ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ФАГОВЫХ МИНИ

УДК 619: 616-076
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА
Использование фаговых мини-антител
для определения концентрации
ферритина в сыворотке крови животных
С.А. Староверов1, 2, доктор биологических наук, А.С. Фомин1, А.А. Волков1, доктор ветеринарных наук,
С.В. Козлов1, 3, кандидат ветеринарных наук, Б.Н. Хлебцов2, доктор физико4математических наук,
С.В. Ларионов1, доктор ветеринарных наук, О.А. Василенко3, П.В. Меженный1,
Н.Т. Винников1, доктор ветеринарных наук, Л.А. Дыкман2, доктор биологических наук
1
ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова»
2
Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (Саратов)
3
Саратовский научно4исследовательский ветеринарный институт (Саратов)
Ключевые слова: альбумин, анемия, коллоидное золото, трансферрин, фаговые частицы, ферритин
Сокращения: БСА — бычий сывороточный альбумин, ИФА — иммуноферментный анализ, КРС —
крупный рогатый скот, ПААГ — полиакриламидный гель
Введение
Анемия — одно из наиболее распространенных заболеваний КРС, характеризующееся снижением гематокрита и концентрации гемоглобина. Протекает в
несколько стадий: уменьшение содержания ферритина, гемоглобина и железа в крови, проявление типичных признаков анемии (бледность кожных покровов
и слизистых, одышка, тахикардия, слабость, быстрая утомляемость, нарушение функции рецепторов
ротовой полости).
В организме животных ферритин служит депо железа. В отличие от трансферрина и гемосидерина, он
может не только транспортировать железо, но и длительное время хранить его в легко доступной форме. В настоящее время не существует диагностических систем для определения содержания ферритина
в крови животных, а видовая специфичность белка не
позволяет использовать тест-системы, предназначенные для человека.
Традиционно в иммунологических исследованиях
используют антитела, полученные от иммунизированных животных (поликлональные) или на основе гибридомных технологий (моноклональные). Однако использование животных может значительно затруднить
получение антител, когда речь идет о низкоиммуногенных или токсичных антигенах. Для решения подобных задач в молекулярной биологии используют
генно-инженерные технологии клонирования узнающих фрагментов — гипервариабельных участков иммуноглобулинов (мини-антител), которые являются более дешевыми и могут конкурировать по селективности с гибридомными технологиями. К таким методам
относится технология фагового дисплея [1, 2].
Стратегия получения специфических антител, основанная на использовании комбинаторных фаговых
библиотек, появилась сравнительно недавно. Дж. МакКаферти с соавторами в 1990 г. впервые показали возможность экспрессии фрагментов антител в составе
белка оболочки фага [1]. Они же продемонстрирова-
30
ли возможность быстрой и эффективной селекции
клонов, несущих высокоаффинные антитела, с помощью иммобилизованного антигена. Этот метод не
сопряжен с использованием животных, дорогих сред
и культур животных клеток, длительными процедурами иммунизации.
В современной литературе встречается много публикаций, посвященных получению антител при помощи фаговых библиотек на токсины столбняка, ботулизма, опухолевые антигены, бактериальные рецепторы и др. [1, 2]. Технология получения специфических к заданному антигену фаговых антител состоит
из 4 основных этапов: иммобилизации антигена на
твердом носителе и селекции специфичных фагов из
библиотеки, заражения клеток E. coli специфичным
фагом, заражения E. coli хелперным фагом, экспрессии фаговых антител и их отмывки.
Цель исследования
Получить фаговые мини-антитела, специфичные к
ферритину, и создать на их основе диагностические
тест-системы для определения содержания ферритина в крови КРС.
