Клиническое значение электрофореза белков и липидов

Клиническое значение электрофоретических
методов
Краткая история Электрофореза
• 1807 г. проф. МГУ Ф.Рейс открыл явление электроосмоса и
электрофореза
• 1930 – А. Тизелиус разработал метод электрофореза в свободной
жидкости и сконструировал прибор.
• В 1940 Д. Филпот предложил использовать колонки с градиентом
плотности буферных растворов, а в 50-ые Свенссон создал прибор
для электрофореза в градиенте плотности.
• В 1950 в качестве твердого носителя используют фильтровальную
бумагу.
• В 1955 О. Смайзис в качестве носителя использовал крахмал
• В 1957 Д. Кон предложил в качестве твердого носителя – пленки
ацетат целлюлозы
• В 1957 А. Гордон использование в качестве носителя гелей на
агарозе
• В 1960 разработан метод капиллярного электрофореза
• 1989 г. - разработка и внедрение в практику оборудования
капиллярного электрофореза
Клинический электрофорез
1. Принадлежит к базовым методам клинической
биохимии
и
широко
используется
при
исследовании нарушений белкового спектра
сыворотки крови, мочи и спинномозговой
жидкости.
2. В настоящее время является единственным
методом, который позволяет одновременно
получить и качественное и количественное
представление о белковом составе крови
3. Электрофоретический анализ позволяет в ряде
случаев предположить диагноз и определить
дальнейшее направление исследований
4.
Электрофорез в клинической
диагностике
• С помощью электрофореза можно анализировать
белковый состав биологических жидкостей сыворотки
крови, мочи, спинномозговой жидкости;
• Наиболее распространенное и востребованное
исследование – анализ белковых фракций сыворотки
крови;
• Электрофорез позволяет определять % соотношения
различных фракций в сыворотке крови.
Зная количественное значение одной из них или общее
количество белка в сыворотке, можно рассчитать
количественное значение для каждой фракции.
Исследование белковых фракций
Какие показания для проведения электрофореза белков сыворотки
в крови?
• Скрининговый тест до назначения биохимического анализа (в ряде
западноевропейских стран – Италия, Франция и др.)
• Выполняется после биохимического анализа, общего анализа крови.
Основные критерии для назначения:
- Снижение концентрации общего белка в сыворотке крови < 60
г/л
- Увеличение концентрации общего белка в сыворотке крови >
85 г/л
- Снижение концентрации альбумина в сыворотке крови < 35
г/л
- Увеличение скорости оседания эритроцитов (СОЭ) неясного
генеза > 25 мм/ч
Электрофорез позволяет
• Качественная и количественная
характеристика белков сыворотки крови
• Изменение структуры белковых молекул
• Появление протеинов, отсутствующих в
крови здоровых людей
Электрофорез белков сыворотки
Гамма - регион
Глобулины
Бетта - регион
Альфа 2 - регион
Альфа 1 - регион
Альбумин
Исследование белковых фракций
Альбуминовая
альбумин
преальбумин
Альфа-1-глобулины
α1-липопротеин(ЛПВП)
α1-антихимотрипсин
орозомукоид
α1-антитрипсин
Альфа-2-глобулины
α2-макроглобулин
Гаптоглобин
Церулоплазмин
гемопексин
антитромбин III
ингибитор C1эстеразы
СРБ
Gc-глобулин
Бета-глобулины
трансферрин
С3-комплемент
β-липопротеин (ЛПНП)
С4-комплемент
β2-микроглобулин
Гамма-глобулины
IgG
IgA
IgM
IgD
IgE
легкие цепи Ig
лизоцим
Электрофорез позволяет оценить
следующие патофизиологические
процессы
• Гуморальное звено иммунитета
• Острый и хронический
воспалительный процесс
• Нефротический синдром
• Острые и хронические гепатиты
• Потеря белка
Острое воспаление
Изменение фракции Альфа-1 и 2
Хроническое воспаление.
