Дисциплина Биотехнология доп. 6 занятий

ПЯТИГОРСКИЙ МЕДИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ
- филиал государственного бюджетного образовательного учреждения
высшего профессионального образования
«ВОЛГОГРАДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ
МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ»
Министерства здравоохранения Российской Федерации
Кафедра технологии лекарств
Д.В. Компанцев, Л.Н. Савченко, Т.Ф. Маринина,
Т.Ю. Манджиголадзе, А.А. Чахирова
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
ПО ОСВОЕНИЮ ДИСЦИПЛИНЫ
«БИОТЕХНОЛОГИЯ»
Образовательная программа
«ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВ»
(подготовка научно-педагогических кадров)
НАПРАВЛЕНИЕ ПОДГОТОВКИ 33.06.01. ФАРМАЦИЯ
Пятигорск 2015
УДК 615.012/.014(076)
ББК 52.82я35.66
М54
Рецензент:
И.Н. Андреева, д-р фармацевт. наук, проф. каф. ЭОЗиФ
Ю.А. Морозов, канд. фармацевт. наук, доц. каф. технологии лекарств ФГБОУ ВПО «Северо-Осетинского государственного университета им. К.Л. Хетагурова, г. Владикавказ
Д.В. Компанцев, Л.Н. Савченко, Т.Ф. Маринина,
Т.Ю. Манджиголадзе, А.А. Чахирова
М 54 Методические рекомендации по освоению дисциплины
«Биотехнология». Образовательная программа «Технология
получения
лекарств».
Направление
подготовки
33.06.01.
ФАРМАЦИЯ /Д.В. Компанцев, Л.Н. Савченко, Т.Ф. Маринина,
Т.Ю. Манджиголадзе, А.А. Чахирова. – Пятигорск: ПМФИ филиал ГБОУ ВПО «Волг ГМУ», 2015. – 58с.
Методические рекомендации разработаны в соответствии с рабочей
программой дисциплины «Технология получения лекарств»
учебного плана 140401 78-132(4)-3486 Технология получения
лекарств и предназначены для обучающихся по образовательной
программе подготовки кадров высшей квалификации «Технология
получения лекарств» очной и/или заочной формы обучения.
УДК 615.012/.014(076)
ББК 52.82я35.66
Печатается по решению ЦМК ПМФИ - филиал ГБОУ ВПО
ВолгГМУ Минздрава РФ
© Пятигорский медико-фармацевтический
институт - филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ
Минздрава Российской Федерации, 2015
2
СОДЕРЖАНИЕ
№ п/п
Название темы
стр.
Тема 1
Ферменты. Иммобилизация ферментов.
4
Тема 2
Ферменты. Элементы энзимологии. Ферменты в медицинской биотехнологии.
10
Тема 3
Фитобиотехнология. Генетически модифицированное растительное сырьё: создание и применение.
Трансгенные растения. Классификация. Обеспечение
безопасности соответствующей продукции
18
Тема 4
Генная инженерия: получение лекарственных препаратов генно-инженерными методами: инсулин, интерферон.
24
Тема 5
Получение антибиотиков, витаминов. Особенности
технологии. Аппаратура
31
Тема 6
Нормофлора. Пробиотики в фармации
38
Задания для рубежного контроля
44
Задания для промежуточной аттестации
53
3
Занятие № 1
1. Тема: Ферменты. Иммобилизация ферментов.
2. Продолжительность занятия – 4 часа
3. Цель занятия:
Уметь теоретически обосновывать и практически выполнять технологические стадии иммобилизации ферментов и отдельных клеток различными
методами.
3.1. Целевые задачи:
В итоге занятия обучающийся (аспирант) должен знать:
- теоретические основы иммобилизации;
- методы иммобилизации ферментов;
- носители, используемые для иммобилизации ферментов и отдельных
клеток;
- использование иммобилизованных ферментов в медицине и фармации;
-номенклатуру, используемых иммобилизованных ферментных препаратов.
В итоге занятия обучающийся (аспирант) должен уметь:
- подбирать оптимальный способ иммобилизации;
- готовить носители для иммобилизации;
- осуществлять стадии технологического процесса;
- оценивать качество иммобилизованного фермента.
4. Выполнить следующие задания:
1. Получить иммобилизованный пепсин методом адсорбции на нерастворимом сорбенте.
2. Определить протеолитическую активность полученного иммобилизованного фермента.
3. Провести иммобилизацию клеток дрожжей включением в гель альгината кальция.
5. Информационные материалы
В биотехнологическом производстве все чаще применяют катализ с использованием иммобилизованных ферментов. Ферментативный катализ имеет большое значение для модификации БАВ с целью получения новых лекарственных средств с улучшенными терапевтическими и фармакологическими
свойствами. Применение ферментов в процессах трансформации обусловлено высокой специфичностью их биологического действия, связанной со способностью направленно изменять структуру того или иного соединения.
Иммобилизованными называют такие ферменты, которые выделены
из клетки, искусственно закреплены на носителе и сохраняют свойственную
им каталитическую активность.
Иммобилизация - это технология, согласно которой молекулу фермента включают в какую-либо фазу или соединяют с нерастворимым носите4
лем. Комплекс «фермент — носитель» отделен от раствора, но при этом может обмениваться с ним молекулами субстрата, эффектора или ингибитора. В
промышленных целях для иммобилизации используют главным образом энзимы, выделенные из микроорганизмов. Они примерно в 100 раз дешевле,
чем ферменты животного или растительного происхождения, и более доступны. По сравнению со свободными ферментативными препаратами, иммобилизованные ферменты имеют существенные преимущества:
- они обладают высокой стабильностью, в несколько тысяч раз превышающей стабильность свободных ферментов, и поэтому достаточно долговечны;
- они легко отделимы от реакционной среды, что позволяет получать
чистые продукты реакции;
- иммобилизация дает возможность многократно использовать ферментативный препарат;
- иммобилизованные ферменты технологичны, что позволяет либо вести процесс непрерывно, регулировать его скорость и, соответственно, выход
продукта, либо в любой момент остановить реакцию;
- с помощью подбора носителей и методов иммобилизации можно целенаправленно изменять некоторые свойства ферментов (специфичность, рН,
температурозависимость, стабильность) для оптимизации процесса.
Во многих случаях необязательно иммобилизовать изолированный
фермент. Иммобилизации могут подвергаться целые микробные клетки, содержащие нужный фермент. При этом еще более повышается стабильность
фермента, и улучшаются экономические показатели производства.
В области синтеза антибиотиков широкое применение нашла группа
ферментов, катализирующих гидролиз ацильных связей у природных антибиотиков группы пенициллина, пенициллинаминогидролазы или пенициллинацилазы. Главным
продуктом такого
гидролиза
является
6аминопенициллановая кислота - исходный ключевой продукт для синтеза
различных полусинтетических пенициллинов (ампициллина, оксациллина,
карбенициллина и др.). Основной путь при получении 6-АПК - процесс гидролиза биосинтетического бензилпенициллина ферментом пенициллинацилазой образуемой штаммами кишечной палочки. Иммобилизация клеток
E. coli с помощью включения их в ячейки альгинатного геля и применение
такой формы биологического катализатора в производстве позволили повысить производительность процесса получения 6-АПК из бензилпенициллина
и, в конечном счете, увеличить выпуск создаваемых на ее основе полусинтетических пенициллинов.
Носители для иммобилизации ферментов должны обладать определенными свойствами:
- высокой биологической и химической стойкостью;
- нерастворимостью;
- высокой механической прочностью;
- значительной гидрофильностью, которая обеспечивает связывание фер5
мента с носителем в водной среде;
- достаточной проницаемостью для ферментов, коферментов, субстратов и
продуктов реакции, пористостью, большой удельной поверхностью;
- легкостью активации комплекса «фермент - носитель»;
-возможностью создания различных структур (мембран, пластин, трубочек,
гранул);
- низкой стоимостью.
В зависимости от структуры, носители подразделяют на природные и
синтетические, органические и неорганические, полимерные и низкомолекулярные.
Природные полимерные носители по своей химической природе подразделяют на белковые (кератин, фиброин, коллаген, желатин), полисахаридные (целлюлоза, декстран, агароза, каррагинан, альгиновые кислоты и их соли, аминополисахариды - хитин и хитозан) и липидные (модель «фермент липид» в виде монослоя или бислоя сферической формы-липосома), наиболее приближенные к естественным комплексам, существующим в клетке.
Синтетические полимерные носители подразделяют на три группы полиметиленовые, полиамидные и полиэфирные. Благодаря разнообразию,
механической прочности и доступности, они широко используются для иммобилизации. Кроме того, при производстве синтетических полимеров можно значительно разнообразить их форму (гранулы, трубочки и т. д.), варьировать величину пор, вводить различные функциональные группы.
Носители неорганической природы могут быть представлены материалами из глины, стекла, керамики, силикагеля, графитовой сажи, а также
оксидами металлов и т. д. Преимущества этой группы носителей состоят в
легкости регенерации, возможности получения любой их формы при производстве и вариабельности размера пор.
Методы иммобилизации ферментов. Иммобилизацию ферментов
можно осуществлять физическими и химическими методами.
Физические методы основаны на адсорбции фермента на нерастворимом носителе, на включении фермента в поры поперечносшитого геля, в полупроницаемые структуры.
Адсорбция ферментов на нерастворимом носителе. Молекула фермента удерживается на поверхности носителя благодаря электростатическим,
гидрофобным, дисперсионным взаимодействиям или возникновению водородных связей. Прочность связывания фермента с носителем небольшая.
Иммобилизация ферментов путем включения в гель (обычнополимерный гель). Метод обеспечивает равномерное распределение фермента в объеме носителя, достаточно прост и применяется для иммобилизации
отдельных молекул определенного энзима, мультиферментных комплексов и
интактных клеток. Однако он непригоден для работы с ферментами, которые
воздействуют на водонерастворимые субстраты.
Иммобилизация в полупроницаемые структуры. В этом случае раствор
фермента и раствор субстрата разделяют с помощью полупроницаемой мем6
браны (микрокапсулирование, включение в липосомы). Метод используется
главным образом в фундаментальных научных исследованиях и в медицине.
Использование химических методов приводит к возникновению ковалентных связей между ферментом и носителем. Этот способ получения промышленных биокатализаторов наиболее распространен. Химическое присоединение энзима к носителю отличается высокой эффективностью и прочностью связи. Однако химические методы иммобилизации сложны и дороги, но
незаменимы в научных исследованиях при создании ферментов с контролируемыми свойствами.
Иммобилизация на носителях, несущих гидроксигруппы. В этой группе
наиболее распространен бромциановый метод, который позволяет связывать
фермент с полисахаридным или синтетическим носителем.
Иммобилизация на носителях, несущих аминогруппы. Аминогруппы
носителя превращают в соли диазония, к которым впоследствии присоединяют молекулы ферментов за счет взаимодействия с фенольными, аминными, имидазольными, тиольными, гуанидиновыми группами этих ферментов.
Иммобилизация на носителях, несущих сульфгидрилъные группы. Если
и носитель, и фермент несут сульфгидрильные группы, то под воздействием
кислорода воздуха эти группы легко окисляются с образованием дисульфидных связей.
Среди всех методов иммобилизации оптимальным считается метод
включения ферментов в полимерные гели. Также широко распространены
адсорбционное присоединение и химические методы, основанные на ковалентном связывании. Достаточно часто иммобилизацию проводят за счет
включения ферментов в мембраны и микрокапсулы, тогда как другие приемы
используют в единичных случаях.
Иммобилизованные полиферментные системы. Первая искусственная биферментная система, включающая ковалентно связанные с носителем
иммобилизованные
ферменты
гексокиназу
и
глюкозо-6фосфатдегидрогеназу, была создана в 1970 г. К. Мосбахом. В настоящее время известно несколько десятков иммобилизованных полиферментных систем, состоящих из двух, трех, четырех и более энзимов. Эффективность таких комплексов намного выше, чем у свободных ферментов, за счет локального концентрирования субстрата около второго и всех последующих ферментов, входящих в систему.
Иммобилизованные полиферментные системы применяют в промышленных технологиях, иногда — в научных исследованиях при изучении метаболизма клеток, транспортных процессов и т. д. Следует, однако, отметить,
что результаты, полученные с помощью таких систем, не всегда правильно
отражают процессы, происходящие в клетках. Это объясняется тем, что в
живых клетках комплексы энзимов чаще всего располагаются упорядоченно
в мембранах клетки, что позволяет регулировать скорость протекания ферментативных процессов, тогда как в полиферментных комплексах иммобилизованные ферменты связываются с носителем случайным образом.
7
Современные методы иммобилизации позволяют создавать не только
полиферментные комплексы, связывать с носителями удается субклеточные
структуры и даже целые клетки. Такие системы очень удобны, поскольку
можно, не выделяя чистые ферментные препараты, получать естественные
полиферментные системы, осуществляющие многостадийные процессы.
Применение иммобилизованных ферментов. Иммобилизованные
ферменты находят широкое применение в различных отраслях народного хозяйства:
- в промышленности - в качестве активных компонентов стиральных и
моющих средств, в дубильных процессах, в пищевых производствах, например при обработке мяса; в качестве катализаторов при проведении различных
технологических процессов, для анализа различных веществ;
- в медицине - в качестве противовоспалительных, тромболитических и
фибринолитических препаратов;
- в фармации — в медицинской диагностике при анализе лекарственных веществ белковой природы;
- в качестве биокатализаторов в биотехнологических производствах.
Созданы искусственные аналитические системы для анализа различных
веществ - ферментные электроды, проточные анализаторы и т. д. В настоящее время разрабатываются новые поколения биодатчиков на базе аффинных
взаимодействий. Использование белковых препаратов в качестве лекарственных средств может быть ограничено их иммуногенностью, аллергенностью,
малым временем действия в организме человека или животного. В связи с
этим в медицине более перспективно применение иммобилизованных ферментов, которые менее аллергенны и иммуногенны, более стабильны, обладают пролонгированным действием. Например, при включении в липосомы
ферменты защищены от эндогенных протеиназ организма пациента, а сами
липосомы утилизируются в организме. В иммобилизованном виде применяют тромболитические ферменты, предотвращающие образование тромбов в
кровеносных сосудах. Иммобилизованные протеолитические ферменты помогают при лечении ожогов, абсцессов, ран. Иммобилизованная уреаза используется в аппарате «искусственная почка». Микрокапсулы, заполненные
аспарагиназой, применяют для лечения аспарагинзависимых опухолей.
