Основы молекулярной биологии вирусов и антивирусной терапии
реклама
Министерство образования Республики Беларусь Международный государственный экологический университет им. А.Д.Сахарова Факультет радиобиологии и экологической медицины Кафедра биохимии и биофизики А.И.Зинченко, Д.А.Паруль Основы молекулярной биологии вирусов и антивирусной терапии Минск МГЭУ 2003 ББК УДК 578:615.281 Авторы: Профессор кафедры биохимии и биофизики, чл.-корр. НАНБ Зинченко А.И., ст. преподаватель кафедры биохимии и биофизики, канд. биол. наук Паруль Д.А. Издано по решению Совета Международного государственного экологического университета им А.Д.Сахарова № от Зинченко А.И., Паруль Д.А. Основы молекулярной биологии вирусов и антивирусной терапии / Мн.: МГЭУ им. А.Д.Сахарова, 2003, ххх с. В учебном пособии рассмотрен широкий круг вопросов, включающий современные концепции учения о вирусах, свойства вирусов, химия и архитектоника вирусных частиц, влияние на них различных физических и химических факторов. Коротко описан арсенал биохимических методов, использующихся при очистке, концентрировании и анализе вирусных препаратов. На основе анализа молекулярных аспектов взаимодействия вирусов с чувствительной клеткой рассмотрены механизм действия основных противовирусных химиопрепаратов, а также существующие и перспективные пути профилактики и терапии наиболее социально-значимых вирусных инфекций. Рекомендуется для студентов ВУЗов, обучающихся по специальностям медико-биологического профиля. Ил. 42, табл. 14, библиогр. 94 назв. Предисловие Интерес к вирусам – мельчайшим объектам, стоящим на самой границе между живым и неживым, обусловлен двумя главными причинами. Первая заключается в том, что вирусы являлись в прошлом, остаются до сих пор и, по-видимому, будут еще долго оставаться в будущем одними из главных возбудителей инфекционных заболеваний. Достаточно напомнить, что оспа, уносившая в прошлом миллионы жизней, является вирусным заболеванием, известным человечеству тысячелетия. Перечень заболеваний, вызываемых вирусами, весьма внушителен. Уже общепризнано, что ряд вирусов непосредственно вовлечен в образование опухолей. Вирусы растений наносят колоссальный экономический урон и заметно снижают продовольственные ресурсы человечества. В тоже время успехи в терапии вирусных инфекций в сравнении с успехами в лечении бактериальных инфекций выглядят гораздо скромнее. Нет эффективных вакцин против большинства вирусных инфекций. В клиническую практику внедрены единичные высокоэффективные химиопрепараты. До сих пор не нашли широкого практического применения индукторы интерферона. Постоянно появляются новые неизвестные ранее вирусные заболевания и получают распространение те, которыми ранее долгое время пренебрегали. Несмотря на потрясающие успехи науки, достигнутые в ХХ веке, «головной болью» человечества в веке ХХI будут оставаться СПИД, грипп, эндогенные гепатиты и ряд др. вирусных и, вполне вероятно, прионовых заболеваний. Сказанного достаточно, чтобы оправдать то внимание, которое уделяется изучению вирусов. Однако дело не исчерпывается огромной практической важностью вирусов для здравоохранения, ветеринарии и растениеводства. В связи с простотой строения вирусы стали незаменимыми объектами и моделями, помогающими решать общебиологические, генетические, биохимические, молекулярно-биологические проблемы. Так, многочисленные исследования по выяснению механизмов репликации, транскрипции и трансляции нуклеиновых кислот, способов регуляции экспрессии генов, а также расшифровка генетического кода, структуры белков и нуклеиновых кислот – все это проводилось и продолжает проводиться при использовании как целых вирусных частиц, так и их отдельных компонентов. Другими словами, едва ли можно найти такую проблему в области молекулярной биологии, в разрешение которой изучение вирусов не внесло фундаментальный вклад. Отсюда следует, что ни один биолог или врач не может считать себя достаточно образованным, если он не знаком с основами вирусологии в ее современном виде. В основу настоящей книги легли лекции, читаемые в течение последних 5 лет одним из авторов студентам Государственного международного экологического университета им. А.Д.Сахарова по утвержденной программе в качестве раздела курса «Молекулярная медицина». Весь материал книги условно подразделен на три части. В первой из них (главы 1 и 2) рассмотрен предмет и история развития вирусологии, даны представления о структуре и химии вирусов; во второй (главы 3 и 4) – процессы, сопровождающие взаимодействие клетки с вирусами, а также представителями нового класса возбудителей инфекционных заболеваний – прионами. Назначение третьей части (главы 5 и 6) – ознакомить студентов с современными и перспективными возможностями контроля вирусных инфекций. При этом особое внимание уделено патологиям, вызываемым наиболее значимыми с медицинской и социальной точек зрения группам возбудителей, включая вирусы гриппа, иммунодефицита, герпеса и гепатита. Материал подается с учетом того, что студенты уже имеют фундаментальную подготовку по химии, биохимии, генетике и др. химическим и биологическим дисциплинам, необходимую и достаточную для продуктивного усвоения материала. Вполне естественно, что ввиду ограниченного объема книги, в ней затронуты далеко не все аспекты молекулярной вирусологии и антивирусной терапии. Как и всегда в подобных случаях, отобранный материал в значительной степени отражает личные научные интересы авторов. За редким исключением мы не приводим ссылок на авторов. Нашей задачей являлось рассмотрение принципиальных вопросов, а не устанавливать приоритет ученых. Кроме того, описание методов дано очень схематично и не претендует на полноту. Мы надеемся, что студенты обратятся к рекомендованной литературе, которая позволит им более подробно ознакомиться с интересующими их вопросами. Авторы Список сокращений ВИЧ – вирус иммунодефицита человека ВПГ-1 – вирус простого герпеса первого типа (HSV-1) ВПГ-2 – вирус простого герпеса второго типа (HSV-2) ВТМ – вирус табачной мозаики CD4 – Т-лимфоциты хелперы / индукторы СПИД – синдром приобретенного иммунодефицита ss – одноцепочечная (single-stranded) ДНК или РНК ds – двухцепочечная (double-stranded) ДНК или РНК АТФ – аденозин-5’-трифосфорная кислота ХТИ – химиотерапевтический индекс БКЯ – болезнь Крейцфельда-Якоба ОРВИ – острая респираторная вирусная инфекция БВДУ – 5-бром-2’-дезоксиуридин НТФ – нуклеозид-5’-трифосфат НМФ– нуклеозид-5’-монофосфат НДФ– нуклеозид-5’-дифосфат ИЛ – интерлейкин ВГА – вирус гепатита А ВГЕ – вирус гепатита Е ВГВ – вирус гепатита В ВГС – вирус гепатита С ВГD - вирус гепатита D ММА – молекулы межклеточной адгезии ВОЗ – Всемирная организация здравоохранения ПЦР – полимеразная цепная реакция IgA - иммуноглобулины класса А IgG - иммуноглобулины класса G IgM - иммуноглобулины класса М В/м – внутримышечно FDA – (Food and Drug Administration) Управление по контролю за качеством пищевых продуктов и лекарственных средств США Глава 1. ВВЕДЕНИЕ. НАУКА ВИРУСОЛОГИЯ. ОБЩИЕ ВОПРОСЫ Некоторые болезни, в вирусной природе которых мы сейчас не сомневаемся, были известны людям еще тысячи лет назад. Первым документированным упоминанием о вирусной инфекции считается дошедшая до нас клинопись Мэмфиса (столица античного Египта), написанная около 1400 лет до н. э. и представившая типичные клинические проявления паралитического полиомиелита. Кроме того, фараон Рамзес V, который умер в 1196 году до н. э. и чья мумия сейчас хранится в Каирском музее, полагают, имел поражения на лице, похожие на поражения современных пациентов, страдающих от оспы. Весьма напоминает оспу эпидемия, описанная в Х веке до н.э. в Китае. В медицинскую практику Запада в конце XVIII в. была введена прививка Дженнера – вакцинация экстрактами, содержащими вирус коровьей оспы. В 1885 г. Луи Пастер приготовил вакцину против бешенства из ослабленного (аттенуированного) штамма вируса. Майер в 1986 г. продемонстрировал возможность передать болезнь табака путем механической иннокуляции соком больных растений. Успехи, достигнутые к концу XIX в. в изучении болезней человека, вызванных бактериями, усилили интерес к тем инфекционным болезням, возбудители которых были еще неизвестны. Однако предположения о существовании субмикроскопических патогенных агентов еще не имели экспериментальной основы. И вот в 1892 г. русский ботаник Д.И.Ивановский сообщил о возможности передачи мозаичной болезни табака соком, профильтрованным через керамический фильтр, задерживающий самые мелкие бактерии. Это сообщение осталось практически не замеченным. Даже сам автор до конца не осознал своего открытия. Потребовалось еще шесть лет (до открытия в 1898 г. Ф.Леффлером и П.Фрошем возбудителя ящура) для всеобщего принятия концепции фильтрующихся (т.е. ультрамелких) инфекционных частиц. В этом же году (1898) голландский исследователь М.Бейеринк подтвердил результаты Ивановского по вирусу табачной мозаики и явился первым, кто разработал современную идею вирусов, которые он назвал «contagium vivum fluidum”, т.е. жидким живым возбудителем. Не смотря на открытие вирусов, вызывающих болезни у растений и животных, существовало сопротивление идее, что вирусы могут иметь какоелибо отношение к заболеваниям человека. Наконец, сомнения были рассеяны Лэндстайнером и Поппером, которые в 1909 г. показали, что полиомиелит вызывается тоже фильтрующимся агентом. Это было первое заболевание человека, для которого была доказана вирусная природа. Ф.Туорт (1915) и Ф.Д’эрель (1917) первыми открыли вирусы, патогенные для бактерий – бактериофаги (дословно – пожиратели бактерий). Начиная с 30-х годов XX в. Луриа, Дельбрюк и многие другие вирусологи стали широко использовать фаги в качестве модели для изучения многих аспектов вирусологии, включая структуру вирусов, генетику, репликацию и т.д. Честь войти в историю вирусологии в качестве первого, кому удалось выделить вирус (ВТМ) в очищенном (кристаллическом) состоянии, принадлежит американскому биохимику В.Стэнли (1935). Долгое время не существовало принципиальных трудностей в отнесении инфекционных агентов к вирусам или другим живым организмам. Однако в настоящее время изучение молекулярных основ некоторых инфекционных агентов усложнило этот вопрос. Дело в том, что некоторые вновь открытые инфекционные агенты обладают свойствами, которые не позволяют отнести их к вирусам, хотя они гораздо ближе по своей природе к вирусам, чем к другим живым организмам. Речь идет о вироидах, вирусоидах и прионах. Вироиды – это очень мелкие (несколько сотен нуклеоидов) кольцевые молекулы РНК, с палочко-образной вторичной структурой. Они не обладают оболочкой и ассоциируются с некоторыми болезнями растений. Их репликационная стратегия подобна вирусной: они - также облигатные внутриклеточные паразиты. Вирусоиды (сателлиты) – это вироид-подобные молекулы, несколько большие, чем вироиды (до 2000 нуклеотидов), которые зависят от присутствия в клетке других реплицирующихся вирусов (вирусовпомощников). Прионы – инфекционные агенты, состоящие из единственной молекулы белка без какой-либо нуклеиновой кислоты. Удивительно то, что прионовый белок и ген, который кодирует его, находят в нормальных, неинфицированных клетках. Прионы ассоциируют с т.н. «медленными инфекциями», такими, например, как болезнь Крейцфельда-Якоба и куру человека, а также скрейпи овец и губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота. Кроме того, современные молекулярно-генетические исследования показали, что около 5-10% генома эукариотической клетки состоит из мобильных вирусоподобных элементов (транспозонов), которые могут играть значительную роль в эволюции как клеточных, так и вирусных геномов. Кроме того, геномы некоторых бактериофагов сильно схожи с бактериальными плазмидами в отношении структуры и механизмов репликации. Все это говорит о том, что взаимоотношения между вирусами и другими живыми организмами возможно более сложные, чем считалось ранее. 1.1. Зачем необходимо изучать вирусы Необходимость изучения вирусов диктуется рядом обстоятельств и, прежде всего, тем, что в настоящее время насчитывается более сотни вирусных заболеваний человека. Число вирусных патологий животных и растений во много раз больше. Ущерб мировой экономике, наносимый ежегодно вирусами, исчисляется многими миллиардами долларов, большая часть которых приходится на счет фитопатогенных вирусов. Следует отметить, что в настоящее время накапливаются данные о том, что имеется связь вирусов с заболеваниями человека, которые никогда не считались вирусными. В качестве примера, отметим, что у больных рассеянным склерозом в 53 случаев из 100 в клетках обнаруживают геном одного из ретровирусов (MSRV). В контроле этот показатель составляет не более 7%. В этиологии сахарного диабета выявляется вирус Коксаки. При некоторых психических заболеваниях упорно выявляют вирус болезни Борна. Есть потенциальная связь между отторжением пересаженного сердца и обнаружением в таких трансплантантах вируса Эпштейна-Барр. Итак, многие вирусы – это враги человека, животных и растений. И хотя мы уже знаем о них довольно много, этого далеко не достаточно для того, чтобы разработать успешную стратегию борьбы с каждым конкретным вирусным патогеном. Дело осложняется тем, что мир вирусов столь разнообразен, что порой один вирус отличаются от другого более кардинально, чем отличаются между собой кишечная палочка и слон, между которыми, на взгляд обывателя, вообще ничего нет общего. Кроме того, на наиболее уязвимых стадиях своего цикла развития вирусы столь тесно интегрируются с клеткой-хозяином, что трудно найти средство, позволяющее поразить вирус, не затрагивая при этом клетки. Отсюда не случайно, что противобактериальных средств (к примеру, антибиотиков) имеется несколько сот, а эффективных противовирусных препаратов нет и двух десятков. Причем большинство из них имеет ограниченную терапевтическую ценность из-за побочных эффектов по отношению к нормальным органам и тканям. Другая причина, по которой следует изучать вирусы, заключается в том, что в вирусах сконцентрировались многие кардинальные проблемы современной биологической науки, решение которых было бы немыслимо на более сложных объектах исследования. Что же дало изучение вирусов для познания фундаментальных законов биологической науки? Прежде всего, вирусы в свое время дали мощный толчок для развития разнообразных химических, физико-химических и физических методов исследования, в частности – ультрацентрифугирования (аналитического и в градиенте концентрации сахарозы или солей тяжелых металлов), электрофореза, хроматографии, электронной микроскопии и т.д. В 1947 г. Шрамм открыл явление самосборки белковых оболочек вируса табачной мозаики (ВТМ). Впоследствии было обнаружено, что так собираются многие белковые ансамбли у различных живых организмов. Херши и Чейз в 1952 г. открыли чрезвычайно важное с вирусологической и общебиологической точек зрения явление. Они показали, что инфекция кишечной палочки (Escherichia coli) фагом Т2 осуществляется его ДНК, не целым фагом. В 1957 г. работами Френкель-Конрата и Зингер была показана возможность искусственного получения путем дезагрегации и реконструкции т.н. «химерных» вирусных частиц, в которых белок и РНК принадлежали разным штаммам ВТМ. Оказалось, что потомство таких химерных вирусов было неотличимо от штаммов-доноров РНК ни серологически, ни по симптомам заболевания, ни по аминокислотному составу белков. Эти эксперименты явились еще одним доказательством того, что материальными носителями генетической информации являются нуклеиновые кислоты, а не белки. Кроме того этими опытами впервые было продемонстрировано, что генетическая информация может быть закодирована не только в ДНК, но и в РНК. Что касается роли белков, интересно отметить следующее. Холланд показал, что изолированные нуклеиновые кислоты некоторых вирусов (в т.ч. вирусов полиомиелита, Коксаки и ЕСНО) являются не только инфекционными (что само по себе в свое время казалось удивительным), но и могут заражать даже клетки тех организмов, которые к целому вирусу невосприимчивы. При этом в инфицированных клетках образуются зрелые вирусные частицы, идентичные исходным вирусам по всем без исключения биологическим и физико-химическим характеристикам. У некоторых РНК-содержащих фагов обнаружены аналогичные явления. А именно, целые частицы способны заражать только F+ (мужские) особи бактерий, в то время как их нуклеиновые кислоты могут инфицировать как мужские, так и женские (F-) штаммы бактерий. Эти данные, многократно подтвержденные на самых различных вирусных моделях, позволили ученым придти к закономерному выводу о том, что тропизм вирусов по отношению к тем или иным клеткам-хозяевам обусловливается вирусными белками. Интенсивные исследования вирусов привели к изменению взглядов на типы и формы нуклеиновых кислот: на двухспиральную структуру ДНК и односпиральную РНК, на тимин и урацил, которые непременно должны входить в состав ДНК и РНК, соответственно. В 60-х годах появилось несколько сообщений об аномалиях химического состава в вирусных нуклеиновых кислотах. Так было доказано, что у Т-четных фагов цитозин полностью замещен 5-оксиметилцитозином. Т.о. ученые впервые столкнулись с фактом полного замещения канонического азотистого основания на неизвестное ранее его производное. Потрясением основ стало обнаружение в составе ДНК одного из фагов Bacillus subtilis урацила в сочетании с дезоксирибозой. По мере дальнейших исследований стало очевидным, что когда речь идет о вирусных нуклеиновых кислотах, нормой является, скорее, наличие самых разнообразных аномалий в их составе, а нуклеиновые кислоты с каноническими азотистыми основаниями и сахарами – большая редкость. За период с 1962 по 1964 г. благодаря изучению макромолекулярной структуры вирусных нуклеиновых кислот было обнаружено, что в природе существуют другие, не известные на тот момент времени типы нуклеиновых кислот: одноцепочечные (ss) ДНК, двухцепочечные (ds) РНК и циклические формы ДНК и РНК. Первое выделение мРНК было осуществлено в 1962 г. Баутцем и Холлом из клеток E. coli, инфицированной фагом Т2. Следует отметить, что для этой цели ученые применили весьма оригинальный метод комплементарной адсорбции мРНК на иммобилизованной фаговой ДНК. Неоценимую роль сыграли вирусы в решении важнейших вопросов генетики. Благодаря таким положительным качествам вирусной модели, как большая скорость размножения, простота культивирования и выраженная способность к рекомбинации признаков, на ней были сделаны очень важные открытия в области общей и молекулярной генетики. Так к 1963 г. была составлена первая генетическая карта (фаг Т4), установлена единица генетической рекомбинации (равная одному нуклеотиду) и единица функции (цистрон). Весьма неожиданно генетическая карта оказалась кольцевой, а не линейной. Начиная с указанных исследований вирусы превратились в излюбленную модель для изучения молекулярных механизмов наследственности и изменчивости организмов вообще. В 1950-1953 гг. Львову удалось открыть явление интеграции ДНК фагов с геномом клетки-хозяина с последующей репликацией вирусной ДНК в составе хромосомы бактериальной клетки, т.е. в состоянии т.н. «профага». Одновременно Львов открыл феномен индукции профага под влиянием некоторых физических и химических факторов. Спустя 10 лет (Дульбекко и Фогт, 1960) явление, аналогичное лизогении, было открыто при изучении клеток животных, зараженных некоторыми вирусами. В 1961 г. было показано, что преобразование нормальной клетки в раковую способны вызывать не только целые вирусы (например, полиомы и папилломы), но и их очищенные нуклеиновые кислоты. Все эти данные подтвердили вирусогенетическую концепцию происхождения опухолей, сформулированную в 1944-1961 гг. советским исследователем Л.А.Зильбером. Все последующие гипотезы включали в себя основное ее положение – интеграцию вирусного генома с геномом клетки-хозяина – как обязательный элемент. Необходимо отдельно подчеркнуть, что, как показано в последние годы, интеграция геномов (вирусного и клетки-хозяина) довольно широко распространена в природе и в определенной мере способствует обмену генетической информацией в биосфере. Другими словами, вирусы (по крайней мере, некоторые) являются инструментом бесконтактного обмена генетической информацией между живыми организмами, и этот обмен, возможно, имеет определенное эволюционно значение. Действительно, обмен генетической информацией между пространственно разобщенными организмами весьма полезен для эволюции, но такой обмен – редкое событие, хотя бы по той причине, что генетический материал для его осуществления должен совершить довольно опасное путешествие по внешней среде перед тем, как попасть в потенциальную реципиентную клетку. В то же время вирусы, транспортируя свою нуклеиновую кислоту от клетки к клетке, могут быть идеальными медиаторами такого генетического обмена, в ряде случаев даже межвидового. Таким образом, на вирусах как модели простейших живых организмов в прошлом были сделаны важнейшие открытия в области молекулярной биологии и молекулярной генетики. В настоящее время вирусы служат инструментом в генно-инженерных экспериментах. На их основе создаются эффективные векторы для клонирования и переноса генетической информации от одних организмов к другим. 1.2. Природа вирусов Вирусы являются субмикроскопическими облигатными внутриклеточными паразитами. На первый взгляд, даже такое простое определение позволяет отличать вирусы от всех других групп живых организмов. Однако, это определение все же нельзя признать до конца исчерпывающим. Ясно, что нет проблем в том, чтобы увидеть разницу между вирусами и высшими организмами. Приведенного определения достаточно также и для того, чтобы отличить вирусы от прокариотов и микроскопических эукариотов таких, как грибы, простейшие и водоросли. Однако существует несколько групп прокариотических организмов, имеющих в своих жизненных циклах особые паразитические стадии, которые делают непригодным приведенное выше определение вирусов. Речь идет о риккетсиях и хламидиях – облигатных внутриклеточных паразитических бактериях. Эти бактерии в результате эволюции настолько стали ассоциированы с клеткой – хозяином, что вне её они уже существовать не могут. В связи с этим, возникла необходимость в усложнении определения – что же такое вирус. В настоящее время одним из наиболее приемлемых определений вирусов является следующее: Вирусы – это субмикроскопические (20-300 нм) ДНК- или РНКсодержащие объекты, репродуцирующиеся только в живых клетках, заставляя их синтезировать т.