойчивостью к раку, нематоде, Y вирусу: 99-10-1, 88-2, 94-5;
к раку, фитофторозу листьев и клубней, Y вирусу – образец 9-159-3. Клон S.
chacoense 19759 может служить донором устойчивости к S. endobioticum.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ
1. Хютти А.В. Рак картофеля снова требует внимания / А.В. Хютти, Н.М.
Коваленко // Защита и карантин растений. - 2008. - № 5. - С. 43.
2. Khyutti A.V. Distribution of potato wart in Leningrad region of Russia / A.V.
23
Khyutti // Root soil microbe interaction: Second symposium of the AgroBiotec Network. - Hamburg, 2006. - P. 33.
3. Khyutti A.V. Virulence of population samples of Synchytrium endobioticum
(Schilb.) Perc. from Moscow Region, Ukraine and Belarus to the set of potato differentials / A.V. Khyutti // Evolution of plant-microbe interactions: Meeting of the
research consortium. - Saint-Petersburg, 2007. - P. 86.
4. Хютти А.В. Анализ популяций возбудителя рака картофеля с использованием молекулярных маркеров / А.В. Хютти, Н.В. Мироненко, О.С. Афанасенко // Актуальные проблемы иммунитета и защиты сельскохозяйственных
культур от болезней и вредителей: Тез. междунар. науч.-практич. конференции. - Одесса, 2007. - С. 33.
5. Хютти А.В. Исходный материал для селекции картофеля на групповую
устойчивость к патогенам / А.В. Хютти, Л.А. Гуськова, М.В. Патрикеева, Л.П.
Козлов, Е.В. Рогозина // Генетические ресурсы культурных растений в XXI
веке. Состояние, проблемы, перспективы: Тез. докладов. - СПб, 2007. - С. 625626.
6. Мироненко Н.В. Структура популяций возбудителя рака картофеля по
ДНК маркерам и вирулентности / Н.В. Мироненко, А.В. Хютти, О.С. Афанасенко // Современная микология России: Тез. докладов 2-го съезда микологов
России. - М., 2008. - Т. 2. - С. 195-196.
24
_____________________________________________________
Научное издание. RIZO-печать
ИННОВАЦИОННЫЙ ЦЕНТР ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ
Лицензия ПЛД № 69-253. Подписано к печати 7 июня 2008 г., тир. 120 экз.
25