МЕТОДИКА ЭКСТРАКЦИИ ГЕНОМНОЙ ДНК ИЗ

МЕТОДИКА ЭКСТРАКЦИИ ГЕНОМНОЙ ДНК ИЗ МИЦЕЛИАЛЬНЫХ ГРИБОВ РОДА
FUSARIUM
Хапилина О.Н.,Новаковская А.П., Созинова Л.Ф.,
Шумега А.Р.,Старцев В.А.
Патогенные почвообитающие грибы рода Fusarium Link являются мощным
стрессорным фактором, поражающим растения многих семейств, в особенности, зерновых
злаковых культур. Борьба с ними затруднена в связи с особенностями их биологии и экологии,
обитанием в почве, способностью поражать многие сельскохозяйственные культуры и
дикорастущие растения. Отсутствие устойчивых сортов пшеницы к патогенным грибам рода
Fusarium обуславливает поиск новых альтернативных и экологичных способов защиты и
является актуальной задачей в регионе исследований. Многие механизмы защиты растений от
болезней зависят от расспецифических особенностей патогенов. В этой связи, на первый план
выходит проблема точной идентификации как родов, так и видов патогенов. Развитие
молекулярной биологии позволяет внедрять новые подходы в диагностику патогенных
организмов. В последнее десятилетие для идентификации видов организмов все шире
применяются молекулярные методы, в частности, использование молекулярно-генетических
маркеров. Такой подход позволяет дифференцировать организмы, выявлять межвидовые и
внутривидовые различия по ДНК. Разработка современных методов идентификации патогенов
может значительно ускорять способы отбора здорового растительного материала, точной
детекции вида заболеваний, формирования системы интегрированной защиты растений от
возбудителей болезней.
Традиционные методы идентификации микроскопических грибов, основанные на
изучении морфологических параметров, таких как диаметр колонии, ее цвет и структура, а
также размер и форма конидий, конидиогенных структур, являются довольно трудоемкими и
продолжительными по времени проведения анализов. Идентификация микромицетов,
основанная на классических определителях, является также и дорогостоящей процедурой –
особенно если планируется изучение видового разнообразия по биологическому критерию [1].
Особую трудность при проведении идентификации микромицетов рода Fusarium вызывают
виды, продуцирующие опасные токсины, например, F. verticillioides, формирующие скрытые и
часто бессимптомные инфекции в тканях растений, требующие систематического проведения
мониторинговых исследований токсинпродуцирующие виды [2]. Кроме того, обилие
морфологических признаков и их сильная изменчивость затрудняет построение
морфологических критериев [3].
Начальным этапом для любого молекулярно-генетического исследования является этап
выделения ДНК. Для дифференциации и диагностики грибов рода Fusarium используются
различные методы экстракции геномной ДНК патогена, но все они направлены на достижение
одной цели - выделенные препараты ДНК должны отвечать основным качественным и
количественным критериям, вкупе с простотой и дешевизной методики [4].
С этой целью нами проводилась отработка протокола выделения геномной ДНК из
мицелиальных грибов рода Fusarium.
Материалы и методы исследований
Объектом исследований являлись микроскопические грибы рода Fusarium, выделенные
из растений и ризосферы яровой мягкой пшеницы, возделываемой в Акмолинской области.
Выделение микромицетов рода Fusarium из поверхностно стерилизованных
растительных тканей проводили с использованием высева на картофельный агар или среду
Чапека, с последующим выделением в чистую культуру.
С.Сейфуллин атындағы ҚАТУ-ң Ғылым жаршысы /
Вестник науки КАТУ им. С. Сейфуллина. – 2011. - №2(69). – С. 83-89.
Определение родов микромицетов проводилось по наиболее распространенным
определителям [5, 6, 7, 8, 9, 10]. Микроскопический анализ грибов был проведен на микроскопе
Micros-200 (Austria) с фотонасадкой SSD, видеокамерой Hi-Resolution SD66P/M.
