МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РФ ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «НИЖЕГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ТЕХНИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ им. Р.Е. АЛЕКСЕЕВА» Кафедра «Нанотехнологии и биотехнологии» ИНТЕНСИВНАЯ ТЕХНОЛОГИЯ ВЫРАЩИВАНИЯ ГРИБОВ «ВЕШЕНКА» Методические указания к лабораторным занятиям по дисциплине «Основы биотехнологии для студентов, обучающихся по направлению «Биотехнология» дневной формы обучения Нижний Новгород 2014 1 Составители: О.В. Кузина, Е.В. Скоробогатова УДК 576(076.5) Интенсивная технология выращивания грибов "Вешенка": Метод. указания к лаб. работам по дисциплине «Основы биотехнологии» для студентов, обучающихся по направлению «Биотехнология» дневной формы обучения / НГТУ; Сост.: О.В. Кузина, Е.В. Скоробогатова – Н. Новгород, 2005.– 21 с. Лабораторный практикум включает описание основных этапов производства мицелия вешенки для промышленных целей, а также технологию выращивания плодовых тел грибов в домашних условиях. Методические указания предназначены для самостоятельной и аудиторной работы студентов. Редактор Э.Б. Абросимова Подписано в печать 10.03.2013. Формат 60841/16. Бумага газетная. Печать офсетная. Усл. п. л. 0,5. Тираж 80 экз. Заказ . Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева. Типография НГТУ. 603950, г. Нижний Новгород, ул. Минина, 24. Нижегородский государственный технический университет им. Р.Е. Алексеева, 2014 2 Введение Искусственное разведение древоразрушающих грибов для пищевых целей имеет многовековую историю. Широкое распространение получила культура ВЕШЕНКИ ОБЫКНОВЕННОЙ (P. ostreatus). Гриб Вешенка относительно легко поддается культивированию и устойчив к комплексу вредителей и болезней. Плодовые тела Вешенки содержат белки, жиры и углеводы, а также ценные аминокислоты и микроэлементы. Важная особенность химического состава – наличие витаминов А, В1, В2, С, Д, РР. В таблице 1 приведены некоторые данные химического состава этого гриба в сравнении с другими. Таблица 1 Данные химического состава отдельных сортов грибов Содержание Гриб Белый Лисич- Сыро Шамвеществ, вес.% Вешенгриб ки ропиньоны ка ежки Вода 89,5 89,4 91,0 88 91,0 Белки 4,7 3,7 1,6 1,7 4,3 Липиды 0,6 1,7 1,1 0,7 1,0 Углеводы, 4,5 1,1 1,5 1,5 0,1 в том числе: клетчатка, 3,0 2,3 0,7 1,4 0,9 растворимая клетчатка 0,23 Зола 0,76 0,9 0,4 0,6 1,0 Витамины, мг/100 г: витамин В1, 0,12 0,04 0,01 0,01 0,1 рибофлавин (В2) 0,42 0,3 0,35 0,30 0,45 Для выращивания грибов необходим посадочный материал – мицелий, который производят предварительно, и органический субстрат. Основой органического субстрата в производстве грибов являются отходы древесины или здоровый опил любых пород деревьев – лиственный, хвойный или смешанный. В целом технология выращивания грибов включает операции получения мицелия, его посев на органический субстрат и собственно выращивание плодов. 1. Получение мицелия 1.1. Общая характеристика процесса Мицелий, как посадочный материал, должен обладать хорошими наследственными свойствами и устойчивостью к заболеваниям, иметь высокую урожайность, короткий период плодоношения, давать плодовые тела высокого качества и обильное и компактное плодоношение. Он должен быть свободным от грибных, бактериальных и вирусных заболеваний, поэтому его производство осуществляется в стерильных условиях. Весь процесс производства мицелия для промышленных целей включает в себя четыре основные стадии. Сначала получают стерильную маточную культуру. Ее родоначальником являются кусочки тел здоровых свежих грибов. Питательной средой на этой стадии является агар, растворенный в отваре зерна – пшеницы или еще, какой-либо зерновой культуры. На второй стадии получают первую промежуточную культуру на основе маточной культуры и в той же питательной среде. Далее получают вторую промежуточную культуру на основе первой, и питательной средой в этом случае является зерно с минеральными добавками в виде мела и гипса. После этого уже готовят посевной мицелий для промышленных целей в условиях, аналогичных приготовления второй промежуточной культуры, но в больших объемах. 