Л.Е. Иваченко, ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ
advertisement
ISSN 0202-5493.МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып.1 (150), 2012 _________________________________________________ ________________________________________________________________________________________ Л.Е. Иваченко, кандидат биологических наук Благовещенский ГПУ, г. Благовещенск Амурская область, ул. Ленина, 104 Факс: (4162) 42-41-64, тел.: 8914-56-34-100 е-mail: ivachenko-rog@yandex.ru ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКИХ СПЕКТРОВ ФЕРМЕНТОВ ДИКОРАСТУЩЕЙ СОИ КАК МАРКЕРОВ ПРОЦЕССА БИОХИМИЧЕСКОЙ АДАПТАЦИИ К УСЛОВИЯМ ВЫРАЩИВАНИЯ Ключевые слова: дикорастущая соя, семена, метеорологические условия, ферменты, электрофорез, адаптация УДК 577.15(571.61) В связи с интенсивным развитием науки возникла острая необходимость внедрения результатов фундаментальных исследований в производство. Особого внимания требует модернизация агропромышленного комплекса. Современная биология благодаря обнаружению качественных биохимических признаков организма, подчиняющихся законам наследственности, способна расширить горизонты генетической изменчивости. Такой подход стал возможен прежде всего благодаря изучению генетического полиморфизма. Основу этих работ составляют электрофоретические и другие биохимические методы фракционирования биополимеров [1]. Открытие значительного полиморфизма макромолекул, в первую очередь белков, привело к возникновению качественно новых возможностей для изучения генетических процессов в популяциях и решения, на новом уровне, ряда задач животноводства, семеноводства и селекции [6]. В настоящее время белки широко используются не только в качестве маркеров соответствующих генов, но также для маркирования полигенных систем как на уровне особи, так и на уровне сорта, вида и популяции [7; 12]. Знания разнообразия и закономерностей наследования различных форм ферментов или функционально сходных неферментативных белков расширили возможности идентификации сортов, форм гибридов по генотипу. Появилась возможность выяснения адаптивной и селекционной ценности генетических факторов, до сих пор не контролируемых, и целенаправленного использования их в селекционном процессе. Не менее важна задача маркирования геномов сельскохозяйственных растений [9]. Изоферментный анализ как наиболее доступный и общепризнанный метод позволяет модифицировать и расширять традиционные методы, основанные на использовании классических генетических маркеров. По целому ряду достоинств изоферментные маркерные системы являются идеальной генетической основой для решения практических ……………………………………………… задач селекции и семеноводства [12]. Изучение полиморфизма по ферментным локусам у различных видов растений показало, что уровень генетической изменчивости является такой же видовой характеристикой, как форма цветка [2]. Дифференциация и идентификация растительного материала по спектрам зимограмм семян и проростков может служить дополнением к традиционной оценке сортовой принадлежности по морфологическим признакам взрослых растений [15]. Экологическая селекция – одно из актуальных направлений биологических исследований. Приоритетным при этом является селекция на адаптивность. Успешное решение практических задач селекции на стабильную урожайность возможно при знании генетических основ адаптивных реакций [10], т.