Молекулярно-генетические методы в диагностике

Молекулярно-генетические
методы
в
диагностике
перинатальных инфекций
Кафарская Л.И., Ефимов Б.А., Шкопоров А.Н.
Работа выполнена при финансовой поддержке
Минобразования и науки
Перинатальные инфекции
Успешная
профилактика и
лечение
перинатальных
инфекций
 зависит
от
использования
эффективных
диагностических
и
лечебных
технологий.

Перинатальные инфекции
Высокая
скорость
развития
и
тяжесть течения
неонатальных
инфекций.
 Важно
использование в
методов
экспрессдиагностики.

Диагностические технологии





Позволяют осуществить
детекцию возбудителя или
серодиагностику
–
в
обнаружение
антител
сыворотке больного( важно
для диагностики вирусных
инфекций).
Процесс
антителообразования
у
новорожденных и особенно
у
недоношенных
детей
может быть снижен, что
снижает
эффективность
серодиагностики.
Дети от серопозитивных
матерей
–интерференция
антител.
Возбудители бактериальных
инфекций
Escherichia coli, Klebsiella sp.,
Staphylococcus aureus
 коагулазо-негативные стафилококки,
стрептококки,
Listeria monocytogenes,
Pseudomonas aeruginosa
 Haemophilus influenzae

Бактериологический метод наиболее
востребован в диагностике бактериальных
инфекций
Длительность (не
менее 36 часов)
 Трудоемкость
 Разрешающая
способность
метода-100
клеток.
 Существование
некультивируемых
микроорганизмов


Быстро
развивающиеся
направление
клинической
лабораторной
диагностики
создание и совершенствование
методов молекулярной диагностики
инфекционных
болезней
основанных на обнаружении и
анализе
специфических
нуклеотидных
последовательностей
возбудителей.
Новые методы – молекулярно-генетические
методы






Полимеразная
цепная
реакция
Высокая специфичность
Высокая
чувствительность
(позволяет
выявить
единичные клетки бактерий и
вирусы)
Прямое определение наличия
возбудителя
Универсальность выявления
различных возбудителей
Высокая скорость получения
результатов
Продукты ПЦР отделяют и визуализируют
с помощью гель-электрофореза.
Молекулярно-генетические
методы
Первое поколение традиционных тестсистем использовалось для определения
только одного вида вирусов или бактерий.
Усовершенствование и разработка новых
подходов
позволяет
разрабатывать
мультипраймерные
тест-системы
с
использованием мультиплексного ПЦР
анализа,
проводить
не
только
обнаружение
и
идентификацию
микроорганизмов, но и выявлятьгены
множественной
резистентности
к
антибиотикам.
Мультипраймерная ПЦР

Наиболее
специфичными,
чувствительными,
позволяющими
определять
количественные
значения
микроорганизмов,
являются
современные
модификации
полимеразной цепной реакции.
Важнейшей модификацией ПЦР
является
мультипраймерная
ПЦР в реальном времени,
которая позволяет проводить
экспресс-диагностику
сразу
нескольких
возбудителей
различной этиологии.
ПЦР в реальном времени

Для постановки ПЦР
в реальном времени
используется
амплификатор,
со
встроенным
оптическим блоком,
для
регистрации
флуоресцентного
излучения исходящее
от
образца,
программное
обеспечение
ЭВМ
поддерживает работу
амплификатора,
строит график
Важной особенностью данного метода, в
отличие от классической ПЦР, является
возможность
определения
агентов
в
количественного
ДНК/РНК
инфекционных
исследуемом
материале,
отсутствие стадии электрофореза, менее
строгие требования к организации ПЦРлаборатории
и
автоматическая
регистрация и интерпретация полученных
результатов.
КИНЕТИЧЕСКИЕ КРИВЫЕ
ПЦР В РЕАЛЬНОМ
ВРЕМЕНИ 3 СТАДИИ
РЕАКЦИИ
Стадия инициации (когда ПЦР-продукты еще не
определяются флуоресцентной меткой), экспоненциальная
стадия (в которой наблюдается экспоненциальная
зависимость интенсивности флуоресценции с увеличением
количества циклов ПЦР) и стадия насыщения (когда кривая
образует плато).
Вирусологические методы


В
неонатальной
практике
методы
основанные на ПЦР
используются
для
диагностики
вирусных инфекций.
Культуральный
метод –
основополагающий
для выявления ряда
групп вирусов.
Недостатки культурального метода



