УДК 618.33 - 022.6 : 616 - 091 Н.М. Ивахнишина, Е.П. Когут, О.В. Островская Оптимальный метод выделения нуклеиновых кислот вирусов в секционном материале Институт охраны материнства и детства СО РАМН, г. Хабаровск При постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР) ключевую роль играет этап подготовки проб. Патологоанатомический материал содержит в большом количестве продукты некроза и аутолиза тканей и клеток, нарушенного обмена белков и липидов, ферментов, которые являются ингибиторами ПЦР [2, 4]. К началу нашей работы не было коммерческих диагностических наборов для выделения нуклеиновых кислот внутриутробных инфекций из секционного материала. Цель исследования — подбор условий для получения препаратов нуклеиновых кислот из патолого-анатомического материала, пригодных для ПЦР. Материалы и методы Для выбора оптимального метода выделения нуклеиновых кислот ДНК-содержащих вирусов (HSV и CMV) из секционного материала сравнивали эффективность пробоподготовки с помощью трех вариантов диагностических наборов, разработанных разными фирмами: 1. Фенольно-хлороформная экстракция с применением наборов «ВектоДНК-экстракция», ЗАО «Вектор-Бест» (пос. Кольцово Новосибирской обл.) для выделения ДНК из сывороток крови, форменных элементов крови, мочи, слюны, слезной жидкости, ликвора, соскобов со слизистой, культур клеток. Метод был модифицирован: фрагменты органов предварительно измельчались и обрабатывались лизирующим раствором [3]. 2. Фенольно-хлороформная обработка («ДНК/РНК экстракция», НПФ «Литех», г. Москва, для выделения ДНК/РНК из сыворотки и плазмы крови). Таблица 1 Ключевые слова: вирусы, подготовка проб, фенольнохлороформная экстракция, сорбционный метод, полимеразная цепная реакция. Key words: viruses, preparation of tests, fast culturing method, reaction of immunofluorescence, polymerase chain reaction. 3. Сорбционный метод выделения ДНК («Gene Pak™ DNA PCR test», OOO «Изоген», г. Москва) из мокроты, экссудатов, плевральной и спинномозговой жидкости, из мазков со слизистой урогенитального тракта. Для выбора оптимального метода выделения нуклеиновых кислот РНК-вирусов — вируса краснухи (Rub) и энтеровирусов (E/v) сравнивали методы: 1. Предварительный лизис и фенольно-хлороформная обработка («ВектоДНК-экстракция», ЗАО «Вектор-Бест» для выделения ДНК из крови, сывороток крови, форменных элементов крови, мочи, слюны, ликвора, соскобов со слизистой, культур клеток). 2. Фенольно-хлороформная обработка («ДНК/РНК экстракция», НПФ «Литех» для выделения ДНК/РНК из сыворотки и плазмы крови). 3. Сорбционный метод («Gene Pak™ RNA PCR test», OOO «Лаборатория Изоген») для обнаружения РНК в мокроте, различных экссудатах, плевральной и спинномозговой жидкости, в мазках со слизистой урогенитального тракта). В дальнейшем сотрудниками ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора (г. Москва) были разработаны наборы «ДНК-сорб-В» для выделения ДНК из цельной крови, биоптатов, фекальных экстрактов. Было проведено сравнительное исследование по выделению ДНК HSV и CMV Эффективность различных способов выделения ДНК из секционного материала Предварительный лизис + фенольная экстракция «ВектоДНКэкстракция» Органы / кол-во проб Фенольная экстракция «ДНК/РНКэкстракция» Таблица 2 Эффективность различных способов выделения РНК из секционного материала Сорбционный метод «Gene Pak™ DNA PCR test» 1 2 3 4 5 6 Органы / кол-во проб Предварительный лизис +фенольная экстракция «ВектоДНКэкстракция» Фенольная экстракция «ДНК/РНКэкстракция» Сорбционный метод «Gene Pak™ RNA PCR test» HSV CMV HSV CMV HSV CMV Тимус 2 2 1 2 1 0 0 1 2 3 4 5 6 Мозг 9 4 2 4 0 2 0 E/v Rub. E/v Rub. E/v Rub. Сердце 9 1 0 0 0 0 0 Мозг 10 1 1 1 1 0 0 Легкое 9 3 3 0 1 1 0 Сердце 10 3 0 0 0 0 0 Почка 9 4 2 2 1 0 0 Легкое 10 3 0 1 0 0 0 10 4 1 2 1 1 0 Печень 9 4 2 2 2 1 1 Почка Селезенка 8 2 1 0 1 0 0 Печень 10 2 0 0 0 0 0 Плацента 4 1 0 0 0 0 0 Селезенка 10 4 1 0 0 0 1 60 17 28,3 ±5,8* 3 5,03 ±2,8 3 5,0 ±2,8 2 3,3 ±2,3 1 1,7 ±1,7 1 1,7 ±1,7 Всего (абс./%±m) 59 21 35,6 ±6,2* 11 18,6 ±5,1 10 16,9 ±4,9 6 10,2 ±3,9 4 6,8 ±3,3 1 1,7 ±1,6 Всего (абс./%±m) Примечание. * — 1 и 3; 1 и 5 — p<0,01. Примечание. * — 1 и 3 — p<0,05; 1 и 5 — p<0,01. 