Influence of silver nanoparticles on biochemical indicators of blood

№ 5 - 2014 г.
14.00.00 медицинские и фармацевтические науки
УДК 612.12:546.57]-092.9
ВЛИЯНИЕ НАНОЧАСТИЦ СЕРЕБРА
НА БИОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ
СЫВОРОТКИ КРОВИ МЫШЕЙ
А. О. Прискока
Национальный медицинский университет им. А. А. Богомольца (г. Киев, Украина)
Целью данной работы было исследование влияния многократных внутривенных введений
наночастиц серебра в разных дозах (1,6; 8,0 и 16,0 мг/кг) на биохимические показатели
сыворотки крови мышей. Выявлено статистически достоверное дозозависимое
увеличение активности фермента аланинаминотрансферазы и снижение активности
аспартатаминотрансферазы сыворотки крови, а также уменьшение соотношения
активности АЛТ/АСТ. В группе мышей, которым вводили 16 мг/кг наночастиц, отмечено
снижение концентрации общего билирубина и креатинина сыворотки крови.
Ключевые слова: наночастицы серебра, биохимические показатели, внутривенное
введение, мыши.
Прискока Андрей Олегович — аспирант кафедры фармакологии Национального
медицинского университета имени А. А. Богомольца, г. Киев, Украина, телефон рабочий:
+38-044-454-49-24, e-mail: [email protected]
Введение. Наночастицы серебра (НЧС) характеризуются выраженной противомикробной
активностью по отношению к широкому спектру возбудителей, включая
антибиотикорезистентные. В то же время оценка безопасности новых наноматериалов
требует комплексного изучения. Одним из аспектов такой оценки является исследование
влияния наночастиц на биохимические показатели — маркеры повреждения
ксенобиотиками внутренних органов. Учитывая возможное применение НЧС, особый
интерес представляет выявление изменений биохимических параметров при различных
путях введения, обеспечивающих системное воздействие. В мировой литературе имеются
немногочисленные работы, в которых исследовано влияние НЧС на некоторые
биохимические показатели крови [1–5]. В то же время практически отсутствуют такие
исследования при внутривенном пути введения НЧС.
На кафедре фармакологии Национального медицинского университета имени
А. А. Богомольца активно проводятся исследования по изучению фармакологических
и токсикологических свойств наночастиц металлов (золота, серебра, меди, железа,
магния и др.) и неметаллов (высокодисперсного кремнезема) [6 ].
Целью данной работы было исследование влияния различных доз НЧС на биохимические
показатели крови мышей в условиях многократного введения.
Материалы и методы. Объект исследования — коллоидный раствор НЧС в концентрации
8 мг/мл (диаметр 30 нм, сферическая форма), синтезированных по оригинальной
методике в Институте биоколлоидной химии им. Ф. Д. Овчаренка НАН Украины
(директор — д-р хим. наук З. Р. Ульберг). Размер и форма данных наночастиц
охарактеризованы при помощи трансмиссионной электронной микроскопии
и лазерно-корреляционной спектроскопии. В предыдущих исследованиях была показана
выраженная противомикробная активность данных наночастиц по отношению
к широкому спектру грамм-положительных и грамм-отрицательных бактерий, включая
антибиотикорезистентные [7 ]. Экспериментальные животные — 40 самок белых
нелинейных мышей массой 20 ± 2 г, содержались в стандартных условиях вивария
Национального медицинского университета имени А. А. Богомольца. Период карантина
составил 5 суток. Животные были распределены на 4 группы по 10 особей — три опытных
группы и одна контрольная. В опытных группах НЧС вводились внутривенно
в латеральную хвостовую вену в дозах 1,6; 8,0 и 16,0 мг/кг десятикратно в течение 28-ми
дней (табл. 1).
Таблица 1
Схема эксперимента с десятикратным внутривенным введением НЧС мышам
№ группы
Разовая доза НЧС*, мг/кг
Общая доза
НЧС, мг
1
0 (0,5 мл физиологического
раствора)
0
2
1,6
16
3
8
80
4
16
160
Дни введения НЧС (от начала
эксперимента)
1, 4, 7, 10, 13, 16, 19, 22, 25, 28-й
Примечание: *— доза НЧС в пересчете на металлическое серебро
В контрольной группе вводили 0,5 мл физиологического раствора по аналогичной схеме.
В течение эксперимента наблюдали за симптомами после введения, клиническими
признаками интоксикации. Наблюдение проводили ежедневно дважды. Животных
взвешивали в первый день эксперимента, на 7, 14 и 28-й дни. На 29-й день животные
выводились из эксперимента при помощи эфирного наркоза. Исследования проводили
в соответствии с «Европейской конвенцией о защите позвоночных животных,
используемых для экспериментов или в иных научных целях» [8]. Комитетом по биоэтике
Национального медицинского университета имени А. А. Богомольца установлено, что
проведенные исследования соответствуют основным этическим и биоэтическим нормам
(протокол № 72 от 29 мая 2013 года).