н. вирионы, которые содержат геном вируса и способны перемещать его в другие клетки. Это определение отражает два главных качества вирусов: во-первых, наличие у вируса собственного генетического материала, который внутри клетки-хозяина ведет себя как часть клетки, и, во-вторых, существование внеклеточной инфекционной фазы, представленной специализированными частицами, или вирионами, которые служат для введения генома вируса в другие клетки. Еще раз следует подчеркнуть, что внутриклеточный паразитизм свойственен не только вирусам. Однако паразитизм вирусов – особый. Его можно характеризовать, как паразитизм на генетическом уровне. В отличие от вирусов, такие паразиты, как риккетсии, малярийный плазмодий, имеют собственный рибосомный и митохондриальный аппараты и клеточную организацию. Вирусы имеют ряд свойств, которые не укладываются в представления о них как о живых объектах, а именно: - вирусы не дышат, - не проявляют раздражимости, - не способны самостоятельно двигаться, - не растут и не делятся, - способны (по крайне мере некоторые) в очищенном состоянии кристаллизоваться. Итак, согласно традиционным зоологическим и ботаническим критериям, вирусы не являются живыми организмами. В то же время, все вирусы обладают главными свойствами живых организмов – способностью реплицироваться, изменяться и передавать эти изменения потомкам, т.е. эволюционизировать. Другими словами, вирусы имеют собственную эволюционную историю. Ни один из известных вирусов не имеет биохимических или генетических потенций для генерирования энергии, необходимой для осуществления своих биологических процессов. В этом отношении они абсолютно зависят от клетки-хозяина. Как видим, вирус имеет две формы существования: внеклеточную (покоящуюся), представленную вирионом, или вирусной частицей, и внутриклеточную – вегетативную. Внутри клетки-хозяина вирионы не растут и не делятся. Они как бы собираются из «запчастей» как автомобили на конвейере. Подключив воображение, сам вирион можно представить как межпланетный корабль, который от планеты к планете (т.е. от клетки к клетке) переносит своих обитателей (лабильные геномы). Часто спрашивают – живые вирусы или нет? Скорее всего, ответ должен быть таков: внутри клетки-хозяина вирус живой, в то время как вне её вирус представляет собой просто ансамбль из метаболически инертных химических соединений. Несмотря на свою простоту, среди вирусов наблюдается разнообразие большее, чем среди бактерий, растений и животных, вместе взятых. Это явилось результатом тех «успехов», которых добились вирусы в паразитизме на всех известных группах живых организмов, и понимание этого разнообразия является ключом к постижению взаимоотношений вирусов с их хозяевами и разработке мер эффективной противовирусной защиты. 1.3. Происхождение вирусов С вопросом о природе вирусов тесно связаны вопросы об их происхождении и эволюции. В разное время были высказаны три основные гипотезы о происхождении вирусов. Ряд исследователей полагают, что вирусы – это потомки неких доклеточных форм жизни, ставшие в результате эволюции паразитами. Согласно второй гипотезе, вирусы – результат дегенеративной эволюции древних бактерий. Однако большинство ученых считают, что вирусы произошли от клеточных компонентов, т.е. фактически от генов. В настоящее время ни одна из перечисленных гипотез не может претендовать на роль теории, хотя предпочтение отдается двум последним предположениям. Следует отметить, что когда рассматривают проблему происхождения каких-либо организмов, всегда строят т.н. «филогенетическое древо». Для его построения весьма полезными являются эксперименты по выяснению степени родства первичной структуры нуклеиновых кислот. Сиквенирование геномов множества вирусов и сравнение их геномов показало, что единого предка у вирусов нет. Это находит свое выражение в том, что в случае вирусов простое фамильное филогенетическое древо построить невозможно. Эволюционные связи между вирусами скорее напоминают не дерево а отдельно растущие кусты. При изучении эволюции организмов весьма полезным является также анализ ископаемых форм. Однако, никто еще не обнаружил ископаемых вирусов – они слишком малы и лабильны, чтобы выдержать процессы, которые сопровождают минерализацию. В результате, исследователи вынуждены изучать только вирусы, изолированные в настоящее время, или их предков, которым не больше нескольких десятков лет. Итак, есть основания считать, что некоторые вирусы – это потомки древних бактерий, которые претерпели дегенеративную эволюцию. Это видно из сопоставления ряда: обычные бактерии – микоплазмы и риккетсии – хламидии – вирус оспы. Микоплазмы и риккетсии несомненно являются продуктами дегенерации бактерий. При этом микоплазмы потеряли клеточную стенку, а риккетсии уменьшились в размерах и упростили свою организацию. Хламидии еще больше упростились и потеряли митохондрии, став, таким образом, не только внутриклеточными паразитами, но и паразитами энергетическими. Резонно предположить, что вирусы оспы появились на дальнейшей стадии дегенеративной эволюции, в результате которой хламидиями были потеряны рибосомные системы синтеза белка. Система репликации и транскрипции ДНК, однако, сохранилась, что позволило возникшим вирусам размножаться в безъядерных клетках. Именно поэтому в отличие от всех других ДНК-содержащих вирусов вирус оспы размножается в цитоплазме, а не в ядре клетки-хозяина. С большой долей вероятности ретровирусы произошли от клеточных генов. Сходные генетические элементы, обладающие обратной транскриптазой, обнаружены у дрозофил и грибов. Всех их относят к мобильным генетическим элементам (транспозонам), и сами ретровирусы в сущности являются своеобразными транспозонами. Во всяком случае некоторые из них, будучи вирусоподобными, никогда не проходят стадии вирионов. 1.4. Эволюция вирусов Главный вывод, который делает всякий, кто знакомится с результатами изучения молекулярной филогении вирусов, заключается в том, что вирусы эволюционизировали совместно со своими хозяевами. Вирусы почти всех главных классов организмов – животных, растений, грибов, бактерий и архей – очень долго эволюционизировали с их хозяевами еще в мировом океане, учитывая, что основная часть времени, отпущенного на эволюцию на нашей планете, пришлась именно на тот период. Это означает, что вирусы, вероятно, выходили из океана со своими хозяевами во время последовательных волн колонизации суши. Иными словами: - вирусы бактерий, ныне обитающих на суше, вероятно, происходят от вирусов, обитавших 3500 млн. лет назад в первых бактериях«колонизаторах» суши; - большинство вирусов наземных растений, вероятно, происходят от вирусов зеленых водорослей, которые появились около 1000 млн. лет назад; - большинство вирусов наземных насекомых происходит от вирусов вымерших ископаемых; - большинство вирусов наземных позвоночных происходят от тех, что вышли на сушу с первыми дышащими воздухом позвоночными 350 млн. лет назад. Это объясняет, почему вирусы разных типов хозяев так сильно различаются между собой – они имели слишком много времени для адаптации к своим жизненным нишам после дивергенции из возможно даже имевшегося общего предка. Так между бактериофагами и вирусами эукариот практически нет родства, поскольку эволюционно они разошлись слишком давно. Однако еще сохранилось некоторое сходство между вирусами растений и позвоночных и (еще большее) между вирусами позвоночных и насекомых. Следует отметить, что, сосуществуя с одно- и многоклеточными организмами в течение миллионов лет, вирусы не только приспосабливались к клеткам-хозяинам, но и «приспосабливали» эти клетки к себе. Так, нормальные диплоидные клетки человека (например, линии WI38) могут делиться ограниченное число раз (50±10) и погибают в конце концов в результате т.н. феномена «запрограммированной смерти» апоптоза. В тоже время клетки, подвергшиеся вирусиндуцированой трансформации (малигнизации) становятся при пассировании в определенном смысле бессмертными. Есть предположение, что этот феномен возник не случайно, а как защитная мера вируса против апоптоза. Действительно, поскольку инфицированные клетки самоуничтожались прежде, чем могло сформироваться потомство вируса, потребовались антиапоптозные меры (и вирусы в ходе эволюции их выработали), которые гарантировали бы вирусам возможность завершать цикл репликации. Как уже отмечалось выше, очень вероятно, что некоторые вирусы произошли от клеточных транспозонов и эписомальных элементов. В ходе эволюции последние сумели захватить часть генома клетки-хозяина. В результате такого «молекулярного пиратства» они приобрели относительную автономность (по крайне мере, в течение части репликативного цикла), способность перемещаться от одной клетки-хозяина к другой, а в ряде случаев - интегрировать свой геном с геномом хозяина. Интересной эволюционной «находкой» некоторых сложных вирусов явилось то, что они приобрели способность уклоняться от иммунологической атаки со стороны организма-хозяина путем своеобразного камуфляжа – включения в состав своей оболочки элементов мембраны клетки-хозяина. 1.5. Классификация и номенклатура вирусов Цель классификации любых классов организмов состоит в том, чтобы структурировать в разумные категории те из них, которые наиболее близки по каким-либо признакам. В основу такой группировки могут быть положены морфологические или физиологические критерии, либо те и другие. Идеал, к которому стремится человек, состоит в создании такой классификации, которая не противоречила бы эволюционным связям организмов, а также обеспечивала бы удобную и рациональную систему номенклатуры. Если говорить о значении классификации вирусов, прежде всего, следует подчеркнуть, что классификация дает возможность предсказывать детали репликации вируса, патогенеза и способы распространения инфекции. Это имеет особо важное значение в том случае, когда проводится идентификация нового вируса. Далее, если предпринимается изучение нового вида известного семейства или рода вирусов, его можно проводить, принимая во внимание информацию, которая уже накоплена исследователями при изучении других членов этой таксономической группы. Классификация и номенклатура вирусов всегда вызывала и вызывает (в силу специфики объекта) большие трудности. Как уже отмечалось выше, вирусы, скорее всего, являются сборной группой представителей, имеющих различное происхождение. К такой группе, строго говоря, затруднительно применять таксономические критерии. Поэтому, все современные классификации вирусов не претендуют на то, чтобы отражать филогенетической родство, а служат главным образом в качестве «таблиц для определения», используемых исследователями в практических целях. Часто вирусы подразделяют в соответствии с природой их хозяев на вирусы животных, вирусы растений, вирусы бактерий и т.д. Однако даже такое подразделение не свободно от противоречий, поскольку вирусы растений способны размножаться в насекомых-переносчиках. Вирусы микроскопических грибов (микофаги) могут размножаться в бактериях. Поскольку подавляюще число вирусов было открыто как патогенные агенты в отношении человека, животных или растений, представляется рациональным в качестве главного критерия в классификации использовать вид хозяина, у которого впервые были обнаружены патогенные проявления того или иного вируса. Однако для самих вирусов часто более важны не те хозяева, которые представляют интерес для человека, а хозяева, в которых вирус как раз и вызывает наименьшие изменения. Иногда при классификации вирусов используются особенности структуры вирусной частицы, которые могут быть установлены прямыми (электронная микроскопия) или непрямыми методами (биохимические или серологические исследования). Однако в последнее время самым надежным подходом к классификации вирусов считается подход, которые базируется на учете типа и структуры вирусного генома. Долгое время при классификации вирусов использовалась унифицированная схема, которая представлена на рис. 1.1. Рис. 1.1. Иерархическая таксономия вирусов, рекомендованная Международным комитетом по таксономии вирусов в 1966 г. Руководствуясь приведенной схемой, надо помнить, что таксон «порядок» обязан иметь в своем латинском наименовании суффикс «virales»; в наименовании семейств присутствует суффикс «viridae»; подсемейств – «virinae». Наименование родов заканчивается суффиксом «virus». Бинарная номенклатура, обычная для обозначения видов животных, растений и микроорганизмов, в данном случае не применяется. Наименования семейств, подсемейств и родов пишутся с заглавной буквы и с использованием шрифтов типа “Italica”. Наименования самих вирусов пишутся со строчной буквы и без наклона. Следует отметить, что с 1995 предложено вместо таксона «порядок» указывать группу Балтимора. Как, согласно современным представлениям, выглядит таксономическое положение вируса простого герпеса первого типа (ВПГ-1) – иллюстрирует рис. 1.2. Рис. 1.2. Таксономия ВПГ-1, согласно рекомендаций Международного комитета по таксономии вирусов 1995 г. По типу нуклеиновой кислоты вирусы распределяют на две группы: ДНК-содержащие вирусы и вирусы, содержащие РНК (табл. 1.1). Из ДНК-содержащих вирусов патогенные для человека присутствуют в шести семействах. Поксвирусы и герпесвирусы вызывают у человека заболевания, сопровождающиеся поражением кожных покровов. Аденовирусы – выделены из аденоидов носоглотки. Следующие два семейства объединяют онкогенные вирусы: парвовирусы (в переводе крошечные) и паповавирусы, получившие исторически название по первым слогам наименований вызываемых ими болезней (папиллома и полиома) и названия вируса (вакуолизирующий вирус SV-40). Наконец, в последние годы в самостоятельную единицу выделено семейство гепаднавирусов, в котором решено поместить вирус гепатита В. Группа патогенных РНК-содержащих вирусов состоит из десяти семейств. Ортомиксовирусы и парамиксовирусы обладают сродством к мукопротеидам клеток. Пять семейств: тогавирусы, аренавирусы, вирусы Буньямвера, реовирусы и ретравирусы – составляют группу арбовирусов, которые циркулируют в природе среди животных и передаются человеку членистоногими. Остальные три семейства – это рабдовирусы, вызывающие бешенство, пикорнавирусы, отличающиеся небольшими размерами, и коронавирусы, частицы которых обрамлены своеобразной короной, вызывают инфекции животных, хотя могут иногда поражать и человека. Таблица 1.1. Классификация вирусов – возбудителей инфекций человека Семейство Тип нуклеиновой кислоты Poxviridae ДНК Herpesviridae ДНК Adenoviridae ДНК Parvoviridae ДНК Papovaviridae ДНК Hepadnaviridae Orthomyxoviridae Paramyxoviridae ДНК РНК РНК Retraviridae РНК Важнейшие представители Вирус натуральной оспы, вирус осповакцины. Вирусы простого герпеса типа 1 и 2, вирус ветряной оспы и опоясывающего лишая, цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр. Аденовирус человека, аденовирусы млекопитающих. Латентный вирус крыс Килхема, аденовирусные сателлиты. Вирус папилломы Шоупа, вирус полиомы, вакуулизирующий вирус SV-40. Вирус гепатита В. Вирусы гриппа А, В и С. Вирусы парагриппа 1, 2, 3 и 4, вирус кори, респираторно-синцитиальный вирус. Вирус иммунодефицита человека, вирус саркомы Рауса. Bunyaviridae Togaviridae РНК РНК Coronaviridae РНК Reoviridae Picornaviridae РНК РНК Arenoviridae Rhabdoviridae РНК РНК Вирус Буньямвера, вирус Укуниеми. Вирус Синдбис, вирус желтой лихорадки, вирусы клещевого энцефалита, вирус краснухи. Коронавирус человека, вирус бронхита птиц. Реовирус человека, реовирус позвоночных. Вирус полиомиелита человека, вирус гепатита А, вирус ящура. Вирус лимфоцитарного хориоменингита. Вирус бешенства, вирус везикулярного стоматита. Что касается названий вирусов, следует подчеркнуть, что при их формировании не прослеживается единого принципа. Вирусы могут называть в соответствии с вызываемыми заболеваниями (например, вирус герпеса) либо по названию географического места, где они были впервые изолированы (например, вирус лихорадки Западного Нила, вирус Буньямвера). Иногда используют фамилии исследователей, впервые изучивших вирусы (например, вирус Эпштейна-Барр). Реже в названии отражаются их особые эпидемиологические свойства (например, арбовирусы). Рекомендуемая литература Основная Ардаматский Н., Абакумова Ю. Клиническое подтверждение вирусной теории атеросклероза // Врач. 1995. № 7. С. 36-38. Бобков А. Как и когда это могло случиться. Происхождение и эволюция ВИЧ // Мед. курьер. 2000. № 1-2. С. 17-20. Кордюм В.А. О концепции «вирусы» и их месте в биосфере // Биополимеры и клетка. 2000. Т. 16, № 2. С. 87-98. Miller M.J. Viral taxonomy // Clin. Infect. Diseases. 1999. V. 29, N 4. P. 731-733. Morse S.S., Schluederberg A. Emerging viruses: the evolution of viruses and viral diseases // J. Inf. Dis. 1990. V. 162. P. 1-7. Дополнительная Краев В.Г. Современная классификация и номенклатура вирусов растений. По материалам Международного комитета по таксономии вирусов // Мiкробiол. ж. 2000. Т. 62, № 5. С. 45-71. Borio L., Inglesby T., Peters C.J., Schmaljohn A.L., Hughes J.M., et al. Hemorrhagic fever viruses as biological weapons: medical and public health management // JAMA. 2002. V. 287, N 18. P. 2391-2405. Boudriau S., Gagnon A., Doyle D. et al. Epstein-Barr virus mediates graft in heart transplant patients // FASEB Journal. 1997. V. 11, № 3. Р. 64. Herzum M., Schaefer J., Hufnage G., Maisch R. Zytomegalie-und herpessimplex-viren in pathogenese und progression der nativen arteriosnecrose und der rezidivstenose nach der intervention // Herz. 1998. B. 23, № 3. Р. 193-196. Garson J.A., Tuke P.W., Giraud P. et al. Detection of virion-associated MSRV-RNA in serum of patient with multiple sclerosis // Lancet. 1998. V. 351, № 9095. Р. 33. Fuhrman J.A. Marine viruses and their biogeochemical and ecological effects // Nature. 1999. V. 399. P. 541-548. Golubev D.B., Perevozchikov A.P. The role of herpes virus in etiopathogenesis of atherosclerosis // Russ. Med. J. 1996. V. 1, № 1. С. 8-15. Hober D., Andreoletti L., Hober C. et al. Enterovirus et diabete de type 1 // Med. Sci. 1998. V. 14, № 4. Р. 398-403. Cuilliton B. Emerging viruses, emerging threat // Science. 1990. V. 247. P. 279-280. Virus Taxonomy: Sixth repot of the International Committee on Taxonomy of Viruses / Ed. by F.A.Murphy, C.M.Fauquet, D.H.L.Bishop et al. Wien: SpringerVerlag, 1995. Planz O., Rentzsch C., Batra A. et al. Persistence of Borna disease virus specific nucleic acid in blood of psychiatric patient // Lancet. 1998. V. 352, № 9128. P. 623. Глава 2. СВОЙСТВА ВИРИОНОВ Физико-химическое изучение любого вируса, как правило, начинается с разработки метода его выделения и очистки. Обычно исходный материал представляет собой культуральную жидкость, тканевой экстракт и т.д. Во всех этих случаях вирус находится в смеси с большим количеством разнообразных балластных веществ – белков, пигментов, структурных компонентов клеток и т.п. Без удаления этих примесей невозможно проводить биохимические исследования вирусов. 2.1. Выделение и очистка вирусов Для очистки большинства вирусов с успехом применяют дифференциальное ульрацентрифугирование. Центрифугирование в градиенте плотности сахарозы делает возможным более тонкое разделение частиц, седиментационные свойства которых незначительно отличаются друг от друга. Методом равновесной седиментации в градиентах плотности цезиевых солей можно разделить частицы, обладающие различной плотностью. В случае если вирусы приходится выделять из больших объемов биологических жидкостей, прибегают к высаливанию сернокислым аммонием, осаждению органическими растворителями, осаждению в изоэлектрической точке. Наряду с этим используется ионообменная хроматография, гельфильтрация и т.д. Короче говоря, большинство методов, используемых для очистки белков, применимо и к вирусам. Однако существует и ряд специфических методов, применяемых для очистки только вполне определенных вирусов. Например, миксовирусы можно очистить, используя их способность адсорбироваться на эритроцитах. Общей схемы, пригодной для очистки любого вируса, в настоящее время не существует. Поскольку свойства вируса, так же как и химические свойства примесей, могут значительно варьировать у различных вируссодержащих материалов, то и выбор приемов очистки будет зависеть от каждого конкретного случая. Высокоочищенные вирусы можно получить только благодаря последовательному применению целого ряда методов. 2.1.1. Выделение вирусов из зараженных клеток Идеальным методом выделения вирионов был бы тот, который обеспечил сохранение их биологической активности при полном разрушении клеточных компонентов и мембран. Однако такого метода нет. В зависимости от характера исходного материала и природы вируса приемы извлечения вирусов различны. Размалывание. Этот способ широко применяется в тех случаях, когда приходится работать с большим количеством вируссодержащего материала. Наиболее простым и почти универсальным приспособлением для размельчения нативной животной ткани является обычная или электрическая мясорубка. Гомогенизация. Более основательное разрушение ткани достигается при помощи гомогенизаторов. Из препаративных гомогенизаторов наиболее популярны высокоскоростные смесители типа “Warring”. Они снабжены стеклянными или стальными сосудами и набором четырехлопастных стальных ножей, которые соединены с мотором, способным вращаться со скоростью до 15 000 об/мин. Единственным недостатком такого гомогенизатора является то, что развиваемое большое гидродинамическое воздействие в сочетании со вспениванием иногда инактивирует некоторые лабильные вирусы. Эти неблагоприятные условия исключаются при использовании гомогенизаторов, состоящих из двух деталей: толстостенной конусной пробирки и пришлифованного к ней пестика из стекла или тефлона. К сожалению, производительность таких гомогенизаторов незначительна (3-8 г ткани за цикл). Обработка ультразвуком. Очень широко используется также дезинтеграция клеток, зараженных вирусами, при помощи ультразвука. Если озвучивать жидкость ультразвуком, то при определенной интенсивности звука (около 20 Кгц/сек) в среде возникает явление т.н. кавитации. Благодаря очень быстрому чередованию давления и разрежения, возникает большое число крошечных воздушных пузырьков, которые разрываясь, образуют вокруг себя область с интенсивной ударной волной. При этом возникает мгновенный жесткий локальный градиент давления, который и разрушает клетки. Лизис клеток. Часто чтобы разрушить зараженные клетки используют ферменты (лизоцим, трипсин, гиалуронидаза и т.д.). Для лизиса дрожжей и грибов эффективен комплексный ферментный препарат Геликаза, получаемый из пищеварительного тракта виноградной улитки Helix pomatia. Клетки животных можно эффективно разрушать мочевиной и детергентами (додецилсульфат натрия, дезоксихолат натрия и др.). На практике часто обработка ультразвуком сочетается с другими способами дезинтеграции, такими, как осмотический шок в дистиллированной воде (протопласты бактерий и грибов), многократное замораживание и оттаивание (ткани животных), гомогенизация, что значительно уменьшает время обработки ультразвуком. Последнее благоприятно сказывается на выходе инфекционных вирусных частиц, поскольку ультразвуковая обработка приводит к значительному разогреву озвучиваемой суспензии. 