О.Бабенко, Т.Утупов, З.А.Аликулов Роль молибдоферментов в

О.Бабенко, Т.Утупов, З.А.Аликулов
О.Бабенко, Т.Утупов, З.А.Аликулов
Роль молибдоферментов в токсичности этанола и нитратов
( Евразийский национальный университет им. Л.Н. Гумилева, г.Астана, Казахстан)
В настоящее время у животных обнаружены 3 молибденсодержащих фермента:
ксантиноксидаза, альдегидоксидаза и сульфитоксидаза. Основным местом синтеза
ксантиноксидазы и альдегидоксидазы являются ткани печени животных. Ксантиноксидаза
и альдегидоксидаза являются растворимыми цитоплазматическими ферментами, тогда
как сульфитоксидаза локализуется в межмембранном пространстве митохондрий, где
электроны из сульфита переносятся к цитохромам. В отличие от двух других ферментов,
одна и та же молекула ксантиноксидазы в клетках животных может находиться в двух
формах - ксантидегидрогеназа и ксантиноксидаза. В качестве акцептора электронов в
каталитической реакции ксантиндегидрогеназа использует НАД+, а ксантиноксидаза кислород. Многочисленные исследований показали, что в нормальных условиях клетки
млекопитающих синтезируют ксантиндегидрогеназу, а при патофизиологии появляется ее
ксантиноксидазная форма. В присутствии некоторых ксенобиотиков, тяжелых металлов
и пероксинитрита дегидрогеназная форма этого фермента превращается в оксидазную.
Продуктом каталитической реакции обоих форм фермента является мочевая кислота,
которая в настоящее время охарактеризована как сильный антиоксидант. Ксантиноксидаза
и альдегидоксидаза являются полифункциональными ферментами с широким спектром
субстратной специфичности - окисляют различные алифатические и ароматические
альдегиды, пурины и другие гетероциклические соединения. Для каталитических реакций эти
ферменты используют кислород и в результате внутримолекулярного переноса одного или
двух электронов образуются, соответственно, супероксид или перекись водорода. Благодаря
образованию свободных кислородных радикалов эти ферменты трансформируют вредные
ксенобиотики в безвредные производные, т.е. являются ферментами-санитарами.
Сульфитоксидаза млекопитающих также хорошо изучена, она катализирует реакцию SO 2−
3
+ + 2e − , которая является конечной стадией окислительной
+
2H
+ H 2 O → SO 2−
4
деградации цистеина, метионина и компонентов мембраны, таких как сульфатиды ().
Нарушение функции этого фермента у человека приводит к большим неврологическим
отклонениям и ранней смерти [1].
Участие альдегидоксидазы и ксантиноксидазы в метаболизме этанола. Ранее на
примере грызунов, человекообразных приматов и человека было показано, что этанол
приводит к образованию свободных кислородных радикалов и перекисному окислению
липидов мембраны клеток печени. А это в свою очередь - к патогенезису этого органа.
Хотя считается, что ацетальдегид является источником свободных радикалов, механизм
образования свободных радикалов оставался невыясненным. Потенциальными кандидатамиферментами, окисляющие ацетальдегид, являются молибденсодержащие ферменты печени альдегидоксидаза и ксантиноксидаза.
Эксперименты, проведенные in vitro показали, что превращение этанола до ацетальдегида
ферментом алкогольдегидрогеназой и дальнейший метаболизм ацетальдегида ферментом
ксантиноксидазой образует супероксид, который вызывает перекисное окисление и мобилизует
железо из ферритина. Однако, относительно высокий Кm ксантиноксидазы к ацетальдегиду
(> 30 мМ), а также доступность и большие сродства к этому ферменту других субстратов,
таких как ксантин и гипоксантин, и более того, у человека и животных преобладает
дегидрогеназная форма этого фермента, чем его оксидазная - все это указывают на то, что в
этом процессе in vivo ксантиноксидаза играет не главную роль [2]. Тем не менее, наблюдается
повышение катаболизма нуклеотидов (пуринов) при метаболизме этанола, что не исключает
участие ксантиноксидазы в удалении избытка ацетата. Известно, что при окислении пуринов
ксантиноксидазой образуются свободные радикалы. Однако сама подкормка животных
ацетатом не дает картину перекисного окисления, индуцированного этанолом, в то же время
оно происходило в присутствии ацетальдегида.