У мышей отбирали кровь в пластиковые контейнеры для дальнейшего определения
биохимических показателей. Отобранную кровь оставляли при комнатной температуре
в течение 2 часов до формирования сгустка, после чего кровь центрифугировали при
2000 об/мин в течение 10 минут, чтобы отделить сыворотку. В полученной сыворотке
определялись такие биохимические показатели: активность аланинаминотрансферазы
(АЛТ), аспартатаминотрансферазы (АСТ), билирубин, креатинин. Активность АЛТ и АСТ
определяли методом Райтмана-Френкеля, концентрацию билирубина — методом
Ендрашика, креатинина — кинетическим методом. Активность АЛТ и АСТ выражали
в мккат/л, концентрации билирубина и креатинина — в мкмоль/л. Для определения
вышеупомянутых показателей в исследованиях использованы стандартные наборы
реактивов («ООО НПП Филисит-Диагностика», г. Днепропетровск, Украина).
Статистическую обработку данных производили при помощи пакета MS Office Excel 2007.
Дисперсии двух выборок сравнивали с помощью теста Фишера, после чего применяли
простой или модифицированный тест Стьюдента в зависимости от значения критерия
Фишера [9]. Уровень достоверности выбран равным 0,95.
Результаты исследований. Животные из группы 1 (доза НЧС — 1,6 мг/кг) в целом хорошо
переносили влияние НЧС. Наблюдалась положительная динамика набора веса,
и в последний день эксперимента его прирост составлял 7,76 %. У отдельных особей
в группах 2 (доза НЧС — 8 мг/кг) и 3 (доза НЧС — 16 мг/кг) наблюдали негативные
последствия введения наночастиц. В частности, у особей из группы 2 наблюдали
длительные кровотечения в месте введения НЧС. В группе 3 при последнем введении
погибли три из десяти особей. Во всех экспериментальных группах наблюдали визуальное
увеличение количества мелких сосудов в области хвоста, что, по-видимому, связано
с большим количеством инъекций. У отдельных особей после первых введений отмечалось
появление небольших язв в месте инъекции, которые заживали до конца эксперимента.
В группе контрольных животных существенных изменений не замечено. Данные
по динамике массы тела всех подопытных животных обобщены в табл. 2.
Таблица 2
Динамика изменений массы тела мышей в эксперименте с десятикратным
внутривенным введением НЧС
№ группы (доза)
1 (1,6 мг/кг НЧС)
Масса тела, г
1-й день
7-й день
14-й день
28-й день
23,32 ± 1,55* 23,91 ± 1,88 23,90 ± 2,16 25,13 ± 2,28
2 (8 мг/кг НЧС)
23,32 ± 2,15
23,06 ± 1,28 22,97 ± 1,46 23,83 ± 1,02
3 (16 мг/кг НЧС)
22,00 ± 1,80
22,01 ± 1,88 22,53 ± 1,67 23,70 ± 1,38
Контроль (0,5 мл физиологического раствора)
22,42 ± 1,48
22,52 ± 1,58 23,92 ± 1,36 24,59 ± 1,68
Примечание: * — М ± m — масса ± доверительный интервал (p = 0,95)
По сравнению с контрольными показателями в группе 1 обнаружено статистически
достоверное повышение активности АЛТ, а в группе 3 отмечено не только достоверное
увеличение активности этого фермента, но и снижение активности АСТ (рис. 1). Кроме
того, такие изменения имели дозозависимый характер: активность АЛТ возрастала
с увеличением дозы НЧС. В то же время, соотношение активности АСТ/АЛТ снижалось
с увеличением дозы НЧС.
Рис. 1. Влияние НЧС на активность АЛТ и АСТ сыворотки крови мышей; К* —
контрольная группа; ** — разовые дозы НЧС в опытных группах
Рис. 2. Влияние НЧС на концентрацию общего билирубина сыворотки мышей; К* —
контрольная группа; ** — разовые дозы НЧС в опытных группах
Рис. 3. Влияние НЧС на концентрацию креатинина сыворотки мышей; К* — контрольная
группа; ** — разовые дозы НЧС в опытных группах
В группе 3, в которой вводили НЧС в наибольшей дозе (16 мг/кг), отмечено статистически
достоверное снижение концентраций общего билирубина (рис. 2) и креатинина (рис. 3)
сыворотки крови по сравнению с контрольными значениями и показателями опытных
групп.
