Современные методы лабораторной диагностики

реклама
Современные методы
лабораторной диагностики
инфекционных заболеваний
Иванов Андрей Михайлович
доктор медицинских наук, профессор
Военно-медицинская академия
им. С.М. Кирова
Лабораторная диагностика
С.П. Боткин – Р. Вирхов
ИСТОРИЯ
Клиническая лабораторная
диагностика
• Лабораторная медицина в нашей стране имеет глубокие корни,
формировалась она, как и многие другие медицинские дисциплины,
на базе военной медицины. Первая клиническая лаборатория была
открыта при кафедре факультетской терапии Военно-медицинской
академии С.Петербурга в 1840 г.г. , начальником ее был доктор К.К.
Зейдлиц. Первые лаборатории делали примитивные исследования :
сахар в моче, мочевина, белок. Тем не менее, именно в этот период
был открыт белок Бенс-Джонса.
• С.П.Боткин создал клинико-экспериментальную лабораторию при
кафедре факультетской терапии Военно-медицинской академии
примерно в 1860 г для проведения клинико-экспериментальных
исследований. Затем этой лабораторией руководил И.П.Павлов, он в
этот период занимался фармакологией, затем перешел на кафедру
нормальной физиологии, где приобрел мировую известность. Эти
великие медики в пору становления лабораторной службы видели в
лаборатории источник объективной информации о больном, который
скрыт даже от самого опытного терапевта.
Кафедра факультетской терапии ВМедА
(Тыренко В.В. И соавт., 2011)
Методы диагностики
Автор, год
Внедрен микроскоп для
лабораторных исследований
К.К. Зейдлиц, 1840
Организована клиническая
лаборатория
К.К. Зейдлиц, 1840
Организована физиологическая
лаборатория
С.П. Боткин, И.П. Павлов, 1876
Значительно расширена
клиническая лаборатория
С.П. Боткин, 1884
Организована бактериологическая
лаборатория
Л.В. Попов, 1891
Культивирование анаэробов
(анаэростат)
С.С. Боткин, 1891
Выявлена закономерность
лейкоцитарной реакции при
инфекционных болезнях и
предложена методика
определения лейкоцитоза
С.С. Боткин, Н.Я. Чистович,
1891-92 гг.
Кафедра факультетской терапии
(Тыренко В.В. И соавт., 2011)
Методы диагностики
Обоснованы методы
фракционного исследования
желудочной секреции и
мочеотделения
Предложен метод
морфологического исследования
плевральных экссудатов
Открыт и описан возбудитель
«маньчжурского тифа»
Автор, год
С.С. Зимницкий, 1901-02 гг.
В.Н. Стасевич, 1903
С.С. Боткин, С.С. Зимницкий ,
1909
1884 год - Разделение кафедры химии:
- Кафедра неорганической химии
- Кафедра органической и физиологической
химии с физиолого-химической лабораторией
(фактическое разделение состоялось в 1892 году)
Член-корреспондент
Петербургской АН
Данилевский А.Я.
(1838 - 1923)
C 1906 по 1910 год –
начальник
Военно-медицинской академии
Конференция ВМедА
(1906-1910)
Современные тенденции и перспективы
лабораторной диагностики инфекций
• этиологическая диагностика
• ускорение лабораторного цикла обследования
пациентов
• изучение резистентности возбудителей к
антимикробным препаратам
• молекулярный мониторинг распространения
возбудителей
Современные тенденции и перспективы
лабораторной диагностики инфекций
• этиологическая диагностика
• ускорение лабораторного цикла обследования
пациентов
• изучение резистентности возбудителей к
антимикробным препаратам
• молекулярный мониторинг распространения
возбудителей
Проблемные вопросы при серологической
диагностике инфекционных заболеваний
• Активный процесс или анамнестическая
инфекция?
• Реинфекция или рецидив?
• Контроль излеченности?
• Целесообразность вакцинации?
• Эффективность поствакцинального
иммунитета?
