Люди, бактерии, фаги: тонкости совместной жизни
реклама
Доктор химических наук В.Н.Крылов Люди, бактерии, фаги: тонкости совместной жизни R последнее время возродился интерес к изучению генетики, ген ом ики и эволюции бактериальных вирусов бактериофагов (или просто «фагов»). В мартовском номере «Химии и жизни» за прошлый год мы рассказали об использовании фагов для борьбы с бактериальными инфекциями. Но есть и другая причина, по которой врачи и ученые интересуются фагами: множество новых данных, свидетельствующих о том, что фаги могут вызывать появление новых патогенных бактерий и, следовательно, новых заболеваний. Теперь мы иначе понимаем значение фагов в природе - они не просто самые мелкие хищники, а переносчики генетической информации. Как они это делают Умеренные фаги (дальше речь пойдет именно о них), в отличие от вирулент­ ных, могут выбрать один из двух пу­ тей развития, литический или лизогенный — то есть убить зараженную бак­ терию или сосуществовать с ней. Во втором случае, как правило, фаг вне­ дряет свой геном в те или иные участ­ ки бактериальной хромосомы. При этом гены фага остаются неактивными бла­ годаря действию особого белка —репрессора. Геном фага становится профагом и копируется вместе с бактериаль­ ной хромосомой. Однако если репрессор по той или иной причине перестает действовать, происходит индукция профага—геном фага вырезается из хро­ мосомы, и начинается литический цикл. Так вот, при неточном вырезании может получиться фаг, утративший часть собственных генов, но зато при­ хвативший некоторые из генов хозяи­ на, прилежавших клевому или право­ му концу профага. Если при этом фаг потерял не слишком важные гены, то он способен нормально развиваться и, заражая нового хозяина, привносит в него гены, захваченные у предыду­ щего. Это наиболее распространен­ ный и простой механизм горизонталь­ ного переноса генов —специализиро­ ванная трансдукция. Горизонтальным переносом называ­ ется передача генов или их блоков между разными видами или штамма­ ми бактерий (в отличие от вертикаль­ ного переноса—передачи генов по на­ следству). Этот процесс существенно ускоряет эволюцию. Очевидно, что ди­ вергенция—случайные изменения нуклеотидной последовательности гена, ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ НАУКИ превращающие его в новый полезный ген, — протекает гораздо медленнее. Фаги могут переносить, например, гены, контролирующие токсины или иные белки, которые влияют на патогенность бактерии. Экспрессия этих генов в новом хозяине называется фаговой (в рассмотренном случае — лизогенной) конверсией, а фаг — кон­ вертирующим. Многократный перенос генов может привести к возникнове­ нию патогенных островков (pathogenic islands), которые иногда заметно уве­ личивают размер генома бактерии. Вновь возникший после индукции фаг не всегда способен прямо инфициро­ вать клетки нового хозяина. Но есть еще одна возможность: фаговый геном может встроиться в плазмиду —коль­ цевую молекулу ДНК, умеющую путе­ шествовать из бактерии в бактерию. Многие плазмиды легко преодолева­ ют межвидовые барьеры. Интеграции конвертирующих фагов в плазмиды способствуют особые последователь­ ности ДНК, также обладающие спо­ собностью вырезаться и встраи­ ваться, — мобильные генетические элементы (МГЭ). И наконец, конвер­ тирующими могут стать и фаги-транспозоны (ФТ) - о с о б а я разновидность бактериальных вирусов, совмещаю­ щих в себе свойства фагов и МГЭ. Напоследок одно маленькое заме­ чание. Здесь и далее речь пойдет о лизогенной конверсии. Однако не ис­ ключено, что и вирулентные фаги, как ни коротко их пребывание в бактерии, могут синтезировать белки, влияющие на макроорганизм, и таким образом изменять течение заболевания. Гены патогена Условимся считать патогенными лю­ бые свойства бактерий, способству­ ющие их внедрению в макроорганизм, осуществлению патологических про­ цессов, а также препятствующие дей­ ствию природных защитных факторов или лекарств. В большинстве случаев бактерия становится