Материалы и методы
Буферы. Использовали следующие буферы:
0,01 М PBS pH 7,2 (NaCl 0,5 г/100 мл, KCl 0,02 г/100 мл,
NaH2PO4 x 2H2O 0,14 г/100 мл,
K2HPO4 x 3H2O 0,025 г/100 мл);
TBS-T (0,05 %-й раствор твин 20 в 0,01М PBS);
0,1 М глицин-HCl буфер pH 2,5 (глицин 2,25 г/30 мл,
НCl до рН 2,5);
1 М трис-НСl буфера pH 9,5 (трис 36,3 г/30 мл, НCl
до рН 9,5);
TYE агар (NaCl 0,8 г/100 мл, триптон 1 г/100 мл,
дрожжевой экстракт 0,5 г/100 мл, агар 1,5 г/100 мл);
2xTY (NaCl 0,5 г на 100 мл, триптон 1,6 г/100 мл,
дрожжевой экстракт 1 г/100 мл).
Выделение ферритина из печени КРС. Ферритин из
печени коров выделяли по методу, предложенному
в работах Kong B. et al., Mete A. et al. [1, 2], с небольшими модификациями. Печень гомогенизировали в
дистиллированной воде в соотношении 3:1, крупные
частицы гомогенизата осаждали центрифугированием 3000 g — 15 мин., надосадок прогревали на водяной бане 68 ± 1 °С — 15 мин., затем термолабильные
белки осаждали центрифугированием 3000 g —
15 мин., супернатант высаливали 60 %-м сульфатом
аммония от насыщения, осадок ресуспензировали в
минимальном объеме 0,01 М PBS pH 7,2, диализовали
против 0,01 М PBS pH 7,2, очищали суспензию на колонке Sephadex G-150, собирали пик выхода высокомолекулярного белка. Чистоту выделенной фракции
проверяли электрофорезом в ПААГ.
Получение мини-антител из фаговой библиотеки.
Мини-антитела на ферритин получали с использованием овечьей фаговой библиотеки (Griffin.1), любезно предоставленной профессором W.J. Harris (Aberdeen
University, Великобритания) [1].
Закрепление антигена на твердом носителе и селекция фагов из библиотеки. В качестве твердой фазы для закрепления антигена использовали пластиковый 96-луночный планшет для ИФА. В лунку вносили
200 мкл ферритина в концентрации 15 г/л и инкубировали 12 ч при 4 °С. За счет электростатического взаимодействия молекулы ферритина связываются со
стенками лунки. Для исключения неспецифичного
связывания блокировали незанятое антигеном пространство на стенках планшета 2 %-м раствором сухого обезжиренного молока в фосфатно-солевом буфере в течение 1 ч. Далее в лунку вносили 200 мкл фаговой библиотеки в концентрации 1012 фаговых частиц
в 1 мл и инкубировали в течение 12 ч при 4 °С.
За это время фаги, несущие специфические фрагменты к ферритину, селективно связывались с антигеном.
По истечении времени инкубации планшет отмывали
трехкратно буфером TBS-T. Элюцию связавшихся фаговых частиц проводили 0,1 М глицин-HCl буфером
(pH 2,5), выравнивали pH равным объемом 1 М трисНСl буфера (pH 9,5). Элюированные фаговые частицы
использовали для инфицирования клеток E. coli штамма XL1 Blue.
Заражение клеток E. coli специфичным фагом.
Аликвоты объемом 200 мкл с плотностью клеток
E. coli штамм XL 1 Blue не менее 1012 клеток/мл высевали на 3 чашки Петри с TYE агаром с добавлением
антибиотиков тетрациклина, ампицилина и канамицина. Культивировали клетки в течение 18 ч при 37 °С.
Рост E. coli отмечен только на среде с тетрациклином.
Отбирали единичную колонию E. coli и делали высев на питательную среду 2xTY, после чего культивировали в течение ночи при 37 °С на термошейкере для достижения экспоненциальной фазы роста бактерий. Помещали в термостат на 30 мин. при 37 °С без
покачивания для образования F-пилей. Добавляли в
культуру 200 мкл выделенных специфичных фагов
и помещали в термостат на 30 мин. при 37 °С. Для
отделения клеток от несвязавшихся фаговых частиц
центрифугировали клеточную культуру при 1000 g —
10 мин. Переносили осадок в свежую питательную
среду 2xTY с добавлением 1 % глюкозы и 100 мкг/мл
ампицилина. Наличие антибиотика препятствует размножению незараженных фагом клеток E. coli. Клетки
культивировали на термошейкере в течение 12 ч при
37 °С, затем помещали в термостат на 30 мин. при
37 °С без покачивания.