• Нейроинфекция?
• Врожденная инфицированность?
Повышение информативности
серологической диагностики:
•
получение искусственных аналогов микробных
антигенов и их использование в диагностических
препаратах
•
раздельное выявление классов и подклассов
специфических иммуноглобулинов (IgM, IgG1,
IgG2, IgG3, IgG4)
•
изменение трактовки результатов
серологического тестирования
Относительная концентрация
Серологический профиль HIV-1 инфекции
(пример информативности определения спектра антител)
Anti-HIV Env
Anti-HIV IgM
Anti-HIV Core
HIV Ag
HIV-1
инфекция
недели
HIV Ag
месяцы
годы
время
Пример расположения антигенов
в иммуноблоттинге
TpN47
TpN17
стрептавидин
Контроли
± 1+ 3+
TmpA
TpN15
Антигены
Биочипы
Повышение информативности
серологической диагностики:
•
получение искусственных аналогов микробных
антигенов и их использование в диагностических
препаратах
•
раздельное выявление классов и подклассов
специфических иммуноглобулинов (IgM, IgG1,
IgG2, IgG3, IgG4)
•
изменение трактовки результатов
серологического тестирования
Биологические свойства иммуноглобулинов человека
СВОЙСТВА Ig
КЛАССЫ И ПОДКЛАССЫ
A1
A2
G1
G2
G3
G4
D
E
M
Активация комплемента
-
-
++
+
++
-
-
-
-
Перенос через плаценту
-
-
+
+
+
+
-
-
-
Перенос через слизистые
+
+
-
-
-
-
-
-
-
Связывание с FcαR1
+
+
-
-
-
-
-
-
-
Связывание с FcγR-I
-
-
++
-
++
+
-
-
-
Связывание с FcγR-II
-
-
+
-
+
-
-
-
-
Связывание с FcγR-III
-
-
+
-
+
-
-
-
-
Связывание с FcδR-I
-
-
-
-
-
-
+
-
-
Связывание с FcεR (I и II)
-
-
-
-
-
-
-
++
-
Связывание с FcμR
-
-
-
-
-
-
-
-
+
Связывание РФ
-
-
+
+
+
+
-
-
-
Связывание с белком А
-
-
+
+
-
+
-
-
-
Связывание с белком G
-
-
+
+
+
+
-
-
-
Биологические свойства подклассов иммуноглобулинов человека
Биологические
свойства
Подклассы IgG
IgG1
IgG2
IgG3
IgG4
7,1
3,0
0,80
0,40
58-71
19-31
5-10
3-6
Экспрессия на В-лимфоцитах, %
40
48
8
1
% плазмоцитов-продуцентов
64
26
8
1
60-70
15-20
4-8
2-6
++
+
+++
-
Связывание с FcγR-I
+++
+
+++
+
Связывание с FcγR-II
++
+
++
+
Связывание с FcγR-III
++
+
++
+
+
+
-
+
Связывание с белком А
++
++
-
++
Связывание с белком G
++
++
++
++
Перенос через плаценту
++
+
++
++
12-21
12-21
7-8
11-21
Блокир. активность при аллергии
-
-
-
+
Функциональная валентность
2
2
2
1
Содержание в сыворотке, мг/мл
Содержание в сыворотке, %
Частота миелом-продуцентов, %
Связывание C1q
Связывание с РФ
Время полужизни в крови
Перспективы совершенствования
методов серологической диагностики
• Использование Fab-фрагментов
антител при конструировании
биосенсоров
• Использование аптамерных и
пептидных лигандов
• Проточная цитометрия
Перспективные методы
серологической диагностики
• Клеточно-опосредованная детекция
• Химическая детекция
• Физическая детекция (поверхностные
плазмон резонансные биосенсоры)
Современные тенденции и перспективы
лабораторной диагностики инфекций
• этиологическая диагностика
• ускорение лабораторного цикла обследования
пациентов
• изучение резистентности возбудителей к
антимикробным препаратам
• молекулярный мониторинг распространения
возбудителей
Современные тенденции и перспективы
лабораторной диагностики инфекций
• этиологическая диагностика
• ускорение лабораторного цикла обследования
пациентов
• изучение резистентности возбудителей к
антимикробным препаратам
• молекулярный мониторинг распространения
возбудителей
Ускорение лабораторного цикла