Время
выделения
вирусов длительное –
от нескольких дней до
нескольких недель.
Результат зависит от
условий
транспортировки
и
хранений
образца,
типа
клеточных
культур,
некоторые
вирусы (гепатит) не
культивируются.
БКМ
–
ускоряет
процесс.
Иммунофлюоресцентный метод

Экспресс-метод,
но менее
чувствительный
чем
культуральный.
ПЦР уже считается золотым стандартом
для диагностики
у новорожденных
менингита
вызываемого
вирусом
простого герпеса
 Внедряется
ПЦР
для
выявления
ассоциированных
с
врожденными
инфекциями новорожденных вирусов как
цитомегаловирусы,
вирусы ветряной
оспы/опоясывающего лишая, гепатитов

ПЦР в диагностике вирусных
инфекций
Возможность обнаружения
несколько групп вирусов, а
также
некультивируемые
микроорганизмы (хламидии).
Результат
может быть
получен на ранних стадиях
заболевания.
Повысится
эффективность
противовирусной терапии
Более
эффективный,
чем
культуральный(48% положит
культуральный и 96% пцр
Обнаружены риновирусы и
аденовирусы)
Диагностика бактериальных инфекций
Сложность диагностики
сепсиса
–клинические
симптомы
«маскируются» нередко
встречающимися
симптомами
у
недоношенных: апноэ,
гипотензия,
нейтропения,
повышение
уровней
ЦРБ
 Проводится
комплексная терапия с
использованием
антибиотиков широкого
спектра.

Диагностика бактериальных
инфекций






Нет
унифицированного
лабораторного
теста
для
диагностики сепсиса.
Низкая
чувствительность
бактериологического метода
Низкая численность бактерий в
кровеносном русле ребенка
Малые объемы крови (необходимо
не менее 4 мл)
Нужна стадия субкультивирования
Назначение антибиотиков до родов
женщинам с дородовым излитие,
новорожденным с первых часов
жизни
Диагностика бактериальных
инфекций

Автоматизированные
системы
для
культивирования
крови
(BACTEC
)
датчики
изменение
концентрации
CO2,
продуцируемого
бактериями
или
изменение давления в
культуральной емкости.
Диагностика бактериальных
инфекций
Метод культур крови принципиально
не сокращают время проведения
исследования,
продолжительность
24-48 часов.
 Необходимость
идентификации,
определения
чувствительности
к
антибиотикам
 Экспресс
методы
позволяющие
обнаружить бактерии в образцах
крови
без
использования
бактериологического посева



Нет
ни одной стандартизованной,
коммерчески доступной тест-системы
адаптированной для обнаружения
нуклеиновых
кислот
патогенных
бактерий
в
образцах
крови
новорожденных.
Тест-система
(Roche)
стандартизированная
в
Европе
позволяет обнаруживать 25 патогенных
бактерий и грибов в образцах крови.
Апробация
возможности
ее
использования
для
диагностики
сепсиса
у
новорожденных
не
проводилось
Метод ПЦР




При
помощи
классической
ПЦР
с
использованием
общих
бактериальных
праймеров
специфичных
к
высоко
консервативным
полинуклеотидным
последовательностям гена, кодирующего
16S рибосомальную РНК бактерий
Более эффективное выявление ДНК
Позволяет
выявить
и
редкие
виды
микроорганизмов
.
Метод ПЦР с амплификацией гена
бактериальной
16S
рРНК,
с
предварительным
5-часовым
культивированием 200 мкл образцов
крови в 4 мл жидкой питательной с
целью обогащения образцов крови
бактериями
Результаты
были
полностью
сопоставимы
Метод ПЦР в нашей лаборатории