Результаты исследований и их обсуждение
На первом этапе нами рассматривались коммерческие наборы, предлагаемые
производителями для экстракции геномной ДНК из любого вида материала – Promega™
(США) и Diatom Prep 200 (Биоком™, РФ).
В соответствием с рекомендацией производителя. При использова-нии кита Promega™
(США) протокол состоял из следующих этапов: гомогенизация в лизирующем буфере Nuclei
Lisis Solution®, после чего к пробам добавляли 3 мкл РНК-азы (RNA-sa Solution®), затем
преципи-тация с использованием Protein Precipitate®, осаждение ДНК изопропа-нолом и
растворение нуклеиновых кислот в 100 мкл DNA Rehydration Solution®. Визуализацию
экстрагированной ДНК проводили в ультрафи-олетовом свете с использованием
гельдокументирующей системы.
В результате исследований было установлено, что данный прото-кол требует
оптимизации, поскольку выделение ДНК зафиксировано только на 3 пробах из 9, т.е.
эффективность экстракции составила около 30% от общего числа проб.
Мы попытались оптимизировать данный протокол, добавив этап предварительной
гомогенизации мицелия в жидком азоте. Предвари-тельная гомогенизация в жидком азоте
используется многими исследова-телями [11, 12]. Растирание в жидком азоте способствует
ингибированию действия ферментов, расщепляющих ДНК. В наших исследованиях с
использованием приема гомогенизации в жидком азоте выделение ДНК было значительно
выше, отрицательный результат был только в 3 пробах из 9, таким образом эффективность
выделения повысилась до 67% (рисунок 1).
1 2 3 4 5 6 7 8 9
1
2 3 4 5
6 7 8 9
А
Б
А – стандартный протокол; Б - протокол с использованием гомогенизации в жидком азоте
Рисунок 1 – Результат экстракции геномной ДНК штаммов грибов Fusarium с использованием
набора Promega™ (США)
Также мы проводили апробацию коммерческого набора Diatom Prep 200 (Биоком™,
РФ), согласно рекомендациям производителя. Согласно этому протоколу, около 100 мг сырого
мицелия гомогенизировали в 600 мкл Лизирующего реагента®. После центрифугирования в
течение 10 мин при 12 000 об/мин к супернатанту добавляется суспензия сорбента NucleoS®
для адсорбции нуклеиновых кислот. После центрифугирования осадок гомогенизируется в
растворе Лизирующего реагента®, и 3-кратно промывается в растворе Солевого буфера®,
подсушивается при 65°С в течение 5 мин. После чего осадок ресуспендируется в растворе
ЭкстраГена Е®. После центрифугирования в течение 5 мин при 10000 об/мин супернатант,
содержащий ДНК, переносится в чистые пробирки.
Детекцию результатов выделения ДНК микромицетов проводили с использованием
гельдокументирующей системы. При использовании данного коммерческого набора результат
экстракции геномной ДНК был отрицательным на всех пробах.
Таким образом, анализируя возможности использования двух коммерческих наборов –
Promega (США) и Diatom Prep 200 (Биоком™, РФ), установлено, что наиболее результативной
является экстракция геномной ДНК с предварительной гомогенизацией мицелия в жидком
азоте по протоколу Promega (США).
Для повышения эффективности исследований мы изучали стан-дартные методики,
оптимизация которых позволила бы разработать собственный протокол выделения геномной
ДНК грибов этого рода.
Одним из наиболее распространенных методов выделения ДНК являются SDS-метод и
СТАВ-метод. Оптимизация данных протоколов заключалась в изменении процедуры
пробоподготовки, отличающейся для каждого метода (таблица 1).
Таблица 1 – Оптимизированные протоколы выделения ДНК из биомассы микромицетов рода
Fusarium
Этап выделения
Пробоподготовка
Экстракция ДНК
SDS-метод
Культивирование 7 суток на жидкой
среде Чапека, центри-фугирование
200 мг биомассы при 13 000 об/мин
5 мин, удалее-ние супернатанта, замораживание при -20°С 20 мин.
СТАВ-метод
Культивирование 72 ч на
жидкой среде Чапека в
микропробирках.