1.2. Получение маточной культуры мицелия 1.2.1. Подготовка к посеву. Маточную культуру выращивают в пробирках, диаметром 21 мм и длиной 200 мм. 4 Пробирки замачивают в теплой воде с 0,5–1,0% раствором синтетического моющего средства на 3 часа, моют неоднократно в проточной воде при температуре (40 ± 2)0С, ополаскивают дистиллированной водой и сушат при комнатной температуре. Затем чистые пробирки стерилизуют в течение часа в сушильном шкафу при температуре 140 – 1500С. Для приготовления питательной среды сначала необходимо получить отвар зерна. Для этого 34 г пшеницы хорошо промывают под водопроводной водой и заливают одним литром дистиллированной воды. Полученную смесь нагревают до кипения и медленно кипятят в течение 2 часов. После этого ее оставляют на 24 часа, а затем фильтрованием через марлю с небольшим количеством ваты получают отвар, объем которого доводят до 1 л добавлением к нему дистиллированной воды. Затем в полученном отваре при нагревании на водяной бане и регулярном перемешивании растворяют 20 г агара. Полученную таким образом питательную среду фильтруют через четыре слоя марли и определяют ее рН с помощью ионометра. Значение рН должно быть равным 7,0. Если оно ниже, то добавляют 0,1М раствор NaOH, а при более высоком значении рН – 0,1М раствор НСl. Питательную среду при температуре 500С разливают в пробирки, в каждую по 15 мл. При этом необходимо следить за тем, чтобы горлышко у пробирки оставалось сухим. Пробирки закрывают ватно-марлевыми пробками и далее проводят стерилизацию питательной среды в автоклаве при давлении 1,5 атм. в течение 40 мин. После окончания стерилизации среду выгружают из автоклава, переносят в бокс и охлаждают не менее 8–10 часов. Штатив с пробирками ставят наклонно таким образом, чтобы уровень питательной среды в пробирке стал скошенным, и оставляют в таком положении до тех пор, пока среда не затвердеет. 5 1.2.2. Посев ткани культуры. Эту операцию проводят в ламинарном шкафу (боксе), который стерилизуют бактерицидными лампами 10-15 мин. Поверхность стола и боковые стенки ламинарного шкафа протираются марлей, смоченной 75-80% этиловым спиртом. У входа в предбоксник перед посевом кладут коврик, смоченный 10-15% раствором хлорамина. В бокс вносят стерильный инструмент, вату. Поверхность стола и руки протирают стерильной ватой, смоченной 75-80% этиловым спиртом. Во время посева инструменты дезинфицируются 75-80% этиловым спиртом и обжигаются в пламени спиртовки. Культуру для посева выделяют из плодовых тел или получают при проращивании спор на твердой питательной среде и, как исключение, используют размноженный стерильный мицелий. Выделение культуры можно проводить в день сбора плодов (молодых и неповрежденных) или из сохраненных в полиэтиленовых мешочках плодовых тел в холодильнике в течение 2-3 дней. Перед выделением плодовое тело следует осторожно очистить от прилипших растительных остатков, соскоблить почву с ножки, промыть в проточной и стерильной воде и положить на фильтровальную бумагу, чтобы оно обсохло. Промывать плодовое тело нужно быстро, чтобы оно не пропиталось водой. Можно также быстро его обжечь пламенем спиртовки. Плодовое тело разламывают, и кусочки ткани из середины стерильным скальпелем переносят на питательную среду. Выделение производят из разных частей плодового тела: шляпки, ножки из места перехода шляпки в ножку, гименального слоя. Обычно выбирают самую толстую часть тела и отбирают внутренние стерильные части грибной ткани. Для успешного выделения следует использовать кусочки гриба диаметром 0,51,5 см. Кусочки ткани помещают на питательную среду в пробирки. Про- 6 бирку открывают около пламени спиртовки. Горловина обжигается в пламени. Пробку, снятую с засеваемого сосуда, во время пересадки ткани держат в руках. В каждую пробирку помещают один кусочек, что важно для предотвращения загрязнения. Кусочки плодового тела помещают сверху на среду или частично погружают в нее. Затем пробирку закрывают в пламени спиртовки. Операция пересадки ткани ведется около