Иммобилизованные ферменты в медицине. Иммобилизованные
ферменты имеют огромное значение для медицины. В частности, большой
рынок сбыта занимают тромболитические ферменты, предназначенные для
борьбы с сердечно-сосудистыми заболеваниями. Так, в отечественную клиническую практику внедрен препарат «стрептодеказа», содержащий стрептокиназу - активатор предшественника протеиназы плазмина, предотвращающий образование тромба в кровеносной системе.
Ферменты, разрушающие некоторые незаменимые аминокислоты (например, аспарагиназа), используют для борьбы со злокачественным ростом
опухолей. Протеолитические ферменты (трипсин, химотрипсин, субтилизин,
коллагеназа), иммобилизованные на волокнистых материалах (целлюлоза,
8
полиамидные волокна, декстран и др.), применяют для эффективного лечения ран, язв, ожогов, абсцессов, а их белковые ингибиторы - в заместительной терапии для лечения эмфиземы и панкреатитов .Исключительно важны с
практической точки зрения работы, посвященные направленному транспорту
лекарственных веществ. В этом отношении особенно выгодны инкапсулированные ферменты типа искусственной клетки. Так, микрокапсулы, стенки которых представлены оболочкой эритроцита («тень эритроцита»), а их содержимое заполнено ферментом аспарагиназой, переносятся кровотоком к зонам
скопления аспарагина и поэтому применяются для лечения аспарагинзависимых опухолей, в частности саркомы. Колонки, заполненные микрокапсулами
с ферментом, используют для диализа в аппарате «искусственная почка», которая работает в 100 раз эффективнее обычного аппарата. Таким образом,
использование иммобилизованных ферментов во многих жизненно важных
отраслях народного хозяйства становится все более массовым. Выгодное сочетание избирательности и эффективности с долговечностью и стабильностью иммобилизованных ферментов в корне меняет химическое производство, способы добывания сырья, способствует созданию новых биотехнологических процессов и методов терапии, совершенствует медицинскую диагностику, анализ, органический синтез и оказывает огромное влияние на образ
жизни человека.
6. Задание для текущего контроля
Вопросы по теме занятия:
1. Что собой представляют иммобилизованные ферменты?
2. Каких целей достигают при иммобилизации ферментов в биотехнологическом производстве?
3. Как получают иммобилизованные ферменты?
4.Чем обусловлены экономические преимущества биотехнологического
производства, основанного на иммобилизованных ферментах, перед традиционными?
5. Какими свойствами должны обладать носители, используемые для
иммобилизации ферментов?
6. В чем сущность физических методов иммобилизации?
7. Дайте характеристику химических методов иммобилизации?
8. Какие методы применяют для иммобилизации ферментов?
9. Что собой представляют иммобилизованные полиферментные системы?
10. Область применения иммобилизованных ферментов в медицине и
фармации.
9
Занятие №2
1.Тема: Ферменты. Элементы энзимологии. Ферменты в
медицинской биотехнологии.
2. Продолжительность занятия – 4 часа
3. Цель занятия:
Изучить основные направления и элементы медицинской энзимологии,
получение ферментов из биологических объектов всех видов.
3.1. Целевые задачи:
В итоге занятия обучающийся (аспирант) должен знать:
- свойства ферментов как биологических катализаторов;
- роль и значение энзимопатологии, энзимодиагностики, энзимотерапии;
- основные этапы и требования к производству ферментов;
- способы культивирования продуцентов ферментов, состав используемых
сред;
- способы переработки культуральной жидкости, выделения и очистки ферментов.
В итоге занятия обучающийся (аспирант) должен уметь:
- выбирать оптимальную технологию производства ферментов;
- выбирать продуценты, готовить питательные среды;
- владеть методами очистки культуральной жидкости, выделять фермент;
- оценивать качество полученных ферментов.
4. Выполнить следующие задания:
1. Получить пепсин методом высаливания из животного сырья.
2.Определить протеолитическую активность пепсина и его количественное содержание.
5. Информационные материалы
Ферменты или энзимы (fermentum - «закваска», еnzyme - «в дрожжах»)
- высокомолекулярные соединения белковой природы, являющиеся катализаторами биохимических реакций в живых организмах и вне их. К настоящему
времени найдена лишь одна ферментативная реакция небелковой природы,
когда молекула РНК катализирует собственное «разрезание» на части.
В живой клетке присутствует множество разнообразных соединений,
но реакции между ними не беспорядочны, а образуют строго определенные
метаболические пути, характерные для данной клетки. Индивидуальность
клетки в большой степени определяется уникальным набором ферментов, который она генетически запрограммирована производить. Отсутствие даже
одного фермента или какой-нибудь его дефект могут иметь очень серьезные
отрицательные последствия для организма.
Все ферменты относятся к глобулярным белкам, причем каждый фермент выполняет специфическую функцию, связанную с присущей ему глобулярной структурой. Однако активность многих ферментов с большой моле10
кулярной массой — от 10 кДа до 1МДа и более (для сравнения: молекулярная масса глюкозы 180, диоксида углерода 44, аминокислот от 75 до 204) зависит от небелковых низкомолекулярных соединений, называемых кофакторами.
Молекулярный комплекс белковой части (апофермента) и кофактора
называется холоферментом. Роль кофактора могут выполнять ионы металлов
(Zп2+, Мg2+, Мп2+, Fе2+, Си2+, К+, N3+) или сложные органические соединения. Органические кофакторы обычно называют коферментами, некоторые
из которых являются производными витаминов. Связи между ферментом и
коферментом могут быть разными. Иногда они существуют отдельно и связываются только во время реакции. В других случаях кофактор и фермент
связаны постоянно и иногда прочными ковалентными связями (тогда небелковую часть фермента называют простетической группой). Важнейшими коферментами являются производные витаминов, кофакторами — минералы
(макро- и микроэлементы). При дефиците витаминов и минералов активность
ферментативных реакций резко падает, с чем связаны многие патологические
процессы в организме.
Ферменты делятся на простые и сложные. Простые состоят только из
аминокислот, а сложные (их большинство) помимо белка включают небелковую группу (кофактор или кофермент).
Особенностью ферментов является их исключительно высокая активность (они ускоряют реакции в миллиарды раз). Так, одна единственная молекула фермента может катализировать при обычной температуре превращение от тысячи до миллиона молекул вещества в минуту. Эта скорость катализа недостижима для небиологических катализаторов. Другое, не менее важное, свойство ферментов - специфичность (избирательность) их действия в
отношении структуры субстрата, типа реакций и условий ее проведения.
Ферменты, обладая высокой специфичностью, направляют превращение вещества в строгое русло. Они катализируют реакции в мягких условиях,
т.е. при обычном давлении, небольшой температуре и значениях рН, близких
к нейтральным, весьма чувствительны к сдвигам рН среды и изменению температуры. Так как максимальная активность фермента обусловлена оптимальной конформацией молекулы фермента в целом и активного центра в частности, то даже небольшие изменения окружающих условий, которые затрагивают связывание субстрата или конформацию третичной структуры белка,
будут соответственно влиять на скорость ферментативной реакции.
Оптимальное pН для каждого фермента означает, что состояние его
ионизации соответствует наилучшей комплементарности. Изменение температуры вызывает противоречивый эффект: с одной стороны, при повышении
температуры до 37-400С скорость ферментативной реакции увеличивается,
что закономерно для катализа; с другой стороны, при температуре более 50 0С
начинается денатурация фермента. Ферментативные процессы не дают побочных реакций, для них характерен 100%-ый выход целевого продукта.
Ферменты регулируемы, т.е. могут изменять свою активность под воз11
действием ряда факторов, при этом выход целевого продукта будет разным.
Этим обеспечивается скоординированность всех метаболических процессов
во времени.
Скорость ферментативной реакции прямо пропорциональна количеству
фермента, поэтому недостаток фермента в организме означает низкую скорость превращения какого-либо соединения, и наоборот, одним из путей
приспособления организма к изменениям внешней среды является увеличение количества требуемого фермента.
В настоящее время четко определились три основных направления
исследований в области медицинской энзимологии: энзимопатология, энзимодиагностика и энзимотерапия.
Энзимопатология. Как известно, из более чем двух тысяч наследственных болезней человека молекулярный механизм развития выяснен только
у двух-трех десятков. Чаще всего развитие болезни непосредственно связано
с наследственной недостаточностью или полным отсутствием синтеза одного-единственного фермента в организме больного. Типичный пример подобной связи болезни с отсутствием синтеза в печени специфического фермента
- фенилпировиноградная олигофрения - наследственное заболевание, приводящее к гибели в раннем детстве или к развитию тяжелой умственной отсталости. Фермент фенилаланин-4-монооксигеназа, катализирующий реакцию
превращения незаменимой аминокислоты фенилаланина в тирозин, не синтезируется в клетках печени. Лечение в основном сводится к исключению из
питания ребенка (в том числе и из молока матери) аминокислоты фенилаланина. Аналогично развитие другого тяжелого наследственного заболевания галактоземии (непереносимость молочного сахара) связано с отсутствием
синтеза в клетках печени фермента, катализирующего превращение галактозы в глюкозу. Следствие подобной аномалии — накопление галактозы в тканях и развитие катаракты в раннем детстве, поражение тканей печени и мозга, нередко приводящее к гибели ребенка; лечение в этом случае сводится к
исключению из диеты молочного сахара.
Помимо наследственных заболеваний энзимопатология успешно решает и проблемы патогенеза соматических болезней, в задачу которых входит
выяснение молекулярных основ, например, злокачественного роста клеток,
атеросклероза или ревматоидных артритов.
Энзимодиагностика. О степени поражения органов, биомембран клеток и субклеточных структур, о тяжести патологического процесса можно
судить по появлению (или резкому повышению уровня) органотропных ферментов и изоферментов в сыворотке крови больных, что составляет предмет
диагностической энзимологии.
В настоящее время известно более 30 ферментов, активность которых
повышается в крови при повреждении клеток различных органов в период
острого и хронического заболеваний. Определение активности большинства
из этих ферментов в сыворотке крови используется для диагностики и контроля лечения многих заболеваний. Для каждого из этих ферментов опреде12
лены контрольные величины (уровни) активности и пределы колебания в
норме, как в сыворотке крови, так и в самом органе.
Диагностическая ценность ферментов существенно повысилась после
внедрения в клиническую практику методов определения изоферментов. В
этой связи отметим диагностическую значимость двух ферментов, определение изоферментных спектров которых внедрено почти во всех клинических
лабораториях мира.
Первый из них — лактатдегидрогеназа (ЛДГ), катализирующая обратимое превращение пировиноградной кислоты в молочную. Подчеркнем, что
ЛДГ является ключевым ферментом анаэробного обмена углеводов во всех
живых организмах, определяя скорость образования энергии в виде аденозинтрифосфата (АТФ). Широко распространенный фермент ЛДГ синтезируется почти во всех клетках организма человека. Различают два типа ЛДГ: так
называемый сердечный Н- (от англ.heart - сердце) и мышечный М-тип (от
анг.muscle— мышцы); каждый из них состоит из четырех субъединиц. При
органическом поражении сердечной мышцы, например инфаркте миокарда, в
сыворотке крови резко повышается уровень обшей лактатдегидрогеназы, что
преимущественно обусловлено изоферментами I и 2 (это очень важно для
точности диагноза).
При поражениях скелетной мускулатуры, а также при воспалительных
процессах (гепатиты) или при вирусных поражениях ткани печени, и, наконец, при отравлении тетрахлоридом углерода или другими ядами, когда преимущественно поражается печень, вызывая некроз ткани, уровень изоферментов 3 и 4 ЛДГ резко повышается при почти неизмененном уровне 1 и 2
изоферментов. Естественно, что методы лечения будут резко отличаться; в
выборе метода и немалую роль играет изоферментный спектр ЛДГ H - или
М-типа.
Диагностическая энзимология достигла значительных успехов при постановке диагноза болезней не только указанных органов, но и других, в частности почек, поджелудочной железы, желудка, кишечника и легких.
Одним из первых тестов на поражение печени является определение
активности щелочной фосфатазы - фермента, катализирующего отщепление
фосфатной группы от органических соединений - эфиров фосфорной кислоты. Активность данного фермента значительно повышается при первичных и
вторичных новообразованиях печени, печеночном холестазе, циррозе печени.
Также в клинической практике широко используют, например, определение
трансамидиназы в сыворотке крови — фермента, открытого только в ткани
почек и поджелудочной железы; или определяют активность фермента гистидазы, обнаруженного только в клетках печени и эпидермиса кожи. При органических поражениях этих органов, воспалительных процессах, травмах,
хирургических вмешательствах в сыворотке крови больных появляются указанные ферменты, в норме в ней отсутствующие.
Энзимотерапия. В настоящее время для фармацевтических целей
применяется свыше 40 ферментных препаратов животного, растительного и
13
микробного происхождения. Получен ряд препаратов протеолитического
действия (трипсин, химотрипсин и др.); специальные фибринолитические
препараты (фибринолизин, стрептолиаза и др.); препараты, уменьшающие
вязкость гиалуроновой кислоты (лидаза, ронидаза) и др. Эти препараты часто
используются при лечении заболеваний, сопровождающихся гнойнонекротическими процессами, при тромбозах и тромбоэмболиях, нарушениях
процессов пищеварения и др. Ферментные препараты находят также применение при лечении онкологических заболеваний (аспарагиназа). Новые перспективы успешного применения ферментных препаратов открывает разработка новых лекарственных форм - иммобилизованных ферментов (стрептодеказа).
Одновременно стал расширяться круг лекарственных средств, действие
которых связано с инактивированием ферментов. К ним относятся ингибиторы протеолитических ферментов (пантрипин, ингитрил и др.), широко применяемые при лечении острых панкреатитов и других заболеваний; избирательно действующие ингибиторы фибринолиза (аминокапроновая кислота и
др.), применяемые в качестве антигеморрагических средств; также большая
группа антихолинэстеразных препаратов; ингибиторы моноаминоксидазы,
применяемые как психотропные средства; ингибиторы карбоангидразы, используемые в качестве диуретиков. Эффективность аллопуринола при гиперурикемии связана с ингибированием им фермента ксантиноксидазы, действие тетурама при лечении алкогализма – с угнетением им фермента ацетальдегидоксидазы.