Заражение вспомогательным фагом. В культуру,
полученную на предыдущем этапе, вносили 200 мкл
фага М13-К07 с концентрацией 1 x 1011 частиц/мл и
инкубировали в течение 1,5 ч при 37 °С. Осаждали
клетки центрифугированием при 1000 g — 10 мин.,
ресуспензировали осадок в 2xTY среде с добавлением 100 мкг/мл ампицилина, 25 мкг/мл канамицина
и 1,25 мкл/мл изопропил-b-D-тиогалактозида. Два антибиотика позволяли размножаться клеткам, содержащим как специфичный, так и вспомогательный
(хелперный) фаг.
Экспрессия фаговых антител и их очистка. После инкубации центрифугировали клетки при 1000 g,
к супернатанту, содержащему фаги, добавляли 1/5
объема ПЭГ/NaCl и инкубировали 1 ч при 4 °С. Далее суспензию фаговых антител центрифугировали
17 000 g — 20 мин. при 4 °С. Полученный осадок ресуспензировали в 3 мл 0,01 M PBS. Фаговую суспензию
очищали диализом в течение 24 ч против 0,01 M PBS.
Полученный препарат фаговых частиц использовали для двух последующих раундов селекции, осуществляемых в аналогичных условиях, но с сокращением времени инкубации и использованием меньшего количества фаговых частиц на стадии их
взаимодействия с иммобилизованным антигеном
(1,5 ч и 1 ч инкубации при комнатной температуре
и 1011 и 1010 фаговых частиц для 2-го и 3-го раундов соответственно).
Дот-иммуноанализ. Специфичность полученных
фаговых антител, а также концентрацию ферритина
в крови КРС определяли методом дот-иммуноанализа. Суть метода заключается в визуализации специфического взаимодействия адсорбированного на
мембране антигена и меченых (коллоидными или молекулярными метками) антител. Детально протоколы получения кроличьих антифаговых антител, их
конъюгатов с пероксидазой, наночастицами золота
и с золотыми нанооболочками на ядрах из двуокиси кремния представлены в работах отечественных
специалистов [1…3]. В нашем исследовании мы использовали стратегию вторичного мечения [10], т. е.
сначала проводили биоспецифическую реакцию феритин/фаговые антитела, а затем визуализовали ее
с помощью меченых наночастицами поликлональных кроличьих антифаговых антител. Универсальность данного подхода позволила нам использовать
те же кроличьи антифаговые антитела и их конъюгаты с наночастицами и пероксидазой хрена, которые
ранее были успешно применены нами для биоспецифического мечения эмбриональных клеток почки
свиньи [10].
В качестве образцов на поливинилиденфторидную
мембрану Western S (Millipore, США) в виде серии точек наносили очищенный ферритин в различных концентрациях, выделенный из печени и плазмы коров
различных возрастных групп. Затем блокировали
мембрану с нанесенным на нее антигеном в течение
1 ч 2 %-м сухим молоком, разведенным в 0,01М PBS
pH 7,2. Мембрану погружали в раствор специфических фагов, разведенных до концентрации 1013 частиц
31
РВЖ • СХЖ • № 4/2012
Использование фаговых мини-антител для определения концентрации ферритина
в сыворотке крови животных
С.А. Староверов, А.С. Фомин, А.А. Волков, С.В. Козлов, Б.Н. Хлебцов, С.В. Ларионов,
О.А. Василенко, П.В. Меженный, Н.Т. Винников, Л.А. Дыкман
в 1 мл 0,01М PBS pH 7,2, и инкубировали 1 ч при комнатной температуре. В результате биоспецифического взаимодействия фаговые антитела связывались
с ферритином, адсорбированным на мембране, после
чего мембрану отмывали от неспецифически связавшихся мини-антител и погружали в конъюгат наночастиц (или пероксидазы хрена) с кроличьими антифаговыми антителами [1, 10]. Через 5…60 мин.,
если в исходном образце присутствовал ферритин
(и, следовательно, специфичные фаги с ним связались), конъюгат связывался с комплексом антиген/мини-антитела, что можно было визуально наблюдать
в виде серии окрашенных пятен. Цвет пятен соответствует максимуму экстинкции наночастиц или молекул-меток [8].