• ассоциируется с увеличением фракций
белков, рассматриваемых как "белки
хронической фазы"
Острый вирусный гепатит
Цирроз печени
Увеличение фракции Бета:
Бета-гамма блок при
алкогольном циррозе
Увеличение фракции
Альфа-2: Нефротический
синдром
Моноклональные гаммапатии — это группа
злокачественных
новообразований
из
клеток
B-лимфоцитарного
ряда,
морфологическим
субстратом
которых
являются
клетки,
продуцирующие
моноклональный
иммуноглобулин
(парапротеин).
Клиническая
картина
моноклональных
гаммапатий во многом определяется типом
парапротеина,
который
секретируется
опухолью
.
Тяжелые цепи
Легкие цепи
Классы имуноглобулинов (Тяжелые цепи)
IgM Первичный ответ
IgG Вторичный ответ
IgA Секреторные антитела
IgD Функция до конца не ясна
IgE Аутоиммунный/аллергический ответ
Классы имуноглобулинов (Легкие цепи)
IgK (Kappa)
Igλ (Lambda)
Тяжелые цепи (G, A, M, D, E) связанны либо с kappa либо lambda
легкими цепями, но не с обоими. Например IgG-Kappa или IgG-Lambda.
Иногда, при моноклональных гаммапатиях, легкие цепи могут
продуцироваться отдельно (т.н. болезнь «Легких цепей»).
Например свободные Kappa (FK) или свободные Lambda (Fλ/FL) .
Kappa встречается чаще чем Lambda.
Наиболее ранним и наиболее точным
лабораторным проявлением моноклональных
гаммапатий является наличие в сыворотки
крови
моноклональных
парапротеинов
выявляемых на электрофореграммах в виде
острого пика в гамма-зоне, называемого Мградиентом
Иммунофиксация с антисывороткой позволяет установить
природу моноклонального компонента
С пентавалентной антисывороткой
(скрининг)
С моновалентными
антисыворотками
IgМ
λ
Без АС
Моноклональная гаммапатия
Моноклональной гаммапатии нет
Электрофорез белков мочи
Из-за малого размера легких цепей
имуноглобулинов последние проникают через
клубочки почек во время фильтрации и
выделяются с мочой.
В связи с этим элетрофорез белков сыворотки
может не показать каких-либо изменений на
электрофореграмме, в то же время при
исследовании мочи будет наблюдаться
выраженные изменения в зоне гаммаглобулинов.
Электрофореграмма белков мочи
Классификация моноклональных
гамапатий
Злокачественные моноклональные гаммапатии
(74%)
1. Множественная миелома
2. Вялотекущая (тлеющая ) или индолентная миелома .
3. Плазмацитома.
4. Злокачественные лимфопролиферативные заболевания
(Макроглобулинемия Вальденстрема)
5. Болезнь тяжелых цепей
6. Амилоидоз (первичный AL-амилоидоз и вторичный )
Доброкачественные моноклональные гаммапатии
1. Моноклональные гаммапатии неопределенного генеза (26%)
Множественная миелома
Заболеваемость составляет приблизительно 4 на
100 000 в год. С возрастом она растет (после 25
лет 30 на 100 000)
Половина больных на момент постановки
диагноза старше 68 лет, темнокожие болеют в 2
раза чаще
В США в среднем регистрируется 15 000 новых
случаев в год и около 10 500 смертей от нее.
Заболеваемость в России 1,24 на 100 тыс.
населения
Частота возникновения моноклональных
гаммаптий в зависимости от возраста
– 25-34 лет
0.8%
– 35-44 лет
2.3%
– 45-54 лет
5.6%
– 55-64 лет
6.6%
– 65-74 лет
7.8%
Трудности в диагностике
миеломной болезни
Отсутствие на начальных стадиях заболевания
патогномоничных клинических симптомов
Классическая триада миеломной болезни – боли в
костях, бактериальные инфекции и миеломная
нефропатия появляются уже в развернутой стадии
заболевания
Клиническая картина
1.