к. фенотипическое выражение любого признака – результат сложного взаимодействия между генотипом и средой [11]. Изучение полиморфизма белков сои за рубежом началось более полувека назад. Накопленный в этой области фактический материал в нашей стране ранее не подвергался разностороннему обобщению и систематизации. Разрозненные работы отражают только генетико-биохимическое направление изучения изоферментов сои. В настоящее время интерес к изучению множественных форм ферментов определяется их важной ролью в регуляции обменных процессов, способной служить тонким инструментом настройки «клеточной машины» в изменяющихся условиях среды [14]. В последнее время особое внимание уделяется изучению генома сои, которая является альтернативным источником белка. Амурская область является идеальным регионом для производства сои, так как имеет соответствующие агроклиматические условия, где находится северный ареал произрастания дикорастущей сои. Изучение полиморфизма изоферментных спектров различных ферментных систем среди рода Glycine выявил недостаточную разработанность этого направления исследований. Актуальность использования изоферментного анализа для изучения сои связана также со слабой генетической изученностью наших отечественных сортов, выращиваемых на Дальнем Востоке. Существенный пробел в изучении множественных форм ферментов сои заключается в дефиците сведений об их функциональной роли в процессе адаптации. Для решения этой проблемы необходимо наличие каталога электрофоретических спектров ферментов линий дикорастущей сои, выращенных в условиях Амурской области. Поэтому целью работы явилось изучение влияния условий среды на изменчивость электрофоретических спектров ферментов дикорастущей сои. Материалом для исследований служили шесть образцов дикорастущей сои, полученные из трех агроклиматических зон Амурской области (КА – Архаринский район, южная зона, КБ – Белогорский район, центральная зона, КЗ – Зейский район, северная зона). Сою выращивали в культуре в 2000-2002 гг. на опытном поле Всероссийского научно-исследовательского института сои в п. Садовом Тамбовского района Амурской области. Для получения экстрактов белков семян сои навеску материала (500 мг) гомогенизировали в фарфоровой ступке в течение 15 мин при охлаждении. Растворимые белки экстрагировали 0,15 М NaCI. Полученные экстракты центрифугировали при 3000 оборотов в минуту в течение 15 мин. Осадок отбрасывали, а надосадочную жидкость фильтровали через слой мельничного газа для удаления липидной пленки и использовали для анализа. Электрофоретические спектры исследуемых ферментов выявляли методом энзим-электрофореза в ПААГ на колонках 7,5 % полиакриламидного геля при температуре + 4 оС по Дэвису [13]. Окрашивание на геле зон с ферментативной активностью проводили соответствующими гистохимическими методами [3; 8]. Вегетационные периоды в годы исследований имели некоторые отличия от среднемноголетних по температурному режиму и количеству осадков. В 2000 г. в период вегетации стояла жаркая погода. Недостаток влаги отмечался в течение всего вегетационного периода, и только в июле преобладала прохладная погода с обильным выпадением осадков (на 18 % выше нормы), что сказалось на развитии сои. Позднее наступление заморозков позволило растениям сформировать физиологически зрелые семена. 2001 г. по температурным условиям соответствовал среднемноголетним данным, но дефицит влаги в течение всего периода вегетации сои был основным лимитирующим фактором для формирования урожая. Вегетационный период 2002 г. был благоприятным для роста и развития сои по сравнению с предыдущими годами и соответствовал среднемноголетним данным. При изучении влияния условий выращивания на электрофоретические спектры ферментов в семенах дикорастущей сои, выращенных в условиях 2000-2002 гг., отмечена низкая гетерогенность по сравнению с культурной соей [4; 5]. В семенах дикорастущей сои за годы исследования установлены 8 форм каталазы. Значительный интерес вызвало то, что в 2000 г. в семенах дикорастущей сои сортообразцов из Архаринского района и КБ-104 была выявлена дополнительная форма К1*, которая отсутствовала в семенах культурной сои (рис. 1А). В этом же году в семенах сои выявлена высокая гетерогенность фермента, что соответствует его высокой активности. В условиях 2001 и 2002 гг. выявлена стабильность каталазы в семенах дикорастущей сои. В эти годы активными были две формы фермента во всех исследуемых образцах. В семенах всех изученных сортообразцов дикорастущей сои обнаружено 12 форм пероксидазы. Причем, для каждого сортообразца за годы исследований установлено от шести до восьми форм этого фермента (рис. 1.