173
Л.Н. Гумилев атындағы ЕҰУ Хабаршысы - Вестник ЕНУ им. Л.Н. Гумилева, 2012, №2
Другой молибденсодержащий фермент альдегидоксидаза, имеющая низкий Кm (1 мМ)
к ацетальдегиду чем ксантиоксидаза, образует супероксид во время метаболизма различных
альдегидсодержащих субстратов и показывает очень низкое сродство к пуринам [3]. Поэтому,
образование свободных радикалов при метаболизме этанола до уксусной кислоты происходит
с прямым участием альдегидоксидазы:
Этанол + НАД + → Алкоголдегидрогеназа → Ацетальдегид + НАДН
Ацетальдегид + О 2 → Альдегидоксидаза → Уксусная кислота + .О 2 (супероксид)
Таким образом, при метаболизме ацетальдегида с участием альдегидоксидазы печени
образуются свободные кислородные радикалы, которые вызывают перекисное окисление
липидов. Инициацию перекисного окисления вызывают как метаболизм этанола, так и
ацетальдегид и оно зависело от присутствия каталитического железа. Введение ацетальдегида
в ткани в тех физиологических концентрациях, которые обнаруживаются при метаболизме
этанола, не вызывало перекисного окисления в клетках, обработанных ингибиторами
альдегидоксидазы. Частичное ингибирование перекисного окисления, индуцированного
аллопуринолом (ингибитором ксантиноксидазы) показывает, что ксантиноксидаза играет
вторичную роль в образовании кислородных радикалов.
Способность этих двух ферментов метаболизировать эндогенные субстраты достаточно
сильно отличаются: например, пурины, такие как ксантин и гипоксантин быстро окисляются
ксантинокидазой, но, очень слабо или вообще не окисляются альдегидоксидазой. Повышение
окислительного стресса в печени наблюдается при введении ацетальдегида, но не
ацетата. Повышенный катаболизм нуклеотидов и образование кислородных радикалов в
результате каталитической реакции ксантиноксидазы наблюдаются после периода гипоксии
(кислородного голодания), и эти эффекты усиливаются этанолом [3]. Усиление превращения
ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу этанолом может быть является одним из механизмов
перекисного окисления. Повышение такого превращения наблюдалось после введения высокой
концентрации этанола. Механизм превращения ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу
остается неясным, но роль ацетальдегида в этом процессе не вызывает сомнения. Перекисное
окисление в печени, индуцированное этанолом или ацетальдегидом, ингибируется полностью
менадионом (ингибитором альдегидоксидазы) и частично аллопуринолом, что указывает на
возможную роль кислородных радикалов, образованных альдегидоксидазой, в превращении
ксантиндегидрогеназы в ксантиноксидазу.
Метаболизм этанола алкоголдегидрогеназой in vitro с образованием ацетальдегида
вызывает медленную мобилизацию железа ферритина [3], а дальнейший метаболизм
ацетальдегида ксантиноксидазой усиливает этот эффект. Эти результаты показывают важную
роль каталитического железа и индукция его мобилизации этанолом в повреждении печени
при злоупотреблении алкоголем. Роль альдегидоксидазы в мобилизации железа под действием
этанола все еще не установлена.
Таким образом, молибденсодержащие ферменты альдегидоксидаза и в малой степени
ксантиноксидаза, являются основными окислителями ацетальдегида до уксусной кислоты и
играют важную роль в перекисном окислении липидов печени.
Нитрат-восстанавливающая активность ксантиноксидазы. Еще в 1980 году нами
было обнаружено, что гомогенная ксантиноксидаза, очищенная из коровьего молока обладает
высокой нитрат-восстанавливающей активностью [4], т.е. превращает нитрат в нитрит c
использованием природных доноров электронов - гипоксантина и НАДН.