Важную группу лекарственных веществ составляют реактиваторы
ферментов, восстанавливающие инактивированную функцию ферментов (реактиваторы холинэстеразы).
Микробиологическим синтезом для медицинских целей получают
следующие ферментные препараты:
• солизим - гидролизующий жиры липолитический фермент, который
применяется при хронических заболеваниях ЖКТ;
• α-амилаза - сахаролитический фермент, гидролизующий крахмал, используется в составе лечебного препарата «фестал» при недостаточной
функции поджелудочной железы;
• террилитин - протеолитический фермент, который рекомендуется для
лечения гнойных ран ожогов, трофических язв;
• стрептокиназа - фибринолитический фермент, эффективный при лечении тромбозов;
• галактозидаза - сахаролитический фермент, хорошо зарекомендовавший себя при лечении лактазной недостаточности.
Традиционные биотехнологии, основанные на переработке тканей животных, поставляют в медицинскую практику:
• трипсин, химотрипсин — протеолитические ферменты, используемые
для рассасывания рубцов и спаечных процессов;
• урокиназу - протеолитический фермент, предназначенный для лече14
ния тромбозов;
• пепсин - протеолитический фермент, незаменимый при расстройствах
пищеварения.
Производство ферментных препаратов. Получение ферментов в
промышленных масштабах производится из биологических объектов всех
видов. Однако признано, что лучшими источниками для получения ферментов являются микроорганизмы.
Среди микроорганизмов-продуцентов ферментов практический интерес
представляют микроскопические грибы родов Aspergillus, Rhizopus,
Реnicillium, бактерии рода Bacillus, дрожжи рода Saccharomyces.
В настоящее время наиболее прогрессивным признан проточный метод
культивирования микроорганизмов, который обеспечивает непрерывную подачу в ферментатор как питательной среды, так и посевного материала. Размножение микроорганизмов и биосинтез фермента регулируют при использовании этого метода по мере поступления питательной смеси в ферментатор.
Важнейшим фактором эффективности технологии ферментных препаратов является качество питательной среды. Основное требование к качеству
питательной среды состоит в полноценности ее состава, обеспечивающей
рост продуцента и биосинтез целевого фермента. Микроорганизмы нуждаются, прежде всего, в соединениях, содержащих углерод, азот, водород и кислород. К ним относятся органические вещества, соли аммония и вода. Кроме того, в состав питательной среды должны быть включены минеральные
соединения, содержащие Мg, Са, Р, S, Fе, К и другие макро- и микроэлементы, витамины, ростовые вещества (биотин, инозит) и пр. Питательные среды
в зависимости от состава делятся на синтетические и комплексные. Синтетическими считают те среды, которые состоят из определенного по качественному и количественному составу набора индивидуальных веществ. В комплексные среды входят различные природные продукты, часто отходы пищевых производств. К их числу относятся различные жмыхи, барда спиртовых
заводов, картофельная мезга, кукурузный экстракт, меласса, отруби и прочие
продукты. Благодаря использованию отходов комплексные питательные среды доступны, дешевы и обеспечивают безотходность биотехнологических
производств.
Выделение и очистка фермента как из культуры микроорганизма (выращенного любым способом), так и из других природных источников весьма
трудоемкая и дорогостоящая процедура, поэтому, если фермент можно использовать в виде неочищенного препарата, его не очищают.
Исходным материалом для получения препаратов ферментов служат:
биомасса продуцента, фильтрат культуральной жидкости, экстракт из культуры микроорганизма или из тканей и органов растений и животных, из которых готовят препараты различной степени очистки.
Неочищенные ферментные препараты получают путем высушивания в
мягком режиме культуры микроорганизмов вместе с остатками питательной
15
среды. Такие препараты получают и путем упаривания экстракта из культуры
продуцента, выращенного поверхностным способом, или из фильтрата культуральной жидкости (в случае глубинного выращивания микроорганизмов).
Распространен также метод ацетоновых порошков, состоящий в осаждении и
быстром обезвоживании при температуре не выше -10°С тканей или вытяжек
из них, содержащих ферменты. Технические препараты ферментов представляют собой либо высушенные до порошкообразного состояния продукты,
либо жидкие концентраты, обычно характеризующиеся 50 %-м содержанием
сухой массы веществ.
Для успешного выделения ферментов из клеточного содержимого необходимо очень тонкое измельчение исходного материала вплоть до разрушения субклеточных структур: лизосом, митохондрий, ядер и др., которые
имеют в своем составе многие индивидуальные ферменты. Для этого используют специальные мельницы и гомогенизаторы, а также ультразвук, метод
попеременного замораживания и оттаивания ткани. Для высвобождения
ферментов из мембранных структур клетки к гомогенатам добавляют небольшие количества детергентов (твин, тритон Х-100) или обрабатывают их
энзимами — лизоцимом, целлюлазой, лецитиназой С. Особое внимание при
выделении ферментов уделяют проведению всех операций в условиях, исключающих денатурацию белка (нейтральные значения рН, стабилизирующие добавки в виде белков, солей и специальных соединений).
В зависимости от свойств выделяемого фермента и сопутствующих ему
балластных веществ, при получении очищенных препаратов ферментов комбинируют различные приемы и методы такие, как термическое фракционирование, осаждение органическими растворителями, солями и тяжелыми металлами, фильтрация на молекулярных ситах, ионообменная хроматография,
электрофорез, изоэлектрофокусирование.
На заключительных этапах очистки часто используют аффинную хроматографию (биоспецифическая хроматография, хроматография по сродству), которая основана на способности ферментов избирательно связывать те
или иные лиганды - субстраты,коферменты, конкурентные ингибиторы, аллостерические эффекторы и т. п. Такое связывание весьма специфично
(Ks,<10-4), что позволяет выделить тот или иной энзим из множества других
белков.
6. Задание для текущего контроля
Вопросы по теме занятия:
1. Ферменты. Определение. Значение и роль в жизнедеятельности организмов.
2. Основные направления исследований в области медицинской энзимологии.
3. Роль и значение энзимопатологии, энзимодиагностики, энзимотерапии.
4. Промышленное производство ферментов, получаемых биотехнологическими методами.
16
5. Схема производства ферментов (стадии производства).
6. Какими способами осуществляют культивирование продуцентов
ферментов?
7. Какие методы очистки и выделения ферментов используют?
8. Устройство и принцип работы ферментаторов, используемых в производственном процессе.
9. Инженерная энзимология, определение, характеристика.
10. Какие препараты ферментов используют для диагностики и лечения
различных заболеваний?
17
Занятие № 3
1. ТЕМА: Фитобиотехнология. Генетически модифицированное
растительное сырьё: создание и применение. Трансгенные растения.
Классификация. Обеспечение безопасности соответствующей продукции
2. Продолжительность занятия - 5 часов
3. Цель занятия:
Изучить теоретические основы создания генетически модифицированного растительного сырья, область его применения, нормативно-правовую
базу по обеспечению безопасности, как производителей, так и потребителей
соответствующей продукции.
3.1 Целевые задачи:
В итоге занятия обучающийся (аспирант) должен знать:
- Тотипотентность как фактор, способствующий созданию трансгенных
растений
- Векторные способы осуществления генетической трансформации растений, приемы прямого переноса ДНК в клетку, комбинированный метод
трансформации для получения трансгенных растений.
- Применение генетически модифицированных растений.
В итоге занятия обучающийся (аспирант) должен уметь:
- Получать растительное сырье in vitro.
- Приготовить питательную среду и определить митотический индекс.
- Определить экстрактивные вещества.
4. Выполнить следующие задания:
1. Изучить основные этапы генетической трансформации растений.
2. Получить каллусную культуру клеток и оценить ее качество.
5. Информационные материалы
Важным преимуществом растений, по сравнению с животными, является способность их клеток развиваться в целое растение (т. е. тотипотентность), что широко используется в работах по получению трансгенных растений.
Генетическая трансформация растений с помощью методов генетической инженерии может быть осуществлена векторным способом (с использованием агробактерий и вирусов) и путем прямого переноса генов.
Наиболее изученным примером работы плазмидных векторов служит
введение чужеродных генов в геном растений с помощью Тi- и Ri-плазмид
почвенных бактерий рода Аgrobacterium. С помощью этих плазмид бактерии
могут интегрировать свой генетический материал в клетки двудольных растений.
Тi-плазмида (от англ. Tumor inducing - индуцирующая опухоль) обнаружена в клетках некоторых штаммов Аgrobacterium tumefaciens. Выделенная в чистой культуре, эта бактерия может приводить к образованию опухолей у двудольных растений, что, по существу, может рассматриваться как
18
природная генно-инженерная система. Тi-плазмида проникает из клетки бактерии в растение, и часть ее, называемая Т-ДНК (от англ. Transferred DNA переносимая), ковалентно встраивается в хромосомы инфицируемого растения. В природе этот фрагмент переносит гены, которые способствуют размножению агробактерий и дают им возможность паразитировать на пораженном растении.
Гены, входящие в состав Т-ДНК, функционируют лишь после их переноса в растительную клетку. Будучи интегрированной с хромосомой, Т-ДНК
индуцирует в месте заражения образование опухоли (корончатых галлов, напоминающих раковые клетки животных), гиперпродукцию фитогормонов цитокининов и ауксина, а также синтез ряда производных аминокислот, опинов - веществ, которых нет в здоровых клетках ни у одного растения.
Опухоль возникает вследствие нарушения баланса фитогормонов, т. е.
как результат функционирования онкогенов, продуктами которых являются
ауксины и цитокинины. Опины, выделяемые клетками опухоли, бактерия использует в качестве источников углерода и азота для своего роста и размножения. Сама бактерия в клетку не проникает, а остается в межклеточном
пространстве и использует клетку со встроенной Т-ДНК как «фабрику», продуцирующую опины. Такие отношения А. tumefaciens и растения назваются
генетической колонизацией.
Тi-плазмида оказалась идеальным природным вектором для введения
чужеродных генов в клетки растения. Проще всего, было бы заменить Т-ДНК
на чужеродные (полезные) гены, ввести их в плазмиды агробактерий и заразить ими растения, так как гены, ответственные за индукцию опухоли, синтез
опинов и подавление дифференциации клеток поражаемого растения, расположены близко друг от друга в Т-ДНК. В то же время гены, ответственные за
перенос и интеграцию Т-ДНК в хромосомы растений, находятся в другой области Тi-плазмиды - в (vir-области). На основе Тi-плазмиды в условиях эксперимента создают искусственные векторы. Для создания трансгенных растений гены, кодирующие хозяйственно ценные признаки, встраивают в ТДНК. Эту же область снабжают маркерными генами (для отбора трансформированных растительных клеток), эукариотическим промотором (например,
35S-промотор вируса мозаики цветной капусты — САМV) и уникальными
сайтами рестрикции.
Однако размеры Тi-плазмид слишком велики и не позволяют использовать их в качестве вектора. Для решения этой проблемы была создана специальная технология - бинарная система.
В последние годы для создания искусственных векторов используют
Ri-плазмиду (от англ.root inducing - индуцирующая корни), присутствующую
в штаммах Аgrodacterium rhizogenes. Ri-плазмиды выгодно отличаются от
Тi-плазмид тем, что они являются естественными безвредными векторами.
После встраивания Т-ДНК в хромосомную ДНК растительных клеток в области заражения наблюдается усиленное образование корешков («бородатость»), из которых легче регенерировать здоровые растения, чем из недиф19
ференцированной ткани опухоли.
Для трансформации устойчивых к агробактериям однодольных растений разработаны приемы прямого физического переноса ДНК в клетку. Эти
методы достаточно разнообразны: бомбардировка микрочастицами, или баллистический метод; электропорация; обработка полиэтиленгликолем; микроинъекция; перенос ДНК в составе липосом и др.
В последнее время разработан и успешно применен также комбинированный метод трансформации, названный агролистическим. При этом чужеродную ДНК вводят в ткани каким-либо физическим методом, например
баллистическим. Вводимая ДНК содержит как Т-ДНК вектор с целевым и
маркерным геном, так и агробактериальные гены вирулентности под контролем эукариотического промотора. Временная экспрессия генов вирулентности в растительной клетке приводит к синтезу белков, которые правильно вырезают Т-ДНК из плазмиды и встраивают ее в хозяйский геном,
как и при обычной агробактериальной трансформации.
После проведения тем или иным способом трансформации растительной ткани ее помещают in vitro на специальную питательную среду с фитогормонами, способствующую размножению клеток. Среда обычно содержит
селективный агент, в отношении которого трансгенные клетки приобретают
устойчивость. Регенерация чаще всего проходит через стадию каллуса, после
чего при правильном подборе сред начинается органогенез (побегообразование). Сформированные побеги переносят на среду укоренения, часто также
содержащую селективный агент для более строгого отбора трансгенных особей.
Методы генетической инженерии позволяют достаточно быстро создавать новые генотипы растений, т. е. значительно сокращают время, которое
затрачивается на классическую селекцию. Кроме того, применение этих методов позволяет изменять генотип целенаправленно. В отношении растений
роль генетической инженерии сводится, главным образом, к созданию сортов
сельскохозяйственных растений, устойчивых к насекомым-вредителям, фитопатогенам, гербицидам, пестицидам, различным стрессовым факторам.
Проводятся работы по введению генов, регулирующих созревание плодов,
отвечающих за синтез витаминов или лекарственных препаратов и т. д.
Получение трансгенных растений значительно облегчается благодаря
присущему растениям свойству тотипотентности, т. е. способности любой
клетки растительного организма регенерировать целое растение. Следовательно, достаточно получить несколько трансформированных клеток, чтобы
регенерировать из них растения-трансгены.
Однако возможности генетической инженерии растений ограничиваются рядом причин:
- во-первых, геном растений изучен хуже, чем геном млекопитающих;
-во-вторых, не для всех растений удается подобрать условия регенерации. Стабильно получают растения-регенеранты из протопластов картофеля,
люцерны, томатов, моркови, табака, капусты и некоторых других двудоль20
ных растений. Регенерировать растения злаков удается не всегда;
- в-третьих, одной из лимитирующих причин служит размер фрагмента
донорной ДНК, который предполагается ввести в клетку, а также появление
химерных организмов неспособных к развитию и размножению.
Была предпринята попытка использовать пыльцу в качестве супервектора при трансформации, что позволяет исключить появление растенийхимер. Использование искусственной бактериальной хромосомы в качестве
векторной системы позволяет переносить целые кассеты генов, кодирующие
множественные ступени биохимических процессов.
