Иммуногистохимическая характеристика тканей суставных

Надеин К.А.
Кандидат ветеринарных наук, Санкт-Петербургская государственная академия
ветеринарной медицины, Санкт-Петербург, Россия
ИММУНОГИСТОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ТКАНЕЙ СУСТАВНЫХ
СУМОК ТАРСАЛЬНОГО СУСТАВА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА ПРИ
ВОСПАЛЕНИИ
Аннотация
Проведено иммуногистохимическое исследование тканей животного (синовиальных
сумок тарсального сустава крупного рогатого скота) в норме и при воспалительном
процессе. Выявлено повышение количества Т- и В- лимфоцитов, которые локализуются в
периваскулярных зонах синовиальной оболочки.
Ключевые слова: бурсит, В-лимфоциты, иммуногистохимия, Т-лимфоциты
Keywords: bursitis, В-lymphocytes, immunohistochemistry, T- lymphocytes
Иммуногистохимия - метод морфологической диагностики, в основе которого лежит
визуализация и оценка с помощью микроскопа результатов реакции антиген-антитело в
срезах биопсированной ткани. В качестве антигена выступают компоненты клеточных
структур или межклеточного вещества ткани. Антитела получают из сыворотки крови
животных, иммунизированных интересующим антигеном, или от культуры ткани
гибридомы, которую создают слиянием "бессмертных" клеток плазмоцитарной опухоли
(миеломы) и активированных интересующим антигеном В-лимфоцитов. Уникальность
метода состоит в том, что все клетки гибридомы являются потомками одной
единственной клетки и поэтому синтезируют абсолютно идентичные молекулы антител.
Такие антитела называют моноклональными, в отличие от поликлональных, получаемых
иммунизацией животных.
Принципиальным отличием иммуногистохимии от других методов
иммунологической диагностики, использующих реакцию антиген-антитело, является
структурная специфичность исследования. Это означает, что в реакции оценивается не
только наличие сигнала (есть окрашивание или нет) и его сила (интенсивность
окрашивания), но и пространственное распределение сигнала в гистологическом
препарате (окрашивание мембран клеток, цитоплазмы, ядра и других структурных
элементов).
Ценность иммуногистохимии заключается в том, что она базируется на строго
специфических реакциях между диагностическими антителами и комплементарными им
антигенами. При иммуногистохимическом исследовании ткань обычно обрабатывают
антителами к антигену, который хотят в ней выявить. Затем ткань обрабатывают
антителами к диагностическим антителам. Эти антитела содержат либо краситель, либо
энзим, которые затем могут быть легко выявлены.
В образовании антител центральная роль принадлежит B-лимфоцитам. При этом Bлимфоциты обеспечивают специфический приобретенный иммунитет совместно с
другими малыми лимфоцитами - T-лимфоцитами, используя разнообразные механизмы,
направленные в большинстве случаев на расширение пределов эффективности
врожденного иммунитета.
Одна из важных регуляторных функций T-лимфоцитов - это их способность
стимулировать B-клетки к пролиферации и дифференцировке. Другая важная
регуляторная функция T-клеток состоит в их способности угнетать иммунный ответ. При
этом T-хелперы и T-супрессоры обнаруживают комплексный тип антигенной
специфичности.
По мнению Борисов М.С.[1,44], суставы являются поверхностными структурами и в
связи с этим часто подвергаются небольшим травмам, приводящим к незначительно
выраженным воспалительным изменениям с вероятным поступлением в суставную
полость компонентов плазмы и реакцией на них синовиальных клеток. Привлекает также
внимание, что значительная часть покровных синовиальных клеток (синовиоциты А)
являются активными фагоцитами и поэтому способны захватывать инфекционный или
любой иной антигенный (либо аутоантигенный) материал, циркулирующий в крови,
протекающей через синовиальную мембрану. Эти клетки имеют костномозговое
происхождение, и их убыль восполняется за счет предшественников моноцитов,
поступающих из костного мозга. Тем самым последние могут принести с собой в полость
сустава вещества антигенной природы, фагоцитированные на значительном расстоянии от
этого сустава. Кроме того, следует иметь в виду, что макромолекулы фиброзного и
гиалинового хряща способны задерживать белковые вещества, в частности
иммуноглобулины и комплексы антиген—антитело, фиксируя их тем самым в тканях
сустава.
Нами произведено изучение влияния воспалительных процессов в ткани
синовиальных сумок (бурс) тарсального сустава крупного рогатого скота на содержание
CD3 Т-лимфоцитов, которые экспрессируются на тимоцитах поздней стадии
дифференцировки и практически на всех периферических Т-лимфоцитах. Антитела к
антигену оказывают митогенное действие на покоящееся Т-лимфоцитах, индуцируют
клональную пролиферацию и секрецию иммуноглобулинов В- лифоцитами, индуцируют
секрецию цитокинов (ИЛ -2, интерферон). CD79 относится к сигнальным молекулам Вклеточных рецепторов.
