Атомно-силовая микроскопия морфоструктурных изменений

Гаврилова И.А. Атомно-силовая микроскопия морфоструктурных изменений Pseudomonas
aeruginosa, подвергшихся воздействию биоцида на основе алкилдиметилбензиламмония хлорида
и полигексаметиленгуанидина // И.А. Гаврилова, Г.К. Жавнерко, Л.П. Титов // Доклады
Национальной академии наук Беларуси – 2013 – выпуск 5 (Том 57). – с. 81-87.
УДК 615.281.9:579.23, 616: 579.61
И.А. ГАВРИЛОВА, Г.К. ЖАВНЕРКО, Л.П. ТИТОВ
АТОМНО-СИЛОВАЯ МИКРОСКОПИЯ МОРФОСТРУКТУРНЫХ ИЗМЕНЕНИЙ
PSEUDOMONAS AERUGINOSA, ПОДВЕРГШИХСЯ ВОЗДЕЙСТВИЮ БИОЦИДА
НА ОСНОВЕ АЛКИЛДИМЕТИЛБЕНЗИЛАММОНИЯ ХЛОРИДА И
ПОЛИГЕКСАМЕТИЛЕНГУАНИДИНА
1
2
– ГУ «РНПЦ эпидемиологии и микробиологии»
– ГНУ «Институт химии новых материалов НАН Беларуси»
Pseudomonas
приобретший
aeruginosa
важное
условно-патогенный
–
значение
в
качестве
микроорганизм
этиологического
агента
внутрибольничных инфекций. Устойчивые к антибиотикам и другим
антимикробным препаратам, включая дезинфектанты, формы этих бактерий
занимают второе место среди грамотрицательных микроорганизмов по
частоте выделения от пациентов с данными инфекциями [1,2]. Основным
способом
предотвращения
внутрибольничных
дезинфекционных
возникновения
инфекций
мероприятий
является
с
и
распространения
проведение
использованием
адекватных
дезинфицирующих
средств (ДС), вызывающих быструю гибель микробов на объектах внешней
среды [3-5].
Несмотря
на
многообразие
средств
химической
дезинфекции,
количество активно действующих веществ (АДВ), входящих в их состав
весьма ограничено. В состав ДС входят такие действующие агенты как
альдегиды, спирты, четвертичные аммониевые соединения, третичные
амины, галогены, перекисные соединения, фенолы, кислоты [6]. Изыскание
новых АДВ, равно как и создание ДС, сдерживается недостаточной
изученностью
механизмов
действия
на
микробную
клетку
[7,8].
Существующие
методы
исследования
биологической
эффективности
воздействия ДС на популяцию бактерий не представляют информации о
механизмах формирования устойчивости, выживании в условиях воздействия
сниженных (суббиоцидных) концентраций и/или несоблюдении требуемой
экспозиции,
равно
адаптационных
как
и
о
морфоструктурных
процессах
выживших
и
геномических
бактерий,
признаках
«дезрезистентности» популяции бактерий, их кооперации и формировании
биопленок [9].
Понимание механизмов действия ДС на бактерии требует новых
знаний об их структурной организации и физических свойствах, как при
физиологических состояниях, так и при воздействии неблагоприятных
факторов. Исследование этих механизмов методами световой микроскопии
затруднено
вследствие
малых
размеров клеток
бактерий и
низкой
разрешающей способностью световых микроскопов.
Атомно-силовая
микроскопия
(АСМ)
является
инновационной
технологией, основанной на оценке взаимодействия биологических сил
между структурами образца и острой иглой прибора позволяющей визуально
качественно
и
количественно
описать
топографические
особенности
исследуемой поверхности в нанометровой шкале. В последние годы возросло
число исследований c использованием АСМ в микробиологических
исследованиях,
и
особенно
по
изучению
поверхностных
структур
бактериальных клеток. Данная технология позволяет изучить процессы,
происходящие на поверхности микробов (экспрессию биомолекул, вывление
пор в клеточной стенке, адгезивные свойства, упругость и шероховатость)
при
различных
условиях,
а
также
оценить
и
описать
изменение
морфоструктурных характеристик бактериальных клеток в целом [10]. Новая
количественная и качественная информация (трехмерное изображение
ультраструктуры поверхности) с молекулярным разрешением в реальном
времени и с минимальным количеством анализируемых проб, получаемая
2
методом АСМ, весьма полезна для исследования биологических эффектов
АДВ простых и композиционных ДС [11].
