R-6038 ИХТ EBV Тест для выявления антигенов вируса

28 Pierre Köenig St., Talpiot Industrial Area
P.O.B 53231 Jerusalem 91531 ISRAEL
Phone: 972-2-6781861; Fax : 972-2-6781852
e-mail: info@novamed.co.il
EBV (IgM) ТЕСТ
ЭКСПРЕСС-ТЕСТ ДЛЯ КАЧЕСТВЕННОГО ОДНОЭТАПНОГО ВЫЯВЛЕНИЯ АНТИТЕЛ (IgM) К ОЧЕНЬ
РАННИМ АНТИГЕНАМ ZEBRA И VCA p18 ЭПШТЕЙНА-БАРР ВИРУСА В СЫВОРОТКЕ ЧЕЛОВЕКА
Кат. № R-6038.
ИНСТРУКЦИЯ ПО ПРИМЕНЕНИЮ
НАЗНАЧЕНИЕ
EBV (IgM) ТЕСТ- иммунохроматографическая тест-система для
качественного выявления антител (IgM) специфических к очень
ранним антигенам ZEBRA И VCA p18 (капсидный антиген)
вируса Эпштейна–Барр (ВЭБ) в сыворотке человека с целью
ранней диагностики острой инфекции вызванной вирусом
Эпштейна-Барр (ВЭБИ).
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ
Открытие ВЭБ связано с исследованиями в области онкологии. В
1961 г. Дэнис Персон Беркитт выявил особое онкологическое
заболевание, позднее описанное как лимфома Беркитта,
наблюдавшееся у детей в африканских странах. В 1964 г.
английский вирусолог Майкл Эпштейн и его аспирантка Ивонна
Барр в сотрудничестве с Беркиттом выявили новый тип
герпесвируса из материалов опухоли. Через четыре года была
доказана этиологическая роль данного вируса при инфекционном
мононуклеозе [5,7,16].Это один из самых распространенных
вирусов у человека. ВЭБ принадлежит к семейству Herpesvirinae,
включающему в себя другие патогенные вирусы человека
(Herpes simplex 1 and 2, Varicella zona virus (VZV),
cytomegalovirus (CMV), HHV6, HHV7 and HHV8).
После первичной инфекции, ВЭБ остается жить в B-лимфоциах и
эпителии носа и горла. При передаче слюной, ВЭБ приводит к
инфекциям у младенцев, которые, однако, часто протекает
бессимптомно. У молодых людей в возрасте от 15 до 25 лет
возможен второй пик заражения. В 2/3 случаев может развиться
инфекционный мононуклеоз (железистая лихорадка Пфайффер,
«болезнь поцелуев»). Клиническими симптомами являются
потеря аппетита, усталость, лихорадка, сыпь, фарингит,
тонзиллит, лимфангит, лейкоцитоз, головные и ревматические
боли, а также функциональные нарушения печени. Все это
определяется инфекцией и литическим жизненным циклом
вируса в В-лимфоцитах и последующим иммунным ответом. В
редких случаях могут возникнуть серьезные осложнения, такие
как гемолитическая анемия, пневмония, неврологические
проявления или кардиологические нарушения. Более 90%
взрослых являются серопозитивными носителями вируса,
поскольку ВЭБ сохраняется в течение всей жизни в Bлимфоцитах и в определенных клетках эпителия.
Как и в случае других вирусов герпеса, реактивация ВЭБИ может
возникнуть у пациентов с иммунными дефектами или при
назначении иммунно-супрессивного лечения, и вновь, растут
титры антител IgG/IgM/IgА, вырабатываемых на ранние
антигены ВЭБ. B-лимфоциты инфицируются ВЭБ на протяжении
всей жизни, поскольку ВЭБ размножаются бесконечно. Это
свойство, обычно контролируемое или подавляемое иммунной
системой, может привести к ряду злокачественных заболеваний:
лимфо-пролиферативным
заболеваниям
обусловленным
иммунодефицитами вызванными заболеваниями (например,
СПИД) или иммуно-супрессивным лечением (поликлональная
лимфома)
или
лимфоме
Беркитта
сопровождаемой
хромосомными изменениями. Вместе с последующими кофакторами, ВЭБ может вызывать рак носоглотки.