обследования пациентов
• Рациональная организация лабораторного
диагностического процесса
• Использование методов экспресс-диагностики
• Миниатюризация формата исследования, за счет
новых биомедицинских технологий и
высокотехнологичных платформ лабораторного
анализа
• Компьютеризация
Современные тенденции и перспективы
лабораторной диагностики инфекций
• этиологическая диагностика
• ускорение лабораторного цикла обследования
пациентов
• изучение резистентности возбудителей к
антимикробным препаратам
• молекулярный мониторинг распространения
возбудителей
Современные тенденции и перспективы
лабораторной диагностики инфекций
• этиологическая диагностика
• ускорение лабораторного цикла обследования
пациентов
• изучение резистентности возбудителей к
антимикробным препаратам
• молекулярный мониторинг распространения
возбудителей
Современные тенденции и перспективы
лабораторной диагностики инфекций
• этиологическая диагностика
• ускорение лабораторного цикла обследования
пациентов
• изучение резистентности возбудителей к
антимикробным препаратам
• молекулярный мониторинг распространения
возбудителей
Молекулярный мониторинг распространения
возбудителей инфекционных заболеваний
• Полиморфизм длины рестрикционных
фрагментов хромосомной и плазмидной
ДНК
• Саузерн-блоттинг
• Пульс-электрофорез
• ДНК-секвенирование
Мультиплексная (мультипраймерная) ПЦР
•Дает возможность индикации
геномной ДНК разных
микроорганизмов
одномоментно в одной пробе
биологического материала
•Особенно перспективной при
диагностике является
мультипраймерная
модификация ПЦР,
позволяющая за один анализ
из одной пробы определять
несколько типов возбудителей.





Прямая протеомная идентификация
микроорганизмов
Метод позволяет проводить прямой
масс-спектрометрический анализ
белковой фракции микробной клетки
(прямое белковое профилирование) и
получать уникальные масс-спектры с
высокой точностью и разрешением,
характеризующие исследуемый объект
по типу “отпечатков пальцев”.
Достоинства метода:
Высокая аналитическая чувствительность достаточно 10-15 – 10-18 вещества
Быстрая и простая пробоподготовка: 10 – 15 минут
Высокая скорость измерения: 1 минута на образец
Возможность автоматизации и роботизации всех
стадий исследования
Возможность идентификации более 3000 бактерий и
грибов
Nobel Prize 2011 and Shaw Prize 2011
(medicine)
Charles Janeway – идея о существовании PRR
Bruce A. Beutler – экспериментальное подтверждение
PRR* мыши
Jules A. Hoffmann – экспериментальное подтверждение
PRR дрозофил
Ruslan Medzhitov – экспериментальное подтверждение
PRR человека
100-летие Нобелевской премии
И.И. Мечникова и П. Эрлиха
2008 год
«Лекции о
сравнительной
патологии воспаления»
1892 год
Максимов Александр Александрович [4.2.1874 4.12.1928] - выдающийся российский учёный,
гистолог и эмбриолог.
•А.А.Максимов родился в СанктПетербурге, где в 1896 году с
отличием окончил Военномедицинскую академию. С 1903
по 1922 гг. А.А.Максимов
занимал пост профессора
кафедры гистологии Военномедицинской академии.
• В 1922 г. эмигрировал в США,
где с 1922 по 1928 годы являлся
профессором кафедры
анатомии медицинского
факультета Чикагского
университета.
Строение бактериальной клеточной стенки
Свойства патоген-ассоциированных
молекулярных паттернов (ПАМП)
• Синтезируются только микроорганизмами, их
синтез отсутствует в клетках макроорганизма.