104 Таблица 3 Значение ранней обработки секционного материала для выявления РНК Выделение РНК через 4 ч методом предварительного лизиса + «ДНК-экстракция» Органы / кол-во проб Выделение РНК через 3-5 сут методом предварительного лизиса + «ДНК-экстракция» Таблица 4 Выявление ДНК-вирусов при обработке секционного материала модифицированным методом пробоподготовки и с помощью тест-системы «ДНК-сорб-В» Предварительный лизис + фенольная экстракция «ВектоДНК-экстракция» Органы / кол-во проб E/v Rub. E/v Rub. Мозг 5 0 1 0 0 Мозг Сердце 5 2 0 0 0 Сердце Легкое 5 0 0 0 0 Почка 5 1 1 1 Печень 5 0 0 Селезенка 5 2 Всего (абс./%±m) 30 5 16,7±6,8 Сорбционный метод «ДНК-сорб-В» HSV CMV HSV CMV 5 4 0 3 1 5 0 0 0 0 Легкое 5 2 2 2 2 0 Почка 5 0 1 0 1 0 0 Печень 5 0 0 0 1 0 0 0 Селезенка 5 3 2 3 2 2 6,7±4,6 1 3,3 ±3,3 0 0±11,8 Всего (абс./%±m) 30 9 30,0±8,4 5 16,7±6,8 8 26,7±8,1 7 23,3±7,7 двумя методами: модифицированным методом фенольно-хлороформной экстракции («ВектоДНК-экстракция», ЗАО «Вектор -Бест») с предварительным измельчением и лизисом секционного материала и сорбционным методом (наборы «Амплисенс» «ДНК-сорб-В»). Амплификацию проводили, используя тест-системы «Амплисенс» (ФГУН ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора, г. Москва). Результаты ПЦР учитывали методом электрофореза в агарозном геле. Результаты и обсуждение Результаты выделения ДНК вирусов с использованием трех способов подготовки проб показаны в табл. 1. Установлено, что с помощью модифицированного нами метода ДНК HSV выявляли в 2,1-3,5 раза чаще, чем с помощью второго и третьего методов (р<0,05; р<0,01). ДНК CMV также выявляли в 1,8-10,9 раза чаще с помощью первого метода, чем при использовании второго и третьего. При сравнении методов выявления РНК-содержащих вирусов установлено, что РНК E/v обнаруживали с помощью первого метода в 5,7-16,6 раза чаще, чем остальными методами (р<0,01). Ампликоны РНК Rub также выявляли в 1,5-3 раза чаще первым методом (табл. 2). Известно, что РНК является неустойчивой структурой [1]. Для установления оптимального срока обработки секционного материала было проведено выявление РНК из фрагментов органов через 4 ч без замораживания и через 3 и 5 сут после хранения при t = -20С°. При обработке материала в самые ранние сроки через 4 ч РНК E/v выявляли в 5 раз чаще. РНК Rub обнаруживали только при раннем способе обработки (табл. 3). Для хранения очищенного препарата РНК необходимо сразу производить реакцию обратной транскрипции (ОТ), комплиментарная ДНК при t = -20 С° хранится длительно, до 1 г. (срок наблюдения). Аналогичное исследование в отношении ДНК-содержащих вирусов показало, что результаты ПЦР не зависят от срока хранения (t° хранения -20°С) очищенной нуклеиновой кислоты. Таким образом, сравнение различных способов выявления ДНК и РНК-вирусов показало, что наиболее эффек- тивен модифицированный нами способ с применением дополнительного лизиса и фенольно-хлороформной экстракции с использованием наборов «ВектоДНК-экстракция». Для выявления РНК вирусов необходимо проводить пробоподготовку не позже 4-6 ч после взятия пробы. Сравнительное исследование двух методов выделения ДНК вирусов HSV и CMV из секционного материала: с использованием предварительного лизиса и фенольнохлороформной экстракции («ВектоДНК-экстракция») и с применением тест-системы «Амплисенс» «ДНК-сорб-В» — показало, что при использовании обоих методов ДНК вирусов выявляли практически с одинаковой частотой и в одних и тех же образцах (табл. 4). Таким образом, в сравнительных опытах было установлено преимущество обработки секционного материала с помощью фенольно-хлороформной экстракции и денатурации этанолом наборами «ВектоДНК-экстракция» с предварительным размельчением и удалением примесей лизирующим раствором. Способ был использован нами для изучения этиологической структуры фетоинфантильных потерь. Этот метод по эффективности сопоставим с разработанным позже ЦНИИ эпидемиологии Роспотребнадзора коммерческим набором для выделения нуклеиновых кислот из цельной крови, биоптатов и фекальных экстрактов «ДНК-сорб-В». Ли т е р а т у р а 1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. М., 1990. 544 с. 2. Мавзютов А.Р., Бондаренко В.М., Латкин А.Т. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2003. №3. С. 93-98. 3. Пат. №2292551, Российская Федерация. МПК 51 G01№33/53 G01№1/28 (2006.01). Способ ранней диагностики внутриутробных инфекций у новорожденных / О.В.Островская, Н.М. Ивахнишина, Е.Б.Наговицына и соавт.; заявитель и патентообладатель ГУ ДНЦ ФПД СО РАМН 4. Wilson I.G. // Appl. Environ. Microbiol. 1997. Vol. 10, Р. 3741-3751.