Во время литического жизненного цикла ВЭБ, имеет место
лавинообразное формирование различных регулирующих белков
в ранней фазе заболевания ("Очень ранние антигены", IEA;
"Ранние антигены", EA), а затем структурных белков
("Капсидные антигены", VCA и мембранные белки, MA).
Антитела IgМ к капсидному антигену (IgМ VCA) появляются в
крови очень рано, обычно до развития клинических симптомов, и
обнаруживаются в начале заболевания в 100% случаев. Антитела
IgМ VCA почти всегда присутствуют в сыворотке при активной
инфекции, поэтому их обнаружение является диагностически
информативным для острого эпизода ВЭБИ.
Белок, называемый ZEBRA (BamH1 Z Epstein-Barr Replication
Activator также называемый EB1 or Zta) выполняет важную роль
в переходе из периода латентного ожидания в литический
жизненый цикла ВЭБ. Этот белок является фактором
транскрипции, который выполняет, в частности, роль активатора
в транскрипции определенных вирусных генов и в их
собственном синтезе. Тест на антитела к ZEBRA был изучен как
косвенный маркер реактивации вирусов среди ВИЧсеропозитивных иммуно-суппресивных лиц. IgM антитела к
ZEBRA появляются очень рано во время первичной инфекции и
их выявление позволяет диагностировать первичную инфекцию
ВЭБИ быть очень рано.
Гуморальный ответ на первичное инфицирование ВЭБ является
быстрым. Антитела, направленные против ВЭБ ориентируются
на различные вирусные белки и антитела коррелирующими
состояние болезни. В случае первичной инфекции, IgM и IgG
появляются последовательно следующим образом: IEA (
немедленный ранний антиген), ранний диффузный антигена
(EA-D), VCA (вирусный капсидный антиген) и EBNA (ядерный
антиген). Первичная инфекция характеризуется наличием IgM
против IEA (белок ZEBRA), EA-D и VCA в то время как IgG
против EBNA отсутствуют. В старых инфекциях, как правило,
обнаруживают анти VCA IgG и анти EBNA IgG.
В серологической диагностике ВЭБ с помощью теста
иммуннофлюоресценции
с
инфицированными
и
ВЭБпродуцирующими
клетками,
антитела,
как
правило
дифференцированы по трем классам антигенов: EA - ранние
антигены, VCA - капсидные антигены и EBNA- ядерные
антигены, активированные в латентной фазе. белки или
синтетические пептиды.
Особенность антигена ZEBRA используемого в EBV (IgM) ТЕСТ
производства Новамед, Израиль основана на очень раннем и
очень интенсивном IgM-ответе позволяющим определить
специфические антитела раньше всех других маркеров широко
представленных на рынке.
Ассоциация белка ZEBRA и VCA антигена p18 позволяет
выявить все стадии первичной инфекции и повышает
клиническую чувствительность теста.
ПРИНЦИП
EBV (IgM) ТЕСТ производства
компании Novamed Ltd.,
Израиль представляет собой метод иммунофильтрации с
использованием антигенов ZEBRA и VCA p18 для обнаружения
анти-ВЭБ антител IgM в сыворотке крови человека. Тест
представляет собой помещенную в пластиковый футляр (кассету)
полоску нитроцеллюлозной мембраны с фиксированными на ней
в области тестовой зоны T1 антигенами ЗЕБРА и VCA p18,
обеспечивающих результат теста в виде появления тестовой
линии. Протеин А зафиксирован на мембране в контрольной зонe
C и является ответственым за появление контрольной линии.
При прохождении предварительно разведенного образца
сыворотки через мембрану, любое антитело типа анти-ZEBRA
(IgM) и анти-VCA p18 содержащееся в образце связывается с
соответствующим антигеном в области зоны T1 мембраны. При
добавлении реагента для развития цветной реакции (development
reagent) реагирующего с антителами IgM человека развивается
синий цвет в области зоны T1 мембраны. Реагент для развития
цветной реакции (development reagent) также проявляет IgM
антитела человека, зафиксированные в контрольной зоне C.
Kонтрольная линия появляется всегда. Наличие контрольной
линии
подтверждает
корректность
результатов
теста
(правильный объем пробы, необходимый темп миграции,
требуемое качество реагентов).