Анемия,повышение СОЭ, гиперпротеинэмия.
2.
Боли в костях, усиливающиеся при движении (70%), спонтанные
переломы. Обусловлены пролиферацией опухолевых клеток, приводящей к
активации остеокластов и остеолизису. Остеолизис ведет к поступлению в кровь
значительного количества кальция.
3.
Бактериальные инфекции (25-30%). Связаны пониженной продукцией антител
и ускоренным их разрушением.
4.
Миеломная нефропатия (50%). Обусловлена гиперкальцийемией,
повреждением канальцев легкими цепями имуноглобулинов.
5.
Амилоидоз
6.
Синдром гипервязкости крови. Обусловлен гиперпродукцией моноклонального
белка
7.
Неврологическая симптоматика. Компрессия спинного мозга, корешковые боли,
периферическая нейропатия.
Обследования при множественной
миеломе
IgG Каппа
IgG Лямбда
IgG Каппа + Лямбда
Диагностические критерии доброкачественной
моноклональной гаммапатии и множественной
миеломы (International Myeloma Working Group, 2003)
Доброкачественная моноклональная гаммапатия
(моноклональная гаммапатия неясного генеза)
встречается намного чаще – у 1% людей старше
50 лет и почти у 10% старше 75 лет.
доля плазматических клеток в костном мозге
составляет менее 10%, уровень парапротеина не
превышает 3 г\л.
лечение обычно не требуется
риск перерождения доброкачественной
моноклональной гаммапатии в множественную
миелому или B-клеточную лимфому составляет в
среднем 1% в год.
риск перерождения через 10 лет (в процентах)
приблизительно соответствует уровню парапротеина
(в г/л): например, при уровне 20 г/л риск составляет
20%.
наблюдение должно включать регулярные осмотры с
измерением уровня парапротеина в сыворотке; при
низком риске прогрессирования интервалы между
осмотрами должны составлять 6—12мес
Макроглобулинемия Вальденстрема
Это злокачественное лимфопролиферативное заболевание,
характеризующееся лимфоплазмацитарной инфильтрацией костного
мозга и секрецией моноклонального IgM
Всегда имеется лимфоплазмоцитарная инфильтрация костного мозга,
л/у, селезенки, печени.
В клинической картине преобладает синдром повышенной вязкости
крови (утомляемость, общая слабость, кровотечения, нарушения
зрения, головная боль и некоторые другие неврологические симптомы)
Примерно в 10% случаев парапротеин обладает свойствами
криоглобулина
У 80% больных легкие цепи имеют изотип каппа.
Уровень парапротеина в сыворотке превышает 30 г\л., но из-за
больших размеров молекулы IgM не проникают через клубочки а легкие
цепи экскретируются с мочой только у 20% больных.
Поражается костный мозг, однако остеолиза и гиперкальцийемии нет
Стадии множественной миеломы по Durie/Salmon.
Стадия I (медиана выживаемости –60 мес). Все нижеперечисленные
критерии:
- гемоглобин более 100 г /л;
- кальций сыворотки в пределах нормы или менее 2,6 ммоль /л (10,5
мг/дл);
- нормальная костная структура при рентгенологическом исследовании
или солитарная костномозговая плазмацитома ;
- низкий уровень продукции М-компонента (уровень IgG менее 50 г/л,
уровень IgA менее 30 г/л, в моче при электрофорезе М-компонент легких цепей
менее 4 г /24 часа).
Стадия II (медиана выживаемости – 41 мес.). Не соответствует
критериям ни для I ни для III стадии.