Замораживание пробы ве-сом
100-200 мг при -70°С 15
минут.
Гомогенизация осад-ка в 300 мкл Гомогенизация и инку-бация в
SDS-буфера (200 mM Tris (pH 8,5), СТАВ-буфере (2M Tris, 5 M
250 mM NaCl, 25 mM EDTA, 0,5% NaCl, 0,5 M EDTA, 5% СТАВ)
SDS) – 5 мин.
при 65°С в течение 1 ч.
Выделение/осаждени
е ДНК
Осаждение
150
мкл
натрийтригидратаце-татом при –20ºС 10
мин,
центрифуги-рование
при
13 000 об/мин 5 мин. Осаж-дение и
очистка в 400 мкл изопропанола,
центрифугирование при 13 000
об/мин 10 мин, удаление супернатанта.
Осаждение
600
мкл
хлороформ-изопропано-ловой
смесью
при
ком-натной
температуре
1
ч,
центрифугирование при 3 000
об/мин
5 мин, от-бор
интерфазы. Осаж-дение ДНК
изопро-панолом из расчета
2/3 к объему при комнатной
температуре
10-12
ч,
центрифугирование
при
12000
об/мин
10
мин,
удаление суперна-танта.
При использовании SDS-метода необходимо использовать достаточно большое
количество биомассы молодого вегетативного мицелия, поэтому культивирование необходимо
проводить на жидкой среде в чашках Петри. Последующее центрифугирование биомассы
позволяет удалить остатки среды, что значительно облегчает процедуру гомогенизации.
Для выделения ДНК с использованием СТАВ-метода достаточно использовать
трехдневную культуру микромицетов, выращенную в микропробирках типа Ependorff на
жидкой синтетической среде Чапека с последующим центрифугированием.
Экстрагированная ДНК наблюдалась в виде осадка на дне микропробирок, который
после высушивания растворяли в 20 мкл воды. Визуализацию экстрагированной ДНК
проводили в УФ-свете, для чего проводили электрофорез в 1%-агарозном геле.
При использовании стандартных методов выделение ДНК было зафиксировано во всех
образцах микромицетов. На рисунке 2 представлены электрофореграммы выделения ДНК
микромицетов рода Fusarium c использованием различных методов.
А
Б
А – выделение СТАВ-методом; Б – выделение SDS-методом
Рисунок 2 – Электрофореграмма выделения ДНК микромицетов
Определение количественных и качественных характеристик проводили с
использованием биофотометра Nano-Drop. Эффективность метода экстракции ДНК оценивали
по таким критериям, как частота выделения (%), среднее на 1 образец количество ДНК
(мкг/мкл), чистота выделения (соотношение А260/А280). Сравнительный анализ используемых методов представлен в таблице 2.
Таблица 2 – Эффективность различных методов выделения ДНК грибов рода Fusarium
Метод выделения
Diatom Prep 200
Promega
SDS-метод
СТАВ-метод
Частота выделения, %
0
67
100
100
Количество ДНК
(мкг/мкл)
423,67
231,52
265,81
Соотношение
А260/А280
2,13
2,07
2,04
Заключение. Таким образом, очевидно, что все используемые методы, за исключением
коммерческого набора Diatom Prep 200, вполне приемлемы для экстракции геномной ДНК
грибов рода Fusarium. Оптимизация стандартных методов (СТАВ и SDS) позволила увеличить
как частоту выделения, так и количество экстрагированной ДНК. Однако, следует отметить,
что СТАВ-метод является наиболее предпочтительным, поскольку имеет более короткий этап
пробоподготовки – для выделения ДНК достаточно получить трехдневную культуру
микромицетов. В общей сложности вся процедура экстракции ДНК из чистой культуры
патогена занимает 4-5 суток, что имеет значение при проведении быстрой идентификации
видовой принадлежности микромицетов.
Литература
1. Grimm C., Geisen R. A PCR-ELISA for the detection of potential fumonisin producing
Fusarium species // Letters Application of Microbiology. – 1988, № l. – Vol. 26. – P. 456-462.