Результаты и обсуждение
Состояния, вызванные нарушением обмена микроэлементов, широко распространены в патологии животных. Одним из важнейших микроэлементов является железо. Нарушения его метаболизма приводят
к различным заболеваниям, среди которых железодефицитные анемии составляют 95 %. Исследования,
касающиеся КРС, немногочисленны, а результаты
зачастую противоречивы [1…5]. Это связано с нехваткой данных по биодинамике железодепонирующих
белков, так как на ветеринарном рынке отсутствуют диагностические системы на ферритин и трансферрин.
Первым этапом нашей работы было выделение
ферритина из печени коров. У полученного по описанному протоколу белка определили молекулярную
массу электрофорезом в 10 %-м ПААГ (рис. 1). Полученный нами белок при нативном электрофорезе выходит единичной полосой с молекулярной
массой 460 кДа, что может указывать на степень чистоты выделенной фракции.
На следующем этапе работы нами были получены рекомбинантные (фаговые) антитела на ферритин по протоколу, приведенному выше. Выделив мини-антитела, мы провели их наработку, клонируя фаги до титра 1:8192, которые в дальнейшем использовали в иммуноанализе в разведении 1:100.
В современной литературе часто встречаются работы по применению твердофазного иммуноанализа в
лабораторной диагностике [1…3]. Несмотря на то что
это в основном качественные или полуколичественные методы, использование их может оказывать большую помощь при постановке предварительного диаг-
Рис. 1. Электрофорез ферритина в 10 %м ПААГ
32
Рис. 2. Дотиммуноанализ ферритина, выделенного из печени
коров, с использованием в качестве метки конъюгатов:
А — 15 нм коллоидного золота, Б — золотых нанооболочек,
В — пероксидазы хрена с антифаговыми антителами,
Г — контроль (БСА)
ноза. На следующем этапе нашей работы мы разработали дот-иммуноанализ для выявления ферритина в
плазме крови КРС. Сначала было необходимо определить минимальную концентрацию антигена, детектируемую визуально с помощью дот-анализа. Для
этого 1 мкл раствора ферритина в 0,01 М PBS pH 7,2,
с концентрациями от 15 до 0,1 мкг/мл (полученной
двукратными разведениями) наносили на мембрану
в центр очерченного квадрата со стороной 5 мм.
В качестве негативного контроля использовали БСА.
Далее дот-анализ проводили, как описано выше, с использованием конъюгатов кроличьих антифаговых
антител с наночастицами коллоидного золота, золотыми нанооболочками и пероксидазой хрена.
Реакцию можно было наблюдать визуально через
5…60 мин. в виде появления красных (серо-синих
или коричневых) пятен. Яркость пятен постепенно
увеличивалась в течение 1…2 ч, а затем интенсивность окраски не изменялась.
На рисунке 2 представлен дот-иммуноанализ ферритина, выделенного из печени коров, с использованием в качестве метки конъюгатов 15 нм коллоидного золота, золотых нанооболочек и пероксидазы
хрена с антифаговыми антителами. Видно, что использование в качестве метки 15 нм коллоидного золота, нанооболочек и пероксидазы дают сходные результаты. В случае негативного контроля (нижний
ряд) никаких окрашенных пятен на мембране не наблюдалось. Следует, однако, отметить, что применение
коллоидных частиц снижает время детекции в среднем на 1 ч. Чувствительность методов во всех трех случаях была сходная и составила 0,225 мкг/мл.
На следующем этапе работы был проведен дот-анализ ферритина, содержащегося в сыворотках крови
КРС из двух групп, различающихся условиями содержания и физиологическим состоянием животных
(стельного и сухостойного периода).