• Являются наиболее общими для
микроорганизмов структурами.
• Структуры в составе ПАМП, распознаваемые
ПРР (а значит и врожденной иммунной
системой), являются важными для выживания и
патогенности микроорганизмов – отличаются
консервативностью и неподверженностью
мутациям.
Специфичность сигнальных рецепторов врожденного иммунитета
Тип
патогена
PRR
Лиганды
TLR-1
Триациллипопептиды, модулин M. tuberculosis
 грам-[+],
 грам-[–]
TLR-2
Липопротеиды большинства патогенов, пептидогликаны, липотейхоевые и
маннуроновые кислоты, порины Neisseria, атипичные ЛПС, факторы
вирулентности Yersinia, вирионы CMV, зимозан




TLR-3
Двунитчатая РНК
 вирусы
TLR-4
ЛПС грам-отрицательных бактерий, HSP60, полимерные маннуроновые кислоты,
флаволипиды, тейхуроновые кислоты, пневмолизин, оболочечный белок RSV
 грам-[+],
 грам-[–],
 вирусы
TLR-5
Флагеллин
 грам-[+]
TLR-6
Диациллипопептиды, модулин, липотейхоевая кислота, зимозан
 грам-[+],
 грибы
TLR-7
Однонитчатая РНК, синтетические вещества
 вирусы
TLR-8
Однонитчатая РНК, синтетические вещества
 вирусы
TLR-9
Неметилированная СpG ДНК
 грам-[+],
 грам-[–]
TLR-10
Неизвестны
TLR-11
Уропатогенные бактерии
NOD1
Пептидогликаны (GM-Tridap)
 грам-[+]
NOD2
Пептидогликаны (ГМДП)
 грам-[–]
грам-[+],
грам-[–],
грибы,
вирусы
Специфичность распознавания ПАМП различными TLR
ПАМП
Патоген
Триацетилированные липопептиды (липо­гликаны
липоманнан и липоарабиноманнан),
Mycobacterium tuberculosis
Mycobacterium leprae
фосфатидилинозитолдиманнозид и липопротеин
19 кД)
Диацетилированные липопептиды
Липополисахарид
Leptospira interrogans, Porphyromonas gingivalis, Helicobacter
pylori
Белки вирусной оболочки
цитомегаловирус, вирус кори, вирус герпеса HSV-1
Гликозилфосфатидилинозитол
простейшие (Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei,
Toxoplasma gondii, Leishmania major, Plasmodium falciparum)
Липопротеины, пептидогликаны, липотейхоевые
кислоты
Зимозан
Гликолипиды
Модулин
Двуцепочечная РНК
Липополисахарид
F(fusion)-протеин вирусной оболочки
Грам-позитивные бактерии (Staphylococcus aureus,
Streptococcus pneumoniae)
грибы (дрожжи)
Treponema pallidum
вирусы и бактерии
TLR2
TLR1/TLR2,
TLR2/TLR6
TLR3
RSV
Бактериальный флагеллин
Legionella pneumophila, Salmonella typhimurium
REP-последовательности ДНК
TLR2/TLR6
Грам-негативные бактерии
Гликозилфосфатидилинозитол
CpG ДНК
TLR1/TLR2
Staphylococcus epidermis
простейшие (Trypanosoma cruzi, Trypanosoma brucei,
Toxoplasma gondii, Leishmania major и Plasmodium falciparum)
Одноцепочечная РНК
Рецептор
вирус HCV
Mycobacterium tuberculosis, вирусы HCV, HIV-1, RSV
вирусы герпеса HSV-1 и HSV-2, HIV, простейшие (Trypanosoma