КОМПЛЕКТАЦИЯ НАБОРА
Набор EBV (IgM) ТЕСТ производства компании Novamed Ltd.,
Израиль содержит количество компонентов достаточное для
проведения 25 анализов:
25 тестовых устройств (кассет) EBV (IgM) ТЕСТ
упакованных в индивидуальные алюминиевые
пакетики:
Антигены ZEBRA и VCA p18 иммобилизированны
на мембране в тестовой зоне T1 тестового
устройства
EBV (IgM) ТЕСТ. Протеин А
приклеплён на мембране в контрольной зоне C.
Замечание: Перед использованием тестового
устройства EBV (IgM) ТЕСТ, зона T1 мембраны
окрашена в жёлтый цвет, а контрольная зона C
мембраны - в розовый цвет. Эти цвета исчезают в
процессе тестирования.
2 флакона содержащих по 21 мл буфера для
разведения образца (Reagent 1).
2 флакона содержащих по 21 мл анти-IgM конъюгата
сцепленого с полистереновыми бусинками синего
цвета (Reagent 2).
2 флакона содержащих по 21 мл буфера для
промывки (Reagent 3).
ОГРАНИЧЕНИЯ
1. EBV (IgM) ТЕСТ производства компании Novamed Ltd.,
Израиль предназначен для скринингового обнаружения IgM
анти-ZEBRA и анти-VCA p18 антител в сыворотке крови
человека.
2. EBV (IgM) ТЕСТ предназначен только для профессиональной
диагностики "in vitro".
3. Данный качественный тест не позволяет определить
количественное содержание анти-ZEBRA IgM aнтител и
проводить мониторинг уровня антител у заведомо
положительных пациентов.
4. Лица с ВЭБИ могут не иметь обнаруживаемые уровни IgM на
ранней стадии инфекции.
5. EBV (IgM) ТЕСТ указывает исключительно на наличие антиZEBRA и анти-VCA p18 IgM антител в образцах сыворотки
крови, обеспечивая качественную детекцию и может
использоваться в качестве единственного критерия для
диагностики первичной ВЭБИ.
6. Как и при всех всех тестах предназначенных для диагностики
"in vitro", результаты должны быть интерпретированы врачом
на базе всех других доступных клинических и биологических
данных (в основном VCA IgG, EBNA IgG и гетерофильных
антител).
7. Результаты анализа образцов взятых у пациентов с
иммунодефицитом должны рассматриваться с особой
осторожностью.
8. Отрицательный результат может быть получен в случае
исследования образца взятого у пациента в конце острой фазы
заболевания, когда ZEBRA IgM антител уже не существует.
9. Анти-VCA p18 IgM антитела могут отсутствовать на самой
ранней стадии первичной ВЭБИ.
10. Наличие ревматоидного фактора в высокой концентрации (>
150 МЕ / мл) может привести к ложно-положительным
результатам.
ХРАНЕНИЕ
EBV (IgM) ТЕСТ производства компании Novamed Ltd., Израиль
необходимо хранить в холодильнике при температуре 2-8оС.
Не замораживать!
Не допускается использование набора и его компонентов после
истечения срока годности. Срок годности набора указан на
упаковке.
До использования тестовое устройство должно находиться в
неповрежденной индивидуальной упаковке.
Флаконы с реагентами должны храниться при температуре 2-8°C
до иапользования теста и сразу же после каждого использования.
ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ И МЕРЫ ПРЕДОСТОРОЖНОСТИ
1. EBV (IgM) ТЕСТ производства компании Novamed Ltd.,
Израиль предназначен только для использования in vitro в
целях лабораторной диагностики.
2. Не допускается использование набора и его компонентов после
истечения срока годности.
3. Не использовать тест из поврежденной упаковки.
4. При проведении исследования необходимо следовать правилам
работы
в
лаборатории,
в
частности,
использовать
специализированную одежду, одноразовые перчатки, не
принимать пищу и не курить на рабочем месте.
5. Исследование проб крови регламентируется правилами работы
с инфекционными агентами.
6. После проведения исследования устройство должно быть
утилизировано в соответствующий контейнер для отходов.