Нынешний этап развития генетической инженерии растений относится
к «метаболической инженерии». При этом, ставится задача не столько улучшить те или иные имеющиеся качества растения (как при традиционной селекции), сколько научить растение производить совершенно новые соединения, используемые в медицине, химическом производстве и других областях.
Этими соединениями могут быть, например, особые жирные кислоты, полезные белки с высоким содержанием незаменимых аминокислот, модифицированные полисахариды, антитела, интерфероны и другие «лекарственные»
белки, новые полимеры, не засоряющие окружающую среду, и т. д. Использование трансгенных растений позволяет наладить масштабное и дешевое
производство таких веществ и тем самым сделать их более доступными.
Изменение пищевой ценности растений
1. Запасные белки. Основной задачей генетической инженерии считается улучшение аминокислотного состава белков. Как известно, в запасном
белке большинства злаковых наблюдается дефицит лизина, треонина, триптофана, а на запасном белке бобовых — дефицит метионина и цистеина.
Введение в эти белки дополнительных количеств дефицитных аминокислот
могло бы ликвидировать аминокислотный дисбаланс Эксперименты по
трансформации пшеницы модифицированным геном, кодирующим одну из
субъединиц запасного белка глютенина, привели к активному синтезу модифицированного белка, что способствовало улучшению хлебопекарского качества пшеничной муки. Растения могут производить и белки животного
происхождения. Было показано, что в растениях табака могут собираться
полностью функциональные секреторные моноклинальные иммуноглобулины. Секреторные иммуноглобулины обычно выделяются в ротовую полость
и желудок человека и животных и служат первым барьером на пути кишечных инфекций. Из растений были получены моноклональные антитела, специфичные для Streptococcus mutans- бактерий, вызывающих зубной кариес.
Предполагается, что на основе таких моноклональных антител, продуцируемых трансгенными растениями, удастся создать действительно антикариесную зубную пасту.
2. Полисахариды. Проводится работа по созданию трансгенных растений картофеля, в которых крахмал будет находиться главным образом в виде
амилопектина (разветвленной форме крахмала) или же только в виде амилозы (линейной формы крахмала). Так, например, крахмал, состоящий в основ21
ном из амилопектина, по-видимому, будет иметь спрос на рынке производителей различных питательных смесей (сейчас в качестве наполнителя используется модифицированный крахмал).
Растения как биореакторы. Растения дают большое количество биомассы, и их выращивание не составляет особого труда. Поэтому естественно
было бы попытаться создать трансгенные растения, способные синтезировать
новые соединения, используемые в медицине, химическом производстве и
других отраслях. Уже созданы экспериментальные установки по получению
с помощью растений моноклональных антител, функциональных фрагментов
антител и полимера поли-β-гидроксибутирата, из которого можно изготавливать пластик, подверженный биодеградации.
Растения являются наиболее дешевыми продуцентами белков. К настоящему времени показано, что растения могут производить белки животного происхождения. Так, встраивание в геном арабидопсиса химерного гена,
состоящего из части гена запасного белка арабидопсиса и кодирующей части
для нейропептида — энкефалина, приводило к синтезу химерного белка в
количестве до 200 нг на 1 г семян. Два структурных белковых домена были
связаны последовательностью, узнаваемой трипсином, что давало возможность в дальнейшем изолировать чистый энкефалин, используемый в качестве болеутоляющего и успокаивающего средства.
Японские ученые получили растения картофеля и табака со встроенным геном человеческого α-интерферона, который применяют для лечения
гепатита С и некоторых форм рака.
Созданы растения табака, нарабатывающие человеческий интерлейкин
10 (стимулятор иммунитета), а также растения арабидопсиса, синтезирующие
витамин Е.
Разработаны также подходы, позволяющие получать бактериальные антигены в растениях и использовать их в качестве вакцин. Так, получен
картофель, продуцирующий нетоксичные субъединицы В-токсина холеры.
Такие растения могут быть использованы для получения дешевых съедобных
вакцин против холеры. Иммунизация такой антихолерной вакциной вполне
эффективно происходит путем перорального приема. .
Производство антител и их фрагментов с помощью трансгенных растений имеет ряд преимуществ перед их синтезом в клетках рекомбинантных
микроорганизмов, так как трансформация растений носит стабильный характер. Кроме того, процессинг и укладка чужеродных белков в растениях сходны с таковыми в животных клетках. Также можно создавать условия, при которых чужеродные белки будут синтезироваться в семенах, где их целостность не нарушится длительное время.
Крупномасштабный бактериальный синтез поли-β-гидроксибутирата
(полимера, из которого получают пластик, подверженный биодеградации)
обходится довольно дорого. Поэтому получение этого полимера с помощью
трансгенных растений - важный шаг для создания сельскохозяйственных
культур, которые можно использовать для получения и больших количествах
22
биодеградирующих пластиков.
Преимущества растений как «биофабрик» очевидны: можно производить очень редкие и дорогие вещества практически в неограниченных количествах; растения становятся продуцентами вакцин, фармакологических белков и антител, что позволяет значительно удешевить лечение различных заболеваний, в том числе и онкологических.
Повышение урожайности, регуляция скорости роста. С помощью
генетической инженерии можно повышать и урожайность сельскохозяйственных культур, несмотря на то, что этот признак является полигенным. Тем
не менее, можно найти и применить отдельные гены, продукты которых позволяют существенно усилить процессы роста и в итоге повысить продуктивность растения. Так, встраивание в геном картофеля гена фитохрома В от
арабидопсиса приводило к повышению интенсивности фотосинтеза и увеличению урожая клубней.
6. Задание для текущего контроля
Вопросы по теме занятия:
1. Осуществление генетической трансформации растений с помощью
методов генетической инженерии (плазмидные векторы, прямой перенос генов).
2. Генетическая колонизация. Характеристика.
3. Агролистический комбинированный метод трансформации.
4. Достижения генетической инженерии растений.
5. Изменение пищевой ценности растений.
6. Создание гербецидоустойчивых растений.
7. . Создание растений устойчивых к насекомым.
8. Повышение устойчивости растений к стрессовым условиям, повышение эффективности фотосинтенза.
9. Растения как биореакторы.
10. Преимущества растений как «биофабрик».
23
Занятие № 4
1.Тема: Генная инженерия: получение лекарственных препаратов
генно-инженерными методами: инсулин, интерферон.
2. Продолжительность занятия – 5 часов
3. Цель занятия:
Изучить теоретические основы получения генно-инженерными методами лекарственных препаратов.
3.1. Целевые задачи:
В итоге занятий обучающийся (аспирант) должен знать:
- использование методов генной инженерии (технологии получения рекомбинантной ДНК) для переноса в микробные клетки генов человека, кодирующих образование видоспецифичных белковых биорегуляторов;
- критерии выбора организма-хозяина, конструирование штаммов;
- технологию получения инсулина человека на основе использования
рекомбинантных штаммов;
- технологию получения интерферона.
В итоге занятий обучающийся (аспирант) должен уметь:
- пользоваться правилами GMP применительно к биотехнологическому
производству;
- провести сравнительную оценку методов получения инсулина из животного сырья, биосинтетическим (или полусинтетическим), генноинженерным, модифицированным генно-инженерным.
4. Выполнить следующие задания:
1. Теоретически изложить технологию рекомбинантных ДНК. Этапы
технологического процесса получения инсулина, интерферона.
2. Рассмотреть методы контроля концентрации инсулина в крови человека. Принцип радиоимунного анализа (РИА).
5. Информационный материал.
Генетическая инженерия - это система экспериментальных приемов,
позволяющих конструировать лабораторным путём (в пробирке) искусственные генетические структуры в виде, так называемых, рекомбинантных или
гибридных молекул ДНК. Это предполагает, что часть генов можно с помощью специальных ферментов вырезать из молекулы ДНК одного организма
(донорная ДНК) и перенести в другой, реципиентный, организм. Такой перенос генов называется трансгенозом, а организмы, в ДНК которых включены
чужеродные гены, носят название трансгенных.
Используемые для переноса генетические конструкции носят название
рекомбинантных ДНК. В их состав входят фрагмент донорной ДНК (клонируемая ДНК) и векторная ДНК (вектор, который отвечает за перенесение и
встраивание — интеграцию — клонируемой ДНК). Молекулы рекомбинантной ДНК создают для клонирования необходимых участков ДНК, картирования ДНК, создания трансгенных организмов, массового получения продук24
тов, закодированных данным участком ДНК. Рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата реципиентного организма и
обеспечивают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и
физиологические свойства.
Технология получения рекомбинантных ДНК включает следующие
методические подходы:
1.Специфическое расщепление ДНК эндонуклеазами рестрикции, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами.
2. Быстрое секвенирование всех нуклеотидов в определенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и кодируемую им аминокислотную последовательность.
3. Конструирование рекомбинантной ДНК.
4. Гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять с
большой точностью и чувствительностью специфические последовательности РНК или ДНК, основанные на их способности связывать комплементарные последовательности нуклеиновых кислот.
5. Клонирование ДНК путем введения ее фрагмента в бактериальную
клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в
миллионах копий, или амплификация in vitro; создание геномных библиотек.
6. Введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.
Получение инсулина
Инсулин синтезируется β-клетками островков Лангерганса поджелудочной железы; 70% мРНК, выделенных из этих клеток, кодируют именно
этот белок. Человеческий инсулин - полипептид с м.м. 5808, состоящий из
51-й аминокислоты, которые образуют две соединенные дисульфидными
мостиками полипептидные цепи (одна цепь состоит из 21 аминокислоты, так
называемая цепь А; другая - из 30 аминокислотных остатков, так называемая
цепь В). Между остатками цистеина А-цепь имеет дополнительную внутреннюю S-S-связь. Эти дисульфидные связи обеспечивают пространственную
структуру молекулы, причем любое другое их замыкание приводит практически к потере активности.
Обычно инсулин получают из поджелудочных желез свиней и коров,
но гормоны этих животных слегка отличаются от инсулина человека: инсулин свиней отличается одной аминокислотой, а инсулин коров - тремя. Отмечено, что инсулин животных часто вызывает побочные эффекты, в том
числе аллергическую реакцию на такой препарат. Кроме того, сами возможности выделения и очистки гормона не беспредельны. В настоящее время инсулин человека получают в основном двумя способами. Первый связан с модификацией свиного инсулина синтетико- ферментативным методом. Он
основан на том, что свиной инсулин отличается от инсулина человека одной
заменой на С-конце В-цепи Аlа30Тhг. Замену аланина на треонин осуществляют путем катализируемого ферментом отщепления аланина и присоединения вместо него защищенного по карбоксильной группе остатка треонина,
присутствующего в реакционной смеси в большом избытке. После отщепле25
ния защитной 0-трет-бутильной группы получают инсулин человека.
Второй способ получения инсулина человека - генно-инженерный, т. е.
биотехнологический. В качестве компетентных клеток использовали Е. соli, а
гены обеих цепей молекулы человеческого инсулина были получены методом химического синтеза. Эти гены присоединяли к 3-концу гена, кодирующего белок β-галактозидазу, и вводили в векторную плазмиду. Трансформированные клетки Е. соli и синтезировали химерные белки, состоящие из А
или В-цепи инсулина, присоединенные через метионин к β-галактозидазе. С
помощью бромциана, специфически расщепляющего белки по остатку метионина, выделяли индивидуальную цепь инсулина. Однако образование дисульфидных цепей in vitro стало лимитирующей стадией всего процесса: выход биологически активного вещества был незначителен (вероятно, в связи с
отсутствием С-пептида, без которого плохо проходило образование -S-Sмостиков между А и В-цепями инсулина). Поэтому был разработан метод
получения проинсулина человека с последующим созреванием его in tube.
Были получены двухцепочечные фрагменты ДНК, соответствующие
гену, кодирующему человеческий инсулин. Они были встроены в плазмиду и
перенесены в Е. соli. Полученные рекомбинантные клетки синтезировали
проинсулин, который затем in vitro превращали в зрелый инсулин.
Одним из вариантов биосинтетического получения инсулина человека
через синтез его биологического предшественника проинсулина. Другой путь
- раздельный биосинтез А и В-цепей, но в этом случае необходимо проводить две ферментации различных химерных штаммов и соответственно два
аналогичных процесса выделения. На первом этапе воссоздают последовательность ДНК по аминокислотной последовательности инсулина, раздельно
синтезируя искусственные гены его А и В-цепей. На 5-конце каждого из них
располагается кодон метионина (который в синтезированном белке оказывается N-концевым), а на 3-конце - терминирующие последовательности. Каждый из генов встраивают затем в ген β-галактозидазы плазмид, а их в свою
очередь вводят в клетки Е. соli. Поскольку бактерии растят на среде с галактозой, а не с глюкозой, то в них индуцируется синтез β-галактозидазы, а вместе с ней - А и В-цепей инсулина, присоединенных через остаток метионина.
После лизиса бактерий и обработки бромцианом, который специфически
расщепляет белки по остатку метионина, цепи инсулина отделяют от βгалактозидазы (инсулин метионина не содержит). Затем проводят очистку
цепей и их объединение (с низким выходом), в результате чего образуется
нативный двухцепочный инсулин. Было показано, что он не содержит белков
Е. соli, эндотоксинов и пирогенных веществ, по физическим свойствам неотличим от инсулина из поджелудочной железы человека и в тест-системе (гипогликемия у животных) проявляет полную биологическую активность.
Получение инсулина микробиологическим синтезом характеризуется большей рациональностью. Используется штамм-продуцент E.coli IM –
109.
Конструкция плазмиды обеспечивает синтез рекомбинантного белка,
26
представляющего собой лидерную последовательность и фрагмент белка А и
последовательность проинсулина человека, а между ними находится остаток
аминокислоты метионина, разрушающийся под действием галогенцианов.
Этим свойством удобно воспользоваться для последующего отщепления
проинсулиновой части молекулы. Кроме того, плазмида содержит ген устойчивости к β-лактамным антибиотикам, поэтому при культивировании биомассы в питательную среду добавляют антибиотики, подавляющие рост посторонних микроорганизмов, в том числе клеток Еscherichia coli потерявших
плазмиду. Для культивирования Еscherichia coli используют достаточно простые, обычные по составу питательные среды. После наращивания основного
количества биомассы в среду вносят специальный индуктор, при этом метаболизм клеток практически полностью переключается на синтез рекомбинантного белка.