2. Baird R., Hamed K. Abbas, Windham G., Williams P., Baird S., Ma P., Kelley R.,
Hawkins L., Scruggs M. Identification of Select Fumonisin Forming Fusarium Species Using PCR
Applications of the Polyketide Synthase Gene and its Relationship to Fumonisin Production in vitro //
International Journal Molecular Sciences. - 2008, № 9. – Р. 554-570.
3. Batista J.F., Santos N.T., Oliveira A.P.D., Pires C.M.S., Motta and Luna-Alves Lima
Е.А. Genetic characterization of Brazilian strains of Aspergillus flavus using DNA markers //
Genetics and Molecular Research. – 2008, № 7. – Vol. 3. - Р. 706-717.
4. Fredlund Е., Gidlund А., Olsen М., Börjesson Т., Hytte Spliid H.N., Simonsson M. Method
evaluation of Fusarium DNA extraction from mycelia and wheat for down-stream real-time PCR
quantification and correlation to mycotoxin levels // Journal of Microbiological Methods. – 2008, №
73. – Р. 33–40.
5. Литвинов М.А. Определитель микроскопических почвенных грибов: (порядок
Monilialis, за исключением подсемейства Aspergilleae. – Л.: Наука. – 1967. – 304 с.
6. Билай В.И. Фузарии (биология и систематика). – Киев: Наукова Думка. – 1977. – 442
с.
7. Билай В.И., Курбацкая З.А. Определитель токсинообразуюших микромицетов. Киев: Наукова думка, 1990. - 234 с.
8. Пидопличко Н. М. - Грибы - паразиты культурных растений: определитель: в 3 т. Т. 1.
- Киев: Наук. думка, 1977. - 296 с.
9. Саттон Д., Фотергилл А., Ринальди М. Определитель патогенных и условно
патогенных грибов. — М: Мир, 2001. – 486 с.
10. Шипилова Н.П., Иващенко В.Г. Систематика и диагностика грибов рода Fusarium
на зерновых культурах. – Санкт-Петербург, 2008. – 84 с.
11. Garber R. C., Yoder O.C. Isolation of DNA from filamentous fungi and separation into
nuclear, mitochondrial, ribosomal and plasmid components. // Anal. Biochem. – 1983. – Vol. 135. – Р.
416-422.
12. Bartlett J.M.S., Stirling D. PCR Protocols // Method in Molecular Biology. – Humana
Press. – Vol. 226. – 605 p.
Түйін
Fusarium ssp. саңырауқұлағының геномды ДНҚ экстракциясының әртүрлі әдістері
зерттелді. ДНҚ бөлуге арналған коммерциялық жиындардың тиімділігі төмендігі анықталды.
ДНҚ экстракциясына SDS және CTAB әдістері тиімді екені анықталды. СТАВ-әдісінің
артықшылығы уақыт үнемділігінде. Патогеннің таза культурасының ДНҚ экстракциясы 4-5
сөтке қажет, мұның микромицеттердің түрін тез идентификациялау жүргізуде маңызы зор.
Fusarium саңырауқұлақтарының геномды ДНҚ-сын СТАВ-буфер және нұсқаларды алдын-ала
қатыру арқылы бөлу протоколы оңтайландырылды. Жасалған протокол бойынша бөлініп
алынған ДНҚ мөлшері орта есеппен 231,52-265,81 нг/мкл.
Summary
The different methods to extractions genomic DNA fungi Fusarium ssp. are explored.
Low efficiency of extraction DNA with commercial kits was installed. The highest results of the
separation DNА with SDS- and CTAB-methods were installed. However, СТАВ- method to
extractions genomic DNA better because the length of time is less. The whole procedure of
extraction (from a pure culture) only 4-5 days continues. It is important for quick identification
of micromycetes at infected wheat plants. The optimized protocol of genomic DNA of
Fusarium species extraction by means of CTAB-buffer and preliminary freezing of the tests
designed. The quantity of DNA allocated according to developed protocols makes on the
average 231,52 -265,81 ng/µl.