Активация образования антител к антигенам ВИЧ при лечении

— Аллергия, астма и клиническая иммунология, 2002, №10, c.12-16.
Активация образования антител к антигенам ВИЧ при
лечении больных ВИЧ-инфекцией иммуномодулятором «Гепон»
Р.Д.Холмс, Р.И.Атауллаханов, А.В.Катлинский , М.Н.Папуашвили , А.В.Пичугин
ГНЦ РФ Институт иммунологии МЗ РФ, Immutic Group, ООО «Иммафарма», Московская
медицинская академия им. Сеченова
У
8
пациентов,
инфицированных
ВИЧ,
исследовали
влияние
курсового
лечения
иммуномодулятором «Гепон» на интенсивность продукции антител к антигенам ВИЧ. Больные
принимали Гепон по 10 мг per os один раз в день в течение 4 недель. До лечения и после его окончания
в сыворотке крови исследовали содержание антител, специфически связывающихся с белками ВИЧ-1
(sgp120, gp41, p31, p24, р17) и ВИЧ-2 (sgp 105 gp36). Для этого проводили титрование исследуемых
сывороток в иммуноблоте INNO-LIA HIV (Innogenetics) с последующей денситометрией и
компьютерной обработкой результатов количественного иммуноблота.
У всех исследованных в крови обнаружены антитела к антигенам ВИЧ-1, но не ВИЧ-2.
Установлено, что у 5 из 8 пациентов под влиянием лечения Гепоном происходило усиление продукции
антител к антигенам ВИЧ-1. Чаще наблюдалось усиление выработки антител, специфичных к р31, sgp120
и р24, реже - к р17 и gp41.
Препарат «Гепон» (per. P№000015/04-2001) является синтетическим тетрадекапептидом [2],
разрешен для применения в качестве иммуномодулятора для коррекции ослабленного иммунитета,
лечения и профилактики оппортунистических инфекций (инструкция Фармакологического комитета МЗ
РФ от 12.04.2001).
В предшествующем сообщении [1] было показано, что введение Гепона в организм
экспериментальных животных приводит к усилению продукции lgM-антител в ходе первичной реакции на
корпускулярный антиген и IgG-антител в ходе вторичной реакции на растворимый белковый антиген. В
данной работе исследовано влияние Гепона на продукцию антител, специфичных к антигенам вируса
иммунодефицита человека (ВИЧ) у лиц, инфицированных этим вирусом.
Материалы и методы
В исследовании участвовали 8 человек (5 мужчин и 3 женщины), инфицированных ВИЧ,
наблюдающихся в клинике ГНЦ Института иммунологии МЗ РФ. Участие в исследовании
было добровольным. Препарат Гепон принимали внутрь по 10 мг в виде водного раствора
однократно, ежедневно 1 месяца. Возраст пациентов варьировал от 27 до 44 лет (средний
возраст 36 лет). Давность установления диагноза "ВИЧ-инфекция" составляла от 2 до 11 лет,
в среднем 5 лет. Из анамнеза установлено, 7 из 8 пациентов были инфицированы при
половых контактах с ВИЧ-инфицированным партнером. Путь инфицирования 1 пациента не
был установлен.
Кровь для исследований забирали из локтевой вены утром натощак с помощью системы
Vacutainer (Beckton Dickinson), сыворотку получали стандартным способом, хранили при 60°С до исследования.
Уровень антител к белкам sgp120, gp41, p31, p24, р17 (ВИЧ-1), а также gp36 и sgpl05
(ВИЧ-2) оценивали с помощью наборов для иммуноблота INNO-LIA HIV Confirmation
(Innogenetics, cat. К-1036) по протоколу фирмы-производителя в нашей модификации
количественного определения титра антител. Сыворотки тестировали в разведении 1:100,
рекомендуемом для качественного определения, а также в серии 10-кратных разведений до
конечного разведения 1:10000000 для определения титра антител. Тест-полоски с
нанесенными антигенами инкубировали в различных разведениях сыворотки в течение 16
ч при комнатной температуре, постоянно покачивая на автоматическом встряхивателе.