2.1.2. Концентрирование и очистка вирусов Как уже отмечалось выше, значительные успехи, достигнутые молекулярной биологией, во многом обусловлены исследованиями химии и физики вирусов. Эта уникальная модель оказалась в руках исследователей после 1935 г., когда Стэнли очистил и получил в кристаллическом виде ВТМ. Этот вирус длительное время играл роль основного и едва ли не единственного объекта исследований, пока не были созданы современные методы получения других высокоочищенных вирусов. Осаждение солями. Вирусы, подобно белкам, осаждаются из водных растворов при определенных концентрациях солей, которые разрушают взаимодействие между молекулами воды и полярными группировками оболочки вируса. При этом вирус агрегирует и выпадает в осадок. Наиболее часто для высаливания вирусов применяют сульфат аммония. Несмотря на простоту и дешевизну, метод высаливания сульфатом аммония обладает двумя недостатками. Во-первых, он неспецифичен для вирусов, поскольку вместе с ними высаливаются и белки клетки-хозяина, а во-вторых, при этой процедуре происходит деструкция некоторых вирусов. Осаждение в изоэлектрической точке. Большинство вирусов преципитирует в кислой зоне рН, поскольку их изоэлектрические точки лежат в пределах 3,5-6,5. Осаждение в изоэлектрической точке – наиболее простая и доступная операция из всех применяемых методов концентрирования и очистки вирусов. Однако, при рН ниже 5,0 также выпадают в осадок многие белки клетки-хозяина, что ограничивает возможность применения этого метода. К тому же подобная процедура не всегда желательна при очистке некоторых лабильных вирусов. Преципитация спиртами. При добавлении к вируссодержащей суспензии охлажденного метанола или этанола вирус преципитирует вследствие уменьшения (как и в рассмотренном выше случае обработки сульфатом аммония) степени гидратации его белковой оболочки. Оптимальная концентрация спирта для каждого вируса подбирается эмпирически. Эта величина колеблется от 15 до 35%. Процедура проводится при максимально возможных низких температурах, для избежания денатурации вирусных частиц. Метанол более выгодно использовать, чем этанол, т.к. применяя его, можно работать при более низких температурах. Однако этот метод так же, как и метод высаливания сульфатом аммония, имеет недостатки. Он неспецифичен для вирусов (осаждается значительное количество балластных белков) и не может быть использован для некоторых вирусов животных, которые не устойчивы к спиртам (сложные вирусы, содержащие липопротеидные оболочки). Обработка ферментами. Благодаря особой структурной организации вирионов, большинство вирусов, несмотря на их нуклеопротеидную природу, устойчиво к действию протеолитических ферментов и нуклеаз, в то время как клеточные нуклеиновые кислоты и белки этими ферментами легко разрушаются. Используя эту различную чувствительность вируса и клеточных примесей к ферментам, можно при помощи ферментов провести частичную очистку вирусов. Ультрафильтрация. Метод концентрирования и очистки вирусов с помощью мембранных ультрафильтров имеет преимущества перед другими методами, как один из наиболее мягких и щадящих. Мембранные фильтры изготавливают из эстерифицированной целлюлозы. Размер пор у фильтров разных типов варьирует от 0,01 до 8 мк. Фильтры устойчивы к температуре (до 125оС), к воздействию разбавленных кислот и щелочей и неполярных растворителей. В идеале, используя последовательную ультрафильтрацию через две мембраны с убывающим размером пор (одна задерживает частицы, более крупные чем вирус, а вторая – только вирус) можно получить в чистом виде любой вирус. Недостатком метода является то, что часто происходит засорение фильтра или адсорбция вируса на фильтре. Разделение в двухфазных системах. Метод основан на том, что распределение веществ в водной полимерной двухфазной системе зависит от их размера и поверхностных свойств и характеризуется определенным коэффициентом распределения. Например, вирусы и примеси в системах, содержащих декстран и полиэтиленгликоль, имеют разные коэффициенты распределения между двумя фазами. Поэтому в одной фазе собирается вирус, а в другой – примеси. Метод прост и не требует сложного оборудования. Преимущество его также состоит в том, что концентрирование и очистка вируса производятся в «мягких» условиях. Кроме того, можно обрабатывать большие количества вируссодержащего материала. Дифференциальное ультрацентрифугирование. Метод ультрацентрифугирования основан на разделении частиц по их различной способности седиментировать в центробежном поле, в частности по такому параметру, как константа седиментации. В свою очередь скорость осаждения частиц в центробежном поле зависит от сочетания таких параметров как масса и т.н. «парашютность» частицы, которая, в свою очередь, зависит от ее размера и формы. Термин «седиментация» означает осаждение частиц под действием силы тяжести. Вирусы настолько малы, что обычной силы тяжести недостаточно для их осаждения. Для этого создается искусственное поле силы тяжести. Приборы, позволяющие добиться увеличения гравитационного поля до таких величин, при которых происходит седиментация макромолекул, называют ультрацентрифугами. Современные ультрацентрифуги позволяют увеличить поле силы тяжести в центрифужной пробирке с исследуемым веществом более чем в 300 тыс. раз. Скорость осаждения частиц, приведенная к единице центробежного ускорения (коэффициент седиментации, S), является специфической характеристикой макромолекул и выражается формулой: S= v dx / dt = 2 , c ω x где х – расстояние от оси вращения, см; t – время, сек; ω - угловая / Коэффициент седиментации имеет размерность времени, т.к. ω имеет размерность, обратную времени (радиан – величина безразмерная). Значения коэффициента седиментации для различных макромолекул имеют величины порядка 10-13-10-14 сек. Для удобства величина 10-13 принята за единицу коэффициента седиментации. Эту величину обозначают S (единица Сведберга). Коэффициент седиментации обычно зависит от концентрации изучаемого вещества. На практике бывает необходимым знать седиментационные характеристики веществ при оседании в сравнимых и идеальных условиях, т.е. условиях, когда взаимодействие между частицами отсутствует. Для этого величина коэффициента седиментации, измеренная в воде при 20оС, рассчитывается для бесконечного разведения раствора и обозначается как S°20,w – константа седиментации. В современных ультрацентрифугах достигается скорость вращения ротора 60 000 об/мин и выше. Для частиц, находящихся на расстоянии 5-6 см от оси вращения, эта скорость соответствует центробежной силе, превышающей силу тяжести в 250 тыс. раз. Ядра клетки оседают при 800 g, митохондрии – при 10 000 g, а большинство вирусов - при 30 000–100 000 g за 0,5–3 часа. При низкоскоростном центрифугировании из вируссодержащей суспензии удаляются обломки клеток и их компоненты. Затем при центрифугировании надосадка при 100 000 g осаждают вирусные частицы, а основная часть белков и других низкомолекулярных соединений остается в надосадочной жидкости. Таким образом, с помощью цикла дифференциального центрифугирования удается разделить вирусную суспензию на ряд фракций, содержащих однородные по скорости седиментации частицы. Следует отметить, что для большинства вирусов использование только одного метода дифференциального центрифугирования недостаточно, чтобы получить высокоочищенную вирусную суспензию. Как правило, конечный препарат содержит некоторые нормальные компоненты клеток, которые имеют очень близкие с вирусами седиментационные характеристики. К сожалению, многие вирусы, особенно палочкообразные, могут образовывать после центрифугирования осадки, которые затем очень трудно вновь суспендировать. Ультрацентрифугирование в градиенте плотности. Это понятие относится к скоростному центрифугированию частиц в столбе жидкости с плотностью, увеличивающейся по направлению от оси ротора. Такой градиент плотности может быть образован с помощью, например, сахарозы, глицерина, фиколла или солей тяжелых металлов (цезия, рубидия). Существует две наиболее важных разновидности метода: метод зонального ультрацентрифугирования и метод изопикнического (или равновесного) ультрацентрифугирования. Метод зонального ультрацентрифугирования для разделения частиц в зависимости от коэффициента седиментации применяется с 1953 г. При этом исследуемую суспензию наслаивают на преформированный градиент. Градиент обычно готовят пологим, и если центрифугирование продолжать длительно, то все частицы могут осесть. Поэтому центрифугирование надо прекращать до момента оседания частиц. Но вместе с тем времени должно быть достаточно для того, чтобы частицы могли мигрировать через градиент. В результате указанной процедуры в центрифужной пробирке формируются зоны, из которых каждая состоит из частиц с близкими седиментационными свойствами. Для извлечения вируса из центрифужной пробирки содержимое ее фракционируют. Обычно это осуществляется путем прокалывания дна пробирки и последовательного сбора фракций. При равновесном ультрацентрифугировании частицы суспендируют в растворе хлористого цезия или сульфата цезия. После продолжительного центрифугирования в пробирке создается устойчивый градиент плотности. Частицы собираются на том уровне, где плотность среды равна их собственной плотности. При этом значение плотности частиц, полученное таким образом, зависит от используемой среды и отличается от значения плотности для сухих частиц или для частиц, исследуемых в другой среде, т.к. концентрированные растворы солей в значительной степени изменяют степень гидратации белков оболочки. Поэтому в этом случае принято говорить о «плавучей» плотности частиц. Принцип работы самоустанавливающегося изоплотностного градиента иллюстрирует рис. 2.1. Рис. 2.1. Схематическое изображение разделения двух вирусов с различной плавучей плотностью путем равновесного ультрацентрифугирования в градиенте плотности CsCl. Левую центрифужную пробирку наполняют водным раствором CsCl (ρ=1,28 г/мл), в котором суспендируется некоторое количество вируса вакцины и вируса гриппа. После центрифугирования в течении 20 ч при 41 000 об/мин молекулы CsCl концентрируются на дне пробирки, образуя градиент плотности. При этом вирионы из нижней части градиента всплывают (т.к. они легче, чем находящийся здесь раствор CsCl), а вирионы из верхней части градиента, наоборот, осаждаются - до зоны, которая имеет ту же плотность, что и частицы вируса. В данном случае это зоны с плотностью 1,28 г/мл (вирус осповакцины) и 1,25 г/мл (вирус гриппа). Разрешение, достигаемое при ультрацентрифугировании в градиентах плотности CsCl и Cs2SO4, очень велико. Например, при помощи этого метода удается легко разделить частицы бактериофагов, отличающиеся друг от друга по плотности всего на 0,05 г/мл. Этому различию в плотности соответствует относительное различие в содержании ДНК порядка 1%. Адсорбционная хроматография. Метод основан на различной степени адсорбции вирусов и примесей при фильтровании через слой твердого адсорбента. Решающее значение имеют поверхностные свойства вирусной частицы и адсорбента, а также состав буфера, в котором суспендирован вирус. При элюировании соответствующим буфером вирусные частицы могут быть отделены от примесей. В качестве адсорбентов в вирусологической практике обычно используются фосфат кальция, гидроксилаппатит, фосфат алюминия, целит. Хроматография на молекулярных ситах (гельфильтрация). Метод основан на способности пористых материалов разделять смесь веществ по размеру и молекулярной массе компонентов. Молекулярные сита не обладают сорбционным сродством к фракционируемым веществам. Обычно в качестве таких пористых материалов применяют гранулированные гели полисахаридов (сефадексы, агароза), полиакриламид (биогели) и пористое порошковое стекло. Схематически процесс гельфильтрации можно представить следующим образом (рис. 2.2). Молекулы более крупные, чем размер пор в гранулах, не проникают внутрь их и поэтому движутся по колонке с жидкой фазой вне гранул. Мелкие молекулы проникают внутрь гранул и движутся относительно медленнее. Степень проникновения зависит от размера и формы молекул. Вследствие этого элюирование молекул из слоя гранул геля происходит в порядке уменьшения размера молекул. Когда из колонки элюируются все молекулы, она вновь готова к следующему эксперименту. Эта автоматическая регенерация – одно из преимуществ гельфильтрации. Метод гельфильтрации нашел широкое применение в вирусологической практике, т.к. он наиболее безвреден для лабильных вирусов. Кроме того, он очень удобен при использовании на последней стадии очистки многих вирусов, поскольку при этом можно удалить из препаратов сульфат аммония и др. низкомолекулярные вещества (например, использующиеся для формирования градиентов плотности). Рис. 2.2. Схема фракционирования молекулярным ситом. вируса и примеси на колонке с Адсорбция на эритроцитах. Этот метод очень удобен для очистки тех вирусов, которые способны адсорбироваться на эритроцитах и элюироваться с них. К таким вирусам относятся вирус полиомы и многие представители миксовирусов. Впервые феномен адсорбции-элюции вирусов с эритроцитов был обнаружен в 1941 г. В частности было показано, что вирус гриппа адсорбируется поверхностью эритроцитов при 0-25оС и спонтанно элюируется с них при 37оС и выше. Этот метод позволяет при минимальном техническом оснащении лаборатории получать достаточно очищенные препараты вирусов. Следует отметить, что в настоящее время вместо нестабильных нативных эритроциов используют куриные эритроциты, обработанные формалином. Такие «формалинизированные» эритроциты более устойчивы к изменениям состава среды и менее загрязняют своими обломками вирусный элюат. При этом их можно (в отличие от нативных эритроцитов) использовать неоднократно. Цикл адсорбции и элюции на эритроцитах обычно проводят перед основными этапами очистки вируса, например перед ионообменной хроматографией, гельфильтрацией или дифференциальным ультрацентрифугированием. Ионообменная хроматография. Ионообменниками называют такие соединения, которые содержат фиксированные заряженные функциональные группы и подвижные противоионы. Последние могут обратимо обмениваться с другими ионами того же заряда, не изменяя физических свойств нерастворимой матрицы. Ионообменниками могут быть органические и неорганические соединения – алюмосиликаты, синтетические смолы, полисахариды, целлюлоза и т.д. Тип ионообменника определяется активностью групп в матрице. Введение фенольных, карбоксильных или сульфогрупп придает матрице катионообменные свойства, а введение алифатических или ароматических аминогрупп – анионообменные свойства (см. табл. 2.1). Разделение компонентов при этом виде хроматографии осуществляется не за счет разницы в их размерах, а за счет различий в их зарядах. Фракционирование вируссодержащих смесей, нанесенных на колонки, осуществляется пропусканием через колонку буферных растворов с возрастающей ионной силой или же растворов с возрастающей (или убывающей) величиной рН. Применяя ионообменники, удается сравнительно легко и быстро проводить препаративную очистку и концентрирование различных вирусов. В тоже время, имеются сообщения и о неудачах при использовании метода ионообменной хроматографии для очистки вирусов. Некоторые вирусы при элюции с ионообменников теряют до 90% активности. Таблица 2.1. Основные типы целлюлозных ионообменников Ионообменник Сокращенное название Диэтиламиноэтил- ДЭАЭцеллюлоза целлюлоза АминоэтилАЭ-целлюлоза целлюлоза Карбоксиметилцеллюлоза Фосфатцеллюлоза КМ-целлюлоза Сульфоэтилцеллюлоза СЭ-целлюлоза Ф-целлюлоза Функциональная Краткая группа характеристика −OC2H4N(C2H5)2 Сильноосновной анионообменник Несколько более −OC2H4NH2 слабый анионообменник, чем ДЭАЭцеллюлоза Слабокислый −OCH2СООН катионообменник Несколько более −ОРО3Н2 сильный катионообменник, чем КМцеллюлоза Сильнокислый −OC2H4SO3H катионообменник 2.1.3. Критерии чистоты вирусных препаратов Вирусный препарат можно считать чистым, если в нем не обнаруживаются какие-либо посторонние примеси. Определение степени загрязненности зависит от чувствительности применяемых методов исследования. Следует помнить, что применяя какой-либо один метод, нельзя доказать гомогенность препарата. Важным критерием чистоты считается кристаллизация. Часто как доказательство чистоты вирусного препарата используется наличие спектра поглощения в ультрафиолете, характерного для нуклеопротеидов. Важнейшим методом оценки гомогенности вирусной суспензии является наблюдение за скоростью седиментации частиц при ультрацентрифугировании в градиенте плотности сахарозы. Требованием для гомогенного препарата является симметричность соответствующего ему пика на седиментационной диаграмме. Еще более чувствительным критерием гомогенности служит наличие одного пика при равновесном ультрацентрифугировании в градиенте плотности CsCl или Cs2SO4. Применение метода электронной микроскопии для выявления примесей целесообразно, если этот материал имеет достаточный размер и по внешнему виду отличается от вируса. Примесь клеточных веществ, которые способны диффундировать и обладают антигенными свойствами, можно выявить с помощью очень чувствительных серологических методов, таких, как иммунодиффузия и иммуноэлектрофорез. Для вирусов с хорошо установленным элементарным составом (например, ВТМ) такие методы, как определение отношения фосфора к азоту, позволяет обнаружить примеси, содержащие азот или фосфор, если они присутствуют в значительном количестве. При определенных обстоятельствах могут быть применены также более сложные химические методы, например анализ концевых групп белков, позволяющих обнаружить всего-навсего одну аминокислоту. Из вышеизложенного следует, что для вирусных препаратов нет одного вполне удовлетворительного метода определения чистоты. Поэтому в практической работе используют и критически сопоставляют результаты, полученные при помощи возможно большего числа разнообразных методов. 2.2. Структурно-функциональная организация вирионов При всем разнообразии форм и размеров вирусов структуре их капсидов присущи некоторые общие признаки (см. рис. 2.3) 2.2.1. Химический состав вирусов Все вирионы содержат геномную нуклеиновую кислоту (ДНК или РНК), покрытую снаружи белковой оболочкой – капсидом. По химическому составу вирусы – нуклеопротеиды, а по структуре – нуклеокапсиды. В состав многих вирусов, кроме белка и нуклеиновой кислоты, входят углеводы, липиды и некоторые другие соединения. Разнообразие вирусных нуклеиновых кислот иллюстрирует рис. 2.4. Рис. 2.3. Схематическое изображение структуры вирусов. А – простой, икосаэдрическая симметрия. Б – сложный, икосаэдрическая симметрия. В – простой, спиральная симметрия. Г – сложный, спиральная симметрия. Рис. 2.4. Геномные нуклеиновые кислоты вирусов. Полярность РНК. Одноцепочечные вирусные РНК разделяют на две группы. К одной группе относят РНК, которые способны в клетке-хозяине транслироваться рибосомами, т.е. играть роль мРНК. Такие РНК обозначают как (+)РНК, а геном, который они представляют, называют позитивным. У другой группы РНК-содержащих вирусов РНК не узнается рибосомным аппаратом клетки и, поэтому, она не способна выполнять функцию мРНК. В клетке такая РНК служит матрицей для синтеза мРНК. Такой тип РНК обозначают как (−)РНК, а соответствующий геном носит название негативного. Перечень вирусных геномов, которые найдены в вирионах, включает: I. двухцепочечную ДНК - dsДНК; II. одноцепочечную ДНК - ssДНК; III. двухцепочечную РНК - dsРНК; IV. одноцепочечную РНК позитивной полярности - ss(+)РНК; V. одноцепочечную РНК негативной полярности - ss(−)РНК; VI. диплоидную одноцепочечную позитивную РНК - ss(+)РНК, в цикле репликации которой имеется стадия обратной транскрипции; VII. двухцепочечную ДНК – dsДНК, в цикле репликации которой имеется стадия обратной транскрипции. Тип нуклеиновой кислоты, находящейся в вирионе, и стратегия ее репликации в клетке-хозяине положены в основу т.н. «Классификационной системы Балтимора». Согласно этой классификации, все известные в настоящее время вирусы разделены на 7 групп Балтимора, соответствующих приведенному выше перечню геномов. Капсид состоит из одинаковых по строению субъединиц – капсомеров, которые располагаются согласно двум основным типам симметрии – кубической (икосаэдрической) или спиральной. Капсомеры – это морфологические единицы капсида, которые, в свою очередь, могут состоять из одной или нескольких молекул белка – структурных единиц. Комплекс капсида и вирусной нуклеиновой кислоты обычно обозначают термином нуклеокапсид, который может обладать кубической (икосаэдрической) или спиральной симметрией. Вирионы т.н. простых вирусов представлены только капсидом. Вирионы сложных вирусов дополнительно имеют двухслойные липидные мембраны, в которую включены белки (почти всегда – гликопротеиды), имеющие форму шипов. Такие вирионы обычно имеют слой негликозилированного белка (матрикс), примыкающего к капсиду. Простые вирусы, как правило, состоят только из вирусспецифических компонентов. Изредка такие вирусы могут «уносить» из клетки-хозяина ее компоненты, такие, например, как полиамины и гистоны – поликатионы, служащие для нейтрализации зарядов на вирусной нуклеиновой кислоте, что облегчает упаковку ее в капсид. Сложные вирусы содержат ферменты, а также могут включать в состав вириона белки, входящие в состав мембраны клетки-хозяина. Это можно рассматривать как побочный эффект процесса отпочковывания вируса при выходе из клетки. Однако часто это служит вирусу своеобразным камуфляжем и позволяет уходить из-под атаки хозяйской иммунной системы. Закономерен вопрос – почему у всех вирусов капсид имеет субъединичную структуру? Такое строение капсида, по-видимому, обусловлено необходимостью экономии генетического материала. В противном случае, как показывают расчеты, у многих вирусов его бы хватило для кодирования белков, способных покрыть не более 15% нуклеиновой кислоты. Очевидно также, что при наличии одного или немногих морфологических компонентов значительно облегчается самосборка капсида. В противном варианте вероятность ошибок в процессе самосборки резко бы возросла. Наконец, существуют своего рода «технические» ограничения, которые снижают прочность упаковки на основе, скажем, тетраэдра или октаэдра. В этих вариантах промежутки между субъединицами будут слишком большими, а частица в результате - непрочной. Расчеты и опыт свидетельствуют, что чем больше число субъединиц и тем больше контактов их друг с другом, тем более стабильной получается структура и тем крупнее может быть капсид, в который, в свою очередь, может быть помещен более крупный и сложный геном. Инкапсулирование генома необходимо вирусам, в первую очередь, для физической защиты лабильной по своей химической природе нуклеиновой кислоты от воздействия на внеклеточной стадии своего существования жестких факторов окружающей среды (таких, как экстремальные значения рН и температуры, УФ-облучение и т.д.). Другой важнейшей функцией капсида является обеспечение адсорбции вируса на клетке-хозяине через взаимодействие с клеточными рецепторами. У некоторых вирусов геном фрагментирован, и оболочка просто необходима для того, чтобы собрать его в единое целое. У сложных вирусов наличие внешней липидной оболочки, из-за сродства ее с мембраной клетки-хозяина, способствует проникновению нуклеокапсида внутрь клетки. Кроме того, за счет включения в эту оболочку белков клетки-хозяина, вирус получает возможность успешнее преодолевать хозяйский иммунологический барьер. 