ОТБОР, ХРАНЕНИЕ И ПОДГОТОВКА ПРОБ.
Только образец сыворотки крови человека может быть
исследован с помощью EBV (IgM) ТЕСТ производства компании
Novamed Ltd., Израиль.
Не использовать гемолизированные или загрязненные образцы.
Мутные образцы должны быть отцентрифугированны перед
использованием.
Рекомендуется проводить тест сразу же после сбора и
центрифугирования образца. В противном случае, сыворотка
может храниться при температуре 2-8°C в течение 48 часов. Для
более длительного хранения, сыворотка должна быть заморожена
при температуре -20°C. Неспецифические реакции были
выявлены при исследовании образцов сыворотки сохраняемых
более 48 часов при температуре 2-8°C.
Замороженные образцы должны быть доведены до комнатной
температуры перед выполнением теста и тщательно
перемешаны. Образцы не должны быть подвергнутыми
нескольким циклам замораживания и оттаивания.
В случае транспортировки образцов следует действовать в
соответствии с регуляциями принятыми для транспортировки
продуктов человеческого происхождения..
ТЕХНИКА ВЫПОЛНЕНИЯ АНАЛИЗА
1. Перед началом тестирования следует довести образец,
тестовую кассету и реагенты до комнатной температуры (1530ºC). Не вскрывать индивидуальную упаковку теста до
начала исследования.
2. Непосредственно перед проведением исследования вскрыть
индивидуальную упаковку теста.
3. Маркировать
тестовую
кассету
инициалами
или
идентификационным номером пациента.
4. Поместить каплю 25 мкл сыворотки на дно пластиковой
пробирки и добавить 1,5 мл буфера для разведения образца
DIL. Тщательно перемешать с помощью пипетки.
5. С помощью лабораторной пипетки перенести каплю
разведенного образца из пробирки в окошко для внесения
пробы тестовой кассеты. Позвольте капле разведенного
6.
образца полностью впитаться в окошко для внесения пробы
(15 сек).
Тщательно перемешайте анти-IgM конъюгат CONJ легким
помешиванием флакона (Reagent 2) до начала тестирования.
Внесите 1,5 мл CONJ в окошко для внесения пробы тестовой
кассеты. Позвольте внесенному количеству CONJ полностью
впитаться в окошко для внесения пробы (15 сек).
7.
Внесите 1,5 мл буфера для промывки WASH в окошко для
внесения пробы тестовой кассеты. Позвольте внесенному
количеству буфера для промывки WASH
полностью
впитаться в окошко для внесения пробы (15 сек).
8. Результат анализа учитывают сразу же как только буфер для
промывки полностью впитается сливается в окошко для
внесения пробы тестовой кассеты. Не интерпретировать
результат после истечения 20 минут.
Примечания:
1. Убедитесь, что не прикасаетесь к мембране кончиком
пипетки. Используйте новые наконечники на каждом этапе,
чтобы не загрязнить Реагенты 1, 2 и 3.
2. Объем 1,5 мл может быть внесен одномоментно или в два
этапа, по две равные капли по 750 мкл каждая, например.
ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ
Положительный результат на анти-ВЭБ
IgM антитела (ZEBRA и VCA p18):
присутствие двух цветных полосок синего
цвета (даже слабой интенсивности) как в
тестовой зоне Т1, так и в контрольной зоне С
тестового окошка кассеты. Обнаружение
анти-ZEBRA и анти-VCA p18 IgM антител
указывает на наличие первичной ВЭБИ или
реактивации.
Отрицательный результат:
отсутствие
цветной полоски синего цвета в тестовой зоне
Т1 и присутствие цветной полоски синего
цвета в контрольной зоне С тестового окошка
кассеты. Анти-ZEBRA и анти-VCA p18 IgM
антитела не обнаружены что указывает на
отсуствие первичной ВЭБИ.
Недействительный результат:
отсутствие контрольной полоски
синего цвета в контрольной зоне
С тестового окошка кассеты вне
зависимости от присутствия или
отсутствия
цветной полоски
синего цвета в тестовой зоне Т1.
Неправильный объем пробы,
несоблюдение
процедуры
тестирования
или
качество
реагентов – наиболее частые
причины
отсутствия
контрольной
линии.