После трехкратной отмывки полоски инкубировали 30 мин с конъюгатом (козьи антитела
против IgG человека, конъюгированные с щелочной фосфатазой) при комнатной
температуре на встряхивателе и отмывали 2 раза отмывочным буфером и 1 раз субстратным
буфером. К отмытым полоскам добавляли субстрат (BCIP/NTB) и инкубировали 30 мин при
комнатной температуре на встряхивателе. Реакцию останавливали 0,1М серной кислотой,
инкубируя в ней полоски в течение 30 минут на встряхивателе. Чтобы избежать вариаций в
интенсивности окрашивания все разведения сывороток от одного пациента исследовали в
одной постановке блота.
Высушенные полоски сканировали с помощью HP ScanJet 5p, используя стандартное
программное обеспечение. Количественную обработку профилей проводили с помощью
пакета Scionlmadge NIH (Национальный институт здоровья, США). По графику (кривая
титрования) зависимости интенсивности окрашивания от разведения сыворотки определяли
разведение (титр) сыворотки, соответствующий 50% интенсивности реакции.
Результаты и обсуждение
Все пациенты обеих групп отмечали хорошую переносимость препарата. Ни в одном
случае применения Гепона не было отмечено каких-либо жалоб, местных или общих
побочных реакций. Все пациенты отмечали общее улучшение самочувствия в период
лечения Гепоном, прибавили в весе. Среднее увеличение массы тела ко времени окончания
лечения составило 2,45±0,4 кг.
На рисунке 1 представлены типичные результаты исследования методом иммуноблота
сыворотки крови ВИЧ-инфицированного пациента (№1). Интенсивность (класс) ответа на
каждый антиген ВИЧ определялся денситометрически путем сравнения с интенсивностью
калибровочных полос 1-3 методом сканирования и анализа денситограммы с помощью
программы Scionlmadge.
Рис. 1.
Детекция антител к белкам ВИЧ1/ВИЧ2
методом иммуноблота INNO-L1A HIV Confirmation
(Innogenetics).
А - вид тест-полоски для определения антител
к белкам ВИЧ.
Б
—
денситометрическая
обработка
результата с помощью пакета Scionlmadge. 0,1,2,3 калибровочные линии, для определения класса
реакции: 0 - негативный контроль, 1 -уровень +/-,
2 -уровень 1+, 3 –уровень 3+.
В таблице 1 приведены результаты качественного определения содержания антител к
белкам ВИЧ у 8 ВИЧ-инфицированных, принявших участие в данном исследовании. У всех
пациентов наблюдался высокий уровень (класс 2-4) антител к белкам sgp120 и gp41 ВИЧ-1.
Несколько ниже был уровень ответов к белкам р31, р24 и р17 ВИЧ-1. Ни у кого из
исследованных не было обнаружено антител к белкам sgp105 и gp36 ВИЧ-2. Следовательно,
все пациенты, принимавшие участие в исследовании, были инфицированы ВИЧ-1, но не
ВИЧ-2.
Таблица 1. Классы реакции в иммуноблоте сывороток ВИЧ-инфицированных пациентов до лечения
Гепоном
Анализ кривых титрования сывороток ВИЧ-инфицированных позволил количественно
охарактеризовать содержание антител к каждому конкретному антигену ВИЧ. На рисунке 2
приведен пример титрования сыворотки крови пациента (№1) в иммуноблоте. В таблице 2
приведены титры антител к белкам ВИЧ sgp120, gp41, p31, p24 и р17 у 8 исследованных
пациентов до и после терапии Гепоном. По интенсивности продукции антител к различным
антигенам ВИЧ исследованные пациенты значительно различались между собой до начала
лечения. В частности, в крови пациента №5 уровень антител к gp41 был значительно выше,
чем у других исследованных. При этом у этого же пациента регистрировались лишь
небольшие количества антител к р17 и sgp120, и практически вообще не обнаруживались
антитела к р31 и р24. У пациента №8 не было обнаружено антител к р17 и р31, в то время как
антитела к другим антигенам ВИЧ интенсивно продуцировались. Антитела к gp41 хорошо
вырабатывались у всех исследованных, хотя пациенты №4 и №6 существенно уступали
другим по этому показателю. Пациент №6 уступал всем другим исследованным еще и по
уровню антител к р17.