Дальнейшие работы с ксантиноксидазой печени животных показали, что обе формы
фермента обладают способностью восстанавливать нитрат: оксидазная форма в качестве
донора электронов использует гипоксантин, а в качестве акцепторов - нитрат вместо кислорода;
для дегидрогеназной формы в качестве доноров электронов служат и гипоксантин, и НАДН,
т.е. она использует для каталитической реакции кофермента - НАД+ и НАДН [5]:
Гипоксантин + O 2 → Ксантиноксидаза → Мочевая кислота + .О 2 (супероксид)
Гипоксантин + NO 3− → Ксантиноксидаза → Мочевая кислота + NO 2−
174
Таблица - Влияние различных температур и рН реакционной среды на нитрат-восстанавливающую активность ксантиноксидазы
(нмоли NO 2− , образованного в минуту на 1 мг белка)
Температура реакционной среды
Доноры электронов
10◦ С
15◦ С
20◦ С
25◦ С
30◦ С
35◦ С
40◦ С
45◦ С
50◦ С
НАДН
56 ±7
95 ±12
120±18
156± 32
195±43
233±35
205±17
120±15
78±18
Гипоксантин
82±13
115±19
182±33
210±36
275±53
341±67
303±65
134±20
97 ±13
рН реакционной среды
5.5
6.0
6.5
7.0
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
НАДН
86±17
105±17
198±22
226±46
215±38
173±20
105±15
50±8
28±7
Гипо- ксантин
102±16
195±18
280±25
338±62
325±62
243±52
103±16
63±12
17±5
О.Бабенко, Т.Утупов, З.А.Аликулов
175
Л.Н. Гумилев атындағы ЕҰУ Хабаршысы - Вестник ЕНУ им. Л.Н. Гумилева, 2012, №2
Гипоксантин + НАД+ → Ксантиндегидрогеназа → НАДН + Мочевая кислота
в присутствии НАДН и отсутствии гипоксантина:
НАДН + NO 3− → Ксантиндегидрогеназа → Мочевая кислота + NO 2−
Следует особо отметить, что при восстановлении нитрата обеими формами
ксантиноксидазы не образуются кислородные радикалы. Аллопуринол, специфический
ингибитор ксантиноксидазы, полностью ингибировал ее нитрат-восстанавливающую
активность, т.е. восстановление нитрата в нитрит происходит на молибденовом участке
активного центре. Известно, что аллопуринол связывается с молибденсодержащим центром
ксантиноксидазы.
Оптимальной температурой для нитрат-восстанавливающей активности ксантиноксидазы,
определяемой с НАДН и гипоксантином, составляет 36 ◦ , а оптимальной рН для этой
активности равен 7.0, в то же время собственная активность (т.е. окисление гипоксантина
в мочевую кислоту) этого фермента была максимальной при рН 9.0 (таблица). Таким образом,
ксантинокисдаза печени коровы показывает максимальную нитрат-восстанавливающую
активность при физиологических условиях, т.е. при температуре 36 ◦ и нейтральном рН среды
- 7.0. Эти результаты указывают на то, что при поступлении в печень животного нитрат может
быстро превращаться в нитрит.
Медицинский и экологический аспекты полученных результатов. Таким образом,
центральной фигурой в отравлении печени алкоголем являются молибденсодержащие
ферменты - альдегидоксидаза и ксантиноксидаза. Альдегидоксидаза имеет высокое сродство
к ацетальдегиду, продукту восстановления этанола алкогольдегидрогеназой. Окисление
ацетальдегида альдегидоксидазой до уксусной кислоты сопровождается образованием
свободных кислородных радикалов. Общеизвестно, что кислородные радикалы вызывают
перекисное окисление липидов мембран и других клеточных органоидов, что приводит к гибели
или трансформации клетки. У клеток живых организмов выработана антиоксидантная система
защиты от радикалов. В эту систему входят низкомолекулярные природные биологически
активные соединения, такие как каротиноиды, фенолы, токоферолы, аскорбиновая кислота
и другие. Поэтому, надо полагать, что при употреблении алкоголя необходимо принимать
растительную пищу с высоким содержанием антиоксидантов. По-видимому, безвредность или
полезность красных вин заключаются в высоком содержании в них антиоксидантов.
Установлено, что нитрат сам по себе не токсичен для организма человека и
животных. Однако при восстановлении нитрат превращается в опасное соединение - нитрит.
Основное токсическое действие нитритов связано со способностью превращать гемоглобин
в метгемоглобин, т.е. они необратимо связываются гемоглобином крови, ингибируя его
кислородпереносящую активность. Наиболее чувствительным контингентом населения к
токсическому действию нитратов являются дети грудного возраста, это связано с наличием у
них высокого процента фетального гемоглобина, а также с тем, что ферментные системы детей
еще не совершенны и восстановление метгемоглобина в гемоглобин осуществляется медленнее.
