Диагностика вируса шарки сливы на косточковых культурах

КАРАНТИН
57 %, кэ и др. В индивидуальных са$
дах можно применять фьюри,
10 %, вэ, фуфанон, 57 %, кэ, кеми$
фос, 57 %, кэ, искру М, 52,5 %, кэ,
инта$вир, впр и др. в соответствии с
Государственным каталогом пести$
цидов и агрохимикатов, разрешен$
ных к применению на территории
Российской Федерации на данный
период. Эти пестициды эффективны
также против других вредителей
сада. В первой декаде мая в боль$
шинстве случаев также наблюдается
интенсивный лёт бабочек плодожор$
ки, но в это время продолжается цве$
тение садов и обработки исключены.
Интенсивный лёт бабочек II гене$
рации начинается с третьей декады
июня и продолжается по первую де$
каду августа, значит, с конца июня и
в июле можно также применять пес$
тициды, но не позднее, чем за 20–
40 дней до съема плодов.
При низкой численности восточной
плодожорки (менее 3 бабочек на
1 ловушку в сутки) можно вывесить в
саду клеевые феромонные ловушки
из расчета 50 ловушек на 1 га в про$
изводственных садах или 2 ловушки
на 100 м2 в ЛПХ в целях борьбы. Кле$
евые вкладыши в ловушках меняют
по мере их заполнения насекомыми.
Период интенсивного лёта восточ$
ной плодожорки III генерации более
растянут по сравнению со второй
из$за понижения температуры воз$
духа. Почти во все годы наблюдений
наиболее интенсивный лёт бабочек
III генерации приходился на I и II де$
кады сентября. В это время для за$
щиты урожая зимних сортов плодо$
вых и после уборки более ранних
сортов можно снова применить пе$
стициды, которые снизят повреж$
денность плодов и уменьшат зиму$
ющий запас вредителя.
Таким образом, для организации
успешной борьбы с восточной пло$
дожоркой необходимо знать, имеет$
ся ли этот вредитель в вашем саду,
какова его численность и периоды
лёта бабочек. Ответы на эти вопро$
сы можно получить с помощью феро$
монных ловушек, которые вывешива$
ют в саду на деревьях на высоте 1,5–
2 м из расчета 1 ловушка на 2–5 га.
УДК 578.85/86.083.2:577.152
Диагностика
вируса шарки сливы
на косточковых культурах
П.А. ПОХОДЕНКО,
младший научный сотрудник
Всероссийского селекционно*
технологического института
садоводства и питомниководства
М.Т. УПАДЫШЕВ,
заведующий отделом
защиты растений
Потивирус шарки сливы (PPV), вы$
зывающий существенное снижение
урожая косточковых культур и ухуд$
шающий товарные качества плодов
(Вердеревская, Маринеску, 1985),
относится к ограниченно распрост$
раненным на территории Российс$
кой Федерации карантинным орга$
низмам.
Ключевым элементом любой тех$
нологии получения безвирусных кло$
нов является диагностика латентной
вирусной инфекции. Важным шагом
в направлении совершенствования
диагностики стало внедрение в прак$
тику метода иммуноферментного
анализа – ИФА (Clark, Adams, 1977).
Данный метод позволяет в краткие
сроки (2–3 дня) в лабораторных ус$
ловиях осуществлять тестирование
нескольких сотен образцов.
Однако получение диагностичес$
ких сывороток возможно далеко не
ко всем вирусам и фитоплазмам пло$
довых культур, а сам метод ИФА име$
ет недостаточную чувствительность
при выявлении вирусов в конце веге$
тации и в состоянии покоя растений,
в тканях коры и древесины, а также в
культурах in vitro. Как правило, ис$
пользование метода ИФА ограничи$
вается двумя месяцами после нача$
ла вегетации растений.