Цель
работы:
изменения
клеток
дезинфицирующего
соединений
выявить
и
охарактеризовать
Pseudomonas
средства
на
при
aeruginosa
основе
морфоструктурные
четвертичных
хлорида
в
аммониевых
хлорида)
(алкилдиметилбензиламмония
полигексаметиленгуанидина
воздействии
рабочей
и
и
суббиоцидных
концентрациях методом атомно-силовой микроскопии.
Материалы и методы. Основные этапы постановки опыта по
воздействию биоцида представлены на рисунке 1 (нумерация в круглых
скобках соответствует номеру этапа на схеме, см. Рис.1).
Объектом исследования явилась типовая культура Pseudomonas
aeruginosa АТСС 15412, обладавшая чувствительностью к изучаемому
дезинфектанту.
Оценка
чувствительности
к
ДС
осуществлялась
качественным суспензионным методом [12]. На суточную культуру (1) тестмикроорганизма
воздействовали
композиционным
дезинфицирующим
препаратом на основе алкилдиметилбензиламмония хлорида (5,5%) и
полигексаметиленгуанидина хлорида (2,5%) в рабочей и «шаговых»
двукратных разведениях рабочей концентрации: 1/2 – 1/4 – 1/8 – 1/16 (этапы 2-4).
Контрольный образец ресуспензировали в том же объёме стерильной
водопроводной воды. Бактерии многократно отмывали в стерильной
дистиллированной воде и физиологическом растворе (0,85% NaCl) с
последующим
осаждением
клеток
центрифугированием
(этапы
5-6).
Готовили препараты бактерий для атомно-силовой микроскопии (АСМ), в
качестве подложки использовали покровные стекла размером 5х5 мм (этапы
7-8).
Приготовленные образцы бактерий исследовались методом атомносиловой микроскопии (9) в контактном режиме на воздухе на микроскопе
Veeco («Nanoscope 3D», США). Использовались контактные кантилеверы
CSC38 (константы жесткости 0,36 Н/м). Анализ и обработка изображений
3
проводились с использованием функций Particle analysis, Section analysis,
Roughness специализированной программы обработки АСМ-изображений
Nanoscope 5.31r1, построение трехмерных изображений бактериальных
клеток осуществлялось в программе ФемтоСкан Онлайн (версия 2.3.219
(5.1)). Оценивали морфологические параметры клеток бактерий (длину,
ширину, высоту) и физические свойства поверхностности клеток тестбактерии
(шероховатость
и
структурированность)
при
воздействии
дезинфектанта в рабочей и субоптимальных концентрациях в трех сериях
опытов. Изменения морфометрических характеристик бактериальных клеток
после воздействия биоцида в различных концентрациях оценены минимум на
56 клетках синегнойной палочки (воздействие 1/8 рабочей концентрации),
максимум на 108 клетках бактерий-объектов исследования (контрольный
образец, не подвергшийся действию ДС).
Полученные
данные
подвергали
статистической
обработке
с
использованием пакета программ STATISTICA 6.1. Вычисляли средние
арифметические значения, ошибки средних величин и доверительные
интервалы. Достоверность различий между статистическими параметрами
определяли
с
помощью
t-критерия
Стьюдента.
4
Рисунок 1 – Схема постановки опыта по воздействию биоцида на бактерии и подготовка клеток к исследованию с помощью АСМ
5
Результаты и их обсуждение.
Клеточная стенка и цитоплазматическая мембрана бактерий являются
первыми барьерами на пути химического антимикробного агента. Действие
четвертичных аммониевых соединений (ЧАС) обусловлено взаимодействием
молекул
активно
действующего
вещества
с
(АДВ)
фосфолипидами
цитоплазматической мембраны, за которым следует ее дезорганизация и
последующий лизис бактериальной клетки. Однако для грамотрицательных
бактерий
характерно
наличие
естественной
устойчивости
к
дезинфицирующим средствам на основе ЧАС, вследствие непроницаемости
клеточной стенки для молекул АДВ. Среди грамотрицательных бактерий
наибольшей резистентностью обладает Р.aeruginosa. Это обусловлено
повышенным содержанием ионов магния в клеточной стенке псевдомонад,
что
способствует
созданию
сильных
связей
между
молекулами
липополисахаридов, кроме того, малые размеры пор не позволяют
осуществлять диффузию молекул ЧАС через клеточную стенку. В связи с
этим, в медицинских учреждениях любого уровня и профиля широко
используются композиционные дезинфектанты на основе четвертичных
аммониевых соединений (ЧАС) и полигексаметиленгуанидина (ПГМГ),
которые
обладают
достаточной
эффективностью
в
предупреждении
возникновения и развития внутрибольничных инфекций при их правильном
применении [13,14]. ЧАС усиливает способность гуанидина связываться с
поверхностью клетки и увеличивает диффузию ПГМГ через клеточную
стенку,
чем
достигается
цитоплазматической
доставка
мембране,
биоцид
молекулы
связывается
дезинфектанта
с
белковыми
к
и
фосфолипидными молекулами мембраны, вызывает её дестабилизацию,
нарушение барьерных и транспортных функций и деструкцию [8,15].