2.2.2. Принципы вирусной архитектоники Морфология капсида. Структура вирусов чрезвычайно разнообразна, однако прослеживаются некоторые общие принципы, которые используют вирусы в построении своих капсидов. По характеру расположения капсомеров вирусы делят на три группы: с кубическим (икосаэдрическим), спиральным и смешанным типом симметрии. Большинство патогенных для человека вирусов обладают икосаэдрическим типом симметрии. Спиральный тип характерен для миксовирусов и некоторых арбовирусов. Смешанный тип симметрии выявлен у поксвирусов и бактериофагов. По форме, выявляемой с помощью электронной микроскопии, вирусы можно разделить на сферические (паповавирусы, поксвирусы), палочкообразные (например, ВТМ) и нитевидные (вирус бешенства и др.). Палочкообразные и нитевидные вирусы – обычно простые со спиральным типом симметрии. Среди сферических вирусов встречаются как простые (икосаэдрическая симметрия), так и сложные, у которых могут быть любые из вышеперечисленных типов симметрии. В 1956 г. Крик и Уотсон предложили (главным образом на основе теоретических рассуждений) принципы структуры вирусов, которые впоследствии были полностью подтверждены экспериментально и сейчас считаются общепризнанными. Эти исследователи, прежде всего, заметили, что размера нуклеиновых кислот (в первую очередь, у мелких вирусов) хватает для кодирования только нескольких сравнительно небольших белков. Отсюда, единственная возможность для вируса создать прочную оболочку – построить ее из идентичных молекул структурного белка. Вторая часть предположения касалась способа, при помощи которого капсид может быть собран из субъединиц. Из общих соображений было предположено, что субъединицы должны соединяться друг с другом так, чтобы обеспечить для каждой из них одинаковое окружение. А это возможно только в том случае, если они будут паковаться с использованием принципов симметрии. Крик и Уотсон постулировали, что единственный способ обеспечить каждой субъединице одинаковое окружение – собрать из них некую структуру с кубической симметрией. Эти предсказания вскоре были подтверждены - капсиды икосаэдрической формы найдены у огромного числа совершенно неродственных вирусов. Таким образом стало очевидным, что икосаэдрическая симметрия капсида это не случайный результат естественного отбора, а один из основополагающих принцип архитектоники вирионов. Структура икосаэдрического капсида. Икосаэдр насчитывает 20 граней, каждая из которых является равносторонним треугольником, и 12 вершин. Как показано на рис. 2.5, икосаэдр имеет 6 осей 5-го порядка, проходящих через вершины, 10 осей 3-го порядка, проходящих через каждую грань, и 12 осей 2-го порядка, проходящих через ребра. Крик и Уотсон указали, что вирусу с симметрией 5:3:2 требуется как минимум 60 субъединиц, чтобы полностью закрыть ими поверхность воображаемой фигуры. При этом каждая субъединица оказывается связанной идентично со своими соседями и ни одна из них не совпадает с осью симметрии. Действительно, к настоящему времени найдено несколько вирусов (например, бактериофаг φX174), которые имеют только 60 субъединиц. Однако большинство вирусов включает в свои капсиды гораздо большее число капсомеров. Рис. 2.5. Простейший икосаэдр и способы получения из него икосаэдров более высокого порядка (класса Р=1, при f=2 и f=3). При этом выполняется правило, согласно которому число структурных единиц любого икосаэдра должно составлять 60Т (минимальное число субъединиц в простейшем икосаэдре, помноженное на т.н. «число триангулирования»). Число триангулирования, определяется из формулы , где P = 1, 3, 7, 13, 19, 21, 37 (класс икосаэдра); f - любое целое число (при этом f 2 - число треугольников, на которые разделяется каждая грань). T = P× f 2 Простейший икосаэдр (рис. 2.5) имеет 20 граней. Более сложные икосаэдрические структуры могут содержать 20Т граней. Говоря проще, при делении граней простейшего икосаэдра на более мелкие треугольники можно получить серию многогранников более высоких классов сложности. Икосаэдрические вирусы, содержащие 60 субъединиц, имеют совершенную симметрию. Если же в состав вирусной частицы входит более 60 субъединиц, то расположить их эквивалентно относительно друг друга на поверхности икосаэдра не представляется возможным. По этой причине в структуре таких вирусов наблюдается явление неполной пространственной эквивалентности (т.е. квазиэквивалентности) субъединиц. Чтобы это проиллюстрировать, рассмотрим частицу со 180 субъединицами. Здесь белковые субъединицы располагаются не независимо, а кластерами, потому что это максимизирует межмолекулярные взаимодействия, которые стабилизируют частицу. Так, например, у вируса полиомиелита три субъединицы размещаются в центре каждого треугольника, образуя 60 морфологических единиц, т.е. капсомеров. У вируса морщинистости репы кластеры располагаются по центру ребер, образуя 90 капсомеров, являющихся димерами. В случае вируса желтой мозаики тюльпанов кластеры располагаются в вершинах треугольников, формируя 20 гексамеров и 12 пентамеров (всего 32 капсомера). Существенно, что связь между субъединицамми в составе капсомера сильнее, чем связь между самими капсомерами, поэтому капсомеры могут быть изолированы для структурно-функционального изучения. Спиральные нуклеокапсиды представляют собой простейшую форму вирусных капсидов. Белок как бы «наматывается» на нуклеиновую кислоту (обычно это одноцепочечные РНК или ДНК) по спирали, наподобие винта. В случае ВТМ (рис. 2.6), образуемая структура – уже вирион. То же справедливо и для нитевидных вирусов, в составе которых нет внешних мембран (все представители сем. Tobamoviridae, Potyviridae и Closteroviridae). Рис. 2.6. Элемент структуры ВТМ. В других случаях палочкообразный спиральный нуклеокапсид может быть окружен матриксным белком и мембраной с шипами. Типичным примером таких вирионов являются члены сем. Paramyxoviridae. В качестве примера сложного вируса рассмотрим структуру вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Рис. 2.7. Схематическое строение ВИЧ. Как видно из рис. 2.7, ВИЧ содержит 2 идентичные копии (диплоидный геном) позитивной одноцепочечной РНК длиной около 9500 нуклеотидов. РНК ассоциирована с основным (положительно заряженным) нуклеокапсидным белком. Этот белок предназначен для нейтрализации отрицательных зарядов на РНК, что облегчает укладку нуклеиновой кислоты в капсиде. Нуклеопротеиновый тяж (полагают, что он имеет спиральную симметрию) окружен икосаэдрическим капсидом, составленным из множества копий капсидного белка. Капсид, в свою очередь, окружен слоем матриксного белка, также имеющим икосаэдрическую симметрию. Матриксный белок контактирует с двухслойной липидной мембраной (оболочкой). Оболочка ВИЧ происходит из клеточной плазматической мембраны и приобретается в процессе выхода вируса из клетки. Считается, что оболочка содержит липидные и белковые компоненты клетки. Кроме того, она содержит вирусные белки, имеющие форму шипов. Главным из них является белок, обозначаемый gp120/41. Этот сложный белок, состоящий из двух гликопротеидов, функционирует в качестве вирусного антирецептора (белка соединяющегося с рецептором клетки). На рисунке видно, что гликопротеид gp41 пронзает оболочку, а gp120 находится на ее внешней поверхности. Внешняя оболочка, окружающая капсид, является обычным элементов вирусов животных и человека, в тоже время у вирусов растений она встречается редко. У ряда вирусов оболочка происходит из ядерной мембраны или мембраны телец Гольджи. Многие вирусы имеют еще более сложное строение, чем мы описали выше, хотя они часто составлены из элементов, которые имеют или спиральную или икосаэдрическую симметрию. Хорошо известный пример – «хвостатые» бактериофаги такие, например, как Т4. Головка этих вирусов икосаэдрическая с триангуляционным числом, равным 7. Она, в свою очередь, прикреплена через воротничок к сокращающемуся хвосту, который уже имеет спиральную симметрию. Рекомендуемая литература Основная Гринин А.С., Титов И.Н. Очистка, концентрирование и фракционирование вирусов животных. М.: Колос, 1971. 240 с. Тихоненко Т.И. Методические основы биохимии вирусов. М.: Медицина, 1973. 384 с. Chiu W., Rixon F.J. High resolution structural studies of complex icosahedral viruses: a brief overview // Virus Res. 2002. V. 82, N. 1-2. P. 9-17. Klug A. Architectural design of spherical viruses // Nature. 1983. V. 303. P. 378-379. Milner J.J. Tobacco mosaic virus: The first century // Trends Microbiol. 1998. V. 6, № 12. Р. 466-467. Дополнительная Knight C.A. Chemistry of viruses. New York, Wien: Springer-Verlag, 1975. McKenna R. Atomic structure of single-stranded DNA bacteriophage ØX174 and its functional implications // Nature. 1992. V. 355. P. 137-143. Structural Biology of Virus / Ed. by W.Chiu, R.Mburnett, R.L.Garcea. Oxford: University Press, 1997. Zaccomer B. The remarkable variety of plant RNA virus genomes // J. Gen. Virol. 1995. V. 76. P. 231-247. Глава 3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВИРУСА С КЛЕТКОЙ-ХОЗЯИНОМ 3.1. Типы взаимодействия вируса с клеткой При проникновении вируса в клетку образуется новый биологический комплекс «вирус-клетка». Этот комплекс содержит генетический аппарат клетки и генетический аппарат вируса, функции которых могут переплетаться самым причудливым образом. По сути дела – это «химера», гибрид двух организмов. Несмотря на огромное разнообразие клеток и вирусов, можно выделить несколько основных типов их взаимодействия. • Клетка гибнет. При этом образуется новое поколение вирусных частиц. Такой тип взаимодействия вируса и клетки называется продуктивным, или литическим. Вирусы, вызывающие лизис клеток - хозяев, носят название вирулентных. Так протекает большинство вирусных инфекций независимо от того, являются ли вирусы крупнымы и сложно устроенными (например, вирусы герпеса, оспы) или мелкими (ВТМ, аденовирусы). • Инфекционный процесс носит абортивный характер – клетка выживает, вирус не образуется. Иногда погибают оба партнера – и вирус, и клетка. • Возникает интеграция двух геномов, которые сосуществуют более или менее мирно не протяжении многих поколений. Такой тип взаимодействия носит наименование вирогении. Вирусы, способные вызывать вирогению, называются умеренными. В случае бактериофагов, такое встраивание генома вируса в ДНК клеткихозяина носит наименование лизогенией, а сами фаги, способные к такому взаимодействию с клеткой, именуются лизогенными. Кроме лизогенных фагов (фаг λ, например) интегративный процесс характерен для ретровирусов, многих ДНК-содержащих онкогенных вирусов (у них может происходить интеграция не только всего генома, но и его части), а также некоторых других вирусов (например, гепаднавирусов). Интегративный процесс часто приводит к трансформации клетки – приобретению ею новых гено- и фенотипических признаков. Типы вирусных инфекций. В зависимости от степени антагонизма двух геномов: вирусного и клеточного – возможны несколько типов инфекции. Феноменологически различают персистентные инфекции, при которых вирус выделяется из организма-хозяина в течение значительно большего времени, чем при обычных литических инфекциях, завершающихся гибелью клеток-хозяев. При латентной инфекции вирус находится в организме хозяина в скрытой форме и выделяется в периоды рецидивов болезни. Медленные вирусные инфекции характеризуются очень длительным инкубационным периодом, который может длиться годами. 3.2. Общая характеристика продуктивного процесса Циклы репродукции всех вирусов имеют общие черты (рис. 3.1). В течение некоторого времени после заражения клетки в ней практически не удается обнаружить вирусных частиц. Этот период известен как фаза эклипса (затмения). В это время вирусная частица находится в клетке в дезинтегрированном состоянии. Период эклипса найден у всех без исключения вирусов, и его наличие в настоящее время рассматривается как один из критериев для отнесения того или иного биологического объекта к вирусам. Рис. 3.1. Кривые, демонстрирующие цикл размножения бактериофага Т1 в клетках E. coli. За периодом эклипса следует периода созревания - интервал, в течение которого вирионы потомства накапливаются внутри клетки с экспоненциальной скоростью. Фаза созревания завершается выходом потомства из клетки, что знаменует собой окончание т.н. латентного (инкубационного) периода – минимального промежутка времени, в течение которого вирусные частицы отсутствуют в окружающей клетку среде. Цикл репродукции вирусов варьирует от 30-40 мин (у многих бактериофагов) до более чем 40 ч (герпесвирусы). При этом урожай вирионов широко варьирует и иногда достигает 100 000 частиц в расчете на одну клетку (вирус полиомиелита). 3.3. Этапы взаимодействия вируса с клеткой-хозяином Чтобы заразить клетку, вирион должен связаться с ней, затем проникнуть сквозь клеточную поверхность и, наконец, «раздеться» до такой степени, чтобы его геном приобрел доступность для ферментов, обеспечивающих транскрипцию и репликацию генома. Цикл репликации вирусов можно разложить на ряд стадий, как это проиллюстрировано на рис. 3.2. Рис. 3.2. Основные этапы репродукции вирусов. Следует подчеркнуть, что приведенное деление на стадии - чисто произвольное, используемое для удобства изложения. Причем на рисунке отражена репликация «типичного», т.е. по сути дела несуществующего вируса. Не все представленные на схеме стадии в реальном инфекционном процессе можно различить как отдельные этапы репликации. У большинства вирусов они накладываются друг на друга во времени, а иногда даже протекают одновременно. Некоторые из стадий репликации изучены досконально, о других известно мало, а ряд стадий остаются вообще пока умозрительными. 3.3.1. Прикрепление вируса к клетке Прикрепление (адсорбция) вируса представляет собой специфическое связывание вирионного белка (антирецептора) с молекулой клеточного рецептора. В настоящее время известно много примеров вирусных антирецепторов. Классическим примером антирецептора является гемагглютинин вируса гриппа. Некоторые сложные вирусы (в т.ч. поксвирусы, герпесвирусы) используют более чем один рецептор. Подавляющее большинство рецепторов и все антирецепторы, идентифицированные к настоящему времени, относятся по своей химической природе к гликопротеидам. С рядом проблем на стадии проникновения в клетку сталкиваются вирусы растений. Причем, дело не только в том, что снаружи растения покрыты несколькими слоями воска и пектина. Более важным является то, что каждая клетка окружена толстой стенкой из целлюлозы. Пока не известны растительные вирусы, которые бы использовали для прикрепления к клетке какие-либо специфические клеточные рецепторы наподобие тех, что используют фаги или вирусы животных. Ясно, что вирусы растений могут попасть в клетку-хозяина только при нарушении целостности клеточной стенки. Такое нарушение стенки имеет место или при механическом повреждении клеток или в результате воздействия на растения насекомыхпереносчиков. Вирус адсорбируется на клетке вначале обратимым образом и может быть элюирован с нее. Затем адсорбция принимает необратимый характер, что связано с изменением как вируса, так и клетки. Следует отметить, что чувствительность клетки (т.е. ее восприимчивость к тому или иному вирусу) определяется наличием рецепторов, однако восприимчивость клеток не следует путать с пермессивностью. Так, клетки кур не восприимчивы к вирусу полиомиелита, поскольку у них отсутствуют рецепторы для связывания вирионов. Однако они способны продуцировать полноценные вирионы после заражения их интактной РНК, изолированной из вирусных частиц, т.е. являются полностью пермиссивными в отношении этого вируса. Одним из хорошо изученных примеров вирус-рецепторного взаимодействия является адсорбция на клетке вируса гриппа. Белок гемагглютенин образует один из двух типов гликопротеидных шипов на поверхности вирусной частицы. Второй тип шипов формирует белок – нейраминидаза. Каждый гемагглютениновый шип состоит из трех молекул, в то время как нейраминидазный шип является тетрамером. Гемагглютениновые шипы отвечают за связывание вируса с рецепторами, которые представляют собой сиаловые (N-ацетилнейраминовые) кислоты – углеводные группы, обычно входящие в состав большинства гликозилированных белков. Из-за сравнительно низкой специфичности такого взаимодействия, вирусы гриппа (кроме клеток, в которых может иметь место продуктивная инфекция), способны связываться с клетками самых разнообразных типов (в т.ч. с эритроцитами, вызывая их агглютинацию). Нейраминидаза является эстеразой, которая отщепляет сиаловую кислоту от углеводной цепи. Это очень важно для вируса гриппа. Поскольку рецепторы для этого вируса широко распространены, вирус часто присоединяется к неподходящим клеткам и даже к их обломкам. Для того, чтобы десорбироваться с таких неподходящих клеток, вирус гриппа способен отделяться от рецепторов в результате отщепления нейраминовой кислоты от полисахаридной части рецепторной молекулы. В большинстве случаев наличие (или отсутствие) рецепторов на поверхности клетки определяет т.н. тропизм вируса, т.е. тип клеток-хозяев, в которых вирус способен реплицироваться. Гораздо реже такую роль играет блокирование репликации на ее более поздних стадиях. Другими словами, самая первоначальная стадия взаимодействия между вирусом и клеткой имеет важнейшее влияние на вирусный патогенез и определяет судьбу вирусной инфекции. 3.3.2. Проникновение вируса в клетку Этот процесс следует за этапом связывания вируса с рецепторами клетки и протекает сравнительно быстро. В отличие от предыдущей стадии процесс проникновения обычно требует затрат энергии. Считается, что проникновение происходит в результате одного из следующих событий: • транслокации вируса целиком через клеточную мембрану (рис. 3.3). Такой способ вирусы использую редко и он еще плохо изучен. Процесс опосредуется белками, находящимися в составе вирусного капсида, и специфическими мембранными рецепторами; • виропексиса (рецепторного эндоцитоза), в результате которого вирус накапливается в цитоплазматических вакуолях (рис. 3.4). По всей вероятности, это наиболее обычный способ проникновения вирусов в клетки. Процесс эндоцитоза подобен фагоцитозу, т.е. заглатыванию чужеродных частиц клеткой. Он не требует участия каких-либо специальных вирусных белков, кроме антирецепторов. Эндоцитарные вакуоли могут перемещаться внутри клетки, перенося находящиеся в ней вирусы вплоть до ядра; Рис. 3.3. Транслокация вириона через клеточную мембрану с помощью рецептора на поверхности клетки. Рис. 3.4. Проникновение вируса в клетку путем эндоцитоза. • слияния оболочки вириона с клеточной мембраной (рис. 3.5). Этот процесс происходит или непосредственно на поверхности клетки или следует за эндоцитозом в цитоплазматической вакуоле и требует наличия в составе вирусной оболочки специфического белка слияния. Под действием этого белка происходит слияние вирусной оболочки с мембраной клетки или вакуоли, в результате чего вирусная оболочка и встроенные в нее белки становятся частью клеточной мембраны (или мембраны вакуоли), а капсид, содержащий генетический материал, проникает в цитоплазму и вызывает инфекцию. Рис. 3.5. Проникновение ВИЧ в клетку путем слияния мембран. С помощью первых двух способов проникают в клетку простые вирусы. Сложные вирусы используют варианты третьего механизма. При этом миксовирусы и герпесвирусы служат примерами вирусов, проникающих в клетки путем слияния их оболочек с плазматической мембраной клетки, т.е. минуя стадию эндоцитоза. Особый механизм введения своего генома в клетку бактерий обнаружен у Т-четных фагов, хозяивами которых являются клетки E. сoli. В результате взаимодействия вириона с клеточными рецепторами происходит обнажение фермента – лизоцима, который до того был экранирован. Лизоцим вызывает разрушение самого прочного, внутреннего слоя клеточной стенки, состоящего из мукопептидов. На следующей стадии чехол отростка, прикрепленный к клеточной стенке, сокращается, что приводит к проколу стенки и клеточной мембраны стержнем отростка. Механизм сокращения чехла сходен с механизмом сокращения мышечного белка – актина. Сократительные белки фагов обладают АТФ-азной активностью и в этом отношении также напоминают мышечные белки. Чехлы отростка содержат АТФ, которая, как известно, является источником энергии при мышечном сокращении. На заключительном этапе процесса фаговая ДНК инъецируется внутрь клетки. При этом цепь ДНК перемещается из головки внутри полости отростка, наподобие тому, как жидкость выдавливается из шприца через иглу. Характерно, что выход ДНК происходит также и при контакте фагов с изолированными клеточными рецепторами. Отсюда следует, что в процессе инъекции фаговой ДНК клетка не принимает никакого участия. 3.3.3. Раздевание вируса Раздевание – обобщенное наименование событий, которые происходят после проникновения вируса в клетку и завершаются полным (или частичным) разрушением вирусного капсида и появлением в цитоплазме вирусного генома в форме, способной к экспрессии. К сожалению, раздевание является стадией репликации вирусов, которая пока остается наименее изученной. В определенном смысле удаление вирусной оболочки, которое происходит во время слияния вирусной и клеточной мембран, уже можно рассматривать как часть процесса раздевания. Слияние вирусной оболочки и эндосомальной мембраны контролируется вирусными белками слияния. Они обычно активируются под действием низких уровней рН внутри эндосомы. Следует отметить, что эндоцитоз таит для вирусов определенную опасность, поскольку если он задерживается в эндосоме надолго, то необратимо повреждается лизосомальными ферментами. Чем заканчивается стадия раздевания – зависит от вида вируса. В случае адено- и герпесвирусов клеточные ферменты разрушают капсид до ДНК или комплекса ДНК с основным (нуклеокапсидным) белком. У реовирусов удаляется только часть капсида, что не мешает однако вирусному геному экспрессировать все свои функции. Поксвирусы раздеваются в две стадии: вначале ферменты клетки-хозяина удаляют наружное покрытие, а на второй стадии для окончательного освобождения вирусной ДНК требуется участие уже вновь синтезированных вирусных ферментов. 3.3.4. Стратегия репликации генома и экспрессия генов Важной особенностью вирусов, отличающей их от других организмов, является то, что компоненты вируса синтезируются в клетке раздельно, а затем соединяются в зрелую вирусную частицу. Такой способ размножения носит название дизъюнктивного. Ключевым моментом в репликации вирусов является использование для синтеза вирусных белков клеточной белоксинтезирующей системы. При этом основной сложностью является то, что в клетке – ни в ядре, ни в цитоплазме нет ферментов, необходимых для синтеза мРНК на вирусных РНК (т.