Указанных недостатков лишены
методы молекулярной диагностики
с использованием полимеразной
цепной реакции (ПЦР), являющиеся
в настоящее время наиболее совре$
менными технологиями определе$
ния патогенов (Olmos et al., 2002). К
преимуществам ПЦР$теста относят$
ся чрезвычайно высокие специфич$
ность и чувствительность. Проведе$
ние анализа возможно в течение
всего одного дня.
ПЦР$тесты для диагностики раз$
личных патогенов плодовых культур
(вирусы, вироиды, фитоплазмы,
бактерии, грибы и др.) активно раз$
рабатываются и внедряются во всем
мире (Candresse et al., 1995;
Kummert et al., 2004). Однако в Рос$
сии было проведено крайне ограни$
ченное число исследований по мо$
лекулярной диагностике вирусов
плодовых культур (Филимонова и
др., 2000, Добржанская и др., 2001),
вследствие чего ПЦР$тесты по$пре$
жнему редко применяются в вирусо$
логической практике.
Эксперименты проводили на базе
лаборатории вирусологии ВСТИСП.
Объектом служил вирус шарки сли$
вы. В серологических тестах приме$
няли сэндвич$вариант иммунофер$
ментного анализа (DAS – ELISA) по
методике М. Кларка и А. Адамса
(1977) с использованием диагности$
ческих наборов на основе поликло$
нальных антител из НИИ садовод$
ства Молдовы и фирмы «Bio$Rad»
(США). Регистрацию результатов
проводили на планшетном фотомет$
ре «Stat Fax 2100» при длине волны
405 нм. Оценку зараженности об$
разцов осуществляли в соответ$
ствии с «Методическими указания$
ми по экспресс$диагностике виру$
сов на ягодных культурах» (2002).
Молекулярную диагностику прово$
дили методом ОТ$ПЦР с праймера$
ми и реакционными смесями, разра$
ботанными в ООО «Агродиагности$
ка». Амплификацию выполняли на
программируемом термостате «Тер$
цик», а регистрацию результатов осу$
25
КАРАНТИН
Таблица 1
Результаты тестирования разных органов сливы и вишни войлочной
методами ИФА и ПЦР в осенний период на вирус шарки
Изоляты
Слива
Вишня войлочная
Листья
ИФА
ПЦР
–
+
+
+
Почки
ИФА
ПЦР
–
–
–
+
ществляли на трансиллюминаторе
Vilber Lourmat TCP – 20.МС с выводом
изображений электрофореграмм
ПЦР$продуктов на компьютер.
Известно, что осенью и в период
покоя косточковых культур частицы
вируса PPV не удается обнаружить
даже методом электронной микро$
скопии (Калашян, 1973). В наших эк$
спериментах при тестировании ме$
тодом ИФА разных органов растения
(листья, почки, кора, древесина) в
осенний период сероположительный
результат наблюдался в листьях изо$
лята вишни войлочной (табл. 1).
При тестировании методом ИФА
коры изолятов вишни войлочной и
сливы результат был сероотрица$
тельным. Низкий титр вируса и не$
равномерное (локальное) распреде$
ление его в тканях являются основ$
ными причинами отрицательных ре$
зультатов ИФА в этих образцах.
Выделение вируса и его диагнос$
тика методом ПЦР были успешными
в листьях и древесине вишни вой$
лочной и сливы, в почках вишни вой$
лочной, в коре сливы. Вирус не вы$
являлся в почках сливы и в коре виш$
ни войлочной, что, вероятно, связа$
но с методом выделения РНК из тка$
ней растения. В целом вирус PPV
выделялся и диагностировался ме$
Kора
ИФА
ПЦР
–
+
–
–
Древесина
ИФА
ПЦР
–
+
–
+
Ò à áë è ö à 2
Ð å çó ë ü òà òû òå ñ òè ð î âà í è ÿ ñ ë è âû
( in v it ro è ï î ñ ë å à ä à ï òà ö è è ) ì å òî ä à ì è
È Ô À è Ï Ö Ð í à âè ð ó ñ ø à ð ê è
Ñ î ð ò (ê ë î í )
Ô è î ë å òî âà ÿ
(êëîí 1)
Ô è î ë å òî âà ÿ
(êëîí 2)
Ó òð î
Ð åíêëîä
òà ì áî âñ ê è é
Ð àñòåí è ÿ Ð àñòåí è ÿ ï îñin v itro
ëå àäàï òàö è è
ÈÔÀ ÏÖÐ ÈÔÀ
ÏÖÐ
–
+
–
+
–
+
+
+
–
–
+
+
+
+
+
+
тодом ПЦР наиболее успешно в дре$
весине и листьях обеих культур. Сле$
довательно, древесина наиболее
пригодна для тестирования расте$
ний в период покоя, а метод выде$
ления РНК, используемый нами, мо$
жет быть рекомендован в работе с
листьями и древесиной.