Субоптимальные концентрации катионных поверхностно активных веществ
(ЧАС и ПГМГ) вызывают менее глубокие изменения в структуре
макромолекул цитоплазматической мембраны. Основной мишенью действия
сублетальных концентраций ПГМГ по-видимому являются нуклеиновые
6
кислоты
микроорганизма.
Исследователи
Allen
et
al.
показали
в
экспериментах in vitro способность молекул ПГМГ связываться с ДНК и
тРНК с осаждением ассоциированого комплекса нуклеиновой кислоты и соли
гуанидина. Предполагается, что при воздействии низких концентраций
ПГМГ, ущерб, причиненный ДНК незначителен и возможна репарация
генома [16], при этом, вероятно, возможна перестройка генетической и
метаболической
программ,
реорганизации
поверхностных
структур
бактериальной клетки с целью обеспечения выживания в неблагоприятных
условиях [17].
Оценка
изменений
морфопараметрических
характеристик
бактериальных клеток под влиянием различных концентраций биоцида с
помощью атомно-силовой микроскопии.
Использование
атомно-силовой
микроскопии
позволило
визуализировать и оценить морфологию и структурные особенности
поверхности бактерий, изучить изменения этих параметров при действии
биоцида в разных концентрациях. Морфология отдельных бактерий, не
подвергшихся
действию
ДС
(контрольный
образец),
соответствовала
типичной морфологии Pseudomonas aeruginosa – вытянутые палочковидные
бактериальные клетки средних размеров (рисунок 2А). При воздействии
дезинфектанта в рабочей концентрации клетки бактериальные клетки
выглядели поврежденными, с сильно структурированной поверхностью,
вокруг отдельных клеток и их скоплений регистрировались образования в
виде глобул, являющиеся, очевидно, бактериальным детритом (рисунок 2В).
Интенсивность выявляемых АСМ структурных повреждений бактерий в
опытных образцах снижалась пропорционально снижению концентрации
биоцида. Истечения клеточного содержимого во внешнюю среду после
воздействия ДС в разведении 1/4 от рабочей концентрации не было выявлено.
Примечательно, что в этом же образце были обнаружены бактерии,
окруженные капсульным веществом (рисунок 2Б). После воздействия 1/16
рабочей концентрации ДС бактерии внешне не проявляли характерных
7
признаков антимикробного эффекта дезинфектанта – клетки располагались
поодиночке, имели характерную удлиненную палочковидную форму, а
поверхность клеток не демонстрировала наличие следов повреждений.
Рисунок 2 – Трехмерные модели бактериальных клеток
А – не подвергшихся действию дезинфектанта;
Б – после действия дезинфицирующего средства в суббиоцидной концентрации - ¼ (вокруг
бактерий визуализируется капсульное вещество, указано стрелкой);
В – после воздействия дезинфектанта в рабочей концентрации (поверхностные слои
структурированы, стрелками указаны компоненты разрушенных бактериальных клеток)
При детальной оценке действия ДС в рабочей концентрации на
бактериальные
клетки
и
характеристике
структурированности
их
поверхности путем построения профилей поперечного сечения клеток были
обнаружены участки тела бактериальных клеток, лишенные клеточного
содержимого (рисунок 3).
Рисунок 3 – АСМ-изображение и профиль сечения клетки синегнойной палочки.
Стрелками указаны участки клетки, утратившие клеточное содержимое и соответствующие им
«уплощенные» фрагменты на разрезе бактерии.