Для отделения проинсулиновой части молекулы от лидерной последовательности проводят химический гидролиз гибридного белка бромцианом в
концентрированной муравьиной кислоте. При этом он расщепляется селективно по остатку метионина, а образующаяся смесь разделяется хроматографическими методами. В выделенном проинсулине S-S - группы связаны хаотически, т.е. конформация молекулы отличается от нативной. Поскольку
пространственная конфигурация определяется ее первичной последовательностью, то следующая стадия процесса — разрушение дисульфидных связей
в структурном аналоге проинсулина (стадия сульфитолиза) и их правильное
замыкание (стадия ренатурации). Молекула проинсулина «сворачивается»
таким образом, что ее начальный и конечный сегменты сближаются. Роль
центральной частит (С-пептида) сводится к правильному взаимному расположению двух цепей инсулина.
Полученный проинсулин является физиологическим предшественником инсулина и отличается от него наличием С-пептида, содержащего три
аминокислотных остатка. Поэтому последняя стадия технологического процесса - ферментативный гидролиз проинсулина смесью трипсина и карбоксипетидазы в условиях, близких к физиологическим. После хроматографической очистки и обессоливания получают раствор инсулина, из которого выделяют белок лиофильным высушиванием или высаливанием солями цинка.
Готовый продукт исследуют методами высокоэффективной хроматографии и электрофореза; кроме того, обязательным требованием является
проведение биологических испытаний на активность и пирогенность. Последний тест отличается большой чувствительностью и позволяет обнаружить в препарате наличие следовых количеств бактериальных эндотоксинов.
Компания «Еli Lilly» в массовом производстве человеческого инсулина
использует технологию рекомбинантных ДНК, помещая к ДНК гена человеческого проинсулина в Е. сoli или S. serevisae и гидролизуя наработанный
проинсулин до молекулы инсулина. Человеческие инсулины этой фирмы носят название «Хумулин». В медицинской практике используют рекомбинатные человеческие инсулины из серии Хумулин «Еli Lilly» - регулярный,
27
НПХ-ленте, ультраленте и их комбинированные составы. Человеческий инсулин быстрее абсорбируется и независимо от формы препарата имеет более
короткую длительность действия, чем животные инсулины. Человеческие
инсулины менее иммунны, чем свиные, особенно смешанные бычьи и свиные инсулины.
В настоящее время в медицинской практике используют инсулины трех
типов: короткодействующие с быстрым началом эффекта; средней продолжительности действия; длительного действия с медленным проявлением эффекта.
Получение интерферона
Интерферонами называют группу эндогенных низкомолекулярных
белков (молекулярная масса от 15 до 25 кДа), обладающих противовирусными, иммуномодулирующими и другими биологическими свойствами, в том
числе противоопухолевой активностью.
Существует три основных класса интерферонов: альфа-интерферон (α),
бета-интерферон (β), гамма-интерферон (γ).
α-Интерфероны являются протеинами, не содержащими простетических групп, а (β-интерфероны и γ-интерфероны - гликопротеинами.
Основными клетками - продуцентами интерферонов являются: для αинтерферона — макрофаги (лейкоциты Т и В); для β-интерферона — эпителиальные клетки и фибробласты; γ-интерферон продуцируется Тлимфоцитами и естественными киллерами (NК-клетками).
Все интерфероны обладают не только антивирусным и противоопухолевым действием, но и, что важнее, свойством активировать, понуждать к
действию такие клетки иммунной системы, как макрофаги.
Помимо общих свойств, между различными типами интерферонов есть
существенные отличия. Основные функции α-интерферона и β-интерферона
связаны с ограничением и подавлением вирусной инфекции. γ-Интерферон
является одним из ключевых медиаторов активации Т-звена иммунитета.
α-Интерферон человека содержит 166 аминокислотных остатков, молекулярная масса интерферонов около 17,5 кДа. У каждого вида животных
имеется несколько α-интерферонов (у человека 14 различных генов аинтерферонов, несколько генов β-интерферонов и один γ-интерферон.
На практике интерферон α выделяют из лейкоцитов при низкоскоростном центрифугировании свежевыделенной крови человека. Лейкоциты переносят в питательную среду, содержащую либо сыворотку крови человека,
либо казеин молока, а также вирус Сендай, и выдерживают в течение 8ч. Далее лейкоциты отделяют центрифугированием, а вирус инактивируют любым
из приемлемых способов.
Супернатант представляет собой нативный интерферон. Его лиофильно
высушивают и выпускают в ампулах. Это серовато-коричневый порошок,
легко растворимый в воде. Из нативного интерферона можно получить концентрированный интерферон путем очистки колоночной хроматографией на
сефадексах или мембранной фильтрацией. Полученный препарат после вы28
сушивания имеет вид порошка серовато-белого цвета, хорошо растворимого
в воде.
β-Интерферон можно получить из фибробластов, выращенных в монослойной культуре, в присутствии циклогексимида и актиномицета Д.
Технологическая схема получения генно-инженерных интерферонов следующая:
1) индукция синтеза и выделение мРНК интерферона из клеток;
2) получение кДНК, комплементарной мРНК интерферона;
3) синтез гена интерферона на основе кДНК с помощью
ДНК-полимеразы и получение рекомбинантной ДНК;
4) введение рДНК в клетки Еscherichia coli;
5) размножение бактерий, содержащих реконструированную плазмиду,
в питательной среде;
6) сепарирование клеток Еscherichia coli;
7) дезинтеграция и экстракция клеток Еscherichia coli
8) осаждение полиэтиленамидом с последующим центрифугированием;
9) высаливание интерферона из супернатанта сульфатом
аммония;
10) диализ осадка интерферона;
11) растворение интерферона и аффинная хроматография раствора на
колонке с иммобилизованными моноклональными антителами;
12) элюация интерферона с последующей хроматографией на целлюлозном катионообменнике.
Из указанных 12 стадий только 8 последних фактически реализуются в
производственных условиях¸ тогда как первые 4 стадии выполняются в лабораторных условиях. Эти стадии наиболее трудные и сложные.
Интерфероны выпускают в качестве лекарственных препаратов в виде
капель в нос, мазей или растворов для инъекций, в виде суппозиториев. Существуют натуральные интерфероны, полученные из лимфоцитов донорской
крови, и искусственно синтезированные с применением генно-инженерных
технологий (рекомбинантные). В настоящее время как у нас в стране, так и за
рубежом выпускают коммерческие препараты — человеческий лейкоцитарный, лимфобластный (Велферон,Wellferon) и фибробластный (Ферон), а также интерфероны, полученные генно-инженерными методами: рекомбинантные α-интерферон (Роферон, Реальдерон и др.), β-интерферон и γинтерферон (Гаммаферон). Свечи «Свеферон» - интерферон человеческий
лейкоцитарный, основа суппозиторная – твердый жир кондитерский.
6. Задание для текущего контроля
Вопросы по теме занятия:
1. Генная инженерия: цель и задачи.
2. Техника генно-инженерного эксперимента.
3. Методы получения рекомбинантной ДНК.
4. Актуальность применения инсулина в медицине.
5. Структурные особенности инсулина.
29
6. Методы получения инсулина.
7. Особенности производства рекомбинантного инсулина.
8. Классы интерферонов, специфическое действие интерферонов.
9. Технологическая схема получения генно-инженерная интерферонов.
10. Номенклатура интерферонов, используемых в медицинской практике.
30
Занятие № 5
1. Тема. Получение антибиотиков, витаминов. Особенности
технологии. Аппаратура
2. Продолжительность занятия – 4 часа
3. Цель занятия:
Изучить основные методы определения антимикробной активности антибиотиков на различных этапах их получения. Изучить биологическую роль
витаминов
3.1. Целевые задачи:
В итоге занятия обучающийся (аспирант) должен знать:
- Механизмы антибактериального действия антибиотиков.
- Качественные и количественные методы определения чувствительности бактерий к антибиотикам.
- Технологии биотехнологического производства витамина
В итоге занятия обучающийся (аспирант) должен уметь:
- Применять определения чувствительности бактерий к антибиотикам
методами диффузии в агар (бумажных дисков) и серийных разведений.
- Составить аппаратурные схемы производства витаминов и подобрать
необходимое оборудование.
4. Выполнить следующие задания:
1. Определить по демонстрационному посеву чувствительность микробов к антибиотикам диско-диффузионным методом.
2. Определить содержание витамина С в капустном рассоле, шиповнике,
картофеле.
5. Информационные материалы.
Антибиотики – это химические соединения биологического происхождения, оказывающие избирательное повреждающее или губительное действие на микроорганизмы. Антибиотики, применяемые в медицинской практике, продуцируются актиномицетами (лучистыми грибами), плесневыми грибами, а также некоторыми бактериями. К этой же группе препаратов относятся синтетические аналоги и производные природных антибиотиков.
Антибиотики являются одними из представителей вторичных метаболитов живых клеток. Первичными метаболитами называются вещества, необходимые для роста клетки (аминокислоты, моносахариды, нуклеотиды, витамины и т.д.). Вторичные метаболиты представляют собой низкомолекулярные соединения (антибиотики, алкалоиды, пигменты и т.д.), образующиеся в
клетках по завершении фазы роста. Антибиотики могут выполнять в продуцирующих их живых клетках следующие функции: средства нападения и защиты («химическое оружие» клетки); детоксикация вредных метаболитов;
контроль некоторых реакций при обмене веществ; участие в процессе дифференцировки клеток; запасные питательные вещества.
Открытие антибиотиков является одним из важнейших достижений
науки XX века. Первый антибиотик – пенициллин – был открыт английским
31
учёным А. Флемингом. Процесс открытия новых антибиотических структур
продолжается и в настоящее время. Так, например, за 1946 – 1950г.г. было
открыто около 200 антибиотиков, 1965 – 1970г.г. – 1000, 1980 – 1985г.г. –
2000, 1995 – 2000г.г. – 3000. В настоящее время известно около 12000 различных антибиотиков. Около 97% всех известных антибиотиков токсичны, в
клинике применяется лишь около 200 соединений.
Классификация антибиотиков.
В зависимости от химического строения различают следующие группы антибиотиков: беталактамиды, макролиды и азалиды, аминогликозиды
(аминоциклитолы), тетрациклины, амфениколы, антибиотики другой структуры. В зависимости от типа действия: бактерицидные – вызывающие гибель микроорганизмов (β- лактамные антибиотики, аминогликозиды); бактериостатические – нарушающие способность микроорганизмов к делению
(макролиды, аминогликозиды, тетрациклины) В зависимости от спектра
действия антибиотики могут быть: влияющие преимущественно на грамположительные микроорганизмы; грамотрицательные микроорганизмы; широкого спектра действия; противотуберкулёзные антибиотики; противогрибковые антибиотики; антибиотики, влияющие на простейших; противоопухолевые антибиотики. В зависимости от механизма действия выделяют группы
антибиотиков, вызывающие: нарушение биосинтеза пептидогликанов клеточной стенки бактерий; повреждение клеточной мембраны; нарушение биосинтеза нуклеиновых кислот; нарушение отдельных процессов трансляции;
нарушение энергетического обмена. По происхождению антибиотики могут
быть: бактериального; актиномицетного; грибкового; растительного; животного происхождения.
Существует ряд требований к антибиотикам, существенно ограничивающих их терапевтическое применение: эффективность в низких концентрациях; стабильность в организме и в различных условиях хранения; низкая
токсичность или ее отсутствие; выраженный бактериостатический и (или)
бактерицидный эффект; отсутствие выраженных побочных эффектов; отсутствие иммунодепрессивного воздействия.
Основные факторы, приводящие к устойчивости микроорганизмов
к антибиотикам.
1. Состояние клеточной стенки, при котором антибиотик задерживается на поверхности клетки и не проникает внутрь в результате ухудшения
проницаемости антибиотиков через пориновые каналы внешней мембраны
или по другим причинам.
2. Способность клетки разрушать лекарственный препарат раньше, чем
он сможет проявить биологическое действие, посредством конститутивных
либо индуцируемых ферментов, усиленно синтезируемых клеткой в присутствии антибиотика, или модифицировать антибиотик.
3. Изменение клеточных структур (рибосом, мембран и др.) или модификация активных центров антибиотика, находящегося в клетке, под действием ряда факторов.
32
4. Способность бактерий снижать концентрацию антибиотика внутри
клетки в результате активного выноса антибиотика.
5. Нарушение в микробной клетке мишени, ответственной за чувствительность микроорганизма к антибиотику.
6. Перенос генов антибиотикорезистентности от устойчивых штаммов
микроорганизмов к чувствительным.
Побочное действие антибиотиков.
Для макроорганизма: токсическое действие; дисбактериозы; аллергические реакции; иммунодепрессивное действие; эндотоксический шок.Для
микроорганизмов: формирование атипичных форм микробов; формирование
антибиотикорезистентных и антибиотикозависимых форм микроорганизмов.
Способы получения антибиотиков.
Различают три возможных способа получения антибиотиков: биосинтез; химическая или биотехнологическая модификация природных антибиотиков и химический синтез. Основным путём получения большинства антибиотиков является биотехнологический способ. Антибиотики продуцируются
плесневыми грибами, актиномицетами, эубактериями и другими микроорганизмами.
Существует несколько вариантов биотехнологического получения природных и полусинтетических антибиотиков.
1. Прямая ферментация микроорганизма-продуцента с веществом, являющимся метаболическим предшественником получаемого антибиотика и
стимулирующим процесс его биосинтеза. Например, биосинтез бензилпенициллина ведут в присутствии фенилуксусной кислоты, макролидов – в присутствии пропионовой кислоты ипропилового спирта.
2. Использование для биосинтеза антибиотиков микроорганизмовмутантов, у которых блокированы определённые ферменты, участвующие в
синтезе антибиотика. Если в среду, содержащую такой микроорганизм ввести аналог предшественника антибиотика, то при этом можно получить модифицированный антибиотик. Мутационный биосинтез используется, например, для получения полусинтетических пенициллинов и цефалоспоринов.
Большинство антибиотиков получают при глубинной аэробной ферментации
периодического действия в асептических условиях.
Процесс биосинтеза антибиотиков состоит из двух этапов:
1. Накопление достаточного количества биомассы, которая выращивается на питательной среде для роста микроорганизмов. Высокая результативность этой стадии зависит от уровня биосинтетической активности продуцента, времени его максимального накопления, стоимости сред для культивирования организма.