Стадия III (медиана выживаемости
критериев из нижеперечисленных :
- 23 мес.). Один или более
- гемоглобин менее 85 г /л ;
- кальций в сыворотке более 3,0 ммоль /л (12 мг/дл);
- распространенные литические костные повреждения (по шкале - 3);
- высокий уровень продукции М-компонента: (уровень IgG более 70 г /л ,
уровень IgA более 50 г/л, в моче при электрофорезе М-компонент легких цепей
более 12 г /24 ч.
Субклассификация (деление на А или В варианты в
зависимости от функции почек)
•
А- уровень креатинина в сыворотке менее 200 ммоль/л
•
В- уровень креатинина более 200 ммоль/л .
Международная классификация множественной миеломы
по стадиям (Greippetal., 2003).
Наблюдение
При бессимптомной множественной миеломе наблюдение должно
включать регулярные осмотры (обычно 1 раз в 3 мес.) с
измерением уровня парапротеина в сыворотке и моче.
При доброкачественной моноклональной гаммапатии наблюдение
также должно включать регулярные осмотры с измерением
уровня парапротеина в сыворотке; при низком риске
прогрессирования интервалы между осмотрами должны
составлять 6—12мес
Критерии эффективности лечения
множественной миеломы
Полная ремиссия:
Отсутствие парапротеина в сыворотке и моче по данным электрофореза в течение
как минимум 6 нед; доля плазматических клеток в костном мозге менее 5%
Истинная полная ремиссия
Полное исчезновение парапротеина из сыворотки крови и мочи, доказанное
методом имунофиксации, числом плазматических клеток в костном мозге менее
5% и отсутсвием клинических проявлений заболевания
Частичная ремиссия
Снижение уровня парапротеина в сыворотке более чем на 50% либо снижение
экскреции легких цепей иммуноглобулинов с мочой на 90% (или до уровня менее
200 мг/сут) в течение 6 нед.
Минимальный эффект
Снижение уровня парапротеина в сыворотке на 25—49% либо снижение
экскреции легких цепей иммуноглобулинов с мочой на 50—89% (но сохранение ее
на уровне, превышающем 200 мг/сут) в течение 6 нед.
Высокий М-градиент
<1.5 g на dL
Электрофорез
раз в год
>2.5 на dL
1.5-2.5 на dL
Электрофорез
белков мочи
Норма
Электрофорез
Через 3 – 6 мес.
Патология
Трепанбиопсия
подвздошной кости
КТ брюшной полости
Уровень β2- микроглобулина
С-реактивный белок
Электрофорез мочи
Консультация
онколога
Норма
Норма
Электрофорез
раз в год
Патология
контроль
через 2 – 3 мес. Консультация
онколога
Применение электрофореза в
клинической диагностике
Электрофорез гемоглобинов:
- Наследственные патологии синтеза Hb
• Электрофорез липидов:
(серповидно-клеточная анемия);
- Дифференциальная диагностика нарушений - Угнетение синтеза цепей Hb
(талассемия);
липидного обмена;
- Персистенция фетального Hb.
- Оценка риска развития атеросклероза.
Электрофорез изоферментов (КК,
• Изоэлектрофокусирование IgG:
ЛДГ, ЩФ):
- Диагностика рассеянного склероза.
- Инфаркт миокарда (оценка тяжести,
осложнения) и ИБС – ЛДГ, КК;
Изоэлектрофокусирование альфа-1антитрипсина.
- Черепно-мозговая травма – КК;
Электрофорез трансферрина:
- Инфаркт легкого – ЛДГ;
• Врожденные нарушения гликозилирования - Рак печени и легких – КК;
белков;
- Дистрофия мышц – КК, ЛДГ;
• Приобретенные нарушения гликозилирования
- Цирроз печени - ЩФ;
(в т.ч. алкоголизм);
- Обструкция желчный путей - ЩФ;
• Отделяемое из ушей и носа:
• Оценка тяжести черепно-мозговой травмы - Заболевания костных тканей,
остеосаркома - ЩФ;
- Паратиреоидные расстройства - ЩФ
Липопротеины и профиль холестерина
Липопротеины
Профиль холестерина
Хиломикроны
β
Пре-β
β
α
ЛВП-холестерин
ЛВП
ЛП(а)
ЛОНП
ЛНП
ЛП(а)-холестерин
Липофильный краситель.