На рисунке 4 представлены морфопараметрические характеристики
клеток синегнойной палочки контрольных и опытных образцов: продольный
размер бактериальных клеток (длина бактерий), поперечный размер (ширина
8
бактерий) и высота клеток. Математический анализ полученных данных
выявил достоверное увеличение продольных и поперечных размеров клеток
синегнойной палочки после воздействия ДС в рабочей концентрации (длина
клеток в исходном образце колебалась от 1,22 до 2,38 мкм и составила в
среднем
1,91±0,16
мкм;
после
обработки
ДС
в
рекомендуемой
производителем концентрации средняя длина бактерий составляла 2,73±0,21
мкм; после обработки ДС клетки бактерий были в 2,0 раза шире, (р < 0,05),
После воздействия дезинфектанта в разведении 1/2 от рабочей наблюдалось
статистически достоверное увеличение ширины клеток (на 33,6%) и
статистически значимое уменьшение высоты бактерий при воздействии
минимальной сублетальной концентрации – «уплощение» клеток в 1,33 раза
по сравнению с контрольным образцом (р < 0,05).
Рисунок 4 – Размеры бактериальных клеток Pseudomonas aeruginosa
в контрольном (1) и опытных образцах (2-6)
Причиной
зарегистрированных
изменений
морфологических
параметров бактериальных клеток мог являться биологический эффект
активно действующего вещества ДС на поверхностные образования
бактерий. Бактериальные клетки при взаимодействии с дезинфектантом
утрачивают свои каркасные формообразующие свойства и, соответственно,
способность к поддержанию свойственной им морфологической формы.
Макробиомаркерами действия ДС на бактериальные клетки являются:
1) увеличение продольных и поперечных размеров бактериальных клеток на
9
35%
и
более;
2)
«уплощение»
клеток
после
воздействия
ДС
в
рекомендованной производителем концентрации, что можно объяснить
деструкцией
клеточной
стенки,
дезорганизацией
цитоплазматической
мембраны и нарушением её проницаемости; 3) «излитие» клеточного
содержимого, гибель клетки и образование теней бактериальных клеток
(рисунок 2В).
По мере снижения концентрации химического вещества, изменения
менее
выражены,
однако
имеет
место
изменение
отдельных
пространственных характеристик – маркеров повреждающего эффекта ДС,
что может быть объяснено «растягивающим» действием осмотического
давления из-за нарушения проницаемости цитоплазматической мембраны
при сохраненной ригидности клеточной стенки (недостоверное увеличение
высоты клеток после обработки суббиоцидными концентрациями 1/8 и 1/16
(средняя высота бактерий соответственно 324,0±47,4 и 318,7±17,5 нм) по
сравнению с контрольным образцом (высота 280,3±11,3 нм) при сохранении
поперечных размеров клеток бактерии).
Оценка изменений ультраструктуры и наномеханических свойств
поверхностных образований бактериальных клеток под влиянием различных
концентраций биоцида с помощью атомно-силовой микроскопии.
Дополнительным
микромаркерным
проявлением
повреждающего
действия биоцида на поверхностные структуры бактериальной клетки
является существенное изменение шероховатости клеточной стенки в
опытных образцах по сравнению с контрольными (таблица 1). При этом
обусловленное
воздействием
дезинфектанта
нарушение
трехмерной
пространственной организации пептидогликана результировалось в более
чем двукратном увеличении шероховатости клеток P.aeruginosa (до 12,4±1,4
нм, против 5,9±0,2 нм в контроле, p<0,01). При снижении концентрации
наблюдалось
менее
выраженное
увеличение
шероховатости,
а
при
воздействии ДС в концентрации меньше 1/4 показатели шероховатости были
меньше, чем в контрольном образце, что также можно объяснить как
10
действием
осмотического
давления,
так
и
синтезом
капсульных
полисахаридов в присутствии субоптимальных концентраций ЧАС (рисунок
2Б).
Таблица 1 – Характеристика шероховатости поверхности бактериальных
клеток в зависимости от воздействия различных концентраций ДС
Группы
Концентрация Среднее арифметическое
Наибольшая высота
дезинфектанта
отклонение профиля
профиля
(Ra), nm
(Rmax), nm
рабочая
12,4±1,4↑*
60.6 ↑
1
/
8,9±0,3↑
27.8
1 2
опыт
/
4,3±0,3↓
21.6 ↓
1 4
/
4,4±0,2↓
26.9
8
1
/16
5,3±0,3
29.4
контроль
–
5,9±0,2
28.8
_____
* - стрелками помечены статистически достоверное увеличение (↑) или
уменьшение (↓) параметра по сравнению с контролем (р≤0,05)
Заключение
В результате исследования получены новые данные по изменению
морфофункциональных
характеристик
и
бактериальных
и
Pseudomonas
клеток
популяции
ультраструктуры
отдельных
aeruginosa
после
воздействия дезинфицирующих средств в различных концентрациях.