Проанализируйте
процедуру
тестирования и повторите ее с
использованием новой тесткассеты.
Если
проблема
остается, следует прекратить
тестирование и связаться с
местным дистрибьютором.
Недействительный результат: сильный
темно-синий фон на мембране появляется в
случае если один из этапов фильтрации занял
время более 1 минуты. Повторите процедуру
тестирования с использованием новой тесткассеты.
КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА
Процедурный контроль
Тест предусматривает внутренний контроль за правильностью
проведения процедуры. Цветная линия появляющаяся в
контрольной зоне (C) тестового окошка кассеты, указывает на
правильность проведения процедуры теста.
Результаты теста не учитываются если неясный фон мешает
интерпретировать результаты. Отсутствие фильтрации или
медленный темп фильтрации (> 1 мин) любого из 3 реагентов,
так же как и присутствие сильного синего фона на мембране
после промывки указывают на деффект устройства. В этом
случае результат считается недействительным.
6.
Контроль качества
Положительный и отрицательный контроли доступны для заказа
отдельно от набора и предназначены для проверки качества
исполнения теста при открытии новой партии или новой
поставки.
9.
EBV(IgM)ТЕСТ
+
Положительный 74
Отрицательный 5
Чувствительность
= 93.7%
ВЭБ
IgM
cыворотки
Отрицат.
4
2
Положит.
1
2
Borrelia Burgdorferi
IgG +
Anti thyroglobuline or
anti thyroperoxydase +
Rheumatoid factor
3
0
6
0
7
3
Tuberculosis (anti A60
antibodies)
4
0
13.
-
1
75
Cпецифичность
= 98.7%
Замечания
В одном из двух
образцов
была
подтверждена
реактивация ВЭБ
Положительный
> 150 UI/ml
"Inter" и "intra" изучение теста
EBV (IgM) ТЕСТ производства компании Novamed Ltd., Израиль
был опробован в трипликатах на двух различных сериях с
использованием отрицательных, слабо-положительных и сильноположительных сывороток. Результаты показали "inter" и "intra"
повторяемость серий до 100%.
ЛИТЕРАТУРА:
1.
2.
3.
4.
5.
10.
12.
Перекрестное реагирование
Сыворотки
CMV IgM +
Borrelia burgdorferi
IgM +
8.
11.
ХАРАКТЕРНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ТЕСТА
Чувствительность и специфичность теста
Изучение результатов полученных от амбулаторных больных и
доноров крови. Сыворотки были тестированы на VCA и/или EA
IgM с помощью ELISA (DiaSorin) или Immunoblot (EBVCHECK
IgM ALLDIAG S.A.) или EBV IgM (Enzygnost Anti EBV/IgM II
Dade Behring).
ВЭБ
IgM
cыворотки
7.
Brousset, P. et al. “Epstein-Barr virus (EBV) replicative gene expression in
tumour cells of AIDS-related non Hodgkins’ lymphoma in relation to CD4
cell number and antibody titres to EBV”, AIDS, vol. 8, 1994, pp. 583-590.
Chan, K.H. et al. “Development and evaluation of an Epstein-Barr Virus
(EBV) Immunoglobulin M enzyme-linked immunosorbent assay based on the
18-kilodalton matrix protein for diagnosis of primary EBV infection”,
Journal of clinical microbiology, vol 36, 1998, pp. 3359-3360
Cheng, Hwez-ming et al. “ Epstein-Barr Virus Nuclear antigen 1 linear
epitopes that are reactive with immunoglobulin A (IgA) or IgG in sera from
nasopharyngeal carcinoma patients or from healthy donors.” Journal of
clinical microbiology, vol. 29, N°10, Oct. 1991, pp. 2180-2186.
Cheng, Hwee-Ming. “Linear epitopes of the replication-activator protein of
Epstein-Barr virus recongised by specific serum IgG in nasopharyngeal
carcinoma.” Cancer immunol immunother, vol. 40, 1995, pp. 251-256.
Epstein, M.A., B.B. Achong, and Y.M. Barr. 1964. Virus particles in
Cultured Lymphoblasts from Burkitt’s Lymphoma. In: Lancet 1:702-703.