cruzi, Trypanosoma brucei, Toxoplasma gondii, Leishmania major
и Plasmodium falciparum)
Salmonella typhimurium, Escherichia coli, Salmonella enterica,
Pseudomonas aeruginosa, Neisseria meningitidis
TLR4
TLR5
TLR7
TLR8
TLR9
Активация сигнальных рецепторов
(TLR, NOD)
•
•
•
•
NF-kB
AP-1
Fos
Jun
ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫЕ
ЦИТОКИНЫ
Биологические эффекты цитокинов
Фагоциты
Эффект цитокинов реализуется
в трех направлениях:

Фагоциты – активация фагоцитоза,
презентация антигена, продукция
Зрелые Ти В- клетки
свободных радикалов

Зрелые Т- и В-клетки – усиление функций (увеличение продукции
Ig, активация киллеров)
Наивные Ти В- клетки

Наивные Т- и В-клетки – активация и подготовка к иммунному
ответу
Алгоритм иммунологического обследования при
сифилисе
Клинико-лабораторная и серологическая
диагностика сифилиса
(скрининг + верификация)
Положительный
результат
(сифилис)
Отрицательный
результат
Сифилис
исключается
Определение
IFN-γ, IL-1β, IL-2, ФЧ
Выраженных изменений
иммунологических показателей
не выявлено
Вероятность развития
серорезистентности низкая
IFN-γ ↑, IL-1β ↑, IL-2 ↑,
ФЧ ↓
Вероятность развития
серорезистентности
высокая
Влияние факторов иммунитета на
эффективность лечения хронического
трихомониаза
Хронический
трихомониаз
IFN-γ ↑, IL-1β ↑
CD19+↓, IL-8(N)
Th1
Неблагоприятный прогноз
эффективности терапии
Определение
IFN-γ, IL-1β, IL-8,
CD19+
CD19+↑, IL-8↑
IFN-γ(N), IL-1β(N)
Th2
Благоприятный прогноз
эффективности терапии
Критерии прогноза течения ХГС
TNF-α ↑
Ig A ↑
IL-10 ↑
Неблагоприятный
прогноз течения
ХГС
ФЧ ↓
IFN-γ ↑
Ig G ↑
Прогноз при инфекционных заболеваниях
определяется активацией иммунной
системы в направлении наиболее
эффективного пути (Th1/Th2) элиминации
этиологического агента
АЛГОРИТМ ОЦЕНКИ
ГЕНЕТИЧЕСКОГО ПОЛИМОРФИЗМА В ПРОФИЛАКТИКЕ И ДИАГНОСТИКЕ
ИНФЕКЦИОННЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ
Генетические
факторы
Фенотипические
факторы
Предрасположенность
к инфекции
Геномный анализопределение SNP
Риск развития
заболевания
Течение
заболевания
Исход
заболевания
Генетический полиморфизм рецепторов TLR-семейства
Ген
TLR1
TLR2
TLR6
TLR4
TLR5
TLR7
Полиморфизм
гена
1805G/T
944C/Т
743A/G
914A/Т
Полиморфизм белка
Фенотипическая ассоциация
серин-602/изолейцин
пролин-315/лейцин
аспарагин-248/серин
гистидин-305/лейцин
Туберкулез, лепра
2408G/A
аргинин-753/глутамин
2180C/T
аргинин-677/триптофан
2021C/A
пролин-631/гистидин
597T/C
аспарагин-199/аспарагин
745Т/С
752Т/А
2069А/С
460/461Del AATAA
896A/G
пролин-680/гистидин
серин-249/пролин
лейцин-251/стоп-кодон
аспарагин-690/треонин
?
аспарагин-299/глицин
1196C/T
треонин-399/изолейцин
1174С/Т
32A/T
2403G/A
аргинин-392/стоп-кодон
?
?
