ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩЕЙ ИНДИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ БОТУЛИЗМА МЕТОДОМ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ

ПОЛУЧЕНИЕ ПОЛИСПЕЦИФИЧЕСКОЙ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩЕЙ
БОТУЛИНИЧЕСКОЙ СЫВОРОТКИ ДЛЯ ЭКСПРЕСС - ДИАГНОСТИКИ И
ИНДИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ БОТУЛИЗМА МЕТОДОМ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ
АНТИТЕЛ (МФА)»
Мустафин Т.Р.
Резюме
Полученная нами поливалентная ботулиническая
сыворотка,
х
состоящая из из 4 культур Cl. botulinum тип А, тип В, тип С, тип D
использовали для получения полиспецифической флуоресцирующей
ботулинической сыворотки.
PRODUCTION OF POLYSPECIFIC FLUORESCENT BOTULINIC SERA FOR RAPID
DETECTION AND INDICATION OF BOTULINIC AGENT USING FLUORESCENT
ANTIBODIES METHOS
Mustafin T.R.
Summary
The obtained polyvalent botulinic sera consisting of 4-fold cultures of
Cl. botulinum type А, type В, type С, type D were used to produce polyspecific
fluorescent botulinic sera.
УДК 619:615.371
РАЗРАБОТКА ПОЛИСПЕЦИФИЧЕСКОГО ЭРИТРОЦИТАРНОГО
БОТУЛИНИЧЕСКОГО АНТИГЕННОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ
РЕАКЦИИ НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ
Мустафин Т.Р. - м.н.с.; Иванов А. В. - д.б.н., профессор, чл.-корр. РАСХН РФ;
Мустафина Э. Н. - к.в.н., с.н.с.; Садыков Н.С. – зав. лаб., д.в.н., профессор
Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных,
г.Казань, e-mail: [email protected]
Ключевые слова: антиген, ботулизм, реакция непрямой
гемагглютинации, гамма-облучение, формалинизация.
Keywords: antigen, Cl. botulism, indirect hemagglutination test, hammairradiation, formalinization.
В конце XIX века профессор медицины Ван Эрменгем изучал
причины пищевых отравлений. Используя методы микробиологических
исследований, он выделил из кишечника людей, скончавшихся после
158
дегустации различных сортов колбас и ветчины, подозрительные бактерии,
которые не встречались в кишечной флоре здоровых людей. Он назвал их
Bacillus botulinus, что в переводе с латыни означает Бацилла «колбасная»,
так вошло в современную медицину страшное заболевание - ботулизм [2].
Ботулизм – остро протекающая кормовая токсикоинфекция,
вызываемая токсином анаэробного спорообразующего микроба Bacillus
botulinus. Эпидемиология ботулизма исключительно специфична и не
укладывается в классические представления об эпидемиологии
инфекционных болезней. Источником заболевания может служить только
больной человек или больное животное. Тяжелая интоксикация возникает
в результате употребления в пищу продуктов, содержащих токсины
Clostridium botulinum, характеризующаяся преимущественно поражением
центральной и вегетативной нервной системы.
С другой стороны широкое распространение возбудителя ботулизма
в природе послужило причиной мнения, что возбудитель убиквитарен и
может размножаться и образовывать токсин в почве. В настоящее время
известно 7 типов возбудителя ботулизма (А, В, C, D, Е, F, G), которые
отличаются между собой по антигенным свойствам вырабатываемых ими
токсинов и некоторыми другими признаками. В почве, кормах, пищевых
продуктах и питательных средах они образуют субтерминально
расположенные споры в виде теннисной ракетки. По морфологии
возбудители ботулизма – небольшие палочки длиной 4 – 9 мкм и шириной
0,6 – 0,9 мкм с закругленными концами.
Вегетативные клетки обладают выраженной подвижностью.
Жгутики в количестве от 3 до 35 расположены по всему телу, капсулы не
образуют. Вегетативные формы возбудителя ботулизма погибают при 80оС
за 30 минут. Споры выдерживают кипячение от 1,5 до 6 часов, при
температуре 115оС они погибают через 30 – 40 минут, при 120оС – через 320 минут.