е. нет ферментов, обеспечивающих транскрипцию вирусных РНКгеномов). Кроме того, в цитоплазме нет ферментов, способных транскрибировать вирусную ДНК. В связи с этим, клеточную транскриптазу для синтеза вирусных мРНК могут использовать только ДНК-содержащие вирусы, способные проникать в ядро. Все остальные вирусы вынуждены создавать собственные ферменты для синтеза мРНК. Еще одна сложность заключается в том, что белоксинтезирующий аппарат эукариот способен транслировать только моноцистронные мРНК (он не распознает участки инициации внутри молекул мРНК). Как результат, вирусы вынуждены синтезировать либо индивидуальные мРНК для каждого гена (моноцистронные мРНК), либо мРНК, кодирующие большой полипротеин, который затем расщепляется на отдельные белки. Стратегия любого вируса после проникновения в клетку направлена на синтез собственных белков (транскрипция и трансляция) и дочерних вирусных геномов (репликация). Способ решения этих задач зависит от природы вирусного генетического аппарата. В этом отношении все вирусы можно разделить на семь групп. Такая классификация была предложена Дэвидом Балтимором в 1971 г. Схематическое представление основных событий, происходящих во время репликации различных вирусных геномов, дано на рис. 3.6-3.12. Группа I. (Двухцепочечная ДНК). Группу составляют вирусы инфицирующие: бактерии (напр. Podoviridae, фаги E. coli); высших животных (Pox-, Herpes-, Adeno-, Papovaviridae); насекомых (Baculo-, Irido- и Polydnaviridae); эукариотические водоросли (Phycodnaviridae); грибы. Эти вирусы обладают: кольцевыми геномами (Papova-, Baculo-, и Polydnaviridae); линейными геномами (Adeno- и Herpesviridae, некоторые фаги); циркулярно пермутированными линейными геномами (фаги Т4, некоторые представители сем. Iridiviridae); линейными геномами с ковалентно замкнутыми концами (Pox-и Phycodnaviridae). Все вирусы, кроме входящих в сем. Polydnaviridae, имеют однокомпонентные геномы; у представителей последнего семейства геном фрагментирован. Репликация геномов во всех случаях полуконсервативна. Вирусы эукариот размножаются в большинстве случаев в ядре, используя клеточные ферменты (рис. 3.6). Рис. 3.6. Схема размножения вирусов, обладающих двухцепочечной геномной ДНК. Однако, репликация поксвирусов, некоторых бакуловирусов и иридовтрусов имеет место в вируспецифических «тельцах включения» в цитоплазме. Эти вирусы имеют все необходимые факторы для репликации и транскрипции и поэтому почти не зависят от клеточных ферментов. Транскрипция вирусного генома носит каскадный характер, т.е. происходит в несколько последовательных раундов с образованием т.н. сверхранних, ранних и поздних белков. Группа II. (Одноцепочечная ДНК). Эта группа включает вирусы инфицирующие: бактерии (фаги сем. Inoviridae и Microviridae); млекопитающих (Circoviridae, Papovaviridae); птиц (цирковирусподобные организмы); растения (Geminiviridae, Nonoviridae). Вирусы обладают: линейным однокомпонентным геномом (Papovaviridae); кольцевым однокомпонентным геномом (Microvirida, Inoviridae Circoviridae, некоторые представители сем. Geminiviridae); кольцевым двухкомпонентным геномом (некоторые представители сем. Geminiviridae); кольцевым многокомпонентным (>3) геномом (Nonoviridae). Репликация всех эти вирусов протекает (рис. 3.7) в ядре через образование т.н. «репликативной формы» - репликативного интермедиата, представляющего собой двухцепочечную ДНК, которая образуется вскоре после начала инфекции при участии (почти всегда) клеточных ДНКполимераз. Рис. 3.7. Схема размножения вирусов, обладающих одноцепочечной геномной ДНК. Группа III. (Двухцепочечная РНК). Группа объединяет вирусы инфицирующие: бактерии (Cystoviridae); животных, растения, насекомых (Reoviridae, Partitiviridae); позвоночных и беспозвоночных (Birnaviridae); грибы (Partitiviridae, Totiviridae). Вирусы обладают геномами: однокомпонентным (Totiviridae); двухкомпонентным (Birna-, Cripto- и Partitiviridae); трехкомпонентным (Cystoviridae); многокомпонентным (10-12 сегментов) (Reoviridae). Таким образом, большинство вирусов этой группы имеют сегментированный геном. Все фрагменты генома находятся в составе одной вирусной частицы. Геномы вирусов этой группы реплицируются (см. рис. 3.8) в цитоплазме клетки-хозяина по консервативному механизму с помощью вирионной РНК-зависимой РНК-полимеразы. При этом двухцепочечная РНК транскрибируется в моноцистронные мРНК, которые выполняют две функции. Во-первых, они транслируются, обеспечивая синтез вирусных белков, и, во-вторых, они служат матрицами для синтеза комплементарных дочерних цепей, что ведет к образованию двухцепочечных сегментов генома. Рис. 3.8. Схема размножения вирусов, обладающих двухцепочечной геномной РНК. Группа IV. (Одноцепочечная (+)РНК). Эта группа включает: вирусы, инфицирующие эубактерии (Leviviridae); вирусы насекомых (Noda- и Tetraviridae); вирусы грибов (Barnaviridae); вирусы растений (Bromo-, Como-, Poty-, Sequi- и Tombusviridae); вирусы позвоночных (Astro-, Calici-, Corona-, Flavi-, Picorna- и Togaviridae). Вирусы обладают разнообразными видами геномов. Одноцепочечные геномы свойственны представителям сем. Poty-, Picorna-, Sequi-, Calici-, Toga- Tombusviridae. Двухкомпонентные геномы найдены у вирусов сем. Como-, Noda-Tetra- и Potyviridae. Трехкомпонентные геномы обнаружены у представителей сем. Bromoviridae. Эти вирусы размножаются в цитоплазме и у них имеется несколько вариантов экспрессии генома. В качестве основного варианта рассмотрим репликацию пикорнавирусов. Их геномные РНК выполняют две функции. Во-первых, она функционирует как мРНК – после проникновения в клетку связывается с рибосомами и целиком транслируются, образуя полипротеин. Затем полипротеин с помощью специфических клеточных и вирусных протеаз расщепляется на функциональные белки. Во-вторых, геномная РНК выполняет функцию матрицы для синтеза на ней комплементарной (−)РНК при участии РНК-полимеразы, появляющейся в клетке в результате расщепления полипротеина. При этом образуется репликативный интермедиат, формирующий молекулы дочерних (+)РНК, которые могут, в свою очередь, использоваться в качестве мРНК или включаться в состав вирионов. Такой вариант стратегии репликации иллюстрирует рис. 3.9. Рис. 3.9. Схема размножения вирусов, обладающих геномной одноцепочечной (+)РНК (пикорнавирусы). У тогавирусов реализуется иной вариант стратегии. Сначала транслируется (в виде полипротеина) часть генома, кодирующая синтез неструктурных белков (РНК-полимеразный комплекс), затем синтезируется (−)РНК с образованием репликативного интермедиата. Информация для синтеза структурных белков считывается уже с дочерних (+)цепей РНК. При этом белки синтезируются в виде полипротеинов с последующим протеолитическим нарезанием. Итак главным в репликации вирусов с позитивным геномом является то, что геномная РНК способна служить в клетке в качестве мРНК. Таким образом, вирус имеет возможность сразу же после заражения клетки синтезировать белки, ответственные за репликацию своего генома, и нет необходимости в их внесении в клетку вместе с вирионом. Вот почему «голая» РНК, изолированная из вирионов, инфекционна. Вторая особенность таких вирусов состоит в том, что первичными продуктами трансляции РНК являются нефункциональные полипротеины, которые, подвергаясь специфическому протеолизу, распадаются на функциональные белки. Группа V. (Одноцепочечная (−)РНК). Вирусы этой группы инфицируют: позвоночных (сем. Arena-, Orthomyxo- и Paramyxoviridae), позвоночных и членистоногих (Bunya- и Rhabdoviridae), растения и членистоногих (Bunya- и Rhabdoviridae). В вирионах представителей сем. Filo-, Paramyxo -, Rhabdoviridae найдены односегментные геномы. Фрагментированные геномы обнаружены у вирусов сем. Bunya- и Orthomyxoviridae. Вирусы этой группы считаются эволюционно молодыми, так как встречаются только в членистоногих и позвоночных. Свойство инфицировать растения возникло на сравнительно позднем этапе эволюции как результат тесных взаимоотношений насекомых с их растениями-хозяевами. Для вирусов с геномной одноцепочечной негативной РНК (рис. 3.10) характерно то, что геномная РНК выполняет две матричные функции. Рис. 3.10. Схема размножения вирусов, обладающих геномной одноцепочечной (-)РНК. Во-первых, она используется для транскрипции и, во-вторых, - для репликации. В связи с тем, что для синтеза мРНК должна транскрибироваться вирусная РНК, а в клетке-хозяине соответствующего фермента нет, все вирусы с негативным геномом содержат в вирионе собственную РНК-зависимую РНК-полимеразу (транскриптазу). Первым событием после проникновения вируса в клетку является транскрипция в цитоплазме вирусного генома, в результате чего накапливаются моноцистронные мРНК, каждая из которых кодирует один белок. Новосинтезированные вирусные белки, в свою очередь, начинают репликацию родительской РНК. Они катализируют образование полноразмерной (+)РНК, которая служит матрицей для синтеза на ней геномной (−)РНК потомства. Итак, главное в репликации вирусов с негативной геномной РНК заключается в том, что она функцинирует как матрица и для транскрипции, и для репликации. Отсюда следует, что: а) вирус должен вносить в клетку при заражении транскриптазу, б) «голая» РНК, изолированная из вирионов, неинфекционна и в) синтезируемые мРНК имеют длину одного гена, т.е. они кодируют один белок. Группа VI. (Одноцепочечная (+)РНК, имеющая в репликативном цикле ДНК в качестве интермедиата). Вирусы этой группы инфицируют только позвоночных и представлены единственным семейством Retroviridae. Важнейшие представители: мышиный вирус рака молочной железы, вирус лейкоза мышей (вирус Молони), вирус лейкоза обезьян, Т-лимфотропный вирус человека. Геном вирусов – монолитный. Его уникальность среди вирусов заключается в том, что он диплоидный (представлен димерной одноцепочечной РНК). Единственная известная функция геномной РНК – матричная функция для синтеза ДНК. Поскольку клетки-хозяева не имеют для этого соответствующего фермента, вирус кроме генома содержит еще и РНКзависимую ДНК-полимеразу (обратную транскриптазу), а также смесь тРНК хозяина, которые служат в качестве затравки. Следует отметить, что в русскоязычной литературе принят для обратной транскриптазы также термин «ревертаза». В цикле репродукции вирусов (рис. 3.11) можно выделить ряд основных стадий. • Синтез в цитоплазме ДНК-копии, комплементарной по отношению к РНК. Эта стадия завершается образованием кольцевой одноцепочечной молекулы ДНК, связанной водородными связями с линейной геномной РНК. • Расщепление геномной РНК нуклеазой, атакующей только РНК в составе гибридов ДНК/РНК (РНКазой-Н, также содержащейся в вирионе). • Синтез комплементарной копии вирусной ДНК. Эта стадия осуществляется при участии вирионной ДНК-зависимой ДНКполимеразы. • Перемещение кольцевой двухцепочечной вирусной ДНК из цитоплазмы в ядро, где она (благодаря действию вирионной интегразы) ковалентно интегрирует с геномом клетки-хозяина. • После интеграции в геном хозяина вирусная ДНК (провирус) попадает под контроль клетки и транскрибируется транскриптазой клеткихозяина точно также, как другие клеточные гены. Продуктом транскрипции является молекула мРНК, равная по длине геномной РНК. Эта РНК транслируется для синтеза (через стадию образования и протеолиза полипротеинов) структурных белков и ферментов, а также используется в качестве геномов дочерних популяций. • Самосборка вирусных нуклеопротеидов происходит в цитоплазме, а созревание вирусных частиц происходит на клеточной оболочке, откуда они отделяются почкованием. При этом нуклеопротеид обволакивается клеточной мембраной, содержащей предварительно встроенные туда вирусные белки. Рис. 3.11. Цикл репродукции вирусов 6-ой группы Балтимора. В дополнение к описанной выше стратегии размножения ретровирусов следует отметить два важных обстоятельства. Прежде всего, все ферментативные активности, фигурирующие в описании репликационного цикла, начиная с обратной транскрипции геномной РНК и включая интеграцию вирусной ДНК в геном клетки-хозяина, являются проявлением единого, трудноразделимого вирусспецифического интегразного комплекса, который присутствует в каждом вирионе и вводится в клетку вместе с вирусным геномом. И далее, экспрессия вирусных генов в составе провируса не обязательна. В течение долгого времени провирус может ничем себя не проявлять и передаваться «вертикальным» образом потомкам клеткихозяина. Группа VII. (Двухцепочечная ДНК, имеющая в репликативном цикле РНК в качестве интермедиата). Этот класс вирусов включает сложные вирусы, содержащие в составе вириона кольцевые двухцепочечные ДНК (обычно с брешью или разрывами цепи), которые реплицируются с образованием одноцепочечных РНК-интермедиатов. Эти вирусы инфицируют: позвоночных (сем. Hepadnaviridae) и растения (роды Caulimoviruses и Badnaviruses). Геномы вирусов представлены: частично двухцепочечной не замкнутой ковалентно кольцевой ДНК (Hepadnaviridae); кольцевой двухцепочечной ДНК с разрывами в обеих цепях (Caulimoviruses и Badnaviruses). Все эти вирусы, по-видимому, эволюционно произошли от того же предка, что и вирусы сем. Retroviridae. По этой причине некоторые исследователи предлагают все вирусы седьмой группы объединить в сем. “Pararetroviridae“. Экспрессия геномов этих вирусов сложна и сравнительно слабо изучена. Гепадновирусы имеют несколько перекрывающихся рамок считывания, что позволяет кодировать большой объем информации, используя относительно компактный геном. После этапа раздевания ДНК и вирионная полимераза мигрируют в ядро клетки-хозяина, где ДНК (см. рис. 3.12) достраивается с помощью ДНКполимеразы и превращается в сверхспирализованную молекулу. Эта молекула транскрибируется с образованием молекул (+)РНК двух типов – небольших мРНК, кодирующих белки, и полноразмерной геномной РНК, которую затем транскрибирует обратная транскриптаза, синтезируя геномную ДНК. Репликация генома включает ряд последовательных процессов. Сначала прегеномная (+)РНК инкапсулируется в сердцевину вириона, содержащую полимеразу, где фермент, действуя как обратная транскриптаза, синтезирует (−)ДНК. Затем эта цепь ДНК используется как матрица для синтеза (+)цепи ДНК, однако процесс носит незавершенный характер и заканчивается образованием двухцепочечной молекулы ДНК с неполной (+)цепью. Одновременно с реализацией сложного репликативного цикла вирусная ДНК может нтегрироваться в геном клетки. Этот процесс не обязателен, но если он имеет место, то ДНК вируса расщепляется на много фрагментов и встраивается в различные участки клеточной ДНК. При этом доступными для транскрипции оказываются лишь некоторые фрагменты вирусной ДНК. Рис. 3.12. Цикл репродукции вирусов 7-ой группы Балтимора. Следует отметить, что достройка неполной цепи вирионной ДНК, синтез прегеномной РНК, обратная транскрипция этой РНК, разрушение РНК-матрицы и синтез неполной второй цепи вирусной ДНК – все эти процессы осуществляются единым вирусным полимеразным комплексом. Таким образом, несмотря на некоторое сходство процессов обратной транскрипции у гепадна вирусов и ретровирусов, их не объединяют в одно семейство, поскольку у ретровирусов репликативным интермедиатом является не РНК, а ДНК. Кроме того, у ретровирусов в ДНК клетки-хозяина интегрирует целый геном, а у гепаднавирусов – его фрагменты. При этом у ретровирусов экспрессируется весь провирусный геном, а у гепадновирусов – только некоторые его области. К тому же интеграция ДНК у последних вообще не обязательна. Экспрессия вирусных генов. Сегментированные вирусные геномы обычно транскрибируются с образованием моноцистронных мРНК. Преимущество таких мРНК заключается в том, что разные белки могут синтезироваться в различных количествах. При экспрессии несегментированных геномов существует тенденция к продукции полицистронных мРНК. Эти мРНК транслируются с образованием полипротеинов, которые затем расщепляются на зрелые (функционально активные) белковые продукты. Для того чтобы использовать клеточную машинерию, вирусные мРНК на уровне первичной, вторичной или третичной структур должны нести определенные информационные сигналы, которые распознаются клеткой (например, сайты связывания рибосом, полиаденилатные последовательности и т.д.). Сходным образом некоторые ДНК-содержащие вирусы (например, паповавирусы) кодируют белки, которые связываются с «ориджин» для репликации и стимулируют клеточную ДНК-полимеразу реплицировать именно вирусный геном. Известны вирусы (среди них - аденовирусы, например), которые кодируют свои собственные ДНК-полимеразы, но остаются зависимыми от некоторых клеточных факторов, необходимых для репликации. Сложные вирусы, напр., герпесвирусы, кодируют большое число белков, вовлекаемых в процесс синтеза ДНК, и почти не зависят от клеточной машинерии. 3.3.5. Сборка вирионов Под сборкой понимают сбор всех компонентов, необходимых для формирования зрелого вириона в определенном месте клетки. Во время этого процесса формируются основные структуры вируса. Место сборки варьирует у разных вирусов. Например, пикорна-, покс- и реовирусы собираются в цитоплазме, адено-, папова- и парвовирусы - в ядре. Место сборки ретровирусов - на внутренней поверхности клеточной мембраны. Не смотря на усиленное изучение этой стадии вирусного репликационного цикла, не понятно еще как осуществляется регуляция этого процесса. В общих чертах, считается, что увеличение внутриклеточного уровня вирусных белков и нуклеиновых кислот до какого-то критического уровня включает процесс сборки. Многие вирусы достигают высоких концентраций вновь синтезированных структурных компонентов путем концентрирования их в особых внутриклеточных компартментах, видимых в световой микроскоп, которые называют «тельцами включения». Появление таких телец – обычное явление на поздних стадиях инфекции многих вирусов. Размеры и локализация таких телец часто являются весьма характерным признаком некоторых вирусов. Например, инфекция вирусом бешенства приводит к появлению больших внутриядерных «телец Негри», которые впервые наблюдала Адель Негри в 1903 г. Формирование вирусных частиц может быть относительно простым процессом, в котором участвуют только субъединицы капсида и нуклеиновые кислоты и который контролируется только законами симметрии. В других случаях, сборка представляет собой весьма сложный многостадийный процесс, в котором участвуют не только структурные белки, но и особые вирусспецифические белки, служащие матрицами для сборки вирусов. Формирование нуклеокапсида может происходить на ранних стадиях сборки капсида (например, многие вирусы со спиральной симметрией «собираются» на геноме), или на поздних стадиях, когда геном комплексируется с уже почти готовым капсидом. Некоторые вирусы синтезируют морфогенетические факоры, которые не являются структурной частью вируса, но присутствие которых требуется для нормальной сборки. Эти факторы называют молекулярными шаперонами. Следует отметить, что иногда в процессах сборки вирусов принимают участие и шапероны клетки. 3.3.6. Созревание и выход вирионов из клетки На этой стадии жизненного цикла вирус приобретает инфекционность. Она обычно сопровождается структурными изменениями частицы в результате специфического расщепления определенных полипротеиновпредшественников зрелых структурных белков. Для одних вирусов сборка и созревание неразделимы, в то время как для других созревание может происходить после того, как вирусная частица покинула клетку. Для литических вирусов (в основном простые вирусы) выход из клетки является сравнительно простым процессом: клетка разрушается, освобождая при этом вирус. Сложные вирусы при выходе из клетки путем отпочковывания приобретают липидную оболочку. Такой способ выхода вируса из клетки не всегда приводит ее к гибели. 3.4. Система интерферона У организма-хозяина имеется ряд защитных механизмов от вирусных инфекций. Наиболее важным ответом организма позвоночных на вирусную атаку является активация гуморального и клеточного разделов иммунной системы. Гуморальный иммунный ответ находит свое выражение в продукции противовирусных антител. Главный результат активности антител – очистка сыворотки крови от вирусных частиц, что предотвращает передвижение вируса к неинфицированным клеткам и снижает нагрузку на другие защитные механизмы организма. Прямая нейтрализация вирусов антителами достигается целым рядом способов, включающих: конформационное изменение капсида, вызванного присоединением антител, блокировку антирецепторов и т.д. Вторичным следствием связывания вируса с антителами является фагоцитоз покрытых антителами («опсонизированных») молекул-мишеней моноядерными клетками или полиморфноядерными лейкоцитами. Связывание антител с вирионами приводит также к активации системы комплемента, которая также способствует нейтрализации вирусных частиц. Участие системы комплемента имеет особо важное значение на ранних стадиях инфекции, когда еще в организме синтезируются ограниченные количества низкоаффинных антител. Как предполагают, в борьбе с вирусными инфекциями более эффективен, в сравнении с гуморальным, клеточный тип иммунитета. Это предположение вытекает из следующих наблюдений. - Врожденные дефекты клеточного иммунитета проявляются в предрасположенности в первую очередь к вирусным инфекциям (и в гораздо меньшей степени – к бактериальным). - В случае СПИДа происходит снижение соотношения числа клеток Тхелперов (CD4+) к числу клеток Т-супрессоров (CD8+) с 1,2 (нормальный уровень) до 0,2. При этом практически все больные начинают страдать от различных оппортунистических вирусных инфекций (вызванных, например, вирусами простого герпеса, цитомегаловирусами, вирусом Епштейна-Барр), которые присутствовали и до развития СПИДа, но были тогда подавлены интактной иммунной системой. Клеточно-опосредованный иммунитет находит свое выражение в уничтожении (лизисе) вирус-инфицированных клеток с участием т.н. NKклеток (естественных киллеров) и ЦТЛ (цитотоксических лимфоцитов). Другим, и по-видимому, более важным фактором защиты организма– хозяина от вирусных инфекций является продукция им интерферона. Действительно, клеточный и особенно гуморальный иммунные ответы – слишком медленные, чтобы защитить организм от быстро реплицирующихся вирусов, особенно в том случае, когда не было предварительного контакта его с вирусом. В этом отношении более мобильной является система интерферона. В 1957 г. английский вирусолог А.Айзекс совместно со своим стажером из Швейцарии (Д.