2. Активный синтез антибиотика. На данном этапе ферментацию ведут
на продуктивной среде. Так как антибиотики являются вторичными метаболитами, их биосинтез происходит не в фазе роста клетки, а в стационарной
фазе (идиофазе). Любые механизмы, тормозящие пролиферацию и активный
рост, активируют процесс образования антибиотиков.
33
Завершающими этапами получения антибиотиков являются стадии выделения и очистки. Данные процессы определяются природой антибиотика,
характером производства и целями дальнейшего использования антибиотиков. Для выделения и очистки антибиотиков применяют следующие методы:
экстракция органическими растворителями; сорбция; осаждение и перекристаллизация из различных сред; ионообменная хроматография и др. Выделенные и очищенные антибиотики подвергают лиофильной и распылительной сушке.
Готовый антибиотик подвергается тщательному контролю: биологическому и фармакологическому. Расфасованный и упакованный препарат с
указанием биологической активности, даты выпуска и срока годности поступает в продажу. Выход антибиотиков обычно составляет несколько десятков
граммов на 1 л.
Витамины – это низкомолекулярные органические вещества, способные в очень низких концентрациях оказывать сильное и разнообразное
действие. Природным источником многих витаминов являются растения и
микроорганизмы. В настоящее время в производстве многих витаминов ведущие позиции принадлежат химическому синтезу, однако при производстве
отдельных витаминов микробный синтез имеет огромное значение, например
при производстве кормовых препаратов витаминов. Витамины принимают
активное участие во многих процессах метаболизма человека и высших животных (процессы цикла трикарбоновых кислот, распад и синтез жирных кислот, синтез аминокислот и др.), оказывая влияние на разнообразные физиологические процессы.
В группе витаминов различают собственно витамины, т. е. вещества,
в отсутствие которых развиваются специфические авитаминозы, и витаминоподобные вещества (В15, U, H1 и др.), которые проявляют благоприятный
эффект на процессы обмена веществ, особенно в экстремальных условиях.
Витамины делят на две группы: водорастворимые (витамины В1, В2, РР,
В6, В12 Вз, фолиевая кислота, витамин С) и жирорастворимые (витамины А,
D, Е, К).
В ряде продуктов содержатся провитамины, т. е. соединения, из которых в организме образуются витамины. К ним относятся каротины, расцепляющиеся в ряде тканей с образованием ретинола (витамина А), некоторые
стерины (эргостеролы, 7-дегидрохолестерин и др.), превращающиеся в витамин D под влиянием ультрафиолетовых лучей.
Дефицит какого-либо витамина субъективно вначале неощутим. Возникающие нарушения обмена веществ на первых порах не проявляются во
внешних признаках. Однако постепенно развивающиеся гиповитаминозы в
дальнейшем могут привести к необратимым патологическим состояниям —
авитаминозам. В сравнительно редких случаях могут развиваться гипервитаминозы. Они связаны с приемом витаминов в дозах, существенно превышающих физиологические нормы (например, при передозировке витаминов
34
А и D, которые применяют у детей для профилактики рахита и нарушений
роста).
Получение витаминов и их применение
С помощью микробного синтеза в настоящее время получают некоторые витамины группы В: В1 2 , В2 , каротиноиды, витамин D и другие.
Витамин
В 1 2 (цианкобаламин) получают
микробиологическим
способом путем культивирования Propionobacteriumи Pseudomonas (P.
denitrificans)в анаэробных условиях, в периодическом режиме.
Концентрат витамина В12 предназначен для обогащения кормов
животных. Для обогащения кисломолочных продуктов витамином В 12
используют пропионовокислые бактерии, как в чистом виде, так и в виде
концентрата, приготовленного на молочной сыворотке.
Витамин В 2 (рибофлавин) можно в небольших количествах выделять
из природного сырья. Наиболее активными продуцентами витамина В2 являются дрожжеподобные грибы рода Eremothecium(эремофекиум) или штаммы бактерий Candida guilliermondii, Ashbyii gossypii, способные накапливать
в культуральной среде 0,5 и более 1г целевого продукта. Культивирование
проводят глубинным способом при хорошей аэрации. Максимальное накопление витамина происходит вместе с максимумом накопления биомассы на
2-е сутки, причем синтез рибофлавина начинается лишь после фазы интенсивной ассимиляции сахара. Сухой продукт с остаточной влажностью 8 %,
содержащий 1,5–2,5% рибофлавина, 20% белка, тиамина, никотиновую кислоту, пиридоксин, цианкобаламин, микроэлементы и другие вещества, рекомендуют для кормления животных.
Витамином В2 обогащают некоторые сорта белого хлеба, его
используют для окраски пищевых продуктов в оранжево-желтый цвет.
Каротиноиды – это предшественники витамина А, среди которых
наиболее активен -каротин. В промышленности -каротин чаще всего
получают с помощью микроскопического гриба рода Blakeslea (блакеслеа).
Культивирование проводят и поверхностным, и глубинным способами на
питательных средах сложного состава. Во время ферментации среду
интенсивно
аэрируют.
Образование
каротиноидов
в
культуре
микроорганизмов не идет параллельно с образованием биомассы.
Интенсивный синтез каротиноидов начинается, когда в среде использован
весь азот, а рост культуры уменьшается. В качестве стимуляторов в
питательные среды добавляют экстракты цитрусовых и дрожжей.
-каротин используют при изготовлении пищевых продуктов как
краситель. Его применяют при производстве колбас, леденцов, пищевых
паст, кексов и других кондитерских изделий. Кроме того, -каротин обладает
антиокислительными свойствами, которые используются для продления
срока хранения продукта.
Витамин С– группа соединений – производных L-(+)-гулоновой
кислоты. Основными способами получения данного витамина является
выделения из растительного сырья, химический синтез из Д-глюкозы через
35
Д-сорбит, биотехнологический способ (по сути, представляет собой
комбинированный химико-ферментативный процесс).
Биологическая стадия процесса катализируется мембраносвязанной
полиолдегидрогеназой, а химическая включает последовательно следующие
этапы: конденсация сорбозы с диацетоном и получение диацетон-L-сорбозы,
окисление диацетон-L-сорбозы до диацетон-2-кето-L-гулоновой кислоты,
подвергаемой затем гидролизу с получением 2-кето-L-гулоновой кислоты;
последнюю подвергают энолизации с последующей трансформацией в Lаскорбиновую кислоту. Ферментацию бактерий проводят в периодическом
или непрерывном режиме. Принципиально доказана возможность получения
L-сорбозы из сорбита с помощью иммобилизованных клеток в
полиакриламидном геле.
Аскорбиновую кислоту используют как антиоксидант в медицине и
пищевой промышленности.
Витамин D (кальцеферол) – группа родственных соединений,
обладающих антирахитичным действием, в основе которых находится
эргостерин,
обнаруженный
в
клеточных
мембранах
эукариот.
Промышленными продуцентами эргостерина являются дрожжи и
мицелиальные грибы – аспергиллы и пенициллы, в которых содержится 1,2 –
2,2 % эргостерина. Получение эргостерина в производственных условиях
можно подразделить на следующие этапы: размножения исходной культуры
и накопление инокулята, ферментация, сепарирование клеток, облучение
клеток ультрафиолетовыми лучами, высушивание и упаковка целевого
продукта. Облученные сухие дрожжи применяют в животноводстве; в
промышленности их выпускают под названием «кормовые гидролизные
дрожжи, обогащенные витамином D2». В таком препарате содержится не
менее 46 % сырого белка, незаменимые аминокислоты (лизин, метионин,
триптофан) и 5000 МЕ витамина D2.
6. Задание для текущего контроля
Вопросы по теме занятия:
1. Антибиотики. Характеристика. Классификация.
2. Основные факторы, приводящие к устойчивости микроорганизмов
к антибиотикам.
3. Способы получения антибиотиков.
4. Продуценты некоторых антибиотиков
5. Механизм действия антибиотиков на микроорганизмы.
6. Витамины: определение, классификация, отличие от витаминоподобных веществ.
7. Гиповитаминозы, авитаминозы, гипервитаминозы, причины их возникновения.
8. Способы получения витаминов.
9. Номенклатура витаминов.
36
Занятие № 6
1. Тема. Нормофлора. Пробиотики в фармации
2. Продолжительность занятия – 4 часа
3. Цель занятия:
Изучить общие проблемы микроэкологии человека, основные причины
дисбактериоза. Нормофлоры в борьбе с дисбактериозом.
3.1. Целевые задачи:
В итоге занятия обучающийся (аспирант) должен знать:
- Факторы, влияющие на состояние нормальной микрофлоры.
- Биообъекты, используемые при производстве нормофлоров.
- Препараты пробиотиков, используемые для лечения дисбактериоза.
В итоге занятия обучающийся (аспирант) должен уметь:
- Готовить среды для учета молочнокислых бактерий и разливать их в
чашки Петри.
- Осуществлять титрование культур молочнокислых бактерий.
4. Выполнить следующие задания:
1.Определить концентрацию жизнеспособных клеток лактобацилл и
бифидобактерий.
2. Определить активную и титруемую кислотность лактобактерина.
5. Информационные материалы.
Нормальная микрофлора (нормофлора) - это совокупность множества микробиоценозов, характеризующихся определенными взимосвязями и
местом обитания. Нормофлора формируется с рождения, заселение ее бактериями продолжается в течение всей жизни. При этом качественный и количественный состав нормальной микрофлоры регулируется сложными антагонистическими и синергическими отношениями между отдельными ее представителями в составе биоценозов. В норме многие ткани и органы здорового
человека стерильны, в частности кровь, ликвор, суставная жидкость, плевральная жидкость, лимфа грудного протока, внутренние органы. Стерильность обеспечивается неспецифическими клеточными и гуморальными факторами иммунитета, препятствующими проникновению микробов в эти ткани и органы. На всех открытых поверхностях и во всех открытых полостях
формируется относительно стойкая микрофлора, специфичная для данного
органа, биотипа или его участка.
Наибольшей обсемененностью характеризуются:
1) толстый кишечник. В составе нормальной микрофлоры преобладают
анаэробные бактерии (96-99%), аэробные и факультативно-анаэробные бактерии;
2) ротовая полость. Представители ротовой полости делятся на три категории: стрептококки, нейссерии, вейлонеллы; стафилококки, лактобактерии, нитевидные бактерии; дрожжеподобные грибы;
37
3) мочевыделительная система. Нормальная микрофлора наружной
части уретры у мужчин и женщин представлена коринебактериями, микобактериями, грамотрицательными бактериями фекального происхождения и неспорообразующими анаэробами (пептококки, пептострептококки, бактероиды).
4) верхние дыхательные пути. Собственная микрофлора носа состоит
из коринебактерий, нейссерий, коагулазоотрицательных стафилококков, гемолитических стрептококков. Микрофлора зева более разнообразна из-за
смешивания микрофлоры полости рта и воздухоносных путей. В верхних
дыхательных путях преобладают стрептококки и нейссерии, встречаются
стафилококки, дифтероиды, гемофильные бактерии, пневмококки, микоплазмы, бактероиды;
5) кожа, особенно ее волосистая часть. В связи с постоянным контактом с внешней средой кожа является местом обитания транзиторных микроорганизмов, имея при этом постоянную микрофлору. Состав резидентной
микрофлоры кожи и слизистых оболочек характеризуется наличием
Staphylococcusepidermis,
S.
aureus,
Micrococcusspp.,
Sarciniaspp.,
Propionibacteriumspp., коринеформными бактериями.
Существует два вида нормальной микрофлоры:
1) резидентная - постоянная, характерная для данного вида и обнаруживается в определенных местах тела человека, при этом важным фактором
является его возраст;
2) транзиторная - временно попавшая, не характерная для данного биотопа; она активно не размножается, поэтому, хотя видовой состав транзиторных микроорганизмов и разнообразен, но они не являются многочисленными
и не обитают постоянно на поверхностях тела человека.
Функции нормальной микрофлоры.
Нормальная микрофлора рассматривается как самостоятельный экстракорпоральный орган с определенной анатомической структурой и следующими функциями:
1. Антагонистическая функция. Нормальная микрофлора обеспечивает
устойчивость соответствующих участков тела к заселению случайной, в том
числе и патогенной, микрофлорой.
2. Иммуногенная функция. Бактерии, являющиеся представителями
номофлоры, постоянно поддерживают иммунную систему в должном состоянии своими антигенами.
3. Пищеварительная функция. Нормальная микрофлора принимает участие в полостном пищеварении за счет своих ферментов.
4. Метаболическая функция. Нормофлора участвует в обмене белков,
липидов, уратов, оксалатов, стероидных гормонов, холестерина за счет свих
ферментов.
5. Витаминообразующая функция. В процессе метаболизма отдельные
представители нормальной микрофлоры образуют витамины.
38
6. Детоксикационная функция. Нормальная микрофлора обезвреживает
образующиеся в организме токсические продукты обмена веществ или организмы, попавшие из внешней среды.
7. Регуляторная функция. Нормальная микрофлора участвует в регуляции газового, водно-солевого обмена, поддержания рН среды.
8. Генетическая функция. Нормофлора является неограниченным банком генетического материала.
Любые количественные или качественные изменения состава нормальной микрофлоры человека, возникающие в результате воздействия на макроили микроорганизм различных неблагоприятных факторов приводят в дисбактериозу.
Факторы, приводящие к развитию дисбактериоза человека, можно
условно разделить на две группы: экзогенные: неадекватное питание; воздействие ксенобиотиков; избыточное ультрафиолетовое облучение; лечение антибактериальными препаратами; злоупотребление алкоголем; физический и
эмоциональный стресс; резкая смена климатических поясов; жизнь в экстремальных условиях. Эндогенные: здоровье матери во время беременности;
иммунодефицитные состояния различного происхождения; хронические воспалительные заболевания ЖКТ, особенно с секреторной недостаточностью;
тяжелые хронические инфекции; заболевания обмена веществ, в том числе
сахарный диабет; онкологические заболевания; оперативные вмешательства;
бактериальные инфекции, пищевые токсикоинфекции, гельминтозы и т. д.
В случае развития дисбактериоза кишечника у больного могу развиваться следующие клинические синдромы и патологические состояния: диарея, запоры, колиты; гастриты, дуодениты, язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки; ревматоидный артрит, болезни суставов и соединительной ткани; злокачественные опухоли желудка, толстой кишки, груди и
др.