При оздоровлении растений от
вирусов с использованием метода
культуры тканей важное значение
имеет чувствительность метода ди$
агностики. Часто метод ИФА не по$
зволяет выявлять вирусы в проби$
рочных растениях, поскольку кон$
центрация вирусов в них, как прави$
ло, низкая. Это затрудняет коррект$
ную диагностику вирусов in vitro и
выбраковку зараженных растений,
ПЦРAанализ растений сливы разных сортов на вирус шарки
Растения после адаптации: 1 – Фиолетовая (клон 1); 2 – Фиолетовая (клон 2); 3 – Утро;
4 – Ренклод тамбовский. Растения in vitro: 6 – Утро, 7 – Фиолетовая, 8 – Ренклод
тамбовский. Образцы различного происхождения: 9 – слива изолят (кора), 10 – слива
изолят (древесина). (К–) отрицательный контроль, (К+) положительный контроль;
а – фрагмент кДНК, соответствующий внутреннему контролю размером 560 пар
нуклеотидов; б – фрагмент кДНК размером 268 п.н.
26
что в конечном итоге приводит к уве$
личению затрат времени, материа$
лов и финансовых ресурсов при про$
ведении технологического процес$
са оздоровления. После адаптации
пробирочных растений к нестериль$
ным условиям происходит накопле$
ние вирусов в тканях растений, что
обеспечивает их успешную диагно$
стику методом ИФА.
Поэтому нами был проведен срав$
нительный анализ результатов выяв$
ления вирусов в пробирочных расте$
ниях и растениях после адаптации
методами ИФА и ПЦР. При тестирова$
нии пробирочных растений методом
ИФА вирус шарки сливы не выявлял$
ся, что связано с низкой концентраци$
ей вируса в растении (табл. 2).
Вместе с тем в растениях после
адаптации вирус диагностировался
методом ИФА у сортов Фиолетовая
(клон 2), Утро, Ренклод тамбовский.
Вирус PPV не выявлялся методом
ИФА в клоне 1 сорта Фиолетовая,
что также объясняется низкой кон$
центрацией вируса в растении. С
применением ПЦР$анализа удалось
детектировать вирус шарки сливы
как в растениях in vitro (рисунок), так
и в растениях после адаптации в от$
личие от ИФА.
Следовательно, метод ПЦР при те$
стировании растений in vitro оказал$
ся предпочтительнее по сравнению
с ИФА. Аналогичные результаты,
подтверждающие его высокую эф$
фективность при тестировании про$
бирочных растений сливы на вирус
шарки, получены и другими исследо$
вателями (Добржанская и др., 2001).
Таким образом, в период покоя ко$
сточковых культур метод ПЦР позво$
ляет с высокой степенью достовер$
ности осуществлять их тестирование
на вирус PPV в древесине растений,
тогда как чувствительность метода
ИФА в данный период часто бывает
недостаточной для выявления вирус$
ной инфекции. С применением ПЦР$
анализа удалось успешно диагности$
ровать вирус шарки сливы как в рас$
тениях in vitro, так и в растениях пос$
ле адаптации. Метод ИФА при тести$
ровании растений in vitro оказался
менее чувствительным, чем ПЦР.