Материалом являются бурсы тарсального сустава крупного рогатого скота
полученные при убое больных (30 голов) и здоровых (30 голов) животных, подобранных
по принципу аналогов. Полученные синовиальные ткани фиксировали в 10%-ном
нейтральном формалине и заливали в парафин. Применяли набор антител фирмы
«DAKO» к CD3 и к СD79[3, 225].
Протокол иммуногистохимического исследования:
1. Прогревание парафиновых блоков в термостате при температуре 60° С в течение
30-60 минут.
2. Депарафинизация в ксилоле (3 минуты х 2), абсолютном спирте (3 минуты х 2),
96° этиловом спирте (3 минуты х 2).
3. Блокирование эндогенной пероксидазы в 3% перекиси на воде.
4. Промывание в дистиллированной воде (3 минуты).
5. Восстановление активности антигенов путём кипячения в цитратном буфере (рН
6,0) или в ЭДТА (рН 9,0) в водяной бане. Стёкла со срезами помещают в контейнер с
буфером, прогревают до момента выравнивания температуры буфера и воды (95° - 99°С
под контролем термометра) и выдерживают 30 минут, затем ещё 20 минут при комнатной
температуре. Переносят в дистиллированную воду на 1-2 минуты. Промывание в TBS (2
раза по 5 минут).
1. Инкубация с первичными антигенами (18 часов при температуре 6° С),
разведёнными Antibody diluent (DAKO).
2. Инкубация с Envision mouse или Envision rabbit в зависимости от вида первичного
антитела (30 минут при температуре 37°С. После этапов 8 и 9 – промывание в TBS (2 раза
по 5 минут).
3. Реакция с DAB(3-5 минут, под контролем микроскопа, при комнатной
температуре). Рабочий раствор DAB готовится путём добавления к 1 мл буфера 1 капли
концентрированного хромогена согласно инструкции.
4. Смывание хромогена дистиллированной водой, промывание в дистиллированной
воде в течение 3-х минут.
5. Докрашивание ядер гематоксилином (2 минуты). Подсинивание в проточной воде
под контролем микроскопа.
6. Обезвоживание и заключение в бальзам с 96°-ным спиртом (2 минуты х 2 раза),
карбол-ксилол (2 минуты х 2 раза), ксилол (2 минуты х 2 раза).
7. Заключение в бальзам.
Результаты и обсуждение. Пролиферативный компонент воспалительного процесса в
группе больных бурситом коров характеризовался увеличением количества СD3- и СD79позитивных клеток.
В тканях суставных сумок при воспалении количество CD3-позитивных Тлимфоцитов было в 3 раза выше, чем в нормальной ткани. При этом изменялась
локализация клеток: в группе здоровых животных единичные CD3-позитивные клетки
располагались преимущественно вокруг сосудов; в воспаленных тканях вся синовиальная
оболочка была диффузно инфильтрирована CD3-позитивными лимфоцитами.
Количество СD79-позитивных В лимфоцитов в группе больных бурситом также
несколько (в 1,5 раза) превышало количество СD79-позитивных клеток в контрольной
группе, но распределение клеток в ткани при этом не отличалось. И у здоровых, и у
больных аутоиммунным бурситом животных В-лимфоциты диффузно располагались в
синовиальной оболочке.
Синовиту свойственны пролиферация рассмотренных синовиальных клеток и
клеточная инфильтрация более глубоких слоев. Характер этой инфильтрации во многом
определяется стадией болезни. При длительном течении преобладают лимфоциты,
макрофаги и плазматические клетки, нередко обнаруживаются лимфоидные фолликулы с
зародышевыми центрами (аналогичные таковым в лимфатических узлах). В наиболее
выраженных случаях синовиальная мембрана уподобляется эктопическому лимфоидному
органу [2,155], что является еще одним доказательством выраженности иммунных
процессов в суставе при коллагенозах. В то же время на самой ранней стадии болезни (в
течение первого месяца) отмечается лишь скромная инфильтрация лимфоцитами, которые
количественно явно преобладают над плазматическими клетками
Таким образом, бурсит тарсального сустава крупного рогатого скота
характеризуется повышением количества как Т-, так и В-лимфоцитов в ткани
синовиальной оболочки. Т-лимфоциты локализуются в периваскулярных зонах, а Влимфоциты диффузно инфильтрируют ткань.
Литература
1. Борисов М.С. Особенности капсулы сустава, синовиальной жидкости, гиалинового
хряща у животных /М.С. Борисов// Ветеринария, 2009,№1, 43-45.
2. Виноградов В.В. Изменение свойств клеток в очаге хронического воспаления./В.В.
Виноградов, С.В. Мордвин, В.Д. Чимитов // «Физиология и патология соединительной
ткани. Тезисы докладов V Всесоюзной конференции 14 – 18 октября 1980г., Новосибирск,
т.2, 154 – 156.
3. Banerjee D., Pettit S. Endogenous avidin-binding activity in human lymphoid tissue // J. Clin.
Pathol.-1984.-Vol.37.-P.223-230.