Обсуждение результатов. Полученные данные указывают на способность НЧС в высоких
дозах вызывать поражения внутренних органов. В частности, дозозависимое увеличение
активности АЛТ свидетельствует о гепатотоксическом действии — способности НЧС
вызывать гепатоцеллюлярные поражения, нарушать целостность гепатоцитов [10].
В то же время снижение активности АСТ с увеличением дозы НЧС, а также уменьшение
соотношения АСТ/АЛТ свидетельствуют о том, что введение НЧС не приводит
к нарушению целостности клеток других внутренних органов, в частности сердца,
скелетных мышц, почек или мозга, в которых присутствует АСТ [11]. Возможность
гепатотоксического действия НЧС подтверждается исследованием K. Park при
пероральном введении НЧС крысам линии Sprague-Dawley [1]. В частности, однократное
введение НЧС в дозе 2 и 20 мг/кг вызывало существенное повышение уровня АСТ,
в то время как применение ионизированного серебра приводило не только к увеличению
активности АЛТ и АСТ, но и к некрозу печени. J. Cheragi и др. отмечают, что пероральное
введение НЧС размером 20–85 нм в различных дозах (3, 300 и 1000 мг/кг) самцам
и самкам мышей в течение 15-ти суток приводило к повышению уровня АЛТ и АСТ [2].
D. K. Tiwari и др. также обнаружили существенное повышение активности биохимических
маркеров печени при введении НЧС в дозе 40 мг/кг крысам линии Wistar [3].
Существенное снижение концентрации общего билирубина сыворотки в группе 3, а также
отсутствие статистических изменений этого показателя между группами 1,
2 и контрольной свидетельствуют, что, вероятнее всего, внутривенное введение НЧС
не вызывает холестатических нарушений. Снижение концентрации креатинина
у животных в группе 3 может свидетельствовать о дистрофических процессах в мышечной
ткани у данных животных. По данным мировой литературы, НЧС мало влияют
на концентрации общего билирубина и креатинина при ингаляционном [4] и пероральном
путях введения [5]. В то же время отсутствуют данные о влиянии НЧС на эти показатели
при внутривенном способе введения.
Выводы
1. Влияние НЧС на активность ферментов АЛТ и АСТ при введении НЧС мышам в дозах
1,6; 8,0 и 16,0 мг/кг имеет дозозависимый характер: с увеличением дозы наночастиц
достоверно возрастает активность АЛТ и снижается активность АСТ.
2. НЧС в дозе 16 мг/кг при внутривенном введении достоверно снижают концентрации
билирубина и креатинина, а при применении доз 1,6 и 8,0 мг/кг не наблюдается
статистических различий по сравнению с контрольной группой.
3. Значительные различия значений исследуемых биохимических показателей сыворотки
крови в группе, в которой вводили НЧС в дозе 16 мг/кг, по сравнению с другими
группами, а также имеющиеся случаи смертности среди животных в этой группе
свидетельствуют о существенной токсичности НЧС в дозе 16 мг/кг.
Список литературы
1. Park K. Toxicokinetic differences and toxicities of silver nanoparticles and silver ions
in rats after single oral administration / K. Park // Journal of toxicology and environmental
health. Part A. — 2013. — Vol. 76, N 22. — P. 1246–1260.
2. In vivo effect of silver nanoparticles on serum ALT, AST and ALP activity in male and
female mice / J. Cheragi, E. Hosseini, R. Hoshmandfar [et al.] // Australian Journal of Basic
and Applied Sciences. — 2013. — Vol. 7, N 1. — P. 171–177.
3. Tiwari D. K. Dose-dependent in-vivo toxicity assessment of silver nanoparticle in Wistar
rats / D. K. Tiwari, T. Jin, J. Behari // Toxicology mechanisms and methods. — 2011.
— Vol. 21, N 1. — P. 13–24.
4. Subchronic oral toxicity of silver nanoparticles / Y. S. Kim, M. Y. Song, J. D. Park [et al.] //
Particle and fibre toxicology. — Vol.7, N 2. — P. 1–11.
5. Subchronic inhalation toxicity of silver nanoparticles / J. H. Sung, J. H. Ji, J. D. Park [et al.]
// Toxicological sciences. — Vol. 102. — N 2. — P. 452–461.
6. Чекман И. С. Нанофармакология : экспериментально-клинический аспект / И. С.
Чекман // Врачеб. дело. — 2008. — № 3–4. — С. 104–109.
7. Silver nanoparticles applicability as antimicrobial substance in the prevention and
treatment of septic complicatoions / A. Pryskoka, L. Rieznichenko, A. Rudenko [et al.] //
Proceedings of 5-th International Conference Nanocon-2013, Brno, Czech Republic,
16–18 October, 2013. — Режим доступа :
http://www.nanocon.eu/files/proceedings/14/reports/2143.pdf. — Дата обращения :
26.09.2014.
