Автореферат (608 kb, PDF) - Институт экологии и генетики
реклама
На правах рукописи ИРКИТОВА АЛЕНА НИКОЛАЕВНА ЭКОЛОГО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ШТАММОВ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫХ В ПРОИЗВОДСТВЕ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ПРОДУКТОВ 03.02.03 – микробиология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Пермь – 2012 Работа выполнена на кафедре экологии, биохимии и биотехнологии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения ВПО «Алтайский государственный университет» и в лаборатории микробиологии ГНУ СО РАСХН Сибирского НИИ сыроделия, Барнаул. Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Соколова Галина Геннадьевна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор кафедры микробиологии и вирусологии ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия им. акад. Е.А. Вагнера Минздравсоцразвития» Кузяев Рафаэль Зиафутдинович кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории водной микробиологии ФГБУН Институт экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН Соломенный Александр Петрович Ведущая организация: университет» ФГБОУ ВПО «Челябинский государственный Защита диссертации состоится «25»мая 2012 г. в часов на заседании диссертационного совета ДМ 004.019.01 в Институте экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН по адресу: 614081 г. Пермь, ул. Голева, 13. Факс: (342) 280 92 11 Автореферат диссертации размещен на официальном сайте Министерства образования и науки РФ (http://www.vak.ed.gov.ru) и сайте Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (http://www.iegm.ru) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН Автореферат разослан «____» ________________2012 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Максимова Юлия Геннадьевна 3 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Микроорганизмы рода Lactobacillus широко распространены в природе и являются представителями микрофлоры человека и теплокровных животных. Они обладают высокой биологической и функциональной активностью, что определяет их практическое использование в качестве пробиотиков и в производстве пищевых продуктов. Среди бактерий, применяемых как пробиотики, наиболее широко известна своим полезным действием Lactobacillus acidophilus, которая заселяет кишечник новорожденного ребенка и, вступив с ним в устойчивый симбиоз, сопровождает человека на протяжении всей его жизни, оказывая благотворное влияние на его здоровье [Королева, 1975; Каган, 2008]. L. acidophilus является наиболее сильным антагонистом среди других представителей рода Lactobacillus. Антагонистическая активность L. acidophilus к патогенной, условно-патогенной и технически-вредной микрофлоре осуществляется конкурентными и аллелопатическими взаимоотношениями. Изучение этих взаимоотношений, которые характерны как для представителей микробоценозов организма человека, так и микробных популяций на фоне действия факторов различной природы являются актуальными задачами экологии микроорганизмов [Тучина, 2008]. Особенно важно, что это свойство, привлекающее к данному виду лактобацилл наибольшее внимание исследователей, четко проявляется не только в опытах in vitro, но и in vivo – непосредственно в естественных системах L. acidophilus/организм хозяина. Штаммы, обладающие антагонистической активностью, различаются по силе и характеру воздействия на ингибируемый микроорганизм, а также по ширине и специфичности спектра ингибируемых микробов. Антагонистическая активность L. acidophilus – важное, но далеко не единственное свойство этой бактерии. L. acidophilus обладает также высоким уровнем колонизационной способности, желчеустойчивости и антибиотикоустойчивости. Все это определяет постоянно растущий интерес исследователей к изучению L. acidophilus и выделению штаммов, перспективных для использования в пищевой промышленности. Следует отметить, что входя в состав пробиотических продуктов или лекарственных препаратов, а также при попадании внутрь организма-хозяина, производственные штаммы L. acidophilus оказываются в среде обитания, где на рост и антагонистическую активность ацидофильной палочки влияют разные экологические факторы, поэтому детальное изучение влияния этих факторов на пробиотические микроорганизмы имеет большое значение. Кроме того, характеристика штаммов L. acidophilus, описанных в патентах не является завершенной, комплексной по оценке биологических и экологических свойств L. acidophilus.Поэтому необходимо описывать и вести мониторинг особенностей коллекционных штаммов, используемых в промышленности для обеспечения экологической безопасности продуктов питания. 4 Цель работы: провести эколого-биологическую оценку штаммов L. acidophilus, используемых в производстве пробиотических продуктов. Задачи исследования: 1. Охарактеризовать морфолого-культуральные свойства исследуемых штаммов L. аcidophilus. 2. Изучить влияние экологических факторов (характер субстрата, аэробные и анаэробные условия, активная кислотность среды, молочная кислота) на рост и антагонистическую активность штаммов L. acidophilus по отношению к тестштаммам Escherichia coli в условиях in vitro. 3. Определить желчеустойчивость исследуемых штаммов L. аcidophilus. 4. Оценить биосовместимость штаммов L. аcidophilus между собой и со штаммами Propionibacterium freudenreichii. 