Токсин ботулизма представляет собой протеин, состоящий как бы из
двух фрагментов, связанных дисульфидными мостиками. Такое строение
обеспечивает необычную устойчивость токсина во внешней среде и
длительное сохранение активности.
Основу лабораторной диагностики ботулинического токсина или
возбудителя является исследование остатков пищевых продуктов, каловых
масс, из трупов берут кусочки печени, тонкого кишечника и желудка с
содержимым; биопроба на белых мышах. В качестве экспресс методов
лабораторной диагностики определяют фагоцитарный показатель и ставят
РНГА с сенсибилизированными антитоксическими сыворотками.
Ботулизм, как и столбняк, относится к группе сапрозоонозов, т.е. к числу
болезней, общих для человека и животных, причем как человек, так и
животные заражаются из окружающей среды, особенно из почвы.
Возбудитель ботулизма широко распространен в окружающей среде,
159
он обнаруживается в почве, воде, на свежих фруктах, овощах, фураже,
силосе, иле, продуктах домашнего консервирования, кишечнике человека
и животных и т.д. Поэтому вопрос по быстрой и точной диагностике
ботулизма, в некоторых случаях, стоит весьма остро. Например, в
условиях чрезвычайной ситуации, военного положения, при угрозе
применения биологического оружия, а также в случаях отравления
продуктами питания людей.
На сегодняшний день нет средств и методов экспресс индикации
возбудителя ботулизма, обнаружения ботулинического экзотоксина
ускоренным методом. Все вышесказанное и обуславливает безусловную
актуальность настоящей работы и необходимость создания экспресс
анализа на обнаружение возбудителя ботулизма и его токсинов в пищевых
продуктах.
Цель работы настоящих исследований является,
разработка
современных тест-систем для выявления патогенного анаэроба Clostridium
botulinum и индикации его токсина в продуктах животноводства, а также в
объектах внешней среды.
Материалы и методы: Проведена работа по получению токсинов
из штаммов возбудителя ботулизма, для этого были взяты 4 штамма: тип
А – № 98; тип В – 16-Я; тип С - № 91; тип Д – SHU, которые засевали в
колбы объемом (1,0 л) со средой Хоттингера с 1% глюкозы, рН 5,0 под
вазелиновым маслом и помещали в термостат при температуре 350С и
культивировали в течение 8 суток. После удаления вазелинового масла
содержимое колбы центрифугировали при 4000 об/мин. в течение 45 мин.,
надосадочную жидкость отсасывали, все это ставили на магнитную
мешалку при температуре +40С на 20 мин., в нее добавляли высушенную
соль сульфата аммония (оптимальная концентрация для осаждения
токсина 50 % к общему объему). По истечении этого времени,
центрифугировали при 6000 об/мин, в течение 20 мин, надосадок удаляли,
а осадок растворяли в стерильной дистиллированной воде (рН 4,0) 1:10 от
общего объема (на 1 л – 100 мл дистиллированной воды). Токсичность
полученного препарата определяли в реакции нейтрализации (РН) на
белых мышах по общепринятой методике.
Для получения корпускулярных антигенов, вышеперечисленную
культуру возбудителя ботулизма (4 типа) высевали на МПА с 2% глюкозы
и культивировали в анаэростате, при температуре 340С в течение 3х суток,
после чего выросшую культуру смывали 0,85% изотоническим раствором
NaCl. Инактивацию культур проводили двумя методами: 1) биологическим
(радиационным); 2) химическим (формалинизация).
Радиационный метод - заключается в воздействии гамма-лучей на
бактериальную клетку с целью инактивации. При этом определена доза
поглощения для возбудителя ботулизма, которая составила 30 кГр., путем
проверки на стерильность.
160
Химический метод - заключается в инактивации бактериальной
взвеси путем внесения в нее 40-го % формалина, и определения конечной
концентрации его бактерицидного действия на бактериальную взвесь Cl.
botulinum. После внесения формалина в бактериальные взвеси, их
культивировали в термостате при температуре 340С в течение 3х недель,
проверяя на стерильность.
Результаты
исследований.
В
дальнейшем
использовали
бактериальные взвеси полученные по вышеперечисленным методикам, для
получения антигенного эритроцитарного диагностикума. Для получения
использовали антигены (из 4х культур) приготовленные тремя методами: 1)
живая взвесь; 2) гамма – облученный; 3) инактивированный формалином.