Бифидобактерии являются основными представителями нормофлоры
кишечника человека и это - единственный вид, у которого не выявлено патогенных для человека свойств. Поэтому бифидобактерии в настоящее время
являются наиболее предпочтительным микроорганизмом нормальной микрофлоры, с использованием которого создаются пробиотики и продукты питания лечебно-профилактического назначения.
В настоящее время описано более 10 видов бифидобактерий, различающихся между собой по биохимическим, физиологическим и серологическим признакам: В. bifidum, B. adolescentis, В. infantis, B. breve, B. longum, B.
pseudo33 longum, B. thermophilum, B. suis, B. asteroides, B. coryneforme, B.
indisum, B. Lactentis - более 500 штаммов этих микроорганизмов.
Штаммы микроорганизмов должны:
- быть непатогенным и нетоксичным;
- обладать способностью к выживанию и жизнедеятельности в условиях кишечного микроокружения, т.е. выдерживать низкие значения рН;
39
- обладать высокой антагонистический активностью по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам;
- обладать устойчивостью (по возможности) к антибиотикам;
- быть толерантным к другим представителям нормофлоры человека;
- обладать высокой адгезивной способностью;
- охранять жизнеспособность в течение длительного времени;
- присутствовать в микробиоценозе человека всех возрастов.
Промышленный штамм должен отвечать следующим требованиям:
1. Должны быть изолированы из организма тех видов животных и человека, для которых они и будут предназначены.
2. Должны обладать полезным воздействием на организм хозяина, подтвержденным лабораторными исследованиями и клиническими наблюдениями;
3. При введении в больших количествах они должны обладать минимальной способностью к транслокации из просвета пищеварительного тракта
во внутреннюю среду макроорганизма; при длительном использовании они
не должны вызывать побочные эффекты
4. Должны обладать колонизационным потенциалом (быть устойчивыми к низким значениям рН, желчным кислотам, антимикробным субстанциям, продуцируемым индигенной микрофлорой; хорошо адгезироваться к
эпителию соответствующих слизистых оболочек.
5. Должны обладать стабильными характеристиками как в клиническом, так и в технологическом плане.
6. Должны обладать высокой скоростью роста и размножения в условиях, близким таковым в кишечном тракте.
7. Должны иметь четкую физиолого - биохимическую и генетическую
маркировку как для исключения фальсификации, так и для периодического
контроля идентичности исходных пробиотических штаммов и производственных культур в процессе их эксплуатации.
Известно, что действие пробиотиков направлено на создание временного искусственного микробиоценоза в кишечнике, во время существования
которого создаются условия для активизации собственной микрофлоры. Поэтому очень важно, чтобы пробиотик содержал в своем составе штаммы, обладающие высокой антагонистической активностью по отношению к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам (продукция бактериоцинов),
быстро размножался в кишечнике, т.е. имел хорошую скорость роста, и быстро закислял его содержимое.
Для коррекции дисбактериоза необходимо использовать препараты
нормофлоров. Существующие на сегодняшний день средства, активно
влияющие на микробиоценозы человека, условно можно подразделить на 5
групп:
1. Пробиотики;
2. Пребиотики;
40
3. Симбиотики;
4. Бактерийные препараты, обладающие селективной антагонистической активностью;
5. Продукты питания с пробиотиками.
1. Пробиотики- препараты микробного происхождения, проявляющие
свои позитивные свойства на мaкpоoрганизм через регуляцию кишечной
микрофлоры. Очень часто для обозначения этой группы препаратов используется термин-синоним эубиотики.
При этом каждая группа в свою очередь делится на подгруппы.
Пробиотики:

монокомпонентные, содержащие живые бактерии, относящиеся к
представителям нормальных симбионтов (бифидобактерии, лактобактерии,
кишечные палочки, пропионовокислые бактерии и др.), или самоэлиминирующие антагонисты (Bacillussubtilis, Bacilluscoagulans, B. licheniformis,
Saccharomycesboulardii). К указанным препаратам относятся бифидумбактерин, лактобактерин, колибактсрин, жидкий концентрат бифидобактерий, энтерол, бактисубтил, биоспорин, споробактерин, бактиспорин, биобактон,
биофлор, нутралин;

поликомпонентные - состоящие из нескольких микроорганизмов:
бифилонг
(Bifidobacteriumbifidum
и
В.longum),
ацилакт
(Lactobacillusacidophilus - 3 разных штамма 100 АШ, NK1, КЗ, Ш24), линекс
(L. acidophilus, B.bifidum, Enterococcusfaecalis}, биоспорин (В. subtilis, B.
licheniformis), бифиформ (В. longum, Enterососсusfaecium), ацидофилюс (L
.acidophilus,
L.
bulgaricum,
Streptococcusthermophilus),
бифидин
(Bifidobacteriumadolescentis и Escherichiacoli), бифинорм (B. bifidum, B.
adolescentis, B. longum);

комбинированные - бифидумбактерин-форте, состоящий из В.
bifidum, адсорбированных на активированном угле в виде микроколоний; кипацид, содержащий L. acidophilus и комплексный иммуноглобулин; бифилиз,
включающий B.bifidum и лизоцим; аципол, содержащий L. Acidophilus и полисахарид кефирных грибков;

рекомбинатные или генноинженерные - субалин, который представляет собой штамм В. subtilis, несущий клонированные гены, контролирующие синтез альфа-интерферона.
2. Пребиотики - препараты немикробного происхождения, способные
оказывать позитивный эффект на организм хозяина через селективную стимуляцию роста или активности нормальной микрофлоры кишечника.
Лактулоза - это синтетическая клетчатка, дисахарид, полученный из
лактозы. Лактулозу содержат: ЛактусанНормазе, Дюфалак, Лактофильтрум,
Полифан (медицинский лигнин), Хилак-форте, Пантотенат кальция, Памба
(парааминобензойная кислота), Эубикор
3. Симбиотики - препараты, полученные в результате рациональной
комбинации пробиотиков и пребиотиков. Симбиотикипредставлены на рынке только препаратами биовестин-лакто содержит 2 штамма бифидобактерий
41
В. bifidum 791 и В. adolescentis MC-42; мальтидофилюс содержит высушенные L.acidophilus,, L. bulgaricum, B. Bifidum и мальтодекстрин; бифидо-бак
комплекс из бифидо-, лактобактерий и фруктоолигосахаридов из топинамбура.
4. Бактерийные препараты, обладающие селективной антагонистической активностью. К данной группе бактерийных препаратов относятся бактериофаги: стафилококковый, клебсиеллезный поливалентный
очищенный, пиобактериофаг комбинированный жидкий, колипротейный
бактериофаг.
5. Продукты питания с пробиотиками
Все бифидосодержащие продукты можно разделить на три группы.
В первую входят продукты, обогащенные бифидобактериями. К подобным продуктам относятся бифидокефир, антацидный бифилакт, бифидомолоко, бифидойогурт, бифидомороженое, бифидосметана.
Вторая группа бифидосодержащих продуктов включает в себя продукты смешанного брожения, чаще всего сквашенные совместной культурой
бифидобактерий и молочнокислых микроорганизмов. Это напитки «Угличский», «Вита».
К третьей группе относятся продукты, сквашенные чистыми или смешанными культурами бифидобактерий, в производстве которых активизация
роста достигается обогащением молока бифидогенными факторами различной природы. Кроме того, могут использоваться штаммы бифидобактерий
адаптированные к молоку и способные расти в аэробных условиях. Среди таких продуктов - бифилин-М, кисломолочный бифидумбактерин.
Общая схема технологического процесса производства пробиотиков
1. Подготовка производственных помещений, оборудования, посуды,
персонала, вентиляционной системы - проводят в соответствии с требованиями инструкций, регламентирующих условия работы со стерильными лекарственными средствами.
2. Подготовка и стерилизация сред (концентрированной, производственной и защитной среды высушивания). Предварительные работы включают качественный подбор необходимых для данной культуры веществ;
3. Оценка влияния отдельных компонентов на выход целевого продукта;
4. Нахождение оптимального соотношения составляющих и удешевление сред.
5. Выращивание маточных (до 6 пассажей) и производственных культур.
Вначале выращивают маточную культуру из специального штамма при
температуре 370°С, используя различные питательные среды. Производственную культуру выращивают методом глубинного культивирования в реакторах, установленных в боксах. Реакторы оснащены магнитной мешалкой и
паровой рубашкой.
42
6. Розлив жидкого полуфабриката во флаконы. Розлив микробной суспензии в ампулы и флаконы проводят на аппаратах розлива и запайки ампул.
Заполненные ампулы и флаконы поступают на сублимацию.
7. Сублимационная сушка. Ампулы помещают в морозильные камеры
под углом 750°. Содержимое ампул замораживают при температуре - 400°С,
выдерживают при этой температуре 18-24ч, подвергая сублимации.
8. Укупорка. Ампулы с сухой микробной массой запаивают (флаконы
укупоривают) с газовой защитой.
9. Маркировка, упаковка. Ампулы маркируют и упаковывают в пачки
по 10штук.
10. Контроль качества готовой лекарственной формы.
6. Задание для текущего контроля
Вопросы по теме занятия:
1. Виды и функции нормальной микрофлоры (нормофлоры) человека.
2. Значение микрофлоры на организм человека
3. Факторы, влияющие на развитие дисбактериоза
4. Штаммы микроорганизмов, используемые для производства нормофлоров.
5. Требования, предъявляемые к штаммам микроорганизмов.
6. Характеристика препаратов для лечения дисбактериоза.
7. Общая схема технологического процесса производства пробиотиков.
8. Частная технология препаратов нормофлоры.
9. Питательные среды, используемые для выращивания молочнокислых
бактерий.
10. Параметры, контролируемые в процессе культивирования молочнокислых бактерий.
43
1. Задания для рубежного контроля
Вопрос №1
Биотехнология – это дисциплина, которая:
(a) использует биологические объекты для промышленного производства
полезных для человека и животных веществ и продуктов
(b) использует химические процессы для получения органических
соединений
(c) изучает химический состав биологических объектов
(d) изучает особенности протекания биохимических процессов в живых
клетках
Вопрос №2
В роли биообъектов могут выступать:
(a) растения, культивируемые в искусственных условиях
(b) продукты жизнедеятельности микроорганизмов
(c) клетки микро- и макроорганизмов и ферменты
(d) выращиваемые в особых стерильных условиях животные-гнотобионты
Вопрос №3
Под культурой клеток понимают:
(a) популяцию про- или эукариотических клеток, выращиваемых в
контролируемых условиях in vitro
(b) группу эукариотических клеток, выполняющих определенную функцию
(c) популяцию микроорганизмов, существующую на питательном субстрате
(d) популяцию клеток в естественной среде, продуцирующих ценные БАВ
Вопрос №4
При росте клеток на питательной среде в биотехнологии выделяют
следующие последовательные стадии:
(a) лог-фаза, идиофаза, стационарная фаза, фаза отмирания
(b) лаг-фаза, трофофаза
(c) лаг-фаза, фаза отмирания, лог-фаза
(d) трофофаза, идиофаза
Вопрос №5
Система GMP предъявляет требования к контролю качества
лекарственных средств:
(a) только на стадии непосредственно производства готовых продуктов
(b) только на стадии переработки сырья
(c) с начала переработки сырья до производства готовых продуктов
(d) на стадиях фасовки и упаковки готовых продуктов
44
Вопрос №6
Особенностью асептики на биотехнологическом производстве является
то, что это комплекс мер, направленных на:
(a) предотвращение попадания в среду любых микроорганизмов
(b) предотвращение попадания в среду только условно-патогенных и
патогенных микроорганизмов
(c) предотвращение попадания в среду посторонних микроорганизмов
(d) предотвращение попадания в среду сапрофитных микроорганизмов
Вопрос №7
Преимущество клеток микроорганизмов как биообъектов над клетками
животных и растений заключается в:
(a) наличии у них ферментных систем, необходимых для роста на
искусственных питательных средах
(b) повышенной чувствительности микроорганизмов к воздействию
механических, физических и химических факторов
(c) выраженной скорости протекания ферментативных реакций и
нарастания клеточной массы в единицу времени
(d) их способности продуцировать аналогичные БАВ, но в значительно
больших количествах
Вопрос №8
В качестве источника минерального азота в составе питательных сред
используется:
(a) зелёная патока
(b) кукурузная мука
(c) меласса
(d) соли аммония
Вопрос №9
По физическому состоянию питательные среды подразделяются на
следующие группы:
(a) жидкие, полужидкие, плотные, сыпучие
(b) твёрдые, мягкие, газообразные
(c) твёрдые, полутвёрдые, плотные
(d) сыпучие, полусыпучие, мягкие, твёрдые
Вопрос №10
Биореактор, используемый для наработки посевного материала,
называется:
(a) эрлифт
(b) барботёр
45
(c) инокулятор
(d) ферментёр
Вопрос №11
Правила GLP регламентируют:
(a) методы математической обработки данных
(b) методы математической обработки данных
(c) планирование поисковых работ
(d) набор тестов при предклинических испытаниях
Вопрос №12
Главный критерий отбора продуцента в качестве биообъекта:
(a) быстрое накопление биомассы
(b) секреция целевого продукта в культуральную жидкость
(c) устойчивость к заражению посторонней микрофлорой
(d) способность расти на дешевых питательных средах
(e) способность синтезировать целевой продукт
Вопрос №13
Ретроингибирование конечным продуктом при биосинтезе БАВ
заключается в подавлении:
(a) активности всех ферментов метаболической цепи
(b) активности последнего фермента метаболической цепи
(c) активности начального фермента метаболической цепи
(d) трансляции
(e) транскрипции
Вопрос №14
Индукция фермента – это:
(a) увеличение скорости синтеза фермента в ответ на появление индуктора
(b) уменьшение скорости синтеза фермента в ответ на появление индуктора
(c) уменьшение скорости разложения фермента в ответ на появление
индуктора
Вопрос №15
Трансляция ферментов синтеза метаболитов в клетке осуществляется
если:
(a) белок-репрессор связан индуктором
(b) белок-репрессор соединен с оператором
(c) белок-репрессор активирован корепрессором
46
Вопрос №16