Линденманн) обнаружил, что заражение некоторых клеток вирусом делает ее и соседние с ней клетки менее восприимчивыми к последующему заражению тем же или другим вирусом. Затем было установлено, что это явление связано с образованием в зараженной клетке особого вещества белковой природы – интерферона. В настоящее время известно, что интерфероны относятся к важнейшим факторам неспецифической резистентности клетки и организма. Общепринято следующее определение: интерфероны – это гетерогенный класс гормоноподобных белков, которые продуцируются клетками позвоночных (от рыб до человека включительно) в ответ на вирусную инфекцию или воздействие различных агентов (индукторов) и осуществляют в организме функции, направленные на сохранение гомеостаза. Несмотря на такой обобщенный характер определения, оно указывает на два кардинальных свойства интерферонов, а именно: интерфероны – это биологически активные белки, и для образования их в клетке необходима специальная индукция. Когда вирус инфицирует клетку, это вызывает ответную защитную реакцию в форме синтеза интерферона. О значении интерферона свидетельствует тот факт, что у экспериментальный животных, которым после заражения вирусами вводят антисыворотку против интерферона, вирусные инфекции протекают гораздо тяжелее, чем у контрольных животных, инфицированных теми же вирусами. Система интерферона включает в себя три взаимосвязанных звена: индукцию, продукцию и действие. Индукция интерферона может осуществляться многочисленными природными и синтетическими веществами, которые, в свою очередь, подразделяют на высоко- и низкомолекулярные индукторы. В настоящее время известны сотни таких индукторов. Индукторами интерферона являются: метилированный альбумин, гистоны, некоторые гормоны, антибиотики, и т.д. Наиболее активные индукторы – двухцепочечные природные и синтетические полирибонуклеотиды. Характерно, что синтез интерферона способны стимулировать не только инфекционные, но нередко и инактивированные вирусы. Наибольший индуцирующий эффект проявляют вирусы с медленным репликативным циклом, например, парамиксо- и альфавирусы. Слабыми индукторами являются вирусы, выраженно блокирующие синтез клеточных мРНК и протеинов, например, герпес- и аденовирусы. В отсутствии индукторов клеточные гены, кодирующие синтез интерферонов, обычно не экспрессируются. Предполагается, что в результате взаимодействия индуктора с цитоплазматической мембраной происходит дерепрессия генов интерферона согласно модели репрессии-дерепрессии Жакоба и Моно, разработанной для синтеза индуцибельных ферментов у бактерий. Непременное условие для запуска синтеза интерферонов – сохранение способности клеткой к синтезу белка вообще. При этом похоже, что прямого взаимодействия индукторов с репрессорами интерфероновых генов нет, поскольку показано, что, например, высокомолекулярные индукторы (а также иммобилизованные низкомолекулярные) в клетки не проникают. Продукция интерферона. Образующаяся в результате транскрипции генов интерферона мРНК транслируется клеточной белоксинтезирующей системой. После соответствующего процессинга интерферон секретируется в окружающую среду. Интерфероны подразделяются на три антигенных типа: α, β и γ. Интерферон-α (или лейкоцитарный интерферон) продуцируется преимущественно лейкоцитами периферической крови. Имеется по крайней мере 15 молекулярных видов этого интерферона; некоторые из них отличаются лишь по одной аминокислоте. Все гены (около двадцати), кодирующие интерферон-α, у человека локализуются на 9 хромосоме. Основными индукторами являются вирусы, природные и синтетические полинуклеотиды. Зрелый белок (молекулярная масса 17 000) содержит 143 аминокислоты. Интерферон-β - фибробластный интерферон – продуцируется преимущественно фибробластами при использовании тех же индукторов, которые вызывают синтез интерферона-α. Способность к образованию этого интерферона кодирует единственный ген, также расположенный на 9 хромосоме. Зрелый белок состоит из 145 аминокислот и, в отличие от интерферона-α, гликозилирован. Интерферон-γ (иммунный интерферон) - продукт стимулированных Тлимфоцитов, нормальных киллеров и (возможно) макрофагов. Способность к образованию кодирует один ген 12 хромосомы. Зрелый белок содержит 146 аминокислот и гликозилирован. По первичной структуре имеет очень мало общего с описанными выше интерферонами-α и -β. Этот вид интерферона до сих пор остается наименее изученным. 3.4.1. Основные биологические свойства интерферонов Противовирусная активность (наиболее детально изученное биологическое свойство итерферонов) имеет следующие основные черты: - универсальность. Интерфероны активны против широкого круга как РНК-, так и ДНК-содержащих вирусов; - видоспецифичность. Каждый биологический вид продуцирует свои уникальные белки, порой весьма похожие по структуре и физикохимическим свойствам, но не способные проявлять антивирусное действие в условиях организма другого вида. Другими словами, интерфероны высокоактивны только в гомологичных системах и слабоактивны (или неактивны) в гетерологичных. Так, огромные количества интерферона, выделенного из мышиной ткани, оказываются неспособными защищать от вирусов ткань куриных фибробластов, и наоборот; - последействие. Даже после удаления интерферона в обработанных им клетках сохраняется способность подавлять репродукцию вирусов в течение довольно длительного времени; - внутриклеточная точка приложения. Интерферон не действует непосредственно на вирионы или их нуклеиновые кислоты и активны лишь на вирусы в процессе их репродукции; Развитие индуцируемого интерфероном состояния противовирусной резистентности имеет характерную динамику. Резистентность начинает отмечаться спустя 1,5-2 ч после контакта клетки с интерфероном и достигает максимума к 5-6 ч. При этом достигаемый уровень резистентности зависит от сочетания таких параметров, как концентрация интерферона, время его добавления по отношению к началу вирусной инфекции, множественность заражения и т.д. Интерферон обладает обширным спектром так называемых непротивовирусных эффектов. Из них наиболее важными считаются антипролиферативный, иммуномодуляторный и радиопротекторный. 3.4.2. Механизмы действия интерферона Эксперименты показали, что антивирусным эффектом обладает не проникающий в клетки комплекс интерферона с высокополимерным углеводом – сефарозой. Следовательно, стадия проникновения интерферона в соседнюю клетку для придания ей антивирусного состояния не является необходимой. В настоящее время установлено, что для активирования генов, ответственных за развитие антивирусного состояния, достаточно интерферону адсорбироваться на специальных рецепторах, локализующихся на клеточных мембранах. Как уже отмечалось выше, интерферон не действует на вирионы или выделенную из них РНК, а действует лишь на вегетативную форму вирусов. Причем тот факт, что ингибирующий эффект обнаруживается даже при использовании для заражения клеток инфекционных РНК, служит доказательством тому, что интерферон не затрагивает ранние фазы размножения вирусов – адсорбцию, пенетрацию и раздевание. Многочисленными экспериментами доказано, что основной эффект интерферона заключается в нарушении способности вирусных мРНК транслироваться. К такому результату действия интерферона приводят следующие биохимические события. Интерферон активирует гены, некоторые из которых кодируют образование ферментов с прямым антивирусным действием – РНКактивируемой протеинкиназы (см. рис. 3.13) и 2’,5’-олигоаденилатсинтетазы (см. рис. 3.14). Индуцируемая протеинкиназа обладает способностью фосфорилировать в белках остатки серина и треонина. При связывании с двухцепочечной вирусной РНК она активируется, аутофосфорилируется, а затем фосфорилирует белковый фактор eIF2α. В норме eIF2α в комплексе с ГTФ заставляет мет-тРНК связаться c 40S рибосомальной субъединицей, что инициирует синтез белка. Фосфорилирование фактора инициации трансляции eIF2α приводит его к инактивации, вследствие чего рассматриваемая стадия синтеза белка блокируется. При этом преимущественное подавление трансляции вирусных матриц обусловлено, по-видимому, несколько большей чувствительностью вирусной системы трансляции к фосфорилированию упомянутого фактора. 2’,5’-Олигоаденилатсинтетаза активируется в присутствии двухцепочечной РНК и полимеризует из АТФ семейство олигоаденилатов с общей формулой (2’,5’)рррА(рА)n. В молекулах этих соединений остатки аденозина соединены друг с другом не обычными (3’-5’-, как в РНК), а т.н. изомеризованными, 2’-5’-фосфодиэфирными связями. Структуру важнейшего (наиболее активного) из них - тринуклеотида (2’,5’)рррА(рА)2 (сокращенно 2’-5’А) – можно видеть на рис. 3.15. Образовавшийся 2’-5’А активирует латентную (неактивную) РНКазу-L, присутствующую в клетках, не обработанных интерфероном. Наконец, активированная РНКаза-L разрушает свободные (не связанные с рибосомами) вирусные и клеточные РНК. Таким образом, блокирование стадии инициации трансляции мРНК и разрушение самих мРНК обусловливает универсальный механизм действия интерферона. Следует отметить, что платой за такую универсальность является приостановка в клетке-хозяине биосинтеза белка вообще. С этим, кстати, связан антипролиферативный эффект интерферона. Таким образом, отрицательный эффект действия интерферона имеет и положительную сторону – подавление опухолевого роста. Рис. 3.13. Механизм действия интерферона, опосредованный индукцией протеинкиназы. Рис. 3.14. Механизм действия интерферона, опосредованный индукцией 2’-5’олигоаденилатсинтетазы. NH2 _ O O N O O P O P O P O OH OH OH O N N NH2 N N O HO O P O O O_ N N NH2 N N O HO O P O O N O _ HO N N OH Рис. 3.15. Химическая структура молекулы 2’,5’-олигоаденилата. Следует отметить, что интерферон может воздействовать и на другие стадии вирусной репродукции. Например, в ряде случаев происходит блокирование депротеинизации нуклеокапсида (стадии раздевания вириона) или выхода зрелых вирусных частиц из клетки-хозяина. Далее, α- и β-интерфероны (но не γ-интерферон) активируют один из генов, находящихся на 21 хромосоме человека. Продукт экспрессии этого гена – белок Mx – ингибирует транскрипцию генома вируса гриппа (но не других вирусов!). Точный механизм ингибирования пока не расшифрован. Общепринято, что система интерферона представляет собой один из основных факторов, обусловливающих выздоровление человека от вирусных инфекций. Например, при отсутствии осложнений, больные гриппом выздоравливают обычно спустя три дня. В тоже время иммунитет (даже обусловленный выработкой в организме иммуноглобулинов класса IgM) развивается не ранее чем через четыре-пять дней. Справедливости ради, необходимо отметить, что, несмотря на то, что система интерферона является довольно мощной (причем широко специфичной, и, поэтому, казалось бы надежной) защитной системой клетки, некоторым вирусам удается с легкостью преодолевать этот эшелонированный защитный редут. Среди таких вирусов можно упомянуть вирус осповакцины, который в значительной мере устойчив к действию интерферона. Исследования показали, что эта устойчивость обусловлена тем, что вирус сам способен направлять синтез белка, по первичной структуре гомологичного клеточному белку eIF2α, и таким образом в значительной мере нивелировать действие интерферониндуцированной клеточной протеинкиназы. Реовирусный капсидный белок σ3 экранирует молекулы двухцепочечных РНК, препятствуя активации РНК-активируемой протеинкиназы. При транскрипции ДНК аденовирусов синтезируются две небольшие молекулы РНК, которые не кодируют никакой информации и обладают прочной двухспиральной структурой. Эти короткие РНК так прочно связываются с РНК-активируемой протеинкиназой, что ингибирует ее активность. В цикле репликации вируса Эпштейна-Барр также есть такие короткие РНК, которые защищают вирус от действия интерферона. Рекомендуемая литература Основная Букринская А.Г., Жданов В.М. Молекулярные основы патогенности вирусов. М.: Медицина, 1991. 256 с. Волкова М.А. Основные представления об интерферонах // Гематол. и трансфузиол. 1999. Т. 44, № 4. С. 32-36. Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и патологии. М.: Медицина, 1996. 239 с. Тарасишин Л.А. Взаимодействие рецептор-антирецептор при вирусных инфекциях // Молекул. генет., микробиол. и вирусол. 1997. № 4. С. 12-15. Хаитов Р.М., Пинегин Б.В. Современные представления о защите организма от инфекции // Иммунология. 2000. № 1. С. 61-64. Cann A.J. Principles of molecular virology. San Diego etc.: Academic Press, 1997. 310 p. Mathews M.B. Viruses and the protein synthesis machinery of the cell: offence, defense and dependence // Molecular Aspects of Host-Pathogen Interaction / Ed. by M.A.McCrae, J.R.Saunders, C.J.Smyth, N.D.Stow. Cambridge: University Press, 1997. P. 211-236. Mettenleiter T.C. Brief overview on cellular virus receptor // Virus Res. 2002. V. 82, № 1-2. P. 3-8. Stark G.R., Kerr I.M., Williams B.R. et al. How cells respond to interferons // Annual Rev. Biochem. 1998. V. 67. P. 227-264. Дополнительная Бажан С.И., Белова О.Е. Молекулярно-генетические аспекты индукции и противовирусного действия интерферона // Вестн. РАМН. 1998. № 3. С. 1824. Вирусология в 3-х томах / Под ред. Б.Филдса, Д.Найпа. Перев. с англ. М.: Мир, 1989. Мэтьюз Р. Вирусы растений. Перев. с англ. М.: Мир, 1973. 600 с. Dimitrov D.S. How do viruses enter cells? The HIV coreceptors teach us a lesson of complexity / Cell. 1997. V. 91, № 6. P. 721-730. Schneider-Schanlies J. Cellular receptors for viruses: links to tropism and pathogenesis // J. Gen. Virol.-2000.-V. 81, № 6.-P. 1413-1429. Whittaker G.R., Kann M., Helenius A. Viral entry into the nucleus // Annual Rev. Cell and Development. Biology.-2000.-V. 16.-P. 627-651. Глава 4. ВИРУСОПОДОБНЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ АГЕНТЫ Могут ли существовать вирусы с геномами размером в 240 нуклеотидов? А может ли существовать инфекционные агенты вообще без генома? Если первое еще можно себе представить, то гипотеза о существовании инфекционных агентов без генома вроде бы подрывает основы основ молекулярной биологии. Как это ни странно, и те и другие агенты существуют и вызывают заболевания растений, животных и человека. В последние годы все чаще говорят о сателлитах, вироидах и прионах. Это необычные инфекционные агенты, которые характеризуются тем, что обладают очень маленьким геномом, а в случае прионов – не обладают им вообще. 4.1. Сателлиты и вироиды Сателлиты (сателлитные вирусы, сателлитные РНК) - это маленькие молекулы РНК, которые абсолютно нуждаются для своего размножения в присутствии в клетке вируса, выступающего в качестве вируса-помощника. Таким образом, даже вирусы имеют своих паразитов. Большинство сателлитов ассоциированы с вирусами растений, но некоторые из них ассоциированы с бактериофагами или вирусами животных. Примером последних могут служить т.н. аденоассоциированные вирусы, которые, как следует из названия, сопутствуют аденовирусам. Типичные свойства сателлитов: - геном сателлитов (одноцепочечная РНК) имеет размер около 5002000 нуклеотидов; - они вызывают специфические проявления заболеваний у растений, которые не обнаруживаются при инфекции тех же хозяев только вирусами-помощниками; - геномы сателлитов по первичной структуре не похожи на геномы вирусов-помощников. Вироиды – это очень маленькие (200-400 нуклеотидов) палочкообразные молекулы РНК, которые обладают характерной вторичной структурой (рис. 4.1). Рис. 4.1. Схематическая структура молекулы вироидной РНК. Они не имеют капсида и оболочки и состоят только из одной молекулы нуклеиновой кислоты. Вироиды вызывают заболевания растений и отличаются от сателлитов по ряду характеристик (табл. 4.1). Таблица 4.1. Характеристика сателлитов и вироидов Характеристика Для репликации необходим вирус-помощник Геном кодирует белки Геном реплицируется при помощи: Место репликации Сателлиты Вироиды Да Нет Да Нет ферментов вирусапомощника То же, что и вируса-помощника РНК-полимеразы клетки-хозяина Ядро Первым открытым и наиболее изученным вироидом является вироид, вызывающий веретеновидность клубней картофеля. Вироиды не кодируют никаких белков и реплицируются при помощи РНК-полимеразы клеткихозяина. Детали репликации еще до конца не выяснены, но похоже, что она протекает по механизму «катящегося кольца» с последующим аутокаталитическим расщеплением и лигированием. Вироиды различаются по первичной структуре, и это служит основанием для разделения их на те или иные виды. Однако все вироиды несут общую последовательность нуклеотидов, которая расположена в центральной части молекулы и, как полагают, важна для репликации (см. рис. 4.1). Не ясно, как вироиды вызывают симптомы заболеваний, но не вызывает сомнения, что это является результатом нарушения нормального метаболизма клетки. Они демонстрируют несомненное сходство по первичной структуре с некоторыми последовательностями в геноме эукариотической клетки-хозяина, в частности с интроном, расположенным между 5,8S и 25S рРНК. Отсюда, предположено, что вироиды могут нарушать посттранскрипционый процессинг РНК инфицированной клетки. Большинство вироидов передаются от клетки к клетке при вегетативном размножении хозяев, т.е. делении инфицированных растений, хотя некоторые могут распространяться и при помощи насекомыхпереносчиков или механическим путем. Поскольку вироиды не имеют преимущества защитной оболочки, вироидные РНК имеют исключительный риск деградировать во внешней среде. Однако их малый размер и высокий процент вторичной структуры в достаточной степени их защищают; и они способны существовать вне клетки-хозяина в течение достаточно долгого периода чтобы успеть переместиться в другого хозяина. Происхождение вироидов загадочно. По одной из версий, они являются пережитком – примитивным геномом, сохранившимся с тех времен, когда еще не было ДНК. По другой гипотезе, вироиды возникли «совсем недавно» и олицетворяют собой крайнюю степень паразитизма. Похоже, что мы никогда не узнаем, какая из этих альтернатив истинна. Ясно одно – вироиды существуют и вызывают заболевания растений и человека. К уникальным в своем роде агентам следует отнести вирус гепатита дельта (ВГD). Он представляет собой молекулу РНК, обладающую свойствами, как сателлита, так и вироида. ВГD для своей репликации нуждается в вирусе-помощнике, в качестве которого выступает вирус гепатита В (ВГB). Поэтому неудивительно, что ВГD находят только в клетках, инфицированных ВГB. Переносится ВГD тем же путем, что и ВГB, извлекая при этом выгоду из наличия защитной оболочки, состоящей из липида и белка ВГB. Вирусные препараты, полученные из ВГB/ВГDинфицированных клеток, содержат гетерогенные частицы, которые представляют собой капсид ВГB, содержащий ковалентно замкнутую кольцевую РНК ВГD, имеющую форму стержня, характерную для всех вироидов. Однако, в отличие от всех других вироидов, РНК ВГD кодирует белок - δ-антиген, который является фосфопротеином. Считается, что геном ВГD реплицируется путем РНК-зависимого синтеза РНК с использованием ДНК-зависимой РНК-полимеразы. Похоже, что ВГD усугубляет патогенные эффекты инфекции ВГB. Например, скоротечная форма гепатита (летальность около 80%) в 10 раз более обычна в случае смешанной инфекции, по сравнению с моноинфекцией только ВГB. Специфической терапии ВГD не существует, однако, поскольку он требует для репликации присутствия в клетке ВГB, его можно контролировать путем вакцинации против ВГB. 4.2. Прионы Прионы – это инфекционные агенты, которые вызывают трансмиссивные спонгиформные (от «спонги», что в переводе означает губку) энцефалопатии человека и животных. Среди них: скрейпи овец, губчатая энцефалопатия крупного рогатого скота (коровье бешенство), трансмиссивная энцефалопатия норок, болезнь Крейцфельда-Якоба (КБЯ) и куру человека. Для всех этих заболеваний характерно: - накопление в мозгу амилоидоподобных образований; при этом ткань мозга принимает пористую форму наподобие губки; - полное отсутствие воспалительных явлений; У больных наблюдаются деменеции, потеря координации движения, конвульсии конечностей. Патологический процесс протекает медленно, но неизменно заканчивается гибелью пациентов. Средства специфической лекарственной терапии отсутствуют. Скрейпи – болезнь, известная уже несколько столетий. Название происходит от английского слова «scrape» – скоблить, тереть. Дело в том, что больные животные соскребают с себя почти всю шерсть. В 1935 году французские исследователи доказали, что болезнь можно передать от одной овцы к другой путем прививки. Возможность трансмиссии указывало на существование инфекционного агента. Скрейпи оставалось заболеванием, известным лишь ветеринарам, до 1959 года, когда было замечено, что срейпи и куру – родственные болезни. О куру мир узнал двумя годами раньше из работ Гейдушека. Этот исследователь доказал, что заболевание, встречающееся у жителей Новой Гвинеи, связано с ритуальным каннибальским обрядом, который состоял в поедании мозга умерших родственников. Инфекционную природу куру Гейдушек продемонстрировал, сумев передать заболевание от умершего человека обезьяне. Вскоре Гейдушек показал, что обезьянам от человека можно передавать и БКЯ. Сходство проявлений скрейпи, куру, БКЯ и других подобных заболеваний навело исследователей на мысль о родственности этих патологий. Сейчас уже известно, что все эти заболевания могут возникать не только в результате инфекции – описаны спорадические и наследственные их формы. При этом существенно, что независимо от происхождения заболевания, оно может быть передано здоровому реципиенту инфекционным путем. Химическая природа прионов. Прионы не задерживаются бактериальными фильтрами. Это характерный признак вирусов. Однако у прионов гораздо больше таких свойств, которыми вирусы не обладают. Более того, по физическим свойствам они не соответствуют ни одному из известных биологических объектов. • - Прионы устойчивы к тепловой инактивации. Инфекционность не исчезает после прогревания при 90оС в течение 30 мин. Инфекционность падает, но не исчезает совсем даже при автоклавировании (135оС; 18 мин). • - Прионы устойчивы к повреждающему действию коротковолнового УФ-облучения и ионизирующей радиации. Такая обработка вызывает инактивацию всех известных патогенных организмов, поскольку повреждает их геномы. Существует обратная зависимость между размерами молекул ДНК (мишени) и дозой радиоактивности или УФоблучения, необходимой для их инактиваци. Иначе говоря, большие молекулы чувствительны к гораздо меньшим дозам, чем те дозы, которые губительны для маленьких молекул. Эксперименты по облучению агента скрейпи показали, что если он и содержит нуклеиновую кислоту, то она не может быть больше 80 нуклеотидов. • - Прионы устойчивы к ДНКазам, РНКазам и многим другим агентам в условиях, разрушающих нуклеиновые кислоты и все известные вирусы, сателлиты и вироиды. • - Прионы чувствительны к обработке мочевиной, додецилсульфатом натрия, фенолом и другими химическими соединениями, денатурирующими белки. Совокупность приведенных выше свойств (см. также табл. 4.2) указывает на то, что исследуемый агент является скорее белком, чем нуклеиновой кислотой или вирусом. Действительно, единственным компонентом, связанным с инфекционным началом приона, оказался белок и этот белок получил обозначение PrPSc. Биохимическая очистка патогена скрейпи приводит к препаратам, высоко обогащенным белком PrPSc, и, наоборот, по мере очистки препаратов PrPSc увеличивается их инфекционность. Таблица 4.2. Отношение прионов к некоторым химическим соединениям и ферментам Вид обработки Концентрация Действие на агента нуклеиновые кислоты Гидроксиламин 0,1-0,5 мМ + Насыщенный Фенол раствор Додецилсульфат 1-10% натрия (ДСН) Мочевина 3-8 М Ионы цинка 2мМ + (Zn2+) Псорален 10-500 мкг/мл + ДНКаза 100 мкг/мл + 0,1-100 РНКаза-А + мкг/мл Протениназа К 100 мкг/мл Трипсин 100 мкг/мл - Действие на белки Действие на прионы - - + + + + + + - - - - - - + + + + В 1984 г. Прузинер определил последовательность в 15 аминокислот на конце очищенного PrPSc. Это привело к открытию того факта, что все клетки млекопитающих содержат ген (prp), который кодирует белок, идентичный по первичной структуре PrPSc. Этот белок нормальных клеток принято обозначать PrPC. Таким образом, очищенный инфекционный агент оказался белком, первичная структура которого закодирована в геноме хозяина. В отличие от нормальных клеток, инфицированные прионом клетки содержат только PrPSc. При заражении экспериментальных животных прионом, как и в случае других инфекционных агентов, существует зависимость доза-эффект, которая демонстрирует четкую корреляцию между количеством PrPSc в инокулюме и продолжительностью инкубационного периода до развития болезни. Чувствительность того или иного организма к прионовой инфекции определяется наличием гена prp. Мутанты, у которых этот ген отсутствует или поврежден, воспринимать прионовую инфекцию не способны. В настоящее время установлено существование по крайней мере 15 различных штаммов PrPSc (с идентичной первичной структурой этого белка, но различающихся по величине инкубационного периода развития болезни). Прионовая гипотеза является революционной, и закономерно была встречена по началу многими скептически. Хотя свидетельства в ее пользу постоянно накапливаются, есть данные, которые ей противоречат. Например, она очень трудно сочетается с существованием прионовых штаммов. В течение многих лет исследования спонгиоформных энцефалитов тянулись чрезвычайно медленно, потому что каждый эксперимент отнимал по меньшей мере один год. С началом молекулярно-биологических этапа эти исследования превратились быстро прогрессирующую область науки. Однако пока рациональная терапия заболеваний, вызванных прионами (как и заболеваний, вызванных сателлитами и вироидами), не разработана. Привычная стратегия борьбы с вирусными инфекциями, основанная на лекарственных препаратах и вакцинах, не имеет в случае этих необычных агентов никакого эффекта. Ясно, что перед тем как будут найдены способы лечения прионовых патологий, необходимо всестороннее и доскональное изучение химии и биологии прионовых белков. Как же может клеточный белок, безобидный в норме, вызывать болезнь? Никаких химических различий в т.