5. Выявить жизнеспособность штаммов L. аcidophilus и штаммов P. freudenreichii в различных экологических условиях (выращивание на разных средах, совместное и раздельное культивирование). 6. Разработать пробиотическую закваску и биотехнологию ацидофильного пробиотического напитка на основе молочной подсырной сыворотки. Научная новизна работы. Впервые дана комплексная экологобиологическая характеристика штаммов L. acidophilus из сибирской коллекции микроорганизмов ГНУ СО РАСХН СибНИИ сыроделия. Выявлена зависимость роста и антагонистической активности исследуемых штаммов L. acidophilus от характера субстрата, аэробных и анаэробных условий, активной кислотности среды и наличия молочной кислоты. Для получения количественной оценки антагонистических взаимоотношений L. acidophilus и E. coli нами модифицированы 2 метода – метод капель и метод культивирования на жидкой среде Кесслера. Проведена оценка биосовместимости штаммов L. acidophilus между собой и с P. freudenreichii. С учетом результатов исследования отобраны штаммы L. acidophilus и P. freudenreichii, перспективные для приготовления пробиотической закваски. Разработана биотехнология и рецептура пробиотического напитка на основе молочной (подсырной) сыворотки с применением пробиотической закваски. Положения, выносимые на защиту: 1. Антагонистическая активность исследуемых штаммов L. acidophilus по отношению к тест-штаммам E. сoli зависит от аэробных и анаэробных условий, активной кислотности среды, наличия молочной кислоты и не зависит от характера субстрата. 2. Жизнеспособность штамма L. acidophilus СКМ-500 не изменяется при раздельном и совместном культивировании с P. freudenreichii, а при использовании разных сред численность сохраняется на высоком уровне (не менее 106 КОЕ/мл). Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты позволили выявить, что антагонистическая активность коллекционных штаммов L. acidophilus является индивидуальным, штаммоспецифическим признаком, а степень проявления этого признака зависит от экологических условий. 5 Результаты исследования могут быть использованы предприятиями молочной промышленности для мониторинга качества бактериальных заквасок и препаратов, обеспечения экологической безопасности продуктов питания, научно-исследовательскими организациями микробиологического профиля для селекции коллекционных и промышленных штаммов молочнокислых бактерий. Модифицированные нами методы позволяют количественно оценить антагонистическую активность штаммов ацидофильной палочки и могут быть внедрены в практику микробиологических лабораторий и лабораторий по оценке качества пищевой продукции. На основе полученных результатов разработана пробиотическая закваска и утверждена нормативно-техническая документация на производство пробиотического напитка на основе молочной (подсырной) сыворотки «Алтайское лето» ТУ 9222-056-00419710-10. Результаты исследования используются при проведении занятий по Экологии микроорганизмов, Микробиологии, Прикладной биотехнологии, Прикладной экологии со студентами биологического факультета Алтайского государственного университета. Апробация работы. Результаты работы апробированы на научных конференциях различного уровня: научно-практическая конференция «Интеллектуальный потенциал ученых России» (Барнаул, 2009); XI городской научно-практической конференции «МОЛОДЕЖЬ-БАРНАУЛУ» (Барнаул, 2009); Международной научной конференции «Биотехнология начала III тысячелетия» (Саранск, 2010); Всероссийской молодежной научной конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты современной биологии» (Томск, 2010); 4-й Всероссийской научно-практической конференции студентов, аспирантов и молодых ученых с Международным участием «Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности» (Бийск, 2011); Всероссийской выставке «РосБиоТех» (Москва, 2010); Слете молодых сыроделов (Барнаул, 2011); Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых ученых «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь, 2011) и др. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 работ, в том числе 3 из них – в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, 6 глав, выводов, библиографического списка и приложения. Диссертация иллюстрирована 26 рисунками и 35 таблицами. Основной текст изложен на 144 страницах машинописного текста. Библиографический список включает 173 наименований работ, в том числе 85 – зарубежных авторов. Личный вклад автора. Автором определены цель и задачи исследования, спланированы и выполнены лабораторные эксперименты на всех этапах исследования, лично выполнена обработка и обсуждение полученных результатов. Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научному консультанту, к.б.н. Я.Р. Кагану за мудрые советы, терпение и понимание, за помощь в планировании экспериментов. Автор работы признателен своему 6 научному руководителю, д.б.н., проф. Г.Г. Соколовой за ценные замечания и консультационную помощь в написании работы. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ В главе на основе данных отечественной и зарубежной литературы приведены сведения об экологических, биологических и пробиотических свойствах L. acidophilus. Рассмотрены основные области применения L. acidophilus. ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Объектом исследования в настоящей работе были 12 штаммов L. acidophilus из отраслевой коллекции ГНУ CО РАСХН СибНИИ сыроделия, 10 из которых являются промышленными штаммами, используемыми в России для крупнотоннажного производства диетических и лечебно-профилактических (пробиотических) ацидофильных молочных продуктов. В экспериментах по выявлению антагонистической активности и биосовместимости указанных штаммов L. acidophilus в качестве тест-культур использовали 2 штамма E. coli и 6 промышленных штаммов пропионовокислых бактерий из коллекции СибНИИ сыроделия. Для выращивания и дальнейшего культивирования микроорганизмов были использованы стандартные микробиологические среды: стерильное обезжиренное молоко, обогащенный агар с гидролизованным молоком, лактатный бульон, бульон из гидролизованного молока, жидкая среда Кесслера. Изучение антагонистических взаимоотношений проводилось с использованием следующих методов: метода перпендикулярных штрихов [Заборских, 1976; Нетрусов, 2005], метода капель [Заборских, 1976; Глушанова, 2004] в нашей модификации и метода культивирования тест-штаммов кишечной палочки в жидкой селективной питательной среде в присутствии того или иного штамма ацидофильной палочки [Заборских, 1976] в нашей модификации. Определение биосовместимости микроорганизмов устанавливали методом «агаровых блоков» [Нетрусов, 2005]. Определение потребностей в питательных веществах проводили ауксанографическим методом [Герхардт, 1984]. Статистическая обработка полученного материала проведена с использованием пакета прикладных программ Statistica 6.0. Вычисляли среднее арифметическое, среднеквадратичное отклонение, ошибку средней арифметической. Достоверность отличий рассматриваемых параметров и доверительный интервал рассчитывали по методу Стьюдента с вероятностью ошибки 5%. ГЛАВА 3. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДУЕМЫХ ШТАММОВ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS Из 12 штаммов ацидофильной палочки, исследованных в данной работе, 11 штаммов являются продуктом отечественной селекции. Все они обладают 7 высокой кислотообразующей активностью и хорошо растут в молоке, образуя плотный сгусток после 4–8 часов инкубации при 37–40оС (при дозе посевного материала 1%). Все 11 отечественных штаммов L. acidophilus при глубинном посеве в среду «АГМ для палочек» формируют в зависимости от густоты посева мелкие или средней величины (диаметром не более 2 мм) беловатые колонии с неровным контуром в виде комочков ваты или клубочков переплетенных нитей, а при выращивании в жидкой среде БГМ дают равномерное помутнение без образования придонного или пристеночного осадка. Заметных различий между штаммами в характере роста в этих питательных средах не выявлено. При внесении культуры петлей в пробирку, содержащую 10 см3 стерильного обезжиренного молока, отечественные штаммы образуют сгусток после 10–12 часов инкубирования при оптимальной (37оС) температуре; молочные сгустки – гомогенные, вязкие («сметанообразные»), без отделения сыворотки, вкус сгустка – чистый кисломолочный. Исключение представляет лишь штамм L. acidophilus СКМ-503, образующий невязкий («колющийся») сгусток. Внешний вид молочных культур всех отечественных штаммов ацидофильной палочки, кроме одного (штамма СКМ-495) оказался однообразным: грамположительные, не имеющие жгутиков, аспорогенные палочки с закругленными концами, располагающиеся поодиночке, парами или в виде коротких цепочек; длина палочек варьировала от 2 до 20 мкм, толщина составила 0,8 мкм. Отличие внешнего вида штамма СКМ-495 от остальных отечественных штаммов L. acidophilus заключалось в том, что клетки этого штамма содержали метахроматические зерна волютина. Это признак, характерный для двух других видов термофильных лактобацилл – L. delbrueckii ssp. bulgaricus и L. delbrueckii ssp. lactis. Изучение штамма L. acidophilus СКМ-506, выделенного нами из коммерческого сухого моновидового бактериального препарата, показало, что по ряду свойств он значительно отличается от вышеописанных отечественных штаммов ацидофильной палочки. В аннотации к препарату указывалось, что штамм L. acidophilus СКМ-506 обладает незначительным кислотообразованием и слабо растет в молоке. Хотя при внесении в стерильное обезжиренное молоко очень высоких доз концентрированного препарата (2х109 или 2х108 КОЕ/см3) сгусток образуется в течение первых суток, снижение дозы до обычных концентраций (104-106 КОЕ/см3) удлиняет срок образования сгустка до 7 суток. При этом во всех случаях молочные сгустки, образованные штаммом СКМ-506, характеризовались как слабые и пресноватые. Попытка поддерживать штамм СКМ-506 перевивками в стерильное обезжиренное молоко (по аналогии с отечественными штаммами ацидофильной палочки) окончилась неудачей: сгусток не образовывался даже после 7 суток инкубации, а в микроскопических препаратах обнаруживались лишь единичные клетки. Сами клетки по морфологии резко отличались от клеток отечественных штаммов L. acidophilus: короткие искривленные палочки, расположенные по одной, изредка по две, или в виде коротких цепочек. Более благоприятной 8 средой для роста штамма СКМ-506 оказался бульон из гидролизованного молока; при выращивании в этой среде штамм давал заметное равномерное помутнение, хотя и существенно позже, чем отечественные штаммы ацидофильной палочки (соответственно после 28 и 18 часов инкубации при 37оС). ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ЭКОЛОГИЧЕСКИХ УСЛОВИЙ НА РОСТ И ПРОЯВЛЕНИЕ АНТАГОНИСТИЧЕСКУЮ АКТИВНОСТЬ ШТАММОВ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS ПО ОТНОШЕНИЮ К ШТАММАМ ESCHERICHIA COLI 4.1. Характер субстрата При определении антагонистической активности штаммов L. acidophilus по отношению тест-штаммам E. coli модифицированным методом капель на питательной среде «АГМ для палочек» строго учитывается количество штаммаантагониста и штамма тест-культуры. Кроме того, культуры высеваются одновременно и вступают в контакт друг с другом одновременно, т.е. появляется эффект взаимодействия антагониста и тест-культуры. Штаммы L. acidophilus, выделяя в среду антибиотические вещества, ингибировали развитие штаммов E. coli (табл. 1). Следует отметить, что в контроле оба штамма кишечной палочки росли до 8-го разведения, что подтверждает ингибирование кишечной палочки испытуемыми штаммами L. acidophilus, причем степень этого ингибирования варьирует. Таблица 1 Ингибирование роста штаммов тест-культуры E. coli коллекционными штаммами L. acidophilus при совместном культивировании в среде «АГМ для палочек» Минимальное соотношение клеток антагонист/тесткультура, вызывающее полное подавление роста Штамм штаммов тест-культуры L. acidophilus СКМ-829 СКМ-830 3 СКМ-492 10 105 СКМ-495 104 105 СКМ-497 105 105 СКМ-498 106 106 СКМ-499 105 106 СКМ-500 100 101 СКМ-501 102 104 СКМ-502 102 104 СКМ-503 104 105 СКМ-504 102 106 СКМ-505 105 105 Таким образом, оценка антагонистической активности L. acidophilus к E. coli при росте на твердой питательной среде выявила, что самым сильным 9 антагонистом является штамм СКМ-500, а самым слабым антагонистом – штамм СКМ-498. Также следует отметить, что тест-штамм СКМ-830 более устойчив к ингибирующему действию L. acidophilus по сравнению со штаммом СКМ-829. Для определения антагонистического эффекта штаммов L. acidophilus в отношении тест-штаммов E. coli при культивировании на жидкой среде нами была использована жидкая среда Кесслера. Хотя в соответствии с данным методом антагонист и тест-культура засеваются в среду Кесслера одновременно, этот метод вряд ли можно отнести к методам совместного культивирования, так как используемая питательная среда неблагоприятна для роста ацидофильной палочки. На рост штаммов тест-культуры E. coli оказывают влияние продукты метаболизма L. acidophilus, внесенные вместе с посевным материалом. Анализ антагонистической активности коллекционных штаммов L. acidophilus к штаммам СКМ-829 и СКМ-830 при их культивировании в жидкой среде Кесслера выявил аналогичный порядок расположения штаммов по минимальному соотношению клеток антагонист/тест-культура, как при тестировании штаммов L. acidophilus на антагонистическую активность на твердой питательной среде методом капель (табл. 2). Таблица 2 Ингибирование роста штаммов тест-культуры E. coli коллекционными штаммами L. acidophilus при культивировании в жидкой среде Кесслера Минимальное соотношение клеток антагонист/тесткультура, вызывающее полное подавление роста Штамм штаммов тест-культуры L. acidophilus СКМ-829 СКМ-830 3 СКМ-492 10 104 СКМ-495 104 105 СКМ-497 105 105 СКМ-498 106 106 СКМ-499 105 105 СКМ-500 100 101 СКМ-501 102 104 СКМ-502 102 104 СКМ-503 104 105 СКМ-504 102 104 СКМ-505 105 105 Таким образом, анализ антагонистической активности исследуемых штаммов L. acidophilus по отношению к штаммам тест-культуры E. coli при культивировании на твердой и жидкой средах показал, что самым сильным антагонистом оказался штамм СКМ-500, самым слабым антагонистом – штамм СКМ-498, а характер субстрата не оказывает влияния на антагонистическую активность исследованных штаммов L. acidophilus . 10 4.2. Аэробные и анаэробные условия Для определения влияния аэробных и анаэробных условий на антагонистическую активность штаммов L. acidophilus по отношению к штаммам E. сoli использовали модифицированный метод капель. Для создания анаэробных условий посевы культивировали в анаэростате. В аэробных условиях наибольший антагонистический эффект проявил штамм СКМ-500 (МСК<101 по отношению к обоим штаммам кишечной палочки). Самым слабым антагонистом к штамму СКМ-829 оказался штамм СКМ-498 (МСК=106), а по отношению к штамму СКМ-830 самыми слабыми антагонистами были штаммы СКМ-498, СКМ-503, СКМ-504 (табл.3). Таблица 3 Ингибирование роста штаммов тест-культуры E. coli коллекционными штаммами L. acidophilus при культивировании в аэробных условиях Штамм Минимальное соотношение клеток антагонист/тесткультура, вызывающее полное подавление роста L. acidophilus штаммов тест-культуры СКМ-829 СКМ-830 3 СКМ-492 10 105 СКМ-495 104 105 СКМ-497 105 105 СКМ-498 106 106 СКМ-499 103 105 СКМ-500 100 100 СКМ-501 102 104 СКМ-502 102 104 СКМ-503 105 106 СКМ-504 102 106 СКМ-505 105 105 В контроле рост обоих штаммов кишечной палочки наблюдался до 8-го разведения, что значительно выше, чем при совместном выращивании с испытуемыми штаммами ацидофильной палочки. В анаэробных условиях все исследованные штаммы ацидофильной палочки проявляли значительно более сильный антагонистический эффект, чем в аэробных условиях. Наибольшая антагонистическая активность наблюдалась у штаммов СКМ-492 и СКМ-504; в анаэробных условиях они проявили себя как самые сильные антагонисты. Наименьшая антагонистическая активность отмечены для штаммов СКМ-505 и СКМ-499 (табл. 4). 