На рисунках 3…5 представлены результаты дот-иммуноанализа ферритина в сыворотках крови КРС с
использованием в качестве метки конъюгатов 15 нм
коллоидного золота, золотых нанооболочек и пероксидазы хрена с антифаговыми антителами. В верхнем
Использование фаговых мини-антител для определения концентрации ферритина
в сыворотке крови животных
Рис. 3. Дотиммуноанализ ферритина в сыворотках крови КРС
с использованием в качестве метки конъюгатов 15 нм коллоидного
золота. А1…А8 — коровий ферритин в концентрации от 15 мкг/мл
до 0,225 мкг/мл, B1…B5 и C1…C3 — сыворотка КРС, С4 — BSA,
C5 — лошадиный ферритин
Рис. 4. Дотиммуноанализ ферритина в сыворотках крови КРС
с использованием в качестве метки золотых нанооболочек:
А1…А8 — коровий ферритин в концентрации от 15 мкг/мл
до 0,225 мкг/мл, B1…B5 и C1…C2 — сыворотка крови КРС,
С3 — BSA, C4 — лошадиный ферритин
ряду коровий ферритин (выделенный нами из печени
КРС) в концентрации от 15 мкг/мл до 0,225 мкг/мл,
в нижнем — сыворотки крови исследуемых животных, концентрация ферритина составила от 1,7 мкг/мл
до 0,6 мкг/мл, при проведении планшетного ИФА по
методу Hornbeck P. [1] были получены аналогичные
данные.
Выводы
Рис. 5. Дотиммуноанализ ферритина в сыворотках крови КРС
с использованием в качестве метки пероксидазы хрена:
А1…А8 — коровий ферритин в концентрации от 15 мкг/мл
до 0,225 мкг/мл, B1…B7 — сыворотка крови крупного рогатого скота,
B8 — лошадиный ферритин
клональных или поликлональных антител, что не лишено ряда недостатков. В частности, получение моноклональных антител очень затратное, так как требуется дорогостоящее специализированное оборудование, широкий арсенал реактивов, а также наличие
линейных лабораторных животных. Недостаток поликлональных антител — низкая специфичность и,
как следствие, невысокая достоверность диагностических систем.
Предлагаемая нами тест-система для определения
ферритина, основанная на использовании комбинаторной библиотеки фаговых антител, имеет ряд преимуществ, в том числе менее затратное и быстрое получение антител, по специфичности не уступающих
моноклональным.
Библиографию см. на сайте http://logospress.ru/site/340
Summary
S.А. Staroverov, А.S. Fomin, А.А. Volkov, S.V. Koslov, B.N. Khlebtsov, S.V. Larionov, O.A. Vasilenko,
P.V. Megennei, N.T. Vinnikov, L.А. Dykman. Usage of Phage Miniantibodies as Means of Detecting
Ferritin Concentration in Animal Blood Serum. The article contains results of researches conducted in
the field of phage mini5antibodies production (this type of phage mini5antibodies has specific ferritin response)
and creation of diagnostic test5systems based on them and used for ferritin detection in cattle blood serum.
The immunodot assay with seconday biospecific labeling is suggested as means of ferritin detection in cow
blood serum (ferritin/phage mini5antibodies/conjugates of rabbit antiphage antibodies with different labels).
Сolloidal gold, nano5shells of gold and peroxidase of horse used as labels have shown similar response while
detecting concentration of ferritin (0,2 mkg/ml).
33
РВЖ • СХЖ • № 4/2012
Подводя итог проведенных исследований, следует
отметить: несмотря на то что анемия — одно из наиболее распространенных заболеваний КРС, характеризующееся снижением гематокрита и концентрации гемоглобина, протекающее в несколько стадий,
в доступной специализированной литературе отсутствует информация о наличии простых и достоверных
тест-систем для диагностики данного заболевания.
В частности, в российской ветеринарной медицине
практически отсутствует упоминание о таком важном показателе, как ферритин, выполняющем функцию основного внутриклеточного депо железа. Кроме
того, не рассматривается роль ферритина как самого информативного индикатора запасов железа в организме.
Нами подтверждено, что определение уровня ферритина в крови коров методом дот-иммуноанализа позволяет получить данные о его концентрации у КРС
в динамике, а это может нести важную информацию
по изучению патологических процессов инфекционной и незаразной этиологии.
Самый распространенный метод определения ферритина — ИФА, сопряжен с использованием моно-