8. European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and
Other Scientific Purposes // European treaty series. — 1986. — № 123. — Режим доступа :
http://conventions.coe.int/treaty/en/treaties/html/123.htm. — Дата обращения :
26.09.2014.
9. Гармаш А. М. Метрологические основы аналитической химии / А. М. Гармаш,
Н. М. Сорокина. — М. : МГУ им. М.В. Ломоносова, 2012. — 47 с.
10. Green R. M. AGA technical review on the evaluation of liver chemistry tests / R. M. Green,
S. Flamm // Gastroenterology. — 2002. — Vol. 123, N 4. — P. 1367–1384.
11. Gianini E. G. Liver enzyme alteration : a guide for clinicians / E. G. Gianini, R. Testa, V.
Savarino // Canadian Medical Association Journal. — 2005. — Vol. 172, N 3. — P. 367–379.
INFLUENCE OF SILVER
NANOPARTICLES ON BIOCHEMICAL
INDICATORS OF BLOOD SERUM
OF MICE
A. O. Pryskoka
National medical university n. a. A. A. Bogomolets (Kiev, the Ukraine)
Research of influence of repeated intravenous administrations of silver nanoparticles
in different doses (1,6; 8,0 and 16,0 mg/kg) on biochemical indicators of blood serum of mice
was the objective of this work. Statistically reliable dose dependent increase in activity
of of alaninaminotransferring enzyme and decrease of the activity
of aspartateaminotransferaza of blood serum, and also reduction of ratio in activity
of ALT/ASAT is revealed. In group of mice who had been injected 16 mg/kg of nanoparticles,
decrease in concentration of general bilirubin and creatinine of blood serum is registered.
Keywords: silver nanoparticles, biochemical indicators, intravenous administration, mice.
About authors:
Pryskoka Andrey Olegovich — post-graduate student of pharmacology department
of National medical university n. a. A. A. Bogomolets, office phone: +38-044-454-49-24, e-mail:
[email protected]
List of the Literature:
1. Park K. Toxicokinetic differences and toxicities of silver nanoparticles and silver ions
in rats after single oral administration / K. Park // Journal of toxicology and environmental
health. Part A. — 2013. — Vol. 76, N 22. — P. 1246–1260.
2. In vivo effect of silver nanoparticles on serum ALT, AST and ALP activity in male and
female mice / J. Cheragi, E. Hosseini, R. Hoshmandfar [et al.] // Australian Journal of Basic
and Applied Sciences. — 2013. — Vol. 7, N 1. — P. 171–177.
3. Tiwari D. K. Dose-dependent in-vivo toxicity assessment of silver nanoparticle in Wistar
rats / D. K. Tiwari, T. Jin, J. Behari // Toxicology mechanisms and methods. — 2011.
— Vol. 21, N 1. — P. 13–24.
4. Subchronic oral toxicity of silver nanoparticles / Y. S. Kim, M. Y. Song, J. D. Park [et al.] //
Particle and fibre toxicology. — Vol.7, N 2. — P. 1–11.
5. Subchronic inhalation toxicity of silver nanoparticles / J. H. Sung, J. H. Ji, J. D. Park [et al.]
// Toxicological sciences. — Vol. 102. — N 2. — P. 452–461.
6. Chekman I. S. Nanopharmacology: experimental and clinical aspect / I. S. Chekman //
Doctor’s records. — 2008. — № 3-4. — P. 104-109.
7. Silver nanoparticles applicability as antimicrobial substance in the prevention and
treatment of septic complicatoions / A. Pryskoka, L. Rieznichenko, A. Rudenko [et al.] //
Proceedings of 5-th International Conference Nanocon-2013, Brno, Czech Republic,
16–18 October, 2013. — Режим доступа :
8.
9.
10.
11.
http://www.nanocon.eu/files/proceedings/14/reports/2143.pdf. — Дата обращения :
26.09.2014.
European Convention for the Protection of Vertebrate Animals used for Experimental and
Other Scientific Purposes // European treaty series. — 1986. — № 123. — Режим доступа :
http://conventions.coe.int/treaty/en/treaties/html/123.htm. — Дата обращения :
26.09.2014.
Garmash A. M. Metrological fundamentals of analytical chemistry / A. M. Garmash,
N. M. Sorokina. — M.: Lomonosov Moscow State University, 2012. — 47 P.
Green R. M. AGA technical review on the evaluation of liver chemistry tests / R. M. Green,
S. Flamm // Gastroenterology. — 2002. — Vol. 123, N 4. — P. 1367–1384.
Gianini E. G. Liver enzyme alteration : a guide for clinicians / E. G. Gianini, R. Testa, V.
Savarino // Canadian Medical Association Journal. — 2005. — Vol. 172, N 3. — P. 367–379.