септический шок, туберкулез,
менингит,
лепра, остеомиелит
туберкулез, менингит, лепра
(особенно
лепроматозная)
системная менингококкемия
туберкулез (особенно
милиарный)
Туберкулез
Грам-негативные инфекции, в
том числе сепсис и
септический шок, вирус RSV
пневмония
хроническая HCV-инфекция
Полиморфизм молекул иммуногенного сигналинга
Протеин
Генный сайт
SNP*
Фенотип**
rs6853
A/G
IL-10, Ig
rs11466004
85С/Т
IL-10, Ig
rs5029748
С/А
IL-4
rs3747811
Т/А
IL-10
rs1801
C/G
IL-12p40
rs230494
A/G
rs230544
С/Т
провоспалительные
rs230547
С/Т
цитокины
rs1585213
G/A
TRAF6
rs5030419
С/G
IRAK1
rs1059703
6434С/Т***
IRAK3
rs3782347
48836A/G
rs4251520
13423Т/С
?
877С/T
?
620–621del
MyD88
MD2
IK
NFB
IRAK4
Jun
?
34C/T (Arg12Cys)
rs11688
750G/A
IFN-γ
вакциноиндуцированные Ig
IL-1, IL-18
провоспалительные
цитокины
IL-6, TNF-
Ассоциации генотипа по HLA и фенотипа при инфекции
Ген
Аллели и гаплотипы
Патоген
Фенотипическая ассоциация
DRB1*1101
HCV
устойчивость к инфекции
DRB1*1101
спонтанный клиренс инфекции
DRB1*06, *08, *16
хронический гепатит
DRB1*07, DRB1*1101/1104, DRB1*1201
устойчивость к инфекции
спонтанный клиренс инфекции
DRB1*1301, *1302
DRB1*14
HLA-DR
HBV
ответ на лечение интерфероном
DRB1*03, *07, *09, *12, *15
хроническая инфекция
DR6, DR13
спонтанный клиренс инфекции
DR9
хроническая инфекция
DR10, DRB1*0301
хронический гепатит
DRB1*0101, *1101, *1104, *1501
HCV
спонтанный клиренс инфекции
DR13
H. pylori-ассоциированный
DRB1*0301
H. pylori
аутоиммунный тиреоидит и
аутоиммунный гастрит
DQB1*1001
P. falciparum
тяжелая нецеребральная малярия
устойчивость к малярии
DRB1*1302
DQB1*0303, DQB1*0301/*0304,
DQB1*0502, DQB1*0201, DQB1*0301,
HLA-DQ
хронический гепатит
DQB1*0301, DQ9
DQB1*0301
DQB1*0501, DQA1*0301,*0302
HLA-DQ
HBV
HCV
DQВ1*0501
P. falciparum
DQ6 (B*0602)
HPV16
DQB1*0503
устойчивость к инфекции
спонтанный клиренс инфекции
устойчивость к малярии
прогрессирующие эпителиальные
поражения
прогрессирование туберкулеза
Ассоциации генотипа по HLA и фенотипа при инфекции
Ген
Аллели и гаплотипы
Патоген
А*02, A* 0301
HBV
A*1101
HCV
HLA-А
В*08, В*35, 44-Cw 1601, 44-Cw
0501
B*57
HLA-В
HBV
HCV
Bw53
Cw*0102
HLA-C
Cw4
С*1507
инфекции
спонтанный клиренс
инфекции
хроническая инфекция,
хронический гепатит
спонтанный клиренс
инфекции
прогрессирования
HIV
ускоренное
прогрессирование
B*1801, *3520, В*57, В*5801
В*46, В*56
спонтанный клиренс
долговременное отсутствие
B*57, B*14, B*27, Bw-4, B*5701
B*3501
Фенотипическая ассоциация
хроническая инфекция
P. falciparum
HCV
церебральная малярия
устойчивость к малярии
спонтанный клиренс
инфекции
ускоренное
HIV
прогрессирование
хроническая инфекция
Ассоциация полиморфизмов генов цитокинов с инфекциями и их исходом
Ген
Полиморфизмы и
Патоген
Фенотипическая ассоциация
HBV
хроническая инфекция
+874A/T
M. tuberculosis
туберкулез
–764G/С
HСV
спонтанный клиренс
HBV
хронический гепатит В
–308G/–238G
HBV
хроническая инфекция
–308G/A
H. pylori
гастрит и рак желудка
СА-повторы
HPV18
рак шейки матки
–1082G/А,–819T/C, –592A/C
HCV
хронический гепатит С и цирроз
гаплотипы
+874A/T
IFNG
СА-повторы
–238G/A
–857C/T
TNF
–592 C/A
IL10
+734 G/T
RSV и другие возбудители
пневмония, осложненная
сепсисом
+3367 G/A
–592A/C
M. tuberculosis
–174G/С
разные возбудители
туберкулез
хроническое воспаление и
тяжелый сепсис
сепсис, острый респираторный
IL6
–174G/С