Установлено,
визуализировать
что
атомно-силовая
повреждения
бактерий
микроскопия
под
позволяет
влиянием
активно
действующего вещества дезинфицирующего средства. Свидетельством
гибели клеток являются: «излитие» клеточного содержимого, значительная
структурированность поверхности клеточной стенки (двукратное увеличение
шероховатости
поверхности
бактерии),
изменение
морфологических
параметров («уплощение» клеток, увеличение длины клеток, увеличение
ширины клеток более чем в два раза). Суббиоцидные концентрации ЧАСсодержащего дезинфектанта вызывают менее глубокие изменения в
структуре макромолекул поверхностных образований клетки: увеличивается
проницаемость
цитоплазматической
мембраны
при
сохранении
формообразующей функции клеточной стенки, что результируется в
11
достоверном увеличении высоты клеток и «сглаживании» поверхности
бактерии (уменьшение шероховатости). При занижении рекомендуемой
производителем концентрации дезинфектанта в четыре раза выявлено
образование бактериальных капсульных полисахаридов.
12
Литература.
1.
Hidron Alicia I., Edwards Jonathan R., Patel Jean et al. // Infection control
and hospital epidemiology. 2008. Vol. 29. N. 11. P. 996-1011.
2.
Higgins C.S., Murtoug S.M., Williamson E. et al. // Clin. Microbiol. Infect.
2001. N 7. P. 308-315.
3.
Ковалишена О.В., Благонравова A.C., Воробьева О.Н. [и др.] //
Ремедиум. Приволжье. 2008. №1 (61). С.49-51.
4.
Семина Н.А., Ковалева Г.П., Галкин В.В. // Дезинфекционное дело.
2002. №3. С. 29-31.
5.
Шандала М.Г. // Дезинфекционное дело. 2002. № 3. С. 19-25.
6.
Веткина И.Ф., Комаринская Л.В., Ильин И.Ю., Соловьева М.В. //
"ФАРМиндекс Практик". 2005. вып.7. С.13 – 20.
7.
науки
Воронина Э.В., Казанцева М.И., Гейн В.Л. // Актуальные проблемы
фармацевтических
и
медицинских
вузов:
от
разработки
до
коммерциализации: материалы науч.-практ. конф. с межд. участием, посвящ. 75летию Пермской государственной фармацевтической академии, г.Пермь, 7 – 9
декабря 2011 года. С. 58-61.
8.
McDonnell G., Russel A.D. // Clin. Microbiol. Rev. 1999. N 12. P. 147-
9.
В.В. Шкарин, О.В. Ковалишена, А.С. Благонравова и др. //
149.
Медицинский альманах. 2012. №3(22). С. 129 – 133.
10. Schilardi P.et al. // Current Res Techn. Eder Farmastex. 2010. P.860-869.
11. Dufrene Yves F.. // J. Of Bacteriology. 2002. Vol.184. N19. P.5206-5213.
12. Филонов [и др.] Методы проверки и оценки антимикробной
активности дезинфицирующих и антисептических средств: инструкция по
применению МЗ РБ / В. П. Минск, 2003. 41 с.
13. Denyer
S.P.,
G.S.
Stewart
//
International
Biodeterioration
&
Biodegradation 1998. Vol. 41. Issues 3–4. P. 261–268.
14. Thomas L., Russell A.D., Maillard J.-Y. // J. Appl. Microbiol. 2005. Vol.
98. P. 533-43.
15. Gilbert P., Moore L.E. // Journal of Applied Microbiology. 2005. Vol. 99.
Issue 4. Р.703 – 715.
13
16. Allen, M. J., Morby, A. P., White, G. F. // Biochemical and Biophysical
Research Communications. 2004. Vol. 318, Issue 2. P. 397–404
17. Gomez Escalada, M., Harwood, J.L. // J. Antimicrob. Chemother. 2005.
Vol. 55. P. 879-82.
14