пламени спиртовки на расстоянии 3-5 см от нее. Соприкосновение инструмента и ватно-марлевой пробки с поверхностью стола не допускается. Для соблюдения стерильности во время пересадки ткани необходимо регулярно обжигать смоченные в спирте скальпель и пинцет в пламени спиртовки, периодически протирать руки и поверхность стола стерильной ватой или марлей, смоченной спиртом (спиртовка при этом должна быть погашена). Пересадочные работы надо производить быстро, чтобы избежать заражения и обжига тканей. По окончании пересадки пробирки снабжают этикеткой с датой посева и в штативе помещают в термостат при температуре 24-260С. Относительная влажность воздуха должна быть не ниже 80%, для чего в термостат помещают сосуд с водой. Через несколько дней на кусочках плодовых тел появляется молодой растущий мицелий. Пробирки необходимо внимательно осмотреть, и те из них, где появилась посторонняя микрофлора, изолируют на термообработку в автоклав, после чего среда из них сливается в мусоросборник, а сосуды замачивают в дезинфицирующем растворе на 4 часа. После того, как растущий мицелий покроет всю поверхность питательной среды, пробирки можно убирать в холодильник и использовать для дальнейшего выращивания промежуточной культуры. При хранении в холодильнике ватно-марлевые пробки пробирок закрывают фольгой для 7 уменьшения испарения влаги. При температуре от 00С до +20С маточноколлекционную культуру грибов в пробирках можно хранить, не пересаживая в течение одного года. 1.3. Технология выращивания первой промежуточной культуры Для выращивания первой промежуточной культуры используют чашки Петри диаметром 100 мм, подготовку которых к работе (мойку и стерилизацию) проводят аналогично описанному выше способу обработки пробирок. Состав питательной среды такой же, как и в предыдущем случае. Посевной материал – выращенная маточная культура мицелия. Питательную среду разливают в чашки Петри по 20-25 мл в каждую и стерилизуют в автоклаве 40 мин при давлении 1,5 атм., после чего чашки переносят в стерильный бокс. Посев мицелия на твердую питательную среду в чашках Петри, как и на предыдущем этапе, производится стерильно в ламинарном шкафу. Пробирка с маточной культурой открывается около пламени спиртовки, горлышко пробирки обжигается в пламени. Чашка Петри также открывается около горящей спиртовки, крышка чашки кладется рядом. Далее стерильной микробиологической петлей, предварительно обожженной в пламени спиртовки, берется небольшое количество мицелия из пробирки и переносится в чашку Петри, делая мазок петлей по поверхности питательной среды в чашке. Затем чашку закрывают. Всю операцию необходимо делать быстро, чтобы избежать заражения. Из одной пробирки с маточной культурой можно засеять до 30 и более чашек Петри. После посева на каждую чашку наклеивается этикетка с датой посева. 8 Заселенные культурой чашки Петри ставят в термостат при температуре 24-260С и влажности не ниже 80% и выдерживают в этих условиях до тех пор, пока растущий молодой мицелий полностью не покроет поверхность питательной среды. Срок инкубации примерно 7-10 дней (если готовить культуру шампиньонов, требуется 15-20 дней). С этого момента этот промежуточный мицелий можно использовать в цикле дальнейшего размножения. Во время роста мицелия необходимо, как и в предыдущем случае, удалять инфицированные образцы, а чашки обрабатывать так же, как обрабатывают пробирки от зараженных образцов маточного мицелия. 1.4. Технология выращивания промежуточной культуры на зерновом субстрате В качестве культивационных сосудов при выращивании промежуточной культуры на зерне удобно использовать 0,5 – 1,0 литровые конические колбы, которые предварительно замачивают в теплом растворе 0,51,0% стирального порошка, затем моют ершами в этом же растворе и ополаскивают чистой теплой водой. Сушат колбы при комнатной температуре. Питательной средой является зерно пшеницы, овса, ржи, проса и или других злаков с добавками гипса и мела. Зерно варят в водопроводной воде в течение 15 мин. После этого воду сливают, зерно пересыпают в другую емкость и при перемешивании сушат в течение одного часа. Влажность высушенного зерна должна составлять 53-55% по массе. Затем в зерно добавляют гипс и мел. Эти добавки создают нейтральную среду, обеспечивая буферную емкость, и препятствуют склеиванию зерна, что способствует его лучшей аэрации. 