11 Таблица 4 Ингибирование роста штаммов тест-культуры E .coli коллекционными штаммами L. acidophilus при культивировании в анаэробных условиях № Штамм Минимальное соотношение клеток антагонисти/тест-культура, вызывающее полное L. acidophilus подавление роста тест-культуры СКМ-829 СКМ-830 0 1 СКМ-492 10 102 2 СКМ-495 102 103 3 СКМ-497 101 104 4 СКМ-498 101 104 5 СКМ-499 104 106 6 СКМ-500 101 103 7 СКМ-501 101 103 8 СКМ-502 102 104 9 СКМ-503 101 103 10 СКМ-504 100 102 11 СКМ-505 103 105 Таким образом, в анаэробных условиях штаммы L. acidophilus проявляют больший антагонистический эффект, чем в аэробных условиях, причем наиболее сильными антагонистами по отношению к штаммам тест-культуры E. coli являются штаммы СКМ-492 и СКМ-504, а самыми слабыми антагонистами – штаммы СКМ-505 и СКМ-499. 4.3. Активная кислотность среды Для определения влияния активной кислотности среды на антагонистическую активность штаммов L. acidophilus к штаммам E. coli, осуществляли совместное культивирование штаммов-антагонистов и штаммов тест-культуры совместно на жидкой питательной среде БГМ с различными значениями рН (от 5 до 9). Для получения нужного значения рН, БГМ подкисляли 40% раствором молочной кислоты или подщелачивали 20% NaOH. Результаты исследования показали, что активная кислотность среды влияет на антагонистическую активность исследуемых штаммов L. acidophilus по отношению к штаммам тест-культуры E. coli. Отмечено, что чем сильнее рН среды смещена в кислую сторону, тем сильнее антагонистический эффект, а чем сильнее смещена рН среды в щелочную сторону, тем слабее антагонистический эффект у исследуемых нами штаммов L. acidophilus. Наибольший антагонистический эффект по отношению к штамму СКМ829 отмечен при рН=5–6 почти у всех штаммов L. acidophilus, кроме СКМ-503, СКМ-505, СКМ-506, которые проявили низкую антагонистическую активность/ Увеличение рН до 9 вызывает резкое снижение антагонистической активности многих штаммов, за исключением штамма СКМ-492 (табл. 5). 12 Таблица 5 Ингибирование роста штамма СКМ-829 коллекционными штаммами L. acidophilus при культивировании на БГМ с разными значениями рН Минимальное соотношение клеток штаммов антагонист/тест-культура, Корреляционное Штаммы L. acidophilus вызывающее полное подавление отношение роста штаммов тест-культуры значения рН 5 6 7 8 9 0 0 0 2 СКМ-492 10 10 10 10 102 0,87 0 1 3 3 7 СКМ-495 10 10 10 10 10 0,89 0 1 1 1 6 СКМ-497 10 10 10 10 10 0,79 0 1 1 1 6 СКМ-498 10 10 10 10 10 0,79 0 2 3 4 9 СКМ-499 10 10 10 10 10 0,94 0 3 3 5 6 СКМ-500 10 10 10 10 10 0,96 0 1 1 1 8 СКМ-501 10 10 10 10 10 0,77 0 1 1 1 8 СКМ-502 10 10 10 10 10 0,77 4 5 7 5 8 СКМ-503 10 10 10 10 10 0,77 0 1 1 1 6 СКМ-504 10 10 10 10 10 0,79 7 7 9 9 9 СКМ-505 10 10 10 10 10 0,69 6 6 8 8 8 СКМ-506 10 10 10 10 10 0,76 Таблица 6 Ингибирование роста штамма СКМ-830 коллекционными штаммами L. acidophilus при культивировании на БГМ с разными значениями рН Минимальное соотношение клеток (МСК) штаммов антагонист/тесткультура, вызывающее полное Корреляционное Штаммы подавление роста штаммов тестотношение L. acidophilus культуры значения рН 5 6 7 8 9 2 6 5 6 СКМ-492 10 10 10 10 107 0,82 8 8 8 8 9 СКМ-495 10 10 10 10 10 0,71 1 3 3 7 7 СКМ-497 10 10 10 10 10 0,94 0 3 4 4 8 СКМ-498 10 10 10 10 10 0,94 3 3 4 5 7 СКМ-499 10 10 10 10 10 0,94 4 7 7 7 9 СКМ-500 10 10 10 10 10 0,88 0 2 1 4 7 СКМ-501 10 10 10 10 10 0,91 0 2 2 4 5 СКМ-502 10 10 10 10 10 0,97 4 5 7 9 8 СКМ-503 10 10 10 10 10 0,91 0 2 3 4 5 СКМ-504 10 10 10 10 10 0,99 9 9 9 9 9 СКМ-505 10 10 10 10 10 0,00 9 9 9 9 9 СКМ-506 10 10 10 10 10 0,00 13 Антагонистический эффект исследованных штаммов ацидофильной палочки к штамму СКМ-830 носил аналогичный характер: самый сильный антагонистический эффект при рН=5 с постепенным ослаблением и слабый антагонизм или полное его отсутствие при рН=9 (табл. 6). В контроле оба штамма тест-культуры растут до восьмого разведения. Таким образом, активная кислотность среды оказывает сильное влияние на антагонистическую активность штаммов ацидофильной палочки к штаммам кишечной палочки. Самыми устойчивыми при изменении рН среды и сохраняющими антагонизм по отношению к штаммам тест-культуры E. coli являются штаммы СКМ-501, СКМ-502, СКМ-504, а самыми слабыми антагонистами – штаммы СКМ-505 и СКМ-506. 4.4. Нейтрализация молочной кислоты Общим свойством молочнокислых бактерий, в том числе L. acidophilus, является продуцирование молочной кислоты (которая сама по себе проявляет определенный бактерицидный эффект) и связанное с этим снижение рН среды до значений, не совместимых с жизнедеятельностью многих групп микроорганизмов. Поэтому для исключения влияния на антагонистический эффект молочной кислоты, проводили её нейтрализацию стерильным 10 %-м раствором NaOH. Все исследованные штаммы L. acidophilus проявляли антагонистический эффект по отношению к штаммам E.coli, но степень антагонистической активности этого эффекта варьирует (табл. 7). Таблица 7 Антагонистическая активность 24-часовых культур ацидофильных палочек к штаммам кишечных палочек до и после нейтрализации их раствором NaOH Минимальное соотношение клеток (МСК) штаммов антагонист/тест-штамм, вызывающее полное № Штаммы подавление