Б), в то время как по годам выявлено от одной до пяти форм пероксидазы. В условиях 2000-2001 гг. пероксидаза в семенах дикорастущей сои отличалась высокой гетерогенностью, что соответствовало низкой активности этого фермента за годы исследований. В 2000 г. было выяв- лено 9, в 2001 г. – 8 форм пероксидазы (рис. 1Б). В 2002 г. во всех исследуемых сортообразцах выявлена только одна форма пероксидазы со средней электрофоретической подвижностью. Невысокая гетерогенность фермента дикорастущей сои соотносится с ранее установленной высокой его активностью в семенах сои. Следует отметить, что вегетационный период 2002 г. практически соответствовал среднемноголетним данным. Таким образом, установлено, что активность и множественные формы пероксидазы и каталазы взаимокомпенсируются, что соответствует ранее установленной зависимости для культурной сои [4]. Рисунок 1 – Электрофоретические спектры каталазы (А), пероксидазы (Б) в семенах сортообразцов дикорастущей сои (1 – КА1344, 2 – КА-1388, 3 – КБ-104, 4 – КБ-49, 5 – КЗ-6316, 6 – КЗ-6359), выращенных в условиях 2000 (а), 2001 (б) и 2002 (в) годов В семенах дикорастущей сои выявлено 12 форм кислой фосфатазы (рис. 2А). Наибольшей гетерогенностью кислой фосфатазы отличились семена сои, выращенные в условиях 2000 г. В сложном по метеоусловиям 2001 г. в семенах сои вы- явлена наименьшая гетерогенность фермента. Видимо, недостаток влаги не вызвал увеличения форм кислой фосфатазы. Во всех исследуемых сортообразцах обнаружено 6 форм фермента, обладающих различной электрофоретической подвижностью. Рисунок 2 – Электрофоретические спектры кислой фосфатазы (А), эстеразного (Б) и амилазного комплексов (В) в семенах сортообразцов дикой сои (1 – КА-1344, 2 – КА-1388, 3 – КБ-104, 4 – КБ-49, 5 – КЗ-6316, 6 – КЗ-6359), выращенных в условиях 2000 (а), 2001 (б) и 2002 (в) годов У семян сои, выращенных в условиях 2002 г., который по метеоусловиям мало отличался от среднемноголетних данных, выявлена высокая стабильность форм кислой фосфатазы. Все изученные линии дикорастущей сои имели по 4 формы фермента. Эстеразный комплекс представлен в семенах дикой сои 12 формами. Ранее установлено, что в 2000 г. в условиях по- вышенных температур наблюдалась высокая активность этого фермента. В этом году выявлено максимальное количество форм – 11 (рис. 2Б). В 2001 г. установлены всего четыре формы эстеразного комплекса. Во всех сортообразцах обнаружена форма с высокой электрофоретической подвижностью, причем в линиях, где обнаружены минорные формы, установлена невысокая активность эстеразного комплекса. В 2002 г. в семенах дикорастущей сои установлено 10 форм фермента. Более высокой гетерогенностью отличились сортообразцы из южной агроклиматической зоны, в семенах которых выявлено 4-5 форм. В семенах дикорастущей сои в 20002002 гг. из десяти форм амилазного комплекса выявлено всего 9 форм (рис. 2В). В условиях 2000 г. (из-за недостатка семян сои для анализа) проанализированными оказались только сортообразцы КБ49, КЗ-6316 и КЗ-6359, для которых характерными оказались две формы амилазного комплекса. В 2001 г. в шести сортообразцах дикорастущей сои выявлено две формы фермента. В условиях 2002 г. в семенах дикорастущей сои проявилось максимальное количество форм амилазного комплекса – восемь. В результате исследования установлено, что сортообразец КБ-104 отличился повышенной гетерогенностью каталазы, кислой фосфатазы, эстеразного комплекса и меньшей – пероксидазы. Поэтому сортообразец КБ-104 можно рекомендовать селекционерам для выведения новых устойчивых сортов сои. Таким образом, изучение электрофоретических спектров пероксидазы, каталазы, кислой фосфатазы эстеразного и амилазного комплексов в семенах дикорастущей сои в течение трех лет показало значительные различия в их выражении в зависимости от метеорологических условий года выращивания. В