разные возбудители
дистресс-синдром,
генерализованное воспаление
–236G
HIV и KSHV
саркома Капоши
+4272C/T
вирус кори
корь
Фармакогенетика в персонализированной медицине
Фармакогенетика
Полиморфизм
генов-кандидатов
Скрининг SNP или других
полиморфизмов
Идентификация фармакологических мишеней
Идентификация локусов предрасположенности к болезни
Определение функционального значения полиморфизма
Молекулярная диагностика
Индивидуальная пациентоспецифичная терапия
Инновационная биосенсорная
технология PLEX
Метод основан на сочетании
мультиплексной ПЦР с времяпролетной масс-спектрометрии
нуклеиновых кислот
Возможности технологии
•
•
•
•
•
SNP-генотипирование
Количественный анализ экспрессии генов
Идентификация микроорганизмов (практически
все бактерии, вирусы, грибы, определенные
виды простейших, в том числе информация о
лекарственной
устойчивости,
вирулентности,
токсикогенности)
Количественный анализ метилирования ДНК
Профилирование редких соматических мутаций
Апоптоз
Энергозависимый, генетически
детерминированный процесс
упорядоченной гибели отдельных
клеток, который происходит в
нормальных и патологически
измененных тканях эукариотов под
действием внутри- и внеклеточных
стимулов.
“Термин “апоптоз” предложен для обозначения до сих
пор
недостаточно
понятного
механизма
контролируемого
разрушения
клеток
…
это
активный, по сути программируемый феномен, для
которого доказана возможность активации или
подавления различными стимулами окружающей
среды,
как
физиологическими,
так
и
патологическими”.
Kerr J.F.R., Wyllie A.H., Currie A.R. (из статьи “Апоптоз:
фундаментальный биологический феномен,
широко участвующий в кинетике тканей”, 1972 г.)
Сравнительная морфология апоптотического и
некротического типов гибели клетки (по: Wyllie et al., 1998)
Механизмы программированной
гибели клеток
• Внеклеточный (лиганд-рецепторное
взаимодействие)
• Внутриклеточный
- митохондриальные рецепторы (белки
суперсемейства Bcl-2)
- каспазы
- протеазы
- белки теплового шока
Методология исследования апоптоза
• Маркеры апоптотических процессов отличаются
лабильностью, а изменения регуляции апоптоза зачастую
предшествуют развитию клинической картины;
• При различных патологических процессах устойчивость
клеток к индукции апоптоза, механизмы его развития
могут существенно искажаться;
• Применение адекватных методов исследования апоптоза
при различных патологических процессах является
необходимым условием изучения патогенеза
заболеваний;
• В лабораторной практике требуется определение
нескольких показателей, а комплекс методов должен быть
взаимодополняющим по информативности
(феноменологические признаки, состояние молекулярных
механизмов инициации и регулирования);
Выделяют две группы
исследований
- Морфофункциональные (клеточный и
субклеточный уровень)
- Молекулярно-диагностические
(уровни: генетический, рецепторный,
регуляторный, эффекторный)
Морфофункциональные исследования
• Выявление интегральных структурнофункциональных признаков апоптоза
• Определение специфичных для апоптоза
изменений плазматической мембраны
клеток
• Оценка митохондриальных процессов
• Изучение характера фрагментации ДНК
Морфофункциональные исследования
• Выявление интегральных структурнофункциональных признаков апоптоза
• Определение специфичных для апоптоза
изменений плазматической мембраны
клеток