патогенной, при­ обретя новые гены, хотя иногда (очень редко) уровень патогенности повыша­ ется, напротив, после удаления генов, подавляющих синтез токсинов. У бак­ терии могут измениться поверхност­ ные компоненты, повысив ее устойчи­ вость к действию антител, макрофа­ гов, антибиотиков, бактериофагов. Появление дополнительной полисахаридной капсулы вокруг клетки меха­ нически защищает бактерию от внеш­ них воздействий. Бактерия может так­ же «научиться» синтезировать экзоток­ сины — яды, действующие на те или иные системы макроорганизма,или специфические белки (интерналины и инвазины), способствующие проник- новению через клеточные барьеры, в том числе попаданию в кровеносную систему. Некоторые гены бактерий способствуют образованию биофиль­ мов—сообщества-пленки, которые плотно прикрепляются к эпителиаль­ ным клеткам и тем самым приобрета­ ют дополнительную способность про­ тивостоять неблагоприятным фак­ торам. Наконец, один из самых изве­ стных примеров — фаги могут пере­ носить гены множественной лекар­ ственной устойчивости. Доказано, что горизонтальный пе­ ренос генов с помощью умеренных фагов порождал новых патогенов в самых разных группах бактерий: воз­ будителей холеры, различных форм диареи, дифтерии, коклюша, скарла­ тины, ботулизма,ерсиниозов, спирохетозов, заболеваний, вызванных ста­ филококками, и других. Для примера мы рассмотрим всего несколько бак­ терий и фагов: синегнойную палочку Pseudomonas aeruginosa и некоторые виды семейства кишечных бактерий. С фагами синегнойной палочки автор работает около 30 лет, и в нашей ла­ боратории накопилось достаточно наблюдений, прямо связанных с го­ ризонтальным переносом генов и межвидовой миграцией этих фагов. Выбор бактерий семейства кишечных обусловлен прежде всего их важнос­ тью в жизни человека. Кишечная па­ лочка, Escherichia coli, добропорядоч­ ный и очень полезный обитатель тол­ стого кишечника, часто именно вслед­ ствие горизонтального переноса ге­ нов переходит в токсигенные и пато­ генные формы. Другой вид бактерий этого семейства, шигеллы, могут вы­ зывать дизентерию (кстати, роль кон­ вертирующих фагов здесь также хо­ рошо установлена). Человек и бактерия: мир или война? Синегнойная палочка —условный па­ тоген: она не может существовать в здоровом человеческом теле, а по­ ражает лишь повреждения. Большин­ ство видов умеренных фагов синегнойной палочки способно обмени­ ваться участками генетического ма­ териала, прямо подтверждая приме­ нимость модульной теории эволюции (эта теория, напомним,утверждает, что новые признаки могут быть ре­ зультатом не только мутаций, но и обмена генами или блоками генов) и на межвидовом уровне. Среди них есть фаги, филогенетически род­ ственные фагам E.coli \л других бак­ терий. Фаги-транспозоны синегной­ ной палочки P.aeruginosa весьма мно­ 32 гочисленны. Изучение этих фагов, принадлежащих к четырем разным видам, выявило модульную структу­ ру их геномов и способность исполь­ зовать для адсорбции одни и те же рецепторы — пили, маленькие прямые волоски на поверхности бактерий. Пили содержат адгезины — вещества, позволяющие бактериям прочно при­ крепляться к любым живым и нежи­ вым поверхностям и образовывать на них пленки. Геном фага-транспозона D3112 пе­ реносится с помощью гибридной плазмиды RP4::D3112 (четырьмя точ­ ками обозначают встройку мобильно­ го элемента в геном) как в бактерии близкородственного вида P.putida, так и в неродственные виды, напри­ мер в кишечную палочку E.coli. Но результат совершенно разный. В P.putida он ведет себя как обычный умеренный фаг. Ecoli, /голучив плазMHflyRP4::D3112, перестает делить­ ся при 30°С и быстро разрушается. А при 42°С ее деление и рост происхо­ дят нормально, и клетки сохраняют в себе плазмиду с фагом. Оказалось, что рост Ecoli со встро­ енной плазмидой при 42°С обуслов­ лен неактивностью при этой темпе­ ратуре белкатранспозазы, контроли­ рующего вырезание и встройку фагатранспозона (хотя ген транспозазы не поврежден, но белок может быть