ч. в первичной структуре между РrPSc и прионом не было обнаружено. На основании этих данных было предположено, что фундаментальное отличие между инфекционной формой приона (PrPSc) и непатогенной эндогенной формой (PrPC) скрыто в конформации этих белковых молекул. В настоящее время считается доказанным, что во вторичной структуре C PrP преобладает α-спираль. Прион, напротив, имеет преимущественно складчатую β-структуру. Было предположено, что молекула PrPC, взаимодействуя с прионом, сама превращается в прион (см. рис. 4.2). Это приводит к амплификации приона и исчезновению пула белкапредшественника. Процесс носит характер цепной реакции. Очень редко имеет место спонтанное перерождение молекулы PrPC в прион. В принципе, как следует из рис. 4.3, такая трансформация энергетически выгодна, однако кинетически она сильно затруднена, из-за большого активационного барьера, препятствующего самопроизвольному превращению белка PrPC в белок PrPSc. Вот почему самопроизвольные формы прионовых заболеваний чрезвычайно редки (приблизительно один случай на 1000000 человек). Тем не менее они имеет место и являются, как полагают, следствием соматической мутации в гене рrp. Понятно, что мутация не задевает структурную часть гена, кодирующую первичную структуру белка. Мутация понижает энергию активации на пути перехода PrPC в PrPSc, что делает появление PrPSc в организме статистически вероятным. Рис. 4.2. Молекулярная биология прионов. Уровень свободной энергии Энергия активации PrPC PrPSc Рис. 4.3. Энергетическая схема реакции трансформации белка PrPС в прион. PrPSc; Суммируем факты, которые согласуются с гипотезой приона: - при всех прионовых заболевания наблюдается сверхпродукция белка - животные, которые в результате мутации не способны к образованию в организме белка PrPC, проявляют абсолютную невосприимчивость к прионовой инфекции; - увеличение экспрессии гена рrp, напротив, способствует возникновению заболеваний. Итак, белок-предшественник приона PrPC является нормальным клеточным белком, функция которого пока не известна. В инфекционного агента PrPSc он превращается в результате любого из двух событий: а) при контакте с прионом и б) спонтанно (крайне редко). В обоих случаях при этом происходит только изменение конформации молекулы. Уникальная особенность этих заболеваний состоит в том, что они могут возникать не только в результате инфекции. Известны спорадические и наследственные формы таких патологий. Причем независимо от происхождения заболевания оно может быть передано инфекционным путем. Таким образом, мы как бы имеем дело с самозарождением инфекции. Согласно современным представлениям, прион представляет собой особую изоформу нормального клеточного белка, отличающуюся от него плохой растворимостью и склонностью к агрегации, которая и является причиной образования амилоидов в тканях мозга. Прион, попадая в клетку или спонтанно в ней возникая, способствует путем белок-белковых взаимодействий превращению клеточной формы PrPC в форму PrPSc. В целом процесс трансформации напоминает цепную реакцию. Существование наследственных форм прионовых заболеваний в рамках этой концепции может объясняться повышенной способностью «мутантных» белков к спонтанному превращению в прионовую форму. Все перечисленные факты полностью согласуются с гипотезой о белковом материальном носителе прионовых заболеваний. Животные, лишенные гена prp, не заболевают просто потому, что их клетки не содержат предшественника, способного к конформационной перестройке. При увеличении количеств молекул этого белка должна возрастать вероятность спонтанного перехода какой-либо из молекул в патогенную форму. Пониженная инфекционность чужого приона при межвидовом заражении может объясняться ухудшенной способностью белка PrPSc передавать свое патогенное состояние белку PrPc, несколько отличающемуся от него по первичной структуре. При всей привлекательности гипотезы приона, есть факты и наблюдения, которые с ней пока не согласуются. Например, одно из наиболее удивительных свойств прионов – это существование различных штаммов (при неизменной первичной структуре!). Каждый штамм у генетически однородных (линейных) животных вызывает заболевание, отличающееся по продолжительности инкубационного периода и некоторым другим параметрам. Существование различных штаммов было подтверждено биохимически. Оказалось, что различные штаммы прионов несколько различаются по своей вторичной структуре. В настоящее время установлена первичная структура прионов, изолированных из многих организмов. Она оказалась высоко консервативной. У разных видов млекопитающих прион лишь незначительно отличается по первичной структуре. Тем более удивительным является факт наличия межвидовых барьеров на пути передачи. Долгое время изучение прионов представляло исключительно теоретический интерес. Однако в конце прошлого века проблема прионов приобрела существенное практическое значение в связи со вспышками соответствующих эпизоотий среди сельскохозяйственных животных в некоторых европейских странах, а также с появлением наблюдений о возможности передачи этих заболеваний от животных к человеку. В заключение следует отметить, что феномен прионов распространен в природе шире, чем это считалось до недавних пор. В последнее время появились данные о существовании прионов у дрожжей Saccharomyces cerevisiae. Некоторые их нехромосомно-наследуемые детерминанты имеют свойства, полностью укладывающиеся в прионовую модель. Если у млекопитающих заболевания, вызываемые прионами, представляют собой пример молекулярных патологий, то вопрос о том, является ли возникновение прионов у дрожжей болезнью или их существование имеет для дрожжей биологический смысл, остается пока открытым. Дело в том, что в данном случае переход предшественников прионов в прионы изменяет фенотип клетки; при этом расширяется набор азотсодержащих соединений, которые клетка может ассимилировать, что может приводить к увеличению ее адаптивных возможностей. В свете новых данных прионы можно определить как белки, способные через взаимодействие друг с другом передавать свое конформационное состояние от одной молекулы к другой. В этом случае определение «прионы» может быть распространено и на соответствующие белки дрожжей и подобные белки других организмов, которые несомненно будет еще открыты в будущем. Рекомендуемая литература Основная Завалишин И.А., Шитикова И.Е., Жученко Т.Д. Прионы и прионные болезни // Клин. микробиол. и антимикроб. химиотерапия. 2000. Т. 2, № 2. С. 12-19. Орлянкин Б.Г. Структура и биология прионов (обзор) // С.-х. биол. Сер. биол. животных. 1998. № 2. С. 46-58. Prusiner S.B. Prions // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95, № 23. P. 13363-13383. The Viroids / Ed. by T.O.Diener. New York: Plenum Press, 1987. Дополнительная Гривенников С.И., Стволинский С.Л. Прионные белки и нейродегенеративные заболевания // Нейрохимия. 1998. Т. 15, № 4. С. 343349. Зуев В.А. Прионы – проблема, которая грозит стать бедствием для человечества // Рос. мед. вести. 1998. Т. 3, № 1. С. 44-46. Labat M.L. Possible retroviral origin of prion diseases // Med. Hypotheses. 1997. V. 49, № 6. P. 461-466. Prusiner S.B. Molecular biology of prion diseases // Science. 1991. V. 252. P. 1515-1522. Глава 5. ТЕРАПИЯ И ПРОФИЛАКТИКА ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ К антивирусным препаратам относятся препараты, обладающие этиотропным эффектом. Этиотропный контроль вирусных инфекций включает следующие варианты (см. также табл. 5.1): • специфический, достигаемый с помощью вакцин; • неспецифический, когда стимуляция резистентности организма достигается с помощью интерферона, его индукторов и иммуномодуляторов; • химический – при использовании химиопрепаратов, избирательно подавляющих репродукцию вирусов. Каждый из перечисленных способов имеет свои достоинства и недостатки. Так, вакцины, обладая максимальной эффективностью и длительностью защиты, отличаются узкой направленностью и пригодны в основном для профилактики. Напротив, интерферон, характеризующийся универсально широким спектром действия, пригоден для терапии и менее эффективен в качестве средства профилактики. Еще в большей мере это относится к химиопрепаратам, для которых характерны, за редким исключением, узкая направленность действия и кратковременный эффект. Таблица 5.1. Характеристика способов контроля вирусных инфекций Тип контроля Препараты Эффективность Вакцины Неспецифический Химический Специфический Высокая Длительность эффекта Длительный Спектр активности Узкий Интерферон, иммуномодуляторы От средней до высокой Кратковременный Очень широкий Химиопрепараты От низкой до средней Кратковременный Узкий 5.1. Вакцинотерапия и вакцинопрофилактика Существуют две принципиально различные стратегии борьбы с патогенными вирусами: упреждение инфекции и лечение уже развившегося заболевания. Для упреждения инфекции полагаются на личную и общественную гигиену (напр., снабжение чистой питьевой водой и своевременное удаление нечистот, стерилизация медицинских инструментов и т.д.) и на вакцинацию которая заставляет иммунную систему человека сражаться с проникшими в организм вирусами. Однако, поскольку большинство повреждений клеток во время вирусных инфекций происходит очень рано (часто еще до появления клинических симптомов заболевания), это очень усложняет своевременную диагностику и последующее лечение вирусной инфекции. Отсюда следует, что профилактика вирусных инфекций более предпочтительна, чем их лечение. Для создания эффективных противоирусных вакцин важно не только понимать механизмы иммунного ответа на вирусную инфекцию, но и хорошо представлять себе стадии вирусной репликации, которые могут являться подходящими мишенями для иммунной атаки. Чтобы быть эффективными, вакцины должны стимулировать в организме как можно большее число защитных механизмов. На практике принцип вакцинации заключается в том, чтобы заранее снабдить организм информацией о патогене и подготовить его иммунную систему таким образом, чтобы при атаке вируса на вакцинированный субъект, мощный (т.н. вторичный) иммунный ответ привел к быстрой элиминации вируса из организма (в идеале еще до развития заболевания). Образно говоря, речь идет о своеобразном «минировании» организма на случай атаки его со стороны того или иного вируса. Следует отметить, что для упреждения эпидемии не обязательно надо стремиться к 100%-ной вакцинации населения. В случае, если достаточно большая пропорция населения провакцинирована, развивается т.н. «групповой иммунитет», благодаря которому цепочки передачи вируса обрываются до возникновения эпидемической вспышки. Атрибуты «идеальной» вакцины: • способность обеспечить у иммунизированного субъекта (в случае его заражения) иммунный ответ, достаточный для предохранения от заболевания; • долговременная, а в идеале – пожизненная, защита от инфекции; • безопасность (вакцинация сама по себе не должна приводить к заболеванию); • дешевизна. 5.1.1. Типы вакцин Существуют два основных типа вакцин: живые и убитые. Живые (аттенуированные) вирусные вакцины. Стратегия использования таких вакцин состоит в том, что с целью стимулирования иммунного ответа без развития самого заболевания, в организм вводится вирус со сниженной патогенностью. В качестве вакцинных штаммов могут использоваться циркулирующие в природе вирусы. Используя такой вирус, Эдвард Дженнер в 1798 г осуществил иммунизацию против оспы, что ознаменовало начало успешной борьбы против инфекционных заболеваний, независимо от их природы – вирусной или бактериальной. Э.Дженнер применил в качестве иммунизирующего начала вирус коровьей оспы. Этот вирус, будучи иммунологически родственным вирусу натуральной оспы, все же достаточно отличается от него, вследствие чего не может вызвать у вакцинированного человека серьезного заболевания. Часто, для того чтобы вирус не смог вызвать заболевания, его аттенуируют (ослабляют). Ослабленным он становится после пассажей через организм какого-либо животного, во время чего он мутирует и становится менее вирулентным для человека. (Вирус коровьей оспы можно рассматривать как ослабленный вирус натурально оспы, получившийся естественным путем). Основным преимуществом живых вирусных вакцин является то, что они активируют все компоненты иммунной системы, вызывая сбалансированный ответ: системный и местный, причем каждый из них состоит из гуморального и клеточного ответов. Это особенно важно для инфекций, при которых важную роль играет клеточный иммунитет, а также для инфекций слизистых оболочек, при которых необходим как местный, так и системный иммунитет. Живые вирусные вакцины обладают высокой иммуногенностью и индуцируют длительный иммунитет. Они характеризуются сравнительно низкой стоимостью и легкостью введения пациентам. Однако ослабленный вирус – все-таки живой и, следовательно, сохраняет способность изменяться. Он может снова мутировать таким образом, что его вирулентность для человека возрастет. К сожалению, несмотря на интенсивные попытки, до сих пор не предложен универсальный метод, согласно которому можно быстро и надежно аттенуировать любой вирус. При получении живой вакцины не исключена вероятность загрязнения ее другими, возможно, патогенными вирусами. Именно такой случай произошел в 1960 г. с вакциной против полиомиелита. Оказалось, что эта вакцина контаминирована живым вирусом SV40 (вакуолизирующий вирус обезьян). Для полиовирусной вакцины восстановление вирулетности вакцинного вируса наблюдается чрезвычайно редко – примерно в 1 случае на 10-6-10-7 иммунизаций. Как правило такие случаи имеют место с субъектами, входящими в группу риска, например, с беременными или обладающими дефектной иммунной системой. Еще одна потенциальная сложность заключается в возможности развития в результате вакцинации персистентной инфекции. Например, описаны случаи выделения из лимфоцитов людей с нормальной иммунной системой спустя 6 лет после иммунизации вируса краснухи. Наконец, нельзя не отметить, что для некоторых вакцинных вирусов (таких, как вирус кори, например) серьезной проблемой является их стабильность. Необходимость хранения и транспортировки живых вакцин при пониженной (4оС) температуре ограничивает их применение, особенно в регионах с жарким климатом. Несмотря на перечисленные трудности, вакцинация против патогенных вирусов – одно из крупнейших достижений 20-го столетия. При этом большинство удач обусловлено применением живых вакцин. Особого упоминания заслуживает ситуация с натуральной оспой. В мае 1980 г. Всемирная Организация Здоровья (ВОЗ) официально декларировала, что натуральная оспа побеждена. Таким образом, первое вирусное заболевание исчезло с лица Земли! Следует отметить, что хотя упреждение инфекции при помощи профилактической вакцинации в подавляющем большинстве случаев является предпочтительной стратегией, в некоторых случаях важна и вакцинация после случившегося заражения. Для иллюстрации можно привести пример с вирусом бешенства. Развитие инфекции может быть столь длительным, что появляется возможность при помощи «вакцинации вдогонку» индуцировать в организме эффективный иммунный ответ и спасти пациента. Живые рекомбинантные вакцины. В настоящее время генноинженерная техника позволяет вводить в геном того или иного, аттенуированного вакцинного вируса ген, кодирующий белок неродственного патогенного вируса. После инъекции такого рекомбинатного вируса в организм он реплицируется и экспрессирует чужеродный антиген в количествах, достаточных для индукции специфического иммунного ответа на патогенный вирус. В качестве вектора при реализации такого подхода можно использовать многие вирусы, но на практике наиболее часто применяют геном вируса осповакцины. Этот вирус уже использовался для вакцинации миллионов людей по всему миру во время кампании по ликвидации оспы и доказал свою безопасность и эффективность. Убитые (инактивированные) вакцины. Такие вакцины приготовляют путем инактивации вируса формалином или некоторыми др. денатурирующими агентами. Получаемые вакцины неинфекционны и, поэтому, сравнительно безопасны. Вместе с тем они обладают меньшей иммуногенностью, и по этой причине для индукции выраженного иммунитета приходится применять многократную иммунизацию повышенными дозами вакцины. Кроме того, по сравнению с живыми, убитые вакцины более дороги в производстве. Необходимо подчеркнуть, что не из всех вирусов можно приготовить инактивированную вакцину, поскольку часто (напр. в случае вируса кори) процедура денатурации вируса приводит к потере им иммуногенности. Кроме того, не следует забывать, что все убитые вирусные вакцины содержат вирусные нуклеиновые кислоты, которые в ряде случаев сами по себе могут быть причиной инфекции (особо это актуально для вирусов, чьи геномы представлены позитивной РНК). Субклеточные вакцины. Вакцины новейших поколений, как правило, представляют собой не целые вирионы (живые или убитые), а их компоненты. Причем наличие этих компонентов в вакцине (хотя и не достаточно для развития самой вирусной инфекции) достаточно для индукции иммунитета. Достоинством таких вакцин является то, что они совершенно безопасны. К сожалению, пока эти вакцины являются самыми дорогостоящими из всех типов вакцин. Кроме того, основными проблемами технического характера, связанными с субклеточными вакцинами, являются сравнительно слабая их иммуногенность и потребность в адьювантах. Вирусные антигены для субклеточных вакцин, как правило, получают путем клонирования и экспрессии соответствующих генов в клетках E. coli или дрожжей. Для использования в качестве вакцины интересующий белок экстрагируют из клеточных лизатов, затем концентрируют и очищают. Из вошедших в практику, единственным примером такой вакцины пока остается вакцина против вируса гепатита В. В последние годы возник большой интерес к т.н. синтетическим вакцинам. Такие вакцины содержат искусственно синтезированные короткие пептиды, которые имитируют небольшие участки оболочки вириона и способны вызывать образование антител против этого вируса. Несмотря на безусловную перспективность синтетических вакцин, ни одна из них еще не рекомендована для практического использования. ДНК-вакцины. Уже около 10 лет существует и весьма интенсивно развивается направление в вакцинологии, основанное на введении в организм не белков, а нуклеиновых кислот, кодирующих эти белки. Это направление называют «ДНК-вакцинацией», и с ним связывают революционные изменения в вакцинологии уже ближайшего будущего. В 1993 г. Алмер с соавт. показали, что инъекция мышам плазмидной ДНК (несущей репортерный вирусный ген) приводит к полноценному иммунному ответу, т.е. образованию антител и цитотоксических Тлимфоцитов и обеспечивает высокий уровень защиты мышей от последующей вирусной инфекции. Исследование в данной области нарастают лавинообразно. Новый подход к иммунизации удивительно прост, дешев и, похоже, универсален. Используя один и тот же плазмидный или вирусный вектор, можно создавать различные вакцины, просто меняя последовательность ДНК, кодирующую антиген. Отпадает сложная и дорогостоящая процедура очистки белков, получаемых методами генной инженерии. Для тропических стран важно то, что ДНК, как известно, стабильна при комнатной температуре. К настоящему времени надежно установлено, что вводимая в организм ДНК не встраивается в геном хозяина, а длительно существует в свободном состоянии. Если при обычной вакцинации антиген вводится в организм сразу в большом количестве и существует в нем сравнительно недолго, то в случае ДНК-вакцинации небольшие количества антигена длительное время синтезируются внутри самого вакцинируемого организма. В настоящее время проходят клинические испытания ДНК-вакцины против ВИЧ, вируса гриппа, вируса простого герпеса (1 типа) и некоторых других вирусов человека и животных. 5.1.2. Вакцины, находящиеся в употреблении в настоящее время Корь. Вакцина содержит живой аттенуированный вирус, размноженный в культуре фибробластов человека. Создана в 60-х годах прошлого века. Широкое использование этой вакцины привело к практически полному исчезновению кори в цивилизованных странах. В этих странах вакцину вводят всем детям на втором году жизни. Однако в развивающихся странах (где корь еще распространена) многие дети успевают инфицироваться уже в течение первого года жизни, что часто приводит к серьезным заболеваниям. Отсюда важно проводить вакцинацию как можно раньше. Однако сложность состоит в том, что, если вакцина вводится слишком рано (до годовалого возраста), то ее эффективность резко падает, из-за интерференции со стороны предсуществующих материнских антител. Свинка. Живая аттенуированнаявакцина против свинки используется уже более 40 лет. В большинстве развитых стран она вводится совместно с вакциной против кори и краснухи на втором году жизни. Краснуха. Как и предыдущие вакцины, содержит живые вирусы. Обычно вирус краснухи вызывает умеренно выраженную лихорадку. Однако если инфекция протекает во время беременности, внутриутробное развитие младенцев нарушается. В США вакцинации подвергаются все дети второго года жизни, но в Британии до сих пор вакцинируют только девушек в возрасте 14-15 лет. Полиомиелит. В широком употреблении находятся сейчас две высокоэффективные вакцины, содержащие все три иммунологических типа полиовирусов: • убитая вирусная вакцина Дж. Солка. С 1954 г. она используется в основном в скандинавских странах; • живая оральная вакцина А.