• Оценка митохондриальных процессов
• Изучение характера фрагментации ДНК
Характеристика флюорохромов,
применяемых для изучения апоптоза
Проникающая
способность в клетку
Характеристика
окраски
Краситель
интактная
мембрана
повреждѐнная
мембрана
ядро
(ДНК)
цитоплазма
(РНК)
Акридиновый
оранжевый
+
+
зелѐная
красно-оранжевая
Hoecsht 33342
+
+
голубая
нет
Hoecsht 33258
-
+
голубая
нет
DAPI (4’,6-диамидин-2’фенилиндолдигидрохлорид)
-
+
ярко
голубая
нет
Этидиум бромид
-
+
оранжевая
слегка красная
Пропидиум йодид
-
+
красная
нет
Морфофункциональные исследования
• Выявление интегральных структурнофункциональных признаков апоптоза
• Определение специфичных для апоптоза
изменений плазматической мембраны
клеток
• Оценка митохондриальных процессов
• Изучение характера фрагментации ДНК
Проточно-цитометрический анализ клеток линии Jurkat в состоянии
апоптоза: до (а) и после (б) обработки камптотецином. На левом графике
в нижнем правом квадранте расположены клетки, находящиеся в
состоянии апоптоза (аннексин V – позитивные, PI – негативные). Клетки,
не обработанные индуктором апоптоза, первоначально негативны по
аннексин V-FLUOS и PI. После обработки камптотецином и инкубации
клеток в течение нескольких часов выявляется довольно высокая доля
клеток, находящихся в состоянии апоптоза.
Люминесцентно-микроскопическое
изображение
клеток
линии SKW6.4, окрашенных препаратами и их сочетаниями:
а – аннексин V-FLUOS (окрашены только мембраны);
б – DAPI (видна характерная для апоптоза конденсация ядер);
в – аннексин V-FLUOS и пропидиум йодид (четко
дифференцируются апоптотические и некротические клетки).
а
б
в
Морфофункциональные исследования
• Выявление интегральных структурнофункциональных признаков апоптоза
• Определение специфичных для апоптоза
изменений плазматической мембраны
клеток
• Оценка митохондриальных процессов
• Изучение характера фрагментации ДНК
Морфофункциональные исследования
• Выявление интегральных структурнофункциональных признаков апоптоза
• Определение специфичных для апоптоза
изменений плазматической мембраны
клеток
• Оценка митохондриальных процессов
• Изучение характера фрагментации ДНК
Выявление апоптотических клеток
TUNEL-методом в эндометрии
Морфофункциональные исследования
Не позволяют определить
состояние ключевых
молекулярно-патологических
звеньев апоптоза
Молекулярно-диагностические
исследования
• Оценка эффективности рецепторных
механизмов активации апоптоза
• Оценка экспрессии ключевых регуляторных
белков
• Определение активности каспаз
Молекулярно-генетические
исследования
• Мутационные изменения
• Идентификация спонтанных и
индуцированных апоптотических процессов
• Малые интерферирующие РНК
Современные представления об
апоптозе
– сформированы единые представления о типах
гибели клеток;
– изучаются молекулярные механизмы и
феноменология программированной гибели
клеток;
– разрабатывается методология исследований
апоптоза как основного типа программированной
гибели клеток;
– идентифицируются молекулярные мишени
ключевых звеньев нарушений апоптоза при
различных заболеваниях;
– создаются фармакологические средства для
целенаправленного регулирования
программированной гибели клеток при различных
патологических процессах.
Кафедра клинической биохимии и лабораторной диагностики
ВМедА им. С.М. Кирова, Санкт-Петербург
БЛАГОДАРЮ ЗА
ВНИМАНИЕ!
Скачать