из­ менен из-за несоответствующего вы­ бора кодонов). Так действует природ­ ная генная инженерия: внедрение профага в несвойственного ему хо­ зяина (даже без генов другой бакте­ рии!) приводит к тому, что кишечная палочка с профаговыми генами поги­ бает при одной температуре, но вы­ живает при другой (близкой к темпе­ ратуре тела человека!) Эти дополни­ тельные гены в ходе постепенной дивергенции могут стать активными компонентами генома бактерии. А что же «родные» фаги Escherichia coin Кишечная палочка —обязатель­ ный компонент нормальной микрофло­ ры здорового человека. Однако иног­ да после инфекции фагами она пре­ терпевает превращение, как в «Стран­ ной истории доктора Джекила и мис­ тера Хайда» — милое создание, вер­ ный друг и спутник человека приобре­ тает токсигенность. Белки-токсины (их называют веротоксинами или шигаподобными токсинами) в патогенных штаммах кишечной палочки похожи на токсины дизентерийных бактерий Shigella, названных в честь японского ученого Кийоши Шига, открывшего эти бактерии более ста лет назад. Есть несколько разновидностей этих токси­ нов со сходными структурой и действи­ ем. Любой из них убивает клетку в две стадии: сначала субъединица В токси­ на присоединяется к трисахариду в составе глюколипидного рецептора Gb3 в мембране клетки эпителия, а затем субъединица А подавляет в клет­ ке белковый синтез. (Запомним эту двустадийность, чтобы вернуться к ней в конце статьи.) У разных больных в ходе одной и той же эндемической вспышки мож­ но найти бактерии с профагами, кон­ тролирующими разные шига-токсины. Да и сами фаги могут значительно отличаться друг от друга. И наконец, бактерии, которые заражаются фага­ ми, также отличаются между собой (относятся к разным серотипам). В результате появляются возбудители, вызывающие заболевания с разными проявлениями:диарею, геморраги­ ческий колит, гемолитический уреми­ ческий синдром. Рассмотрим теперь важные и инте­ ресные результаты сравнения после­ довательности нуклеотидов в патоген­ ном штамме E.coli0\ЫМ1 с класси­ ческим объектом молекулярной гене­ тики, штаммом К12. Штамм E.coli 0157:Н7 был обнаружен в 1982 году во время вспышки геморрагического колита —впервые распознанного син­ дрома, при котором наблюдались кро­ вавый понос и сильная боль в животе практически без повышения темпера­ туры. У больных не обнаружили ни одного из ранее известных патогенов, которые могли бы вызвать такие симп­ томы. Эпидемиологический анализ показал, что все заболевшие ели один и тот же мясной паштет, инфициро­ ванный бактериями редкого серотипа. Сейчас бактерии этого серотипа чрез­ вычайно распространились и в ряде случаев могут вызвать системные за­ болевания со смертельным исходом. Обычные их носители — крупный ро­ гатый скот, свиньи, птица. Находят их и на различных овощах и фруктах, и в воде возле пляжей. Причем, как ока­ залось, штаммы, выделенные из раз­ ных источников, существенно отлича­ ются между собой. Что же лежит в основе такой приспособляемости и разнообразия? Последовательности нуклеотидов размером 4,1 миллионов пар нуклео­ тидов в геномах у лабораторного штам­ ма К12 и у патогена 0157:Н7 очень сходны: принято считать, что это и есть характерный для всего вида E.coliveном. Но хромосома штамма 0157:Н7 содержит дополнительно еще около 1,4 миллионов пар нуклеотидов. Именно там находятся патогенные островки, причем около половины этого довеска составляют 24 (!) фаговых генома. Эта область кодирует примерно 1600 бел­ ков, которых нету К12 (из них для 131 уже доказана связь с вирулентностью штамма), и 20 транспортных РНК. (На­ помним, что молекулы тРНК служат «мостиками» между информационной РНК и белком, устанавливая соответ­ ствия между нуклеотидными триплета­ ми и аминокислотами в процесе син­ теза белковой молекулы.) Дополни­ тельные тРНК, которых нет у нормаль­ ной E.coli, нужны патогенной форме именно для обеспечения эффективной экспрессии новых генов, как свиде­ тельствует анализ использования трип­ летов в обычных и «благоприобретен­ ных» генах. Иными словами, зловред­ ные гены были привнесены бактерио­ фагами из бактерий, имеющих иную частоту триплетов —скорее всего, со­ вершенно других видов. Упомянем еще одну почти детектив­ ную историю, последние страницы ко­ торой пока не дописаны. Этиологичес­ ки неясное заболевание, так называе­ мый синдром внезапной смерти но­ ворожденных (английская аббревиату­ ра— SIDS), в последнее время стали связывать с инфекцией детей внутрибольничным штаммом E.coli, выраба­ тывающим токсин курлин. Этот токсин образует особые клеточные поверхно­ стные структуры, «курчавые волоски» (отсюда название), и обладает высо­ кой адгезивной активностью — он спо­ собен связывать белки крови, что вы­ зывает шок у лабораторных живот­ ных. Заметим, что синтезировать кур­ лин могут и другие виды бактерий се­ мейства кишечных бактерий. Было бы интересно выяснить роль бактериофа­ гов в распространении его гена. Попробуем подвести итоги 1. Между патогенными бактериями и родственными им непатогенными ва­ риантами существует перенос генов, который выполняют умеренные бак­ териофаги, плазмиды и мобильные генетические элементы. Это приводит к возникновению новых возбудителей. 2. Вновь возникший штамм несет патогенные признаки, проявление ко­ торых (то есть особенности протека­ ния заболевания)зависит и от гене­ тической структуры бактерии-носите­ ля, и от генетической структуры конк­ ретного фага-переносчика, и от реак­ ции макроорганизма. 3. Ни для вирулентных, ни для уме­ ренных фагов до сих пор не решен вопрос о возможности патогенного или токсического действия продуктов, кодируемых собственными генами фага. Ссылки на отсутствие явно не­ гативных эффектов при использо­ ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ НАУКИ вании фаготерапии не слишком убе­ дительны. Во-первых, они касаются только вирулентных фагов, во-вторых, на фоне болезни такой эффект мо­ жет пройти незамеченным. Кому-то из читателей покажется, что рассмотренные случаи, при всем их многообразии, — некая частность, курьез микромира. Приведем еще два аргумента, чтобы показать, как опас­ но недооценивать роль фагов. Многие умеренные фаги являются индуцибельными — их гены можно активировать с помощью внешнего воздействия. Так, облучение солнеч­ ным светом стимулирует синтез хо­ лерного токсина в случае фага Vibrio cholerae, а применение некоторых антибиотиков, например широко ис­ пользуемого сейчас ципрофлоксацина, —синтез шига-токсинов. Стиму­ ляция отмечена как in vitro, так и in vivo и происходит, очевидно, за счет увеличения числа копий фагового ге­ нома (примерно в 10 000 раз). Таким образом, применение антибиотика может резко ухудшить течение забо­ левания, если думать только о бакте­ рии и забыть о фаге. Но не исключено, что инфекцион­ ные болезни — не единственный «по­ дарок» фагов человечеству. Возмож­ но, существует канал для генетичес­ кого обмена между фагами и макро­ организмами. Некоторые фаговые гены кодируют продукты, сходные с продуктами самых разных микро- и макроорганизмов, и это все чаще свя­ зывают с прямым захватом фагом этих генов у соответствующих орга­ низмов. Хороший пример на сей раз дает не умеренный, а вирулентный фаг — гигантский бактериофаг fKZ, активный на P. aeruginosa. Родствен­ ные ему фаги, образующие не менее трех видов, часто встречаются и в при­ роде. Среди их белков много в разной степени сходных с продуктами не толь­ ко патогенных бактерий (например, Haemophilus influenza, Listeria murrayi, Campylobacter jejuni, Mycoplasma hominis, Vibrio cholerae, Ricketsia prowazakeii, Mycobacterium tuberculosis, Chlamydia trachomatis, Caulobacter crescentus, Escherichia coli, Salmonella typhimu- hum), но и эукариотов —мыши, крысы и человека. Часть этих белков вы­ полняет функции,связанные с мета­ болизмом ДНК, процессами транс­ крипции и трансляции генома фага. Однако, поскольку у этого фага функ­ ция более 200 генов из 306 обнару­ женных остается неизвестной, нельзя исключить, что некоторые