Разработать диагностическую тестсистему,
обеспечивающую
одновременную экспресс-диагностику
инфекционных
заболеваний,
вызванных Streptococcus agalactiae,
Escherichia coli и Klebsiella spp., у плодов
и
новорожденных
детей,
путем
количественной детекции геномной
ДНК указанных возбудителей методом
ПЦР в режиме реального времени (ПЦРРВ).
Создан
лабораторный
образец
мультипраймерной тест-системы, позволяющий
проводить одновременную детекцию методом
ПЦР-РВ
трех
основных
возбудителей
неонатальных инфекций. Был произведен
дизайн
олигонуклеотидных
праймеров
и
флуоресцентно-меченных
олигонуклеотидных
зондов комплементарных фрагментам генов E.
coli, S. agalactiae, консервативному участку 16S
рибосомальной РНК Klebsiella spp., а также
проверена специфичность и чувствительность
этих праймеров на коллекции лабораторных
штаммов и клинических образцах
Гены мишени для праймеров и зондов
разрабатываемой тест системы
 ген
uidA Escherichia coli кодирует синтез
фермента β-глюкуронидазы
 ген cfb Streptoccus agalactiae отвечает за
образование
CAMP-фактора,
биологическая
активность
которого
заключается в расширении зоны гемолиза,
вызванного β-гемолизином золотистого
стафилококка.
Гены мишени для праймеров и зондов
разрабатываемой тест системы

В настоящее время у бактерий рода
Klebsiella не описаны уникальные гены,
характерные только для этого рода. В
этой
связи
задача
создания
родоспецифичной тест-системы для
детекции
бактерий
Klebsiella
spp.
решалась путем поиска консервативных
районов в гене 16S-рРНК, отличающихся
у
бактерий
рода
Klebsiella
от
последовательностей у бактерий других
родов семейства Enterobacteriaceae.
Выделение ДНК
При сравнении различных методов выделения
геномной ДНК из штаммов бактерий S. agalactiae и
K. pneumoniae, было показано, что, несмотря на
хороший выход при выделении ДНК из культуры K.
pneumoniae c использованием стандартных наборов
данные
комплекты
реактивов
оказались
неэффективны для выделения ДНК из культуры S.
agalactiae. Наилучшие результаты как для S.
agalactiae, так и для K. pneumoniae были получены
при использовании комбинации метода Бума с
предварительным разрушением клеточной стенки
бактерий
гидролитическими
ферментами
(протеиназа К)
Метод Бума с лизоцимом и
протеиназой К
S.agalactiae
K. pneumoniae
Метод Бума
Метод ПЦР

Диагностические
характеристики
разработанной тест-системы изучали в
сравнении
с
классическим
бактериологическим методом, выделением
чистых культур бактерий из исследуемого
материала с использованием элективных
питательных среды и последующую
морфологическую и биохимическую (либо
серологическую)
идентификацию
выделенных культур.
Метод ПЦР

При
изучении
слепым
методом
симулированных образцов данные по
качественному
и
количественному
присутствию S. agalactiae, E. coli и Klebsiella
spp., полученные методом ПЦР-РВ с
использованием мультипраймерной системы,
полностью соответствовали результатам
бактериологического
исследования.
Аналитическая чувствительность полученной
тест системы была не ниже 300 геномэкв для
детекции генов uidA, cfb, rrn.
Содержание микроорганизмов в клинических образцах,
полученных от новорожденных отделения реанимации и
интенсивной терапии, выявленная бактериологическим методом и
методом ПЦР-РВ.
Сравнительная характеристика Klebsiella spp – позитивных и
Klebsiella spp – негативных недоношенных новорожденных
по результатам обследования эндотрахеального аспирата.
M m для детей Klebsiella
spp положительных
M m для детей Klebsiella
spp негативных
P=
Масса, г
970,7 188,5
1270,6 616,3
0,225
ГВ, нед
27,1 2,0
28,6 4,2
0,375
ИВЛ, сутки
46,9 9,7
25,6 15,9
0,004
К/Д ОРИТ
57,6 12,6
31,7 14,6
0,001
К/Д сумма
83,9 14,3
50,9 24,6
0,004
а/б, сутки
73,9 14,3
44,5 22,1
0,005
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
ГВ
ИВЛ
К/Д ОРИТ
К/Д сумма
а/б
Klebsiella "-"
28,6
25,6
31,7
50,9
44,5
Klebsiella "+"
27,1
46,9
57,6
83,9
73,9

Лабораторный
образец
диагностической
тест
системы
позволяет в короткие сроки (не более
3 часов) проводить количественную
детекцию бактериальных патогенов S.
agalactiae, E. coli и Klebsiella spp.
методом ПЦР-РВ в различных видах
клинического материала.

Полученная мультипраймерная тестсистема характеризуется высокой
диагностической чувствительностью
и
специфичностью,
а
также
достоверностью
качественной
и
количественной детекции ДНК S.
agalactiae, E. coli и Klebsiella spp.
Спасибо за внимание