9 При приготовлении питательной смеси следует руководствоваться следующими соотношениями компонентов: на 15 кг зерна требуется 180 г гипса и 45 г мела (по Лемке); дозу гипса и мела можно увеличить до 5% от массы зерна. Готовую смесь засыпают в колбы, заполняя не более 2/3 объема (что составляет 400 – 450 г смеси). Колбы закрывают ватно-марлевыми пробками или пергаментной бумагой, сложенной вдвое. Ватно-марлевые пробки стерилизуют в боксах в сушильном шкафу при 147 – 1520С в течение 1,5 часа. Стерилизацию зернового субстрата проводят в автоклаве под давлением 1,5 атм. в течение 2 часов. После стерилизации колбы помещают в стерильный бокс, где субстрат охлаждается до температуры ниже 300С, при которой будет производиться посев. Субстрат должен иметь рН 6,5-6,7. Перед посевом содержимое колбы встряхивают, оно должно рассыпаться. Посев стерильного мицелия, выращенного предварительно в чашках Петри на твердой питательной среде из агара в отваре зерна, проводят следующим образом. Стерильным скальпелем отрезают от содержимого чашки несколько миллиметров от ее края и по всей окружности, а затем делят колонию на 10-15 частей. Таким образом, мицелий из одной чашки Петри используют для засева 10-15 колб. Колбу открывают над пламенем спиртовки, скальпелем помещают в нее кусочек твердого субстрата с мицелием так, чтобы на него насыпать как можно больше зерна. После чего колбу закрывают и располагают ее лежа, при этом зерновой субстрат не должен касаться пробки. Мицелий, прорастая, пронизывает питательный субстрат. Оптимальной температурой для его роста является 22-250С. Повышение температуры до 350С уничтожает мицелий. Относительная влажность воздуха должна составлять 60%. 10 На 5-7 день после посева (при выращивании шампиньонов на 10-12 день) необходимо произвести встряхивание мицелия, чтобы заросшие мицелием зерна равномерно распределить по всему объему колбы. Эта операция предотвращает склеивание зерна и ускоряет рост мицелия. Через 3 – 4 дня после посева или же после встряхивания субстрат может загрязниться организмами – контаминатами из-за нарушения стерильности во время посева, либо при встряхивании колбы в результате всасывания воздуха с посторонней флорой. Поэтому зерновой субстрат следует внимательно осматривать на наличие загрязнений. В помещении необходимо каждый день проводить влажную уборку, а раз в неделю – дезинфекцию 3% раствором перекиси водорода. Через 2 – 3 недели после посева (для шампиньонов – через 3-4 недели) мицелий готов к употреблению. Зерна должны стать белыми. Субстрат должен быть равномерно и полностью заросшим. Если мицелий передержать при выше указанных условиях, то он продолжает расти, и появляются пятна вторичного роста, что отрицательно сказывается на урожайности. Поэтому, полностью проросший мицелий до дальнейшего его применения хранят в холодильнике при температуре от 00 до +20С. 1.5. Технология выращивания производственного мицелия Культивационными сосудами для выращивания производственного мицелия служат трехлитровые банки, которые предварительно обрабатывают так же, как и колбы в предыдущем случае. Аналогично предыдущему готовят и зерновой субстрат, который засыпают в банку примерно на 2/3 от ее объема (1200 г). Банки с субстратом закрывают пергаментной бумагой, сложенной вдвое, которую закрепляют на горлышке банки резинкой, капроновой нитью или тонкой медной проволокой. Бумажную крышку свер- 11 ху закрывают фольгой для предотвращения высыхания питательной среды. Банки стерилизуют в автоклаве в течение 2 часов при 1500С и давлении 1,5 атм., после чего их охлаждают в боксе. В стерильных условиях ламинара проводят инокуляцию субстрата в банках второй промежуточной культурой. Для этого над пламенем спиртовки вынимают ватно-марлевую пробку из колбы с промежуточной культурой, затем