Рис. 2. Образец титрования антител к
белкам ВИЧ1/ВИЧ2
с использованием
набора для иммуноблота INNO-LIA HIV
Confirmation
Приведены
(Innogenetics).
данные для пациента №1 до начала
лечения. По оси абсцисс - разведения
сыворотки,
интенсивность
полосы
по
оси
ординат
-
окрашивания
(пиксели)
соответствующего
антигена.
Кривые титрования антител к: 1 —
sgp120, 2 - gp41, 3 - р31, 4 - р24, 5 - р17.
Сечение
(6)
максимальной
по
уровню
50%
от
интенсивности
использовано для определения титров.
Лечение Гепоном стимулировало продукцию антител у 5 (62,5%) из 8 исследованных
пациентов (табл.2). Наибольшие эффекты касались продукции р24 и р17, хотя в ряде случаев
стимулировалась и продукция антител к sgp120, gp41 и р31. Так, после лечения Гепоном
содержание антител к р24 возросло в 8 и 3,8 раз у пациентов №6 и №4, соответственно. У
пациентов №6 и №7 после лечения Гепоном в 5 и 2,45 раза, соответственно, увеличилось
содержание антител к р17. Уровень антител к gp41 возрос в 2,7 раза у пациента №6, а
уровень антител к gpl20 - в 2,16 раза у пациента №2.
Таблица 2. Титры и относительные изменения содержания антител к различным белкам ВИЧ в
крови исследованных пациентов до и после лечения Гепоном.
Примечания: А — до лечения, В - после лечения Гепоном. Представлены значения титров антител,
специфичных в отношении указанного белка ВИЧ (соответственно, колонки обозначены sgp120, gp41, р31,
р24, р17). Коэффициент усиления продукции антител, специфичных к данному белку ВИЧ, указан в виде К с
соответствующим значком антигена.
Приведенные данные свидетельствуют об иммуномодулирующем влиянии
Гепона у пациентов, инфицированных ВИЧ. Это хорошо согласуется с описанным
ранее
[1]
усилением
иммунизированных
продукции
чужеродным
антител
у
антигеном
в
экспериментальных
сочетании
с
животных,
оральным
или
парентеральным введением Гепона. В случае лечения Гепоном ВИЧ-инфицированных
пациентов
получен
аналогичный
эффект
усиления
продукции
Иммунизирующими антигенами у таких пациентов являются белки ВИЧ.
антител.
Из представленных результатов очевидны различия между исследованными пациентами
по усилению продукции антител к различным белкам ВИЧ. Они могут проистекать из
различий между исследованными лицами как по HLA-фенотипу, так и по вирусной
нагрузке. Хорошо известно, что интенсивность синтеза антител к каждому конкретному
вирусному антигену зависит
от
количества
антигена
(вирусная
нагрузка)
и
от
индивидуальных особенностей (HLA-фенотип), определяющих способность данного
человека реагировать на данный антиген.
В целом, невзирая на индивидуальные различия между пациентами, факт усиления
продукции антител к антигенам ВИЧ у лиц, инфицированных ВИЧ, свидетельствует об
усилении противовирусной защиты в результате лечения иммуномодулятором «Гепон».
Список литературы
1.
Атауллаханов
Р.И.,
А.В.Катлинский,
Р.Д.Холмс,
Т
Б.Мастернак,
А.С.Ларин,
Е.Ю.Малкина,
Н.М.Шишкова. Усиление образования антител под влиянием иммуномодулятора «Гепон» // Иммунология. 2002.
2.
US Patent 5773573 dated 30.06.1998.
Примечание: работа спонсировалась Immutic Group.