Преимуществами генно-инженерного инсулина являются
(a) большая стабильность
(b) меньшая аллергенность
(c) высокая активность
(d) меньшая токсичность
Вопрос №17
Преимущество РИА инсулина перед определением инсулина по падению
концентрации глюкозы в крови животных:
(a) ненужность дефицитных реагентов
(b) продолжительность времени анализа
(c) в отсутствии влияния на результаты анализа других белков
(d) легкость освоения
Вопрос №18
Ослабление ограничений на использование в промышленности
микроорганизмов-рекомбинантов, продуцирующих гормоны человека,
стало возможным благодаря:
(a) совершенствованию методов изоляции генно-инженерных
рекомбинантов от окружающей среды
(b) повышению квалификации персонала, работающего с рекомбинантами
(c) экспериментальному подтверждению обязательной потери чужеродных
генов
(d) установленной экспериментально слабой жизнеспособности
рекомбинанта
Вопрос №19
Прямой перенос чужеродной ДНК в протопласты возможен с помощью:
(a) микроинъекции
(b) трансформации
(c) упаковки в липосомы
(d) культивирования протопластов на соответствующих питательных средах
Вопрос №20
Субстратами рестриктаз, используемых генным инженером, являются:
(a) нуклеиновые кислоты
(b) полисахариды
(c) липиды
(d) белки
47
Вопрос №21
«Ген-маркер» необходим в генетической инженерии:
(a) для отбора колоний, образуемых клетками, в которые проник вектор
(b) для включения "рабочего гена" в вектор
(c) для включения вектора в клетки хозяина
(d) для повышения стабильности вектора
Вопрос №22
Понятие «липкие концы» применительно к генетической инженерии
отражает:
(a) взаимодействие нуклеиновых кислот и гистонов
(b) комплементарность нуклеотидных последовательностей
(c) реагирование друг с другом SH-групп с образованием дисульфидных
связей
(d) гидрофобное взаимодействие липидов
Вопрос №23
Успехи генетической инженерии в области создания рекомбинантных
белков больше, чем в создании рекомбинантных антибиотиков Это
объясняется:
(a) трудностью подбора клеток хозяев для биосинтеза антибиотиков
(b) проблемами безопасности производственного процесса
(c) более простой структурой белков
(d) большим количеством структурных генов, включенных в биосинтез
антибиотиков
Вопрос №24
Ферменты лигазы используется в генетической инженерии поскольку:
(a) катализируют включение вектора в хромосому клеток реципиентов
(b) катализируют ковалентное связывание углеводно-фосфорной цепи ДНК
гена с ДНК вектора
(c) скрепляют вектор с оболочкой клетки реципиента
(d) катализируют замыкание пептидных мостиков в пептидогликане
клеточной стенки
Вопрос №25
Вектор на основе плазмиды предпочтительней вектора на основе
фаговой ДНК благодаря:
(a) отсутствия лизиса клетки хозяина
(b) меньшей токсичности
(c) лизису клетки хозяина
(d) большей частоты включения
48
Вопрос №26
Для получения протопластов из бактериальных клеток используется:
(a) папаин
(b) трипсин
(c) «улиточный фермент»
(d) лизоцим
Вопрос №27
Для протопластирования наиболее подходят суспензионные культуры в:
(a) стационарной фазе
(b) фазе замедленного роста
(c) логарифмической фазе
(d) лаг-фазе
Вопрос №28
Гибридизация протопластов возможна, если клетки исходных растений
обладают:
(a) видоспецифичностью
(b) совместимость не имеет существенного значения
(c) половой несовместимостью
(d) половой совместимостью
Вопрос №29
Прямой перенос чужеродной ДНК в протопласты возможен с помощью:
(a) гибридом
(b) трансформации
(c) культивирования протопластов на соответствующих питательных средах
(d) упаковки в липосомы
Вопрос №30
Изолированный протопласт растительной клетки не содержит:
(a) ядра
(b) аппарата Гольджи
(c) вакуолей
(d) целлюлозной стенки
49
Вопрос №31
Генетическая инженерия получила практическое применение после:
(a) установления первичной структуры ДНК
(b) завершения фундаментальных исследований по проекту «Геном
человека»
(c) открытие законов Менделя
(d) открытия информационной РНК
(e) формулирование молекулярной концепции гена
Вопрос №32
Транскрипция – это:
(a) введение последовательности оснований ДНК в компьютер для анализа
(b) процесс копирования генетической информации с ДНК на РНК
(c) обмен генетической информацией между двумя хромосомами в паре
хромосом
(d) синоним бинарного деления
Вопрос №33
Рестриктазы используются в технологии рекомбинантных ДНК,
поскольку:
(a) специфически расщепляют одноцепочечные участки нуклеиновых
кислот
(b) специфически расщепляют двухцепочечную ДНК по сайтам узнавания
(c) катализируют синтез нуклеотидной цепи из отдельных нуклеотидов
(d) катализируют ковалентное связывание углеводно-фосфорной цепи ДНКгена и ДНК-вектора
(e) катализируют синтез комплементарной ДНК на матрице РНК
Вопрос №34
Природная роль лигаз:
(a) интеграция генома ретровируса в виде ДНК в хромосомы клетки хозяина
(b) защита бактериальных клеток от инфицирования фагами
(c) воссоединение молекул ДНК бактерий после расщепления
(d) ограничение скрещивания между различными бактериальными видами и
штаммами
(e) соединение молекул ДНК бактерий и бактериофага
50
Вопрос №35
Последовательность нуклеотидов ДНК используется как исходный код
для производства полимеров:
(a) клеток
(b) аминокислот
(c) солей
(d) сахаров
Вопрос №36
Плазмиды – это:
(a) небольшие молекулы ДНК вне бактериальной хромосомы, которые
могут самостоятельно реплицироваться
(b) слабые вирусы, которые могут войти в клетку, но не могут ее убить
(c) белки, из которых строится бактериальная мембрана
(d) вирулентные вирусы, быстро убивающие бактериальную клетку
Вопрос №37
Гибридомы – это:
(a) генетически однородное потомство одной клетки
(b) клетки, лишенные клеточной оболочки
(c) клеточные линии, полученные от слияния нормальных лимфоцитов и
миеломных клеток
(d) клоновая культура, наследственная однородность которой
поддерживается =отбором по специфическим признакам
Вопрос №38
Моноклональные антитела получают в производстве:
(a) фракционированием лимфоцитов
(b) по гибридомной технологии
(c) фракционированием антител организма
(d) химико-ферментативным синтезом
(e) очисткой антител методом аффинной хроматографии
Вопрос №39
Трансгенный организм – это:
(a) организм с неполовой репликацией
(b) организм с необычным набором транспозонов в геноме
(c) организм, созданный методами генетической инженерии и способный
передавать новые гены своему потомству
(d) организм, в популяции которого много генетических вариантов
51
Вопрос №40
Функцией мРНК является:
(a) обеспечивает правильный фолдинг белков
(b) участвует в процессе обратной транскрипции в присутствии обратной
транскриптазы
(c) «редактирует» белки, обеспечивая правильную последовательность
аминокислот
(d) участвует в образовании тРНК, которая принимает участие в
образовании белка
52
2. Задания для промежуточной аттестации
1. История возникновения, становления и развития биотехнологии как
самостоятельной науки.
2. Объект и методы биотехнологии. Специфика использования биологического объекта.
3. Задачи современной биотехнологии, тенденции и перспективы ее
развития.
4. Предмет и задачи генетической инженерии. История возникновения
и развития методов работы с рекомбинантными ДНК.
5. Ферменты, используемые при создании рекомбинантных ДНК. Способы конструирования рекомбинантных ДНК.
6. Способы получения гена.
7. Прямые методы переноса чужеродной генетической информации в
клетки про- и эукариот.
8. Векторные молекулы ДНК. Требования, предъявляемые к векторам
для клонирования. Плазмидные векторы.
9. Векторы на основе бактериофагов. Гибридные векторы (космиды и
фазмиды).
10. Идентификация клеток-реципиентов, несущих ген-мишень. Методы, основанные на идентификации признака, кодируемого геном.
11. Ферментные препараты медицинского назначения.
12. По лучение инсулина генно-инженерными методами.
13. Получение гормона роста (соматотропина) человека путем комбинации методов химического синтеза ДНК и ферментативного синтеза кДНК.
14. Характеристика интерферонов, их применение и получение генноинженерными методами.
15. Характеристика интерлейкинов, их применение и получение генноинженерными методами.
16. Биологические датчики.
17. Подходы к конструированию генно-инженерных вакцин. Вакцины
первого, второго и третьего поколений.
18. Создание безопасных вакцин против вируса гепатита В.
19. Создание безопасных вакцин против вируса ящура.
20. Создание безопасных вакцин против вирусов полиомиелита, гриппа.
21. Подходы к конструированию вакцины против вируса иммунодефицита человека.
22. Задачи и проблемы генетической инженерии растений. Магистральные пути развития генетической инженерии растений.
23. Создание векторов для введения чужеродных генов в протопласты
растений. Векторы на основе плазмид бактерий, заражающих растения в естественных условиях.
53
24. Создание векторов на основе ДНК-содержащих вирусов растений.
Конструирование челночных векторов из прокариотических плазмид и фрагментов хлоропластных или митохондриальных ДНК растений.
25. Биологическая фиксация азота. Генно-инженерные работы в области биологической фиксации азота.
26. Пути повышения эффективности фотосинтетических систем генноинженерными методами.
27. Выведение растений с увеличенным содержанием незаменимых
аминокислот генно-инженерными методами.
28. Выведение растений устойчивых к неблагоприятным внешним факторам (рН почвы, ранние заморозки, засолению и т.д.) генно-инженерными
методами.
29. Выведение растений устойчивых к гербицидам (глифосату) генноинженерными методами.
30. Генная инженерия человека. Основные направления и перспективы
использования для терапии генетических заболеваний, для получения органов для трансплантации, для конструирования человека denovo.
31. Соматическая генная терапия как способ лечения, включающий генетические изменения клеток-мишеней. Векторные системы доставки и экспрессии терапевтических генов.
32. Трансгенные сельскохозяйственные животные. Принципиальные
возможности генетической инженерии в животноводстве. Методы получения
трансгенных животных.
33. Векторы, используемые в генетической инженерии животных (на
основе литических вирусов, ретровирусов).
34.Генно-инженерные работы с геном гормона роста животных. Получение животных с ускоренным ростом и увеличенной массой.
35. Главные направления генно-инженерных работ со структурными
белками молока. Получение фармакологических белков в молоке трансгенных животных.
36. Создание новых белков методами химической модификации белковой молекулы, сайт - направленного мутагенеза, молекулярной эволюции и
переноса отдельных доменов.
37. Применение белковой инженерии.
38. Основная терминология и история развития клеточной инженерии
растений и животных.
39. Виды культур клеток и питательные среды, используемые для культивирования.
40. Получение клеточных культур.
41. Методы культивирования клеток и тканей растений и животных.
42. Клонирование животных и растений.
43. Получение биологически-активных веществ из культивируемых
клеток и тканей.
54
44. Использование клеточных культур для оздоровления и сохранения
редких генофондов.
45. Получение моноклональных антител.
46. Практическое применение моноклональных антител.
47. Кинетика роста микроорганизмов в периодических и проточных
процессах.
48. Классификация ферментационных процессов.
49. Количественные параметры ферментационных процессов.
50. Значение углекислого газа в ферментационных процессах.
51. Классификация биореакторов по функциям и типу.
52. Принципы масштабирования в биотехнологическом производстве.
53. Сырье и среды для биотехнологических производств.
54. Выделение продукта в биотехнологических производствах.
55. Общая характеристика спиртового брожения. Физиологобиохимические основы брожения.
56. Общая морфофизиологическая характеристика дрожжей, используемых в промышленности.
57. Получение этилового спирта.
58. Общая характеристика пропионовокислого брожения.
59. Применение пропионовокислых бактерий.
60. Ацетонобутиловое брожение: биохимизм процесса брожения.
61.Среды и культуры бактерий, используемых в производстве ацетона
и бутанола.
62.Общая характеристика полисахаридов микроорганизмов.
63. Биосинтез полисахаридов.
64. Получение полисахаридов в промышленности.
65. Практическое применение полисахаридов.
55
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Основная литература:
1. Биотехнология. Учебное пособие: В 8-и кн. /Под. Ред. Егорова Н.С.,
Самуилова В.Д.-М.: Высш. шк.-1987.
2. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и
применение.-М.: Мир.-2002.
3. Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.А. Основы биотехнологии.-М.: Академия.-2003.
4. Орехов С.Н. Фармацевтическая биотехнология. Руководство к
практ. занятиям: учеб. пособие.- М.: ГЭОТАР-Медиа.- 2012.
Дополнительная литература:
1. Прищеп Т.П., Чучалин В.С., Зайков К.Л и др. Основы фармацевтической биотехнологии: Учебное пособие.- Ростов н/Д.: Феникс; Томск: Изд.
НТЛ, 2006.
2. Сазыкин Ю.О., Орехов С.Н., Чакалева И.И. Биотехнология.- М.: изд.
центр «Академия», 2006.
3. Егоров Н.С. Основы учения об антибиотиках. Учебник.-М.: Изд-во
МГУ, Наука.-2004.
56
Ответы на тесты для рубежного контроля
[1] a
[11] d
[21] a
[31] e
[2] c
[12] e
[22] b
[32] b
[3] a
[13] c
[23] d
[33] b
[4] d
[14] a
[24] b
[34] c
[5] c
[15] a
[25] a
[35] b
[6] c
[16] b
[26] d
[36] a
[7] c
[17] c
[27] c
[37] c
[8] d
[18] c
[28] b
[38] b
[9] a
[19] c
[29] d
[39] c
[10] c
[20] a
[30] d
[40] b
57
УЧЕБНОЕ ИЗДАНИЕ
Д.В. Компанцев, Л.Н. Савченко, Т.Ф. Маринина,
Т.Ю. Манджиголадзе, А.А. Чахирова
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
ПО ОСВОЕНИЮ ДИСЦИПЛИНЫ
«БИОТЕХНОЛОГИЯ »
Образовательная программа
«ТЕХНОЛОГИЯ ПОЛУЧЕНИЯ ЛЕКАРСТВ»
(подготовка научно-педагогических кадров)
НАПРАВЛЕНИЕ ПОДГОТОВКИ 33.06.01. ФАРМАЦИЯ
Технический редактор:
Подписано в печать ________________
Формат 60×84/16, бумага писчая белая. Усл. печ. л. ___
Уч. изд.л. ____. Тираж _____ экз. Заказ №___________
Пятигорский медико-фармацевтический институт
- филиал ГБОУ ВПО ВолгГМУ Минздрава Российской Федерации, 357532, г.
Пятигорск, пр. Калинина, 11
58