роста тест-штамма L. acidophilus до нейтрализации после нейтрализации СКМ-829 СКМ-830 СКМ-829 СКМ-830 2 2 1 СКМ-492 1 10 10 104 2 СКМ-495 103 104 104 107 3 СКМ-497 1 103 106 108 4 СКМ-498 1 102 106 107 5 СКМ-499 102 104 103 105 6 СКМ-500 1 1 102 103 7 СКМ-501 1 1 106 107 8 СКМ-502 102 104 106 107 9 СКМ-503 102 103 103 106 10 СКМ-504 1 1 1 101 11 СКМ-505 1 1 1 1 14 Большинство штаммов ацидофильной палочки (7 из 11) полностью подавляли штамм СКМ-829 уже при соотношении 1:1 (МСК=1). Среди остальных 4 штаммов наименьшую активность наблюдали у штамма СКМ-495 (МСК=103). Тест-штамм E. coli СКМ-830 оказался более устойчив к антагонистам, чем штамм СКМ-829: максимальную активность (МСК=1) проявили по отношению к нему только 4 штамма L. acidophilus (СКМ-505, СКМ-500, СКМ-501 и СКМ-504), у остальных штаммов отмечено изменение МСК в сторону до 102–104 (табл.7). ГЛАВА 5 . СРАВНИТЕЛЬНАЯ ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ШТАММОВ LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS 5.1. Желчеустойчивость Устойчивость к желчи – важное свойство пробиотических штаммов лактобацилл, позволяющее прогнозировать возможность их адгезии к эпителиальным клеткам кишечника. Штаммы L. аcidophilus существенно различаются по устойчивости к этому фактору. Поэтому все изучаемые нами штаммы мы проверили на чувствительность к воздействию различных концентраций (0, 10, 20, 30 и 40 %) медицинской желчи. Анализ результатов исследования показал, что высокую чувствительность к желчи проявил только 1 штамм – СКМ-505, у которого рост отсутствовал даже при наименьшей из испытанных концентраций желчи (табл.8). Таблица 8 Рост штаммов L. acidophilus при различной концентрации желчи Штаммы Рост штаммов при различной концентрации желчи L. acidophilus 0% 10 % 20 % 30 % 40 % СКМ-492 + + + + + СКМ-495 + + + + – СКМ-497 + + + + + СКМ-498 + + + + – СКМ-499 + + + + + СКМ-500 + + + + + СКМ-501 + + + + + СКМ-502 + + + + – СКМ-503 + + + + + СКМ-504 + + + + + СКМ-505 + – – – – Условные обозначения: «+» – рост есть; «–» – признаки роста отсутствуют Все остальные штаммы L. acidophilus хорошо росли в присутствии от 10 до 30 % концентрации желчи, причем у четырёх штаммов (СКМ-497, СКМ-498, СКМ-500 и СКМ-504) рост в виде помутнения среды обнаружился, уже после 24 часов инкубирования, тогда как у остальных штаммов – лишь через 48 часов. 15 Наиболее устойчивыми к высокой концентрации желчи (40%) в субстрате оказались штаммы СКМ-492, СКМ-497, СКМ-499, СКМ-500, СКМ-501, СКМ503 и СКМ-504; рост у штаммов СКМ-495, СКМ-498, СКМ-502 и СКМ-505 при высокой концентрации желчи отсутствовал (табл. 8). Таким образом, 7 из 11 исследованных штаммов L. acidophilus проявили очень высокую степень желчеустойчивости (до 40%) и являются перспективными для включения их в состав пробиотических продуктов и заквасок. 5.2. Биосовместимость штаммов L. acidophilus между собой Биосовместимость штаммов L. acidophilus проверяли методом агаровых блоков на твердой питательной среде «АГМ для палочек». Результаты исследования показали, что зоны ингибирования характерны только для штаммов СКМ-495, СКМ-504 и СКМ-502 и лишь по отношению к одному штамму – СКМ-505. Таким образом, все исследованные штаммы L. аcidophilus, кроме штамма СКМ-505, являются биосовместимыми и, следовательно, могут использоваться в приготовлении многоштаммовых заквасочных комбинаций ацидофильной палочки. 5.3. Биосовместимость штаммов L. acidophilus и P. freudenreichii Биосовместимость L. acidophilus и P. freudenreichii также проверяли методом агаровых блоков на твердой питательной среде «АГМ для палочек». Результаты исследования показали, что все изучаемые штаммы L.acidophilus и P. freudenreichii не проявили ингибирующего эффекта по отношению друг к другу при совместном культивировании. Таким образом, все исследованные штаммы L. acidophilus и P. freudenreichii использоваться для приготовления многоштаммовых заквасочных комбинаций ацидофильной палочки и пропионовокислых бактерий. Так как штамм СКМ-785 из всех исследуемых штаммов пропионовокислых бактерий известен как наиболее активный продуцент витамина В12 (Отт, 1984; Воробьева, 1995), то именно он использовался нами для дальнейших исследований. А из изученных штаммов L. acidophilus для дальнейших исследований использовали штамм СКМ-500, так как он проявил себя во всех экспериментах стабильно как сильный антагонист, а также обладает высокой степенью желчеустойчивости и биосовместимости. 5.4. Жизнеспособность L. acidophilus и P. freudenreichii в различных экологических условиях 5.4.1. Выращивание на разных средах Для изучения жизнеспособности L. acidophilus и P. freudenreichii на разных средах эти культуры выращивали совместно на каждой из сред, после чего хранили в течении 30 суток в холодильнике (6-8ºС). Контролем служили чистые культуры L. acidophilus и P. freudenreichii, выращенные при таких же 16 условиях культивирования. Культивирование проводилось на следующих вариантах сред: 1 – Стерильное обезжиренное молоко. 2 – Стерильное обезжиренное молоко/стерильная подсырная сыворотка в соотношении 1:1. 3 – Стерильная подсырная сыворотка. Вариант 1. Анализ динамики численности L. acidophilus и P. freudenreichii (рис.1) показал, что в пробе численность ацидофильной палочки выше, чем в контроле, на протяжении всего срока хранения. Это можно объяснить тем, что пропионовокислые бактерии стимулируют рост ацидофильной палочки. Численность P. freudenreichii в пробе также выше по сравнению с контролем на протяжении всего срока хранения, т.