ЛОНП-холестерин
ХАРАКТЕРНЫЕ ПРОФИЛИ:
• Поражения печени;
• Гипотиреоидизм;
• Ожирение;
• Атеросклероз;
• Диабет I типа;
• Алкоголизм,
• Прием оральных контрацептивов;
• Панкреатит ...
ЛНП-холестерин
Визуализация: обр-е формазанового
красителя в результате действия
холестеринэстеразы, холестериноксидазы,
диафоразы
Чувствительность: 4,2 мг/дл на фракцию
Дифференциальная диагностика нарушений липидного обмена,
оценка риска развития атеросклероза.
Современный гелевый электрофорез
SAS
1plus
Helena
–
автоматическое
нанесение,
концентрирование и разделение образцов на агарозном геле.
Одновременное выполнение до
24 образцов белковых
фракций на геле (4 образца иммунофиксации на геле).
Производительность – 72 образца в час (8 иммунофиксаций в
час). Время разгонки образца от 20 минут.
SAS
2
Helena
– автоматическая обработка гелей:
регулируемая
окраска,
обесцвечивание
и
сушка.
Производительность – 72 образца в час (8 иммунофиксаций в
час). Время разгонки образца от 20 минут.
SAS 2
Современный гелевый электрофорез
SAS 3 Helena – автоматическое нанесение, концентрирование
и разделение образцов на агарозном геле. Одновременное
выполнение до 100 образцов белковых фракций на геле.
Возможно проводить определение на гелях различного
формата: на 24, 60, 80 и 100 образцов на одном геле при
SAS 3 определении белковых фракций и 4 или 9 образцов для
иммунофиксации. Производительность – 300 образцов в час (18
иммунофиксаций в час). Время разгонки образца от 20 минут.
SAS 4
SAS 4 Helena – автоматическая обработка гелей: регулируемая
окраска,
обесцвечивание
и
сушка.
Одновременное
выполнение до 100 образцов белковых фракций на геле.
Возможно проводить определение на гелях различного
формата: на 24, 60, 80 и 100 образцов на одном геле при
определении белковых фракций и 4 или 9 образцов для
иммунофиксации. Производительность – 300 образцов в час
(18 иммунофиксаций в час). Время разгонки образца от 20
минут.
СОВРЕМЕННЫЙ КАПИЛЛЯРНЫЙ
ЭЛЕКТРОФОРЕЗ
Знакомьтесь – V8 – новое решение от компании
Helena
V8
Эволюция в клиническом электрофорезе
V8 Меню тестов
Непрерывная загрузка
Динамичный процесс выполнения анализа
90 определений белка сыворотки в час.
18 иммунотипирований в час.
Полная загрузка или постоянная дозагрузка в процессе работы.
Пополнение реагентов и буфера без простоя системы.
Отбор проб из любых пробирок со снятой крышкой:
- Диаметр 13-18 мм;
- Высота 20 – 100 мм.
Белки сыворотки (5 фракций)
Белки сыворотки (6 фракций)
Белки сыворотки (высокое разрешение))
Изоэлектрофокусирование гемоглобина
Иммунотипирование (5 фракций)
Иммунотипирование (6 фракций)
Белки в моче (5 фракций)
Мертвый объем - 30 µl.
Белки в моче (6 фракций)
Единые ячейки для образцов.
Белки в моче (высокое разрешение)
Углевод дефицитный трансферрин (CDT)
Иммунотипирование (высокое разрешение)
Спасибо за внимание.
Эксклюзивный дистрибьютер фирмы HELENA
в России компания Эко Мед С