стерильной, специально изготовленной из металлической (нержавеющей) трубки, ложкой берут промежуточную культуру мицелия из колбы и вносят в трехлитровые банки. В одну банку вносят приблизительно 40-45 г инокулята. Таким образом, из одной колбы промежуточной культуры засевается примерно 10 – 11 банок зернового субстрата. После посева банки встряхивают, чтобы промежуточная культура равномерно перемешалась с субстратом. Для соблюдения стерильности в процессе инокуляции необходимо использовать одну ложку для рассева только одной бутыли с промежуточной культурой. После инокуляции банки устанавливают в культивационные камеры при 24±10С для выращивания мицелия. Период зарастания субстрата в банке составляет 10 дней (для шампиньонов – 14-20 дней). По истечении 47 дней банки встряхивают для равномерного зарастания субстрата. После полного зарастания мицелий в стерильных условиях из банок переносят в полиэтиленовые пакеты, которые потом запаивают. В таком виде мицелий помещают в холодильную камеру, где при температуре от 0 до +20С он дорастает и может храниться до 6 месяцев. 12 2. Выращивание грибов 2.1. Обработка опила Основными критериями качества опила являются: запах свежей древесины, цвет от белого до желтого и влажность не выше 30%. Количественное соотношение опилок и стружки не должно превышать 1/10. Необходимое количество опила смешать равномерно с соответствующим количеством активатора – органической добавки и засыпать в тканный синтетический мешок. Мешок перенести в место со свободным сливом воды, удовлетворяющее гигиеническим нормам. Залить мешок с опилом горячей водой (900С) и оставить на 12 часов для охлаждения органического субстрата и удаления излишков воды. Готовый увлажненный субстрат легко рассыпается и не прилипает к ладоням. 2.2. Инокулирование (посев мицелия в органический субстрат) Субстрат и мицелий в момент инокулирования должны иметь комнатную температуру. Мицелий разминают до отдельных зерен тщательно вымытыми руками в чистой посуде. Органический субстрат выкладывают в чистый полиэтиленовый мешок, к нему добавляют мицелий и все содержимое перемешивают до однородной массы. Затем его уплотняют вручную и завязывают мешок. Мешок перфорируют, прокалывая отверстия диаметром 1 мм равномерно по всей поверхности блока, после чего грибной блок приготовлен. 13 При приготовлении грибного блока следует руководствоваться следующими соотношениями его компонентов. На 25 л опила необходимо 75 г активатора, 15 л воды, 0,5 кг мицелия и полиэтиленовый мешок, размером 350×750 мм. Для такого размера блока при перфорировании мешка делают 300 отверстий. 2.3.Проращивание (созревание грибного блока) 14 Мицелий прорастает в течение нескольких недель при комнатной температуре от 18 до 220 С и в умеренно проветриваемом помещении. Освещение в этот период не требуется. Во время проращивания нельзя вскрывать полиэтилен и разминать содержимое блока. На первом этапе наблюдается видимое глазом пушение. На втором - пушение увеличивается настолько, что появляется толстый слой белого 15 или желтоватого цвета (строма). Заключительным этапом созревания блока и его готовности к плодоношению является появление зачатков плодовых тел грибов (примордии). Его признаком является образование на поверхности блока уплотнений - скоплений грибных тел микроскопических размеров. При несоблюдении гигиенических требований в процессе инокулирования, недоброкачественном опиле или при использовании для его обработки воды, температура которой ниже 900С, наблюдается слабое пушение, не образуется строма, а на поверхности блока появляются темные или зеленые пятна. Слабое пушение может быть при перегреве или переохлаждении мицелия, при перепадах температуры и других ошибках приготовления блока. 