гены с не­ известной функцией могут кодировать вредные продукты. Окончательный вывод делать рано, кроме разве что самого общего: многое в наших вза­ имоотношениях с фагами еще оста­ ется тайной. Изменчивая бактерия материал или архитектор? До сих пор не вполне ясно и другое: что же такое — патогенные бактерии, возникают ли они случайно или по определенным законам, пока нам не известным. Есть два мнения. Соглас­ но одному из них, патогены происхо­ дят от бактерий-комменсалов (напом­ ним, что комменсализм — разновид­ ность симбиоза, при которой один партнер полностью отказывается от связей с внешним миром, предостав­ ляя их другому, причем гость не при­ носит хозяину заметной пользы или вреда)вследствие неких случайных событий с участием переносчиков генов: фагов, плазмид и МГЭ. Действительно, известно, что неко­ торые гены патогенности могут при­ сутствовать и в геномах комменсалов, которым эти гены помогают выживать в их собственной нише, например в кишечнике млекопитающих. Ведь до сих пор не вполне ясно происхожде­ ние генов токсинов и их реальное значение. Читатели «Химии и жизни», несомненно, помнят гипотезу, кото­ рую предложил в № 11 «Химии и жиз­ ни» за прошлый год В.П.Скулачев, токсины (например, дифтерийный) могут быть зачем-то нужны самому макроорганизму. Возможно, эта ги­ потеза покажется менее экзотичной, если вспомнить предположение, вы­ сказанное недавно А.С.Нейшем («Mic­ robes Infect.» 2002, т.4(3), с.309—317): токсины могли быть производными 33 ПРОБЛЕМЫ И МЕТОДЫ НАУКИ белков бактерий-комменсалов, кото­ рые помогали тем удерживаться в макроорганизме. (Интересно рас­ смотреть с этой точки зрения двустадийный механизм действия шига-токсинов, о котором мы рассказывали выше. Что, если безобидная первая стадия и убийственная вторая — это два этапа эволюционного процесса, превратившего симбионта в агрессо­ ра? Но разумеется, это предположе­ ние требует дальнейших подтвержде­ ний.) Согласно другому мнению, патоге­ ны возникают не случайно, а законо­ мерно, и существует генетический механизм, регулирующий и направ­ ляющий их совершенствование и рас­ пространение. То есть патогены рас­ сматривают не как причуду эволюции, а как особую группу живых существ, которые лучше всего приспособлены именно к обитанию в макроорганиз­ ме и «целенаправленно» защищают­ ся от неблагоприятных воздействий со стороны хозяина, в том числе мо­ дифицируя свой геном. Исходя из того что природа, в отли­ чие от человека, глупостей не делает, я склонен принять, что патогенные бактерии — не случайность и не кап­ риз, а особый фактор эволюции. Тог­ да появление патогенов с новыми свойствами — тоже не случайность, а реакция на стресс, возникающий тог­ да, когда бактерии не могут существо­ вать по-прежнему в облюбованной ими природной нише —в макроорга­ низме. (Пример — введение в меди­ цинскую практику нового лекарства.) Значит, механизм ответа на стресс должен быть заложен в генетической структуре патогенов. Можно предпо­ ложить, что эволюционные изменения запускает система сенсоров, настро­ енных на восприятие каких-то особых условий в многоклеточном организме. Такие системы в принципе известны. Скажем, P.aeruginosa при нехватке ионов железа образует многие фак­ торы вирулентности, в том числе сидерофоры, экзотоксин, протезазы и гемолизин. Вообще при голодании хозяина по железу у нее увеличивает­ ся выражение примерно 120 генов в 5 34 раз, а выражение примерно 90 генов во столько же раз уменьшается, хотя какова функция большинства этих ге­ нов—остается неясным. Хорошо изу­ ченная, вошедшая в учебники систе­ ма SOS-ответа бактерий на неблаго­ приятные воздействия тоже ведет к индукции профагов. Здесь можно вспомнить, что и па­ тогенный штамм кишечной палочки, о котором шла речь выше, не возник «из ничего» в момент начала эпидемии, а, скорее всего, существовал очень дол­ гое время. Приобрести более 29 про­ фагов и лишний миллион пар нуклеотидов за короткий срок невозможно — это вам не точечная мутация. Очевид­ но, штамм обитал в кишечнике домаш­ них животных, но активности на чело­ веке не проявлял: до определенного времени мясные продукты вреда лю­ дям не приносили. Но на одном из этапов сосуществования этого штам­ ма и животного условия изменились. Возможно, животное получило какойто антибиотик (их часто добавляют в корма), что и могло стать причиной или индукции какого-то профага, или запуска иной гипотетической системы ответа на стресс). Произошедшее в ге­ нетическом аппарате изменение адап­ тировало патоген к новым условиям и одновременно расширило его норму реакции —эта кишечная палочка ста­ ла вызывать заболевания и у людей. На молекулярном уровне ответ на стресс может быть различным: у бак­ терий возникают интегроны с кассе­ тами генов устойчивости к антибио­ тикам, мобильные островки патоген­ ное™, повышается мутаторная актив­ ность, активизируются фаговая кон­ версия признаков, перестройки гено­ ма и тому подобное. Конечным ре­ зультатом может стать повышение патогенности и вирулентности — и приспособление к изменившимся ус­ ловиям в макроорганизме. Кроме того, благодаря горизонтальному пе­ реносу генов частоты генотипов в популяции бактерий смогут быстро изменяться в пользу гипервирулент­ ных, лучше приспособленных к новым условиям, вариантов. (Кстати, имен­ но это показал сравнительный анализ геномов патогенных стафилококков.) Следует ожидать, разумеется, и быс­ трого приобретения устойчивости к различным способам лечения, старым и новым: к антибиотикам, бактерио­ фагам, литическим ферментам, бактериоцинам,вакцинам и сывороткам, к разным вариантам ASR-технологии (от «Anti-Sence RNA» — введение в патогенные бактерии генов, кодиру­ ющих антисмысловую РНК, которая «заглушает» действие вредных генов). Действительно, даже на эту послед­ нюю хитрость патогены могут ответить (и, скорее всего, ответят) своими хит­ ростями. Как следствие ASR-терапии они могут: увеличить число копий заглушаемого гена, заменить его на другой, функционально эквивалентный, но структурно отличный, так что анти­ смысловая РНК к нему больше «не под­ ходит», или же, наконец, бактерия мо­ жет получить(через горизонтальный перенос) ферменты рестрикции, раз­ резающие на части ASR-гены. Почти во всех этих процессах могут участвовать конвертирующие фаги. Парадоксально, но факт: причинами, ведущими к возникновению новых ин­ фекционных заболеваний,становятся те самые области человеческой дея­ тельности, которые должны бороться с болезнями, в частности практичес­ кая медицина —клиники, больницы, роддома. Концентрация в одном лечеб­ ном учреждении, например,больных кистозным фиброзом (муковисцидозом), с одной стороны, улучшает каче­ ство их лечения, с другой стороны создает новую, совершенно особую нишу для обитания и эволюции пато­ генов. Опасность, исходящая от науки, от промышленных биотехнологий, мо­ жет быть связана с использованием в производстве или лабораторных иссле­ дованиях бактерий, имеющих нишу в организме человека (если эти бакте­ рии из-за нарушения правил попадут в окружающую среду). Люди встреча­ ются с новыми возбудителями и в ходе освоения новых природных ниш, а ме­ стные эндемические заболевания рас­ пространяются на непривычные к ним контингенты людей при массовых пе­ реселениях, войнах. Сможет ли человечество отказать­ ся от всего этого? Вряд ли. Прогресс (назовем это так) можно считать бла­ гом или злом, но в любом случае его не остановить. Однако серьезным ученым, думающим не только о гран­ тах, и квалифицированным врачам, ду­ мающим не только о гонорарах, нельзя не помнить о возможных последстви­ ях их работы. Настала пора обсудить необходимость законодательного зап­ рета на использование в клинической практике всех— пусть даже очень эф­ фективных в лабораторных условияхпроцедур и методов, включающих в себя направленное изменение генома патогенной бактерии (или могущих привести к этому) . Иначе мы неизбеж­ но придем к новому витку эволюции патогенов, и никто не знает, что нас будет ждать на этом витке.