Epstein, M.A., Y.M. Barr, and B.G. Achong. 1965. Studies with Burkitt’s
Lymphoma. In: Wistar Inst. Sympos. Monogr. 4:69-82.
Gorgievski-Hrisoho, M., et al.. Serodiagnosis of Infectious Mononucleosis by
using recombinant Epstein-Barr Virus Antigens and Enzyme-linked
immunosorbent assay technology. J. Clin. Microbiol. 28, 2305-2311 (1990)
Hinderer, W et al. “Serodiagnosis of Epstein-Barr virus infection by using
recombinant viral capsid antigen fragments and autologous gene fusion”
Journal of clinical microbiology, vol. 37, 1999, pp. 3239-3244
Ho, D. W., P. R. Field, and A. L. Cunningham. 1989. Rapid diagnosis of
acute Epstein-Barr virus infection by an indirect enzyme-linked
immunosorbent assay for specific immunoglobulin M (IgM) antibody
without rheumatoid factor and specific IgG interference. J. Clin. Microbiol.
27(5): 952-958.
Jilg, W. et al., Diagnostic significance of antibodies to the Epstein-Barr virusspecific membrane antigen gp 250. J. Infect. Dis. 152, 222-225 (1985)
Joab, I. et al. “Detection of anti Epstein-Barr virus trans-activator (ZEBRA)
antibodies in sera from patients with human immunodeficiency virus. JID,
vol. 163, Jan. 1991, pp. 53-56.
Joab, I. et al. “Detection of anti Epstein-Barr virus trans-activator (ZEBRA)
antibodies in sera from patients with nasopharyngeal carcinoma”. J. Cancer,
vol. 48, 1991, pp. 647-649.
Lee, C.L. and Davidson, L. 1967. Spot test for infectious mononucleosis.
Annual Meeting ASCP and CAP.
14. Marechal, V. et al. “enzyme-linked immunosorbent assay for antibodies to
ZEBRA, an Epstein-Barr trans-activator”. Research in virology, vol. 144,
N°5, 1993, pp.397-404.
15. Matheson, B. A., S. M. Chisholm, and D. O. Ho-Yen. 1990. Assessment of
rapid ELISA test for detection of Epstein-Barr virus infection. J. Clin.
Pathol. 43:691- 693.
16. Mathew, A et al., “A high incidence of serum IgG antibodies to the
Epstein-Barr virus replication activator in nasopharyngea carcinoma”,
Cancer Immunology Immunotherapy, vol. 38, 1994, pp. 68-70.
17. Mikaelian, I et al. “The DNA-binding domain of the two BZIP
transcription factors, the Epstein-Barr virus switch gene product EBI and
Jun, is a bipartite nuclear targeting sequence”. Journal of virology, Feb.
1993, pp. 734-742.
18. Miller, G., “The switch between latency and replication of Epstein-Barr
virus”, The Journal of infectious diseases, vol. 161, 1990, pp. 833-844.
19. Niedobitek, G., et. al. 1997. Epstein-Barr virus (EBV) infection in
infectious mononucleosis: virus latency, replication and phenotype of
EBV-infected cells. J. Pathol. 182: 151-159.
20. Tedeschi, R. et al. “the disease associations of the antibody response
against the Epstein-Barr virus transactivator protein ZEBRA can be
separated into different epitopes.” Journal of General Virology, vol. 76,
1995, pp1393-1400.
21. Thorley-Lawson, D.A.. 1988. Immunological responses to Epstein-Barr
virus infection and the pathogenesis of EBV-induced diseases.
Biochimica et Biophysica Acta. 948: 263-286.
22. Van Grunsven, Wout M.J., et al. “Gene mapping and expression of two
immunodominant Epstein-Barr virus capsid proteins”, Journal of
virology, vol. 67, 1993, pp. 3908-3916
УТВЕРЖДАЮ
Генеральный директор ООО «ГЕМ»
_____________С.А. Гольдберг
«23» июня 2010 г.
Представительство в РФ:
ООО «ГЕМ» 127083, г. Москва, ул. 8
Марта, д.1, стр.12, этаж 3, пом. XXV,
ком.11. Tел/факс: +7 (495) 612-43-12
www.hemltd.ru
IFU-EBV IEA (IgM)-R-6038b-HEM-russ-v.03-13.01.14