2.4. Плодоношение. Уход за плодовыми телами Гриб вешенки растет при следующих условиях: а) температура воздуха от +5 до +200С, оптимальная - +10 - +160С; б) влажность в пределах 75-85%, для обеспечения которой производится увлажнение грибных тел 34 раза в сутки путем распыления воды; в) активное проветривание, небольшой сквозняк; г) освещение от 200 до 800 люкс в сутки. В качестве помещения для культивирования можно использовать любое свободное место жизненного пространства. Относительную влажность воздуха в помещении можно определить по разности между показаниями термометра в обычном состоянии (сухой термометр, tc0С) и термометра, головка которого обвернута влажной марлей (tвл.0С). В таблице 2 приведены эмпирические данные, связывающие значения относительной влажности со значениями указанной выше разности температур, ∆ t = (tc - 16 tвл.), при различных температурах среды. Переувлажнение или недостаточное перфорирование блока может вызывать явление заболачивания. Грибы не любят прямых солнечных лучей, поэтому для их выращивания желательно использовать затемненные места. Грибы растут сростками в течение 5-6 дней, и через это время после начала формирования грибной семьи рекомендуется снимать урожай, не допуская перезревания плодов. После сбора первого урожая следующие волны следуют с интервалом в 10-14 дней. Выборочная срезка грибов не допустима. При соблюдении указанных выше условий урожайность составляет от 25 до 45% от веса органического субстрата. Любые нарушения в технологии ведут к снижению урожайности. Оптимальные размеры грибов ─ шляпка в диаметре от 40 до 100 мм, ножка длиной от 10 до 40 мм соответственно. Плодовые тела должны быть упругими, мясистыми, крепкими, сухими, но естественно увлажненными и без постороннего запаха. Шляпка плодового тела в начале развития темноокрашенная, позднее ─ пепельно-серая, а в зрелости резко светлеет. Ее форма может быть выпуклой или ухообразной. Пластинки белые, избегающие на ножку. Мя- 17 коть плодового тела – белая, а на изломе ее цвет меняется и становится светло-серым. Боковая ножка – белая, плотная, она должна быть еле заметной или отсутствовать. При образовании грибов с черепицеобразным образованием шляпок их сростки необходимо аккуратно отломить от блока и срезать опилки. К употреблению такие грибы также допускаются. Отклонения во внешнем виде плодов (длинная ножка и кривая, маленькая шляпка, шляпка в форме воронки, грибы загибаются) могут возникать из-за дефицита воздуха, влаги или света. При перезревании грибов шляпка становится ломкой и дряблой, появляется коричневая каемка по краю, ножка деревенеет. У таких грибов теряется товарный вид и резко снижаются вкусовые и питательные качества. Срок хранения свежих грибов составляет 7 дней при температуре от 0 до +50С, 3 месяца при -40С и 4 часа при +200С. После снятия основного урожая отработанные блоки способны к плодоношению достаточно длительный срок (еще 2-3 месяца), но урожайность резко снижается, и держать такой блок становится не рентабельно. 18 Использованный блок утилизируется в качестве ценного органического удобрения, а также как белковая биодобавка в корм сельскохозяйственным животным и птицам (свиньям, курам). 19 Таблица 2 t c, C 0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 91 92 92 92 93 93 93 93 94 94 94 94 95 83 84 84 85 86 86 87 87 88 88 88 89 89 90 90 90 90 91 91 91 91 75 76 77 78 79 79 80 81 82 82 83 83 84 84 85 85 85 85 86 87 87 66 67 69 70 71 73 74 75 76 76 77 78 79 79 80 81 81 82 82 83 83 58 60 62 63 65 66 67 69 70 71 72 73 74 74 75 76 77 77 78 78 79 50 52 54 56 58 60 61 63 64 65 66 68 69 70 70 71 72 73 74 74 75 42 45 47 49 51 53 55 57 58 60 51 63 64 65 66 67 68 69 70 70 71 34 37 40 42 45 47 49 51 53 54 56 57 59 60 61 63 64 64 65 66 67 Определения влажности воздуха ∆ t = (tc - tвл.)0C 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 Относительная влажность,% 26 19 30 22 15 33 26 19 36 29 22 16 38 32 25 19 41 34 28 22 16 43 37 31 26 20 45 40 34 28 23 18 47 42 36 31 26 20 49 44 39 33 28 23 51 46 41 36 31 26 52 48 43 38 33 29 54 49 45 40 35 31 55 51 47 42 37 33 57 52 48 44 39 35 58 54 50 45 41 37 59 55 51 47 43 39 61 56 52 48 44 41 62 58 54 50 46 42 62 59 55 51 48 44 63 60 56 52 49 45 7,5 8,0 8,5 9,0 9,5 10 10,5 11 18 21 24 27 29 31 33 35 37 39 40 42 18 20 22 24 27 29 31 33 35 37 38 19 21 23 25 28 30 32 33 35 17 19 22 24 26 28 30 32 18 21 23 25 27 29 17 19 21 24 26 18 20 22 19 3