к. ацидофильная палочка в процессе своей жизнедеятельности выделяет в среду молочную кислоту. А лактат, в свою очередь, является питательным субстратом для пропионовокислых бактерий. Рис. 1. Динамика численности L. acidophilus и P. freudenreichii при хранении на обезжиренном молоке Вариант 2. Анализ динамики численности L. acidophilus и P. freudenreichii при хранении на молочной сыворотке выявил, что численность пробиотических культур (L. acidophilus и P. freudenreichii) снижается по сравнению с выращиванием на обрате, но сохраняет тот же порядок (107 КОЕ/см3). Численность обеих культур, как и в предыдущем варианте, в опытных образцах выше, чем в контрольных (рис. 2). 17 Рис. 2. Динамика численности L. acidophilus и P. freudenreichii при хранении на молочной сыворотке Вариант 3. Анализ динамики численности L. acidophilus и P. freudenreichii при хранении на смешанной среде выявил, что численность ацидофильной палочки и пропионовокислых бактерий аналогична той, что регистрировалась при выращивании на обезжиренном молоке или сыворотке по отдельности и составила 107 КОЕ/см3 (рис. 3). Рис. 3. Динамика численности L. acidophilus и P. freudenreichii при хранении на смешанной среде сыворотка/обрат Таким образом, численность L. acidophilus и P. freudenreichii при культивировании и последующем хранении во всех вариантах сред сохраняется на высоком (107 КОЕ/см3). 18 5.4.2. Совместное и раздельное культивирование L. acidophilus и P. freudenreichii культивировали совместно и раздельно на обезжиренном молоке, после чего хранили в течении 30 суток в холодильнике (6-8ºС). Контролем служили чистые культуры L. acidophilus и P. freudenreichii, культивируемые при таких же условиях. При раздельном культивировании ацидофильная палочка показывает хорошую выживаемость до 30 суток хранения, ее численность выше в пробе по сравнению с контролем (рис. 4) и составляет 2,1·107 КОЕ/см3 в пробе и 1,1·107 КОЕ/см3 в контроле (рис. 4). КОЕ/см3, 108 3,5 3 2,5 2 Контроль Проба 1,5 1 0,5 0 1 10 20 30 время хранения, сутки Рис. 4. Динамика численности L. аcidophilus при раздельном культивировании 3 КОЕ/см , 10 6 8 5 4 Контроль 3 Проба 2 1 0 1 10 20 30 время хранения, сутки Рис. 5. Динамика численности P. freudenreichii при раздельном культивировании 19 Численность пропионовокислых бактерий при раздельном культивировании достигла своего максимума на 30 сутки хранения и составила 5,1·108 КОЕ/см3 в пробе (рис. 5). При совместном культивировании численность L. аcidophilus составляет 2,7·108 КОЕ/см3 на 20-е сутки хранения, что сопоставимо с раздельным вариантом культивирования. На первые сутки в контроле численность ацидофильной палочки несколько выше на контроле, но при дальнейшем хранении численность пробиотической культуры в пробе превышает значения по сравнению с контролем (рис. 6). КОЕ/см3, 108 3 2,5 2 Контроль Проба 1,5 1 0,5 0 1 10 20 30 время хранения, сутки Рис. 6. Динамика численности L. аcidophilus при совместном культивировании КОЕ/см3, 108 6 5 4 Контроль Проба 3 2 1 0 1 10 30 20 время хранения, сутки Рис. 7. Динамика численности P. freudenreichii при совместном культивировании Численность пропионовокислых бактерий в пробе выше по сравнению с контролем на протяжении всего срока хранения. Максимальная численность пропионовокислых бактерий отмечена на 30-е сутки хранения и составила 4,9·108 КОЕ/см3. По сравнению с раздельным культивированием, численность пропионовокислых бактерий при совместном культивировании сохранилась на том же уровне и составила 108 КОЕ/см3 (рис. 7). 20 При хранении проб постоянно изменяется титруемая кислотность. Анализ изменения титруемой кислотности в зависимости от продолжительности культивирования выявил, что титруемая кислотность при раздельном и совместном культивировании постепенно нарастает при хранении и достигает максимума при 30 сутках культивирования, что является естественным процессом, так как в среде накапливаются продукты обмена микроорганизмов. Которые смещают рН среды в кислую сторону. Разница титруемой кислотности при совместном и раздельном культивировании составила 5%. Также отмечено, что в опытной пробе титруемая кислотность ниже, чем в контрольных образцах на протяжении всего срока хранения. Это можно объяснить тем, что пропионовокислые бактерии, используя лактат, который выделяет ацидофильная палочка, тем самым понижают кислотность среды. Таким образом, установлено, что способ культивирования (совместное или раздельное) не влияет на численность L. acidophilus и P. freudenreichii и на титруемую кислотность при хранении. ГЛАВА 6. БИОТЕХНОЛОГИЯ АЦИДОФИЛЬНОГО ПРОБИОТИЧЕСКОГО НАПИТКА НА ОСНОВЕ МОЛОЧНОЙ ПОДСЫРНОЙ СЫВОРОТКИ Данные, полученные в экспериментах по влиянию экологических факторов на антагонистическую активность ацидофильной палочки, а также по выращиванию раздельных и совместных культур ацидофильной палочки и пропионовокислых бактерий в молочных средах, использовали для разработки пробиотической закваски и биотехнологии напитка на основе молочной (подсырной) сыворотки с использованием пробиотической закваски. ВЫВОДЫ 1. Показано, что по морфолого-культуральным свойствам исследованные 11 отечественных штаммов L. acidophilus соответствует общепринятому описанию неотипового штамма L. acidophilus АТСС 4356, но отличаются от зарубежного штамма La-5 (СКМ-506). 