семенах дикорастущей сои в условиях жаркого лета 2000 г. выявлена значительная гетерогенность пероксидазы, кислой фосфатазы и эстеразного комплекса. Для каталазы в этом году установлена дополнительная редко встречающаяся более высокопод- вижная форма К1*. В семенах дикорастущей сои в 2002 г., выявлена только одна форма пероксидазы, обладающая очень высокой активностью, что видимо, связано с наиболее благоприятными условиями произрастания по сравнению с предыдущими годами. Электрофоретические спектры кислой фосфатазы значительно меняются в зависимости от года выращивания. Причѐм наименьшее количество спектров выявлено в менее благоприятном по условиям выращивания 2001 г. В этом же году установлена самая высокая гетерогенность амилазного комплекса. Очевидно, что недостаток влаги значительно влияет на гетерогенность кислой фосфатазы и амилазного комплекса, а высокая температура – на активность пероксидазы и эстеразного комплекса. Изменение состава электрофоретических спектров ферментов сои является показателем степени стрессорного воздействия характеризующего высокую адаптивность сортов сои к условиям выращивания. Изменение количественного состава форм ферментов свидетельствует о качественной стратегии биохимической адаптации растений, степень которой зависит от концентрации стрессора. Внедрение современных методов исследования для изучения генома сои позволит быстро проанализировать и отобрать селекционный материал, более устойчивый к стрессовым условиям. Список литературы 1. Алтухов, Ю.П. Генетические процессы в популяциях: Учеб. пособие. 3-е изд., перераб. и доп. / Ю.П. Алтухов. – М.: ИКЦ Академкнига, 2003. – 431 с. 2. Глазко, В.И. Генетика изоферментов животных и растений / Под ред. А.А. Созинова / В.И. Глазко, А.В. Созинов. – Киев: Урожай, 1993. – 528 с. 3. Иваченко, Л.Е. Методы изучения полиморфизма ферментов сои / Л.Е. Иваченко [и др.]. – Благовещенск: Изд-во БГПУ, 2008. – 142 с. 4. Иваченко, Л.Е. Ферменты сои: монография / Л.Е. Иваченко. – Благовещенск: Изд-во БГПУ, 2010. – 214 с. 5. Иваченко, Л.Е. Характеристика электрофоретических спектров ферментов как маркеров сортов сои / Л.Е. Иваченко, И.В. Егорова, Н.Д. Фоменко // Материалы Междунар. науч. конф. Фундаментальные исследования, Израиль, 1017 апреля 2010г. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований. – 2010. – № 5. – С. 65-69. 6. Календарь, Р.Н. Типы молекулярно-генетических маркеров и их применение / Р.Н. Календарь, В.И. Глазко // Физиология и биохимия культурных растений. – 2002. – Т. 34. – № 4. – С. 279 -296. 7. Конарев, В.Г. Белки растений как генетические маркеры / В.Г. Конарев. – М.: Колос, 1983. – 320 с. 8. Левитес, Е.В. Генетика изоферментов растений / Е.В. Левитес. Новосибирск: Наука, 1986. – 145 с. 9. Нецветаев, В.П. Теоретические основы использования белкового полиморфизма для оптимизации селекционного процесса / В.П. Нецветаев // Автореф. дис. …д-ра биол. наук. – СПб.: ВИР, 2000. – 49 с. 10. Пивоваров, В.Ф. Актуальные направления экологических исследований в селекции и семеноводстве овощных культур / В.Ф. Пивоваров, Е.Г. Дробутская // Приоритетные направления в селекции и семеноводстве с.-х. растений в ХХI в.: сб. науч. тр. междунар. науч.-практ. конфер. М.: РУДН, 2003. – С. 301-308. 11. Романова, Е.В. О биохимическом полиморфизме белков сельскохозяйственных растений / Е.В. Романова, О.Л. Мартынов, А.Ф. Туманян // Вестник РАСХН. – 2003. – № 6. – С. 39-404. 12. Созинов, А.А. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции / А.А. Созинов. – М.: Наука, 1985. – 272 с. 13. Devis, B.J. Disc electrophoresis. II. Method and application to human serum proteinse / B.J. Devis // Ann. N.Y. Acad. Sci. – 1964. – V.121. – №1. – P.404-427. 14. Markert, C.L. Biology of isozymes / C.L. Markert // Isozymes. N.Y.: Acad. Press. – 1975. – V. 1. – P. 1-9. 15. Palmer, R.G. Qualitative genetic traits / R.G. Palmer, R.C. Shoemaker // Soybean Genet. Newsl. – 1996. – V. 23. – P. 25-42.