В организме человека и животных нитриты вступая в реакцию с вторичными аминами
такими как путресцин, кадаверин, спермидин, триптамин и другие, могут образовывать
канцерогенные нитрозамины. Активный синтез нитрозаминов отмечен в содержимом сычуга,
для которого характерны кислые значения рН. Было подтверждено, что нитриты в
концентрациях, близких к тем, с которыми реально встречается человек, могут представлять
бластомогенную опасность для человека. Поэтому, проблема нитратов в биосфере приобретает
в настоящее время важное научное и практическое значение. Актуальность ее решения
приобрела особую значимость в связи с широкомасштабной химизацией земледелия. Конечно,
получение высоких урожаев сельскохозяйственной продукции невозможно без применения
нитратных удобрении. В связи с интенсивной химизацией земледелия возникает важнейшая
задача изучения ее влияния не только на плодородие почв, качество продукции, но и на
окружающую среду. Особую опасность чрезмерного поступления нитратов в организм человека
и животных представляет овощные культуры и питьевая вода. В связи с полученными
176
О.Бабенко, Т.Утупов, З.А.Аликулов
результатами, в настоящее время особое внимание должно быть обращено на эндогенное
образование нитритов в организме человека и животных, а также на факторы, влияющие
на его интенсивность. Таким образом, по иронии ксантиноксидаза является одновременно
продуцентом сильного антиоксиданта - мочевой кислоты и токсичного нитрита.
Многочисленные эксперименты показали, что при относительно длительной подкормке
животных с вольфрамсодержащим кормом молибденсодержащие ферменты теряют свою
активность. Это связано с тем, что вольфрам как химически аналог молибдена легко
встраивается в молекулу фермента вместо молибдена. Однако, вольфрамовые ферменты
становятся неактивными. По-видимому, одним из способов регуляции активности в
соответствующих ситуациях, является подкормка животных вольфрамом. Токсичны ли
относительно высокие концентрации вольфрама или молибдена для здоровья человека
и животных? Установлено, что соли молибдена нетоксичны, даже их умеренно высокая
концентрация дают положительные результаты in vitro у клеток человека и in vivo y мыши [6].
Многочисленные эксперименты показали, что среди вольфрамсодержащих соединений, только
так называемый "твердый металл", в состав которого входят кобальт и карбид вольфрама,
является очень токсичным. Постоянное вдыхание пыли "твердого металла"приводит к
фиброзным альвеолитам у людей, работающих в промышленности, связанной с этим
веществом. В то же время, попадание в легкие отдельных компонентов этого вещества не
вызывает фиброзы. Более того, ряд исследований показали, что оксианионы, такие, как
молибдат и вольфрамат стимулируют рецептор инсулина, т.е. могут регулировать диабет
меллитус без побочных эффектов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Eilers T., Schwarz G., Brinkmann H., Mendel R.R. Identification and biochemical characterization
of sulfite oxidase. J. Biol. Chem. 276 (50). 2001. pp. 4994-5003.
2. Бесбаева Б., Аликулов З., Якупбаев К. Способ получения ксантиноксидазы. Авторское
Свидетельство №1693047 от 22 июля 1991.
3. Shaw S.R and Jayatilleke K.V. Liver aldehyde oxidase is a main producer of free radicals
during the ethanol metabolism. 2002. J. Biol. Transact. 143(12): 35-41.
4. Аликулов З., Львов Н.П., Кретович В.Л. О нитратдуктазной активности ксантинксидазы
коровьего печени. 1983. В кн: "Биологическая роль молибдена"М. "Наука"C.45-49.
5. Аликулов З., Львов Н.П. Нитратредуктазная активность ксантиноксидазы печени
коровы. Биохимия 1998. том. 45, №9, C. 1714-1719.
6. Titenko-Holland N, Shao J, Zhang L, Xi L, Ngo H, Shang N, Smith MT. Studies on the
genotoxicity of molybdenum salts in human cells in vitro and in mice in vivo. 1998 - Environ. Mol.
Mutagen. 32(3):251-9.
Бабенко О., Утупов Т., Аликулов З.А.
Молибдоферменттердiң этанол мен нитраттардың улығындағы ролi
Ұсынылып отырған мақалада адамның бауырындағы молибдендi ферменттер - ксантиноксидаза мен
альдегидоксидазаның этанол мен нитратты өзгерiстерiне қатысатыны көрсетiлген. Осы заттармен уланудың мәселесi
медициналық және экологиялық аспектiлерi қарастырылған.
Babenko O., Utupov T., Alikulov Z.
Role of molybdoenzymes in the toxicity of ethanol and nitrates
In present article the participation of molybdoenzymes - xanthine oxidase and aldehyde oxidase in metabolism of ethanol
and nitrates was shown. The medicinal and ecological aspects of intoxication by these compounds were discussed.
Поступила в редакцию 12.01.12
Рекомендована к печати 27.01.12
177