2. Выявлено, что на рост и антагонистическую активность L. acidophilus по отношению к штаммам тест-культуры E. coli влияют такие экологические факторы, как аэробные и анаэробные условия, активная кислотность среды и наличие молочной кислоты в культуральной жидкости. В анаэробных условиях антагонистическая активность исследуемых штаммов L. acidophilus повышается по сравнению с аэробными условиями. При смещении активной кислотности среды в щелочную сторону антагонистическая активность исследуемых штаммов L. acidophilus понижается, а при смещении активной кислотности среды в кислую сторону – повышается. Нейтрализация молочной кислоты в культуральной жидкости приводит к уменьшению антагонистической активности штаммов L. acidophilus. 3. Установлено, что характер субстрата не влияет на антагонистическую активность L. acidophilus по отношению к штаммам тест-культуры E. coli. 21 4. Определено, что большинство (7 из 11) исследованных штаммов L. acidophilus являются желчеустойчивыми (до 40%). 5. Установлено, что все исследованные штаммы L. acidophilus являются биосовместимыми между собой (за исключением штамма СКМ-505) и все 11 штаммов биосовместимы с исследованными штаммами P. freudenreichii. 6. Показано, что численность L. acidophilus и P. freudenreichii сохраняется на высоком уровне (107 КОЕ/см3) во всех исследованных вариантах среды (обезжиренное молоко, сыворотка, обезжиренное молоко/сыворотка). 7. Выявлено, что способ культивирования (совместное или раздельное) не влияет на численность L. acidophilus и P. freudenreichii и на титруемую кислотность при хранении. 8. Разработана пробиотическая закваска и биотехнология приготовления ацидофильного пробиотического напитка на основе молочной (подсырной) сыворотки. СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ: 1. Иркитова А.Н., Вечернина Н.А. Биотехнология пробиотического напитка на основе молочной (подсырной) сыворотки // Известия Алтайского государственного университета. Серия Биологические науки. – №3/1. – 2010. – С.30-32. 2. Иркитова А.Н. Сравнительная оценка штаммов ацидофильной палочки для использования в составе пробиотических продуктов // Вестник уральской медицинской академической науки. №4/1 (38). – 2011. – С.30-31. 3. Иркитова А.Н., Каган Я.Р., Соколова Г.Г. Антагонистическая активность молочных культур Lactobacillus acidophilus по отношению к тестштаммам Escherichia coli // Известия Алтайского государственного университета. Серия Биологические науки. – №3/1 – 2011. – С.19-22. Публикации в других журналах и сборниках: 4. Каган Я.Р., Сергеева И.Я., Зуева Л.А., Иркитова А.Н. Пробиотические кисломолочные продукты в магазинах города Барнаула // Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока. – 2008. – Вып. 5. – С. 269-282. 5. Иркитова А.Н. Оптимологический подход к осмыслению биоценоза в валеологической практике // Интеллектуальный потенциал ученых России. – 2009. – С.151-153. 6. Каган Я.Р., Сергеева И.Я., Отт Е.Ф., Иркитова А.Н. Пробиотический кисломолочный напиток на основе подсырной молочной сыворотки // Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока. – 2009. – Вып. 6. – С. 186-190. 7. Иркитова А.Н., Каган Я.Р., Вечернина Н.А. Биотехнология пробиотического напитка на основе молочной (подсырной) сыворотки // 22 Материалы XI городской научно-практической конференции «МОЛОДЕЖЬБАРНАУЛУ». – 2009. – С.520-521. 8. Иркитова А.Н., Соколова Г.Г. Биотехнология пробиотического напитка на основе молочной (подсырной) сыворотки // Биотехнология начала III тысячелетия. Саранск: ООО «Мордовия - Экспо». – 2010. – С.72-73. 9. Иркитова А.Н., Соколова Г.Г. Переработка отходов молочного производства // Первая Всероссийская молодежная научная конференция, посвященная 125-летию биологических исследований в Томском государственном университете. – 2010. – С.272-274. 10. Иркитва А.Н. Биотехнология сывороточного напитка // Технологии и оборудование химической, биотехнологической и пищевой промышленности. – 2011. – С.193-196. 11. Иркитова А.Н., Каган Я.Р. Свойства, экологические аспекты и практическое значение ацидофильной палочки. Описание и местообитание // Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока. – 2011. – Вып.8. – С.207-212. 12. Иркитова А.Н., Каган Я.Р. Свойства, экологические аспекты и практическое значение ацидофильной палочки. Систематика и культивирование // Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока. – 2011. – Вып.8. – С.213-216. 13. Иркитова А.Н., Каган Я.Р. Свойства, экологические аспекты и практическое значение ацидофильной палочки. 3. Антагонистическая активность // Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока. – 2011. – Вып.8. – С.216-222. 14. Иркитова А.Н., Каган Я.Р. Свойства, экологические аспекты и практическое значение ацидофильной палочки. Пробиотические свойства и лизогения // Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока. – 2011. – Вып.8. – С.222-230. 15. Иркитова А.Н., Каган Я.Р. Свойства, экологические аспекты и практическое значение ацидофильной палочки. Практическое использование // Актуальные проблемы техники и технологии переработки молока. – 2011. – Вып.8. – С.230-239.