Из живой и инактивированных культур, готовили 200 млн. взвесь, в
соотношении 1:1:1:1.
Антигенный эритроцитарный диагностикум приготовлен на основе
формалинизированных эритроцитов сенсибилизированных глобулином,
полученных токсинами возбудителя ботулизма (АГ). Получение
эритроцитарного
антигенного
диагностикума
проводилась
по
общепринятой методике в нашей модификации.
Проведенные
исследования
в
РНГА
с
использованием
полиспецифической сыворотки, в сравнении с моносыворотками показало,
что ботулинические моносыворотки положительно реагировали в титрах
1:8 – 1:32, в то время как поливалентная сыворотка давала положительный
результат со всеми типами (А, В, C, D, Е, F, G) в титрах от 1:16 до 1:128,
при отрицательных результатах в контроле.
Заключение. На сегодняшний день нет ускоренных методов
индикации возбудителя ботулизма в объектах внешней среды и в
патологическом материале. В настоящее время исследования продуктов
питания животного происхождения на безопасность проводятся
многоступенчатыми способами (посевы на питательные среды, выделение
выращивание в индифферентном газе и т.д.), окончательный результат
получают
биологической
пробой
на
мышах.
Разработка
полиспецифического эритроцитарного антигенного ботулинического
диагностикума дает возможность
для ускоренного выявления в
сыворотках крови наличия токсина возбудителя ботулизма всех типов в
РНГА.
ЛИТЕРАТУРА: 1. Колычев Н.М., Госманов Р.Г. Ветеринарная
микробиология и иммунология. - Омск: Изд. ОмГАУ, 1996. – С. 314 – 319.
2. Матвеев К.И. Ботулизм. – М.: Медицина, 1959. – С. 5-41, 350-361.
3. Никифоров В.Н., Никифоров В.В. Кн.: Ботулизм. - Л.: Медицина, 1985.
– С 104-116.
161
РАЗРАБОТКА ПОЛИСПЕЦИФИЧЕСКОГО ЭРИТРОЦИТАРНОГО
БОТУЛИНИЧЕСКОГО АНТИГЕННОГО ДИАГНОСТИКУМА ДЛЯ РЕАКЦИИ
НЕПРЯМОЙ ГЕМАГГЛЮТИНАЦИИ
Мустафин Т.Р., Иванов А. В., Мустафина Э.Н., Садыков Н.С.
Резюме
Отличаясь высокой чувствительностью и специфичностью, РНГА
позволяет обнаружить минимальные количества антител. Разработана
методика наработки антигена, для получения полиспецифического
эритроцитарного антигенного диагностикума, для индикации возбудителя
ботулизма и ботулинового токсина в реакции непрямой гемагглютинации.
DEVELOPMENT OF POLYSPECIFIC ERYTHROCYTЕ BOTULINIC ANTIGEN
DIANOSTIC KIT FOR INDIRECT HEMAGLUTINATION TEST
Mustafin T.R., Ivanov А.V., Mustafina E.N., Sadykov N.S.
Summary
Being highly specific and sensible indirect hemagglutination test allows to
detect minimal antibodies level. A novel method of antigen production was
developed for polyspecific erythrocyte antigen diagnostic kit, for indication of
botulinic agent and botulinic toxin in indirect hemagglutination test.
УДК 599.322.3
ИЗУЧЕНИЕ ТЕРРИТОРИЙ БЛИЗ БОБРОВЫХ ПРУДОВ
В ПЕРИОД АНОМАЛЬНОЙ ЗАСУХИ
Мухаметзянов М.З. – аспирант; Сайфуллин Р.Р. - к.б.н. профессор;
Салахов Н.В. - к.б.н., доцент,
Казанский (Приволжский) федеральный университет, тел.: 89274038531
Ключевые слова: бобр, плотина, нора, трасса, засуха, лось, кабан.
Keywords: beaver, weir, burrow, route, drought, elk, boar.
Бобр европейский – вид (фото 1), деятельность которого
принципиально меняет структуру ландшафтов долин малых рек и
определяет высокое биологическое разнообразие этих участков [2].
Материал и методика исследований. Был использован метод
визуального наблюдения, материалы: фото камера и видеокамера для
регистрации изменений.
162