Себина. С 1957 г. она принята в большинстве стран мира. Вакцину выпускают в жидком виде и форме конфет-драже. Репродукцию вируса для приготовления вакцин проводят в культуре почечной ткани макак резус или африканских зеленых мартышек. Бешенство. Пока не созданы безопасные для человека аттенуированные штаммы вируса бешенства. Использующиеся вакцины представляют собой высушенную суспензию мозговой ткани кроликов, овец или крыс, содержащих химически инактивированный вирус. Вакцину перед использованием разводят дистиллированной водой и сразу же вводят подкожно. Хранить разведенную вакцину запрещено. При применении такой вакцины нередко отмечаются реакции гиперчувствительности на миелин, содержащийся в препаратах, поэтому в последнее время эта вакцина заменяется на аналогичную, но приготовленную с использованием культуры ткани человека (в частности клеток амниона). Вакцины против бешенства применяют в двух случаях: а) для профилактики после заражения, последовавшего в результате укуса бешенного животного. Курс вакцинации состоит из 5-6 внутримышечных инъекций, начиная со дня заражения; б) профилактика здоровых лиц, которые подвергаются риску заразится (ветеринарные работники, персонал лабораторий и т.д.). Схема вакцинации включает две дозы с интервалом в месяц и одну повышенную дозу через год. Клещевой энцефалит. Вирус полученный из тканевой культуры фибробластов куриного эмбриона, убивают формалином. Препараты выпускают в жидком виде или лиофильно высушенном. Вакцину вводят подкожно (сухую – после разведения водой). Грипп. Причиной периодически повторяющихся эпидемий гриппа является быстрая вариабельность структуры гликопротеидов, входящих в состав оболочки вириона. В принципе, антитела против вирусной нейраминидазы и гемагглютенина должны были бы защищать организм хозяина от повторной инфекции. Однако, из-за быстрой антигенной изменчивости вируса, вакцины, содержащие антигены, соответствующие тем штаммам, которые в данный момент атакуют человеческое сообщество, приходится нарабатывать каждый раз заново. Долгое время для профилактики гриппа применяются живые вакцины. Живая противогриппозная вакцина представляет собой высушенную аллантоисную жидкость, взятую из зараженных вирусом куриных эмбрионов. Тип вируса подбирается с учетом эпидемиологической ситуации. Препараты могут выпускаться в виде моно- и дивакцин (например, включающих вирусы А и В). Эти вакцины разрешены для интраназального или орального применения, начиная с трехлетнего возраста. В настоящее время, с целью снижения токсичности разработана субъединичная вакцина. Она содержит частично очищенные поверхностные антигены (нейраминидазу и гемагглютенин) вирусов гриппа А и В и менее токсична, чем вакцина из целого вируса. Следует отметить, что имеющиеся как субъединичные, так и цельновирусные вакцины против вируса гриппа, обеспечивают только частичную защиту от этого патогена. Во многих странах противогриппозной вакцинации подвергают только людей, входящих в группу риска. Это – престарелые, кардиологические больные и пациенты с иммунодефицитами. Хотя, как уже отмечалось, защита у этих пациентов от заболевания гриппом только частичная, однако тяжесть инфекции при этом резко понижается. Гепатит А. Вакцина против гепатита А приготавливается из формалининактивированного вируса, выращенного в культуре ткани. Высокие уровни нейтрализующих антител индуцируются при двукратном введении вакцины с месячным перерывом. Вакцина особо рекомендуется для лиц, предпринимающих посещения стран т.н. третьего мира. Гепатит В. В широком употреблении имеются две субклеточные вакцины – сывороточная и рекомбинантная. Обе вакцины содержат очищенные препараты поверхностного антигена вируса гепатита В. Сывороточную вакцину получают из белка оболочки вируса, изолированного из сыворотки хронически инфицированных людей-носителей вируса гепатита В. У таких людей этот белок в избытке синтезируется инфицированными гепатоцитами и секретируется в кровь. Специальные исследования показали, что три внутримышечные инъекции в течение 6 месяцев обеспечивают 95% защиту от последующего заражения. Что касается рекомбинантной вакцины, следует отметить, что для неё поверхностный антиген получают из дрожжей, где его экспрессия достигается при клонировании рекомбинантной плазмиды, содержащей ген поверхностного белка вируса гепатита В. Интересно, что продуцируемый дрожжами антиген, очевидно, не гликозилирован. Те не менее, он достаточно иммуногенен. После разрушения дрожжевых клеток антиген очищают с помощью ультрацентрифугирования в комбинации с иммуноаффинной хроматографией. Ранее эту вакцину рекомендовали для группы риска, в частности, для младенцев, рожденных матерями-носителями вируса гепатита В, медработников, гомосексуалов и наркоманов. Однако с 1995 г. на Западе вакцина введена в обязательную практику для иммунизации всех детей в 6-, 10- и 14-недельном возрасте. Основные характеристики упомянутых выше, а также и других вакцин, разрешенных к применению для профилактики и терапии вирусных заболеваний, приведены в табл. 5.1. Таблица 5.1. Некоторые из разрешенных к применению антивирусных вакцин Заболевание Способ Вакцина: введения живая убитая вакцины* Бешенство вм + Гепатит А вм + Гепатит В вм/пк Грипп вм + Желтая лихорадка пк + Клещевой энцефалит пк + Корь+свинка+краснуха вм + Опоясывающий лишай вм + Полиомиелит о/вм + + *Сокращения: вм – внутримышечно; о – орально; пк – подкожно. субъединичная + + Пассивная иммунизация. Пассивная иммунизация заключается в «переносе» уже имеющегося иммунитета от донора к другому организму путем пересадки специфических антител. Эти антитела получают обычно из сыворотки доноров путем дифференциального осаждения имуноглобулинов охлажденным этанолом. Иммуноглобулины, выделенные из иммунных индивидуумов, можно использовать для профилактики вирусных инфекций у лиц, заразившихся, но не имеющих соответствующего иммунитета. Эти антитела связываются с внеклеточными вирусными частицами, блокируя тем самым стадию проникновения их в клетку-хазяина. Защитный эффект такой процедуры кратковременен (до 3-х месяцев) и определяется временем, в течение которого антитела метаболизируют в организме. Иммунизация «нормальными» иммуноглобулинами. В ряде случаев для профилактики вирусных заболеваний используют препараты иммуноглобулинов, получаемых из сыворотки крови здоровых (нормальных) доноров. Эти препараты содержат низкие титры антител к широкому кругу вирусов человека и используются для профилактики: гепатита А, энтеровирусных инфекций (в неонатальном периоде), парвовирусных инфекций, СПИДа (у ВИЧ-инфицированных младенцев). Иммунизация специфическими иммуноглобулинами. Иммуноглобулины могут быть получены из сыворотки отдельных индивидуумов, которые имеют высокие титры антител к конкретному вирусу. Такие специфические иммуноглобулины необходимы как для профилактики, так и для терапии ряда вирусных заболеваний. Иммуноглобулины против вируса опоясывающего лишая используются для профилактики этого заболевания у детей с иммунодефицитами. Иммуноглобулины против вируса бешенства используются для предотвращения заболевания у людей, покусанных бешеными животными. Иммуноглобулины против респираторно-синцитиального вируса применяют для лечения респираторно-синцитиальной вирусной инфекции у новорожденных младенцев. 5.2. Клиническое применение интерферона Существующие медицинские препараты интерферона делятся: по типу активного компонента - на α-, β- и γ-интерфероны; по способу получения и, следовательно, времени создания и начала клинического применения - на природные (или интерфероны первого поколения) и рекомбинантные (или интерфероны второго поколения) (табл. 5.2). Таблица 5.2. Применяемые препараты интерферона Тип интерферона Природные интерфероны: α-интерферон β-интерферон Препарат Человеческий лейкоцитарный интерферон, виллферон, лейкинферон, эгиферон Фибробластный интерферон человека, ферон Иммунный интерферон человека γ-интерферон Рекомбинантные интерфероны: Реаферон, роферон-А, виферон, реальдерон α-2а Интрон А, инрек α-2в Берофор α-2с Бета-ферон β-интерферон Гамма-ферон γ-интерферон Спектр заболеваний, при которых показано применение интерферона, можно разделить на три большие группы – вирусные инфекции (табл. 5.3), болезни злокачественного роста и прочие заболевания. Таблица 5.3. Эффективность использования интерферона при терапии некоторых вирусных инфекций Тип интерЭффективность применения ферона Острые и Снижение смертности. Уменьшение α, β и γ хронические формы интенсивности интоксикации гепатитов В и С Генитальный герпес. Сокращение сроков рецидивов. αиβ Опоясывающий Снижение болевых эффектов. α Увеличение продолжительности лишай межрецидивных периодов Герпетические Снижение тяжести и сокращение αиβ кератиты и продолжительности заболеваний кератоконьюктевиты Острые Ингаляции эффективны для экстренней α респираторные профилактики, особенно для групп риска вирусные инфекции (дети, лица пожилого возраста). Лечебный эффект отмечен при внутримышечном введении младенцам с респираторно-синцитиальной инфекцией Цитомегаловирусные Профилактика цитомегаловирусных α инфекции при пневмоний и гепатитов СПИДе СПИД Снижается острота течения инфекции. αиβ Исчезают некоторые сывороточные маркеры заболевания. Отмечен положительный эффект в отношении ассоциированной со СПИДом саркомы Капоши Заболевание К перечню, представленному в табл. 5.3, можно добавить вирусные осложнения, часто наблюдающиеся при трансплантации органов и на фоне приема иммунодепрессантов. Применение интерферона такими больными приводит к улучшению общего состояния, уменьшению или снижению симптомов интоксикации и т.д. Особо следует отметить, что самым эффективным средством для терапии такого грозного заболевания, как хронический гепатит С, является разрешенная к применению с 1998 г. комбинация «рекомбинантный αинтерферон + виразол » (препарат Ребетрон). Индукторы интерферона. Индукторы интерферона представляют собой разнородную по составу группу высоко- и низкомолекулярных природных и синтетических соединений, объединенных способностью вызывать в организме образование эндогенного интерферона. Многие соединения этой группы обладают противовирусной, антипролиферативной и иммуномодулирующей активностью, т.е. всеми характерными для интерферона эффектами. В табл. 5.4. представлены примеры имеющихся в настоящее время нескольких весьма перспективных для медицины индукторов интерферона, пригодных для профилактики и лечения вирусных инфекций. Таблица 5.4. Индукторы интерферона, пригодные для клинического применения Химическая природа Препарат Показания к применению Природные соединения А. Низкомолекулярные производные госсипола Б. Полимеры Двухцепочечная РНК Мегасин, саврац, рагосин, кагоцел гозалидон, Ларифан, ридостин Грипп, ОРВИ, энтеровирусные инфекции Герпетические инфекции, грипп, ОРВИ, бешенство. Синтетические соединения А. Низкомолекулярные Флюореноны Акриданоны Б. Полимеры Поли(А):поли(У) Амиксин Камедон, неовир, циклоферон Полудан Поли(Г):поли(Ц) Полигуацил Поли(И):поли(Ц) Амплиген Герпетические инфекции, грипп, ОРВИ, гепатит А ОРВИ, бешенство Герпетические поражения глаз Грипп, бешенство, гепатит В СПИД Изучение эффективности индукторов интерферона при различных экспериментальных вирусных инфекциях и при клиническом применении позволило выявить важнейшее свойство индукторов – универсально широкий диапазон противовирусной активности, а также то, что их активность, в целом, совпадает с антивирусными эффектами экзогенных интерферонов. При этом наиболее активными индукторами интерферона зарекомендовали себя очищенная природная двухцепочечная РНК и искусственные двухцепочечные полинуклеотиды (при обязательном условии их достаточно высокой молекулярной массы). Ранее индукторы интерферона применяли главным образом местно, однако в настоящее время есть все основания предполагать, что в недалеком будущем будет широко распространено и системное применение этих препаратов. Наконец следует отметить, что применение препаратов, которые индуцируют синтез эндогенного интерферона, имеет ряд преимуществ перед экзогенным интерфероном. • Индукторы относительно стабильны, дешевы и доступны. Они не обладают антигенностью. • Естественный (хотя и стимулированный) синтез эндогенного интерферона не вызывает гиперинтерферонемии, которая нередко возникает при введении экзогенных (особенно рекомбинантных) интерферонов и приводит к тяжелым побочным явлениям. • Однократное введение индуктора интерферона обеспечивает длительную циркуляцию интерферона на терапевтическом уровне. Для достижения такого уровня экзогенного интерферона требуется многократное введение высоких доз экзогенного интерферона, поскольку время полужизни интерферона в крови составляет всего 2040 мин. • Наконец, широко применяемые сейчас интерфероны (рекомбинантные) являются препаратами только α-интерферона, что существенно ограничивает их противовирусные свойства, так как для эффективной противовирусной защиты необходимо наличие всех трех классов интерферонов, синтез которых и вызывается применением индукторов интерфероногенеза. В заключение разговора об интерфероне следует подчеркнуть, что интерферон является хотя и мощным, однако не «высокоточным оружием». Образно говоря, это оружие стреляет по площадям. Как следствие интерфероновая терапия сопровождается серьезными побочными эффектами (лихорадка, тошнота и др. недомогания). На основании этого, многие исследователи считают, что интерферон никогда не будет широко применяться для лечения тривиальных вирусных инфекций, типа простуды. Однако для терапии угрожающих жизни заболеваний (например, эндогенные гепатиты) применение его будет со временем лишь возрастать. 5.3. Химиотерапия вирусных инфекций Химиотерапия вирусных инфекций (ХВИ) - раздел вирусологии, основными задачами которого являются поиск, испытание и отбор противовирусных лекарственных средств синтетического или природного происхождения. В настоящее время эта наука, развивая классический скрининг препаратов, использует достижения молекулярной биологии, генетики и биохимии вирусов для разработки научно обоснованного подхода к решению данной проблемы. В связи с тем, что вирусы являются облигатными внутриклеточными паразитами, основной принцип ХВИ заключается в избирательном подавлении репродукции вирусов без существенного нарушения жизненных функций клетки-хозяина и макроорганизма в целом. Следует отметить, что это классическое положение ХВИ в последнее время существенно расширено. К антивирусным химиопрепаратам сейчас многие относят не только препараты, которые селективно ингибируют отдельные этапы вирусной репродукции в клетке, но и вирулицидные вещества, инактивирующие внеклеточный вирус, а также вещества, которые влияют на структуры клетки, принимающие участие в механизмах репродукции вируса. Наконец, к антивирусным химиопрепаратам часто относят и такие препараты, которые действуют на зараженные вирусом клетки и приводят к элиминации их из организма. Понятие о химиотерапевтическом индексе. Основное требование, которое предъявляется к антивирусным препаратам – специфичность. Именно поэтому основным показателем клинической пригодности препаратов служит их т.н. химиотерапевтический индекс (ХТИ). Химиотерапевтический индекс в его классическом понимании обычно изображается в виде следующей формулы: ХТИ = Dmt ( Dosis max ima tolerata Dmc ( Dosis min ima curativa) Величина частного определяет качество химиопрепарата. Дадим пояснения. Чем больше числитель, тем более это свидетельствует о хорошей переносимости химиопрепарата, а значит и о возможности безопасно повышать его дозу. Другими словами, высокий числовой показатель числителя – это показатель малой токсичности препарата и, следовательно, ценности его как антивирусного препарата. Знаменатель указывает на минимальную лечебную дозу. Нетрудно понять, что здесь благоприятствующее для оценки препарат значение будет определяться обратным отношением к числителю: чем меньшая доза необходима для получения лечебного эффекта, тем выше ценность препарата. Из всего изложенного нетрудно понять, что идеальным химиопрепаратом будет такой, который характеризуется большим цифровым показателем в числителе и очень малым – в знаменателе. Практика показывает, что соотношение рассматриваемых параметров чрезвычайно важно. Нередко из-за резкого нарушения в этом соотношении препарат оказывается негодным, его практически нельзя применять – очень невысокая толерантность организма к препарату, определяемая небольшой цифрой в числителе, характеризует его высокую органотропность. С другой стороны, высокий цифровой показатель в знаменателе указывает на необходимость сильно поднимать дозы для получения терапевтического эффекта, что свидетельствует о низком этиотропном свойстве препарата. Справедливости ради следует заметить, что существует проблема с унификацией критериев активности и токсичности противовирусных соединений. Не вдаваясь в детали проблемы, отметим, что различными исследователями параметры, располагающиеся в числителе и знаменателе формулы ХТИ рассчитываются по-разному, что несколько затрудняет сопоставление данных, полученных различными авторами. 5.3.1. Разработка и испытания противовирусных препаратов Как правило, разработка противовирусных препаратов должна вестись в порядке, который в немного упрощенном виде иллюстрирует рис. 5.1. Синтез химических соединений Оценка активности и токсичности в культуре тканей Исследование активных соединений в экспериментах на животных Доклиническое определение переносимости и безопасности препаратов Разработка предварительных нормативно-технических требований (временная фармакопейная статья) Клинические испытания препаратов Рис. 5.1. Схема разработки и испытания противовирусных препаратов. Задача начального этапа испытаний - объективно и точно выявить первичную специфическую противовирусную активность соединения и дать заключение о его перспективной значимости и целесообразности испытаний в опытах на животных. Практика показала, что наиболее дешево и быстро можно получить такие данные, используя тканевые культуры. Противовирусную активность препаратов в культуре ткани выявляют с помощью тех же тестов, что используются для оценки репродукции вируса: цитопатический эффект, феномен гемагглютинации, феномен гемадсорбции, метод флуоресцирующих антител, метод электронной микроскопии и метод бляшек (негативных колоний). При этом наиболее часто в последние 20-25 лет активность препаратов в культуре тканей определяют методом редукции бляшек. Популярной модификацией метода подавления бляшек является методика градиента концентрации исследуемого вещества в агаре, которое вносится в лунку, высеченную в центре чашки Петри с инфицированными клетками. По этой методике можно определять минимальную активность исследуемого вещества с одновременной оценкой его токсичности для клеток. Широко используется также дисковый метод подавления образования негативных колоний, состоящий в том, что исследуемое соединение вносится в составе фильтровального диска в культуру клеток с агаровым покрытием. На стадии первичного отбора противовирусных препаратов особую ценность приобретают системы для одновременной оценки большого числа соединений. Описана методика исследования противовирусной активности химиопрепаратов с использованием культуры ткани в микрообъемах. По этой методике культуру клеток выращивают в пластиковых панелях с 96 лунками, в каждую из которых вносят по 0,1 мл вируссодержащей среды. После 72 ч инкубирования культуру клеток микроскопируют для определения цитопатического действия (ЦПД). По такой методике можно исследовать сразу большое число препаратов при небольших расходах питательных сред и изучаемых соединений. Можно упомянуть и один из ускоренных методов оценки противовирусной активности соединений, который основан на определении интенсивности включения 3Н-уридина или 3Н-тимидина в нуклеиновые кислоты соответственно РНК-содержащих или ДНК-содержащих вирусов. В суспензию клеток вносят исследуемый вирус и спустя 30-60 мин распределяют по лункам панелей. Предварительно в каждую лунку наливают раствор испытуемого вещества и один из указанных выше радиоактивномеченных предшественников вирусной нуклеиновой кислоты. Пробы инкубируют 5 ч при 37оС. Затем радиоактивность, включившаяся в васокополимерную (кислотонерастворимую) фракцию клеточных лизатов замеряется в жидкостном сцинтилляционном счетчике. При помощи этого метода один работник за 3 ч может исследовать до 100 образцов различных соединений. Считается, что оценка противовирусной активности соединений методом ингибирования синтеза вирусных нуклеиновых кислот более точная, чем методом редукции бляшек. При отборе антивирусных средств большое значение имеет правильная оценка токсичности соединений. Наиболее широко распространенным и простым является метод прижизненного морфологического исследования клеток культуры ткани, которая инкубируется 48 ч в присутствии тестируемого соединения. Морфологическая оценка цитотоксичности основана на использовании результатов световой, фазово-контрастной и люминисцентной микроскопии. В качестве критерия токсического поражения клеток используются результаты теста на жизнеспособность. Доза препарата оценивается как нетоксичная, если культура клеток после смены среды, содержащей препарат, способна репродуцировать вирус в том же титре, что и интактная культура. Этот метод определения токсичности химиопрепаратов считается более чувствительным, чем метод прижизненного морфологического исследования. Минимальная доза препарата, полностью прекращающая размножение в клетках вируса, рассматривается как токсичная. Критерий эффективности антивирусных препаратов - ХТИ – в экспериментах с использованием культуры ткани определяется, как к отношение среднетоксичной концентрации вещества (СТ50) среднеэффективной вирусингибирующей концентрации (ЕД50). Соединения с ХТИ более 8 считаются перспективными для дальнейших исследований в опытах на животных. Здесь уместно сделать следующее замечание. В англоязычной литературе для обозначения ХТИ приняты индексы TI (therapeutic index) или SI (selectivity index). Их рассчет производится из отношения IC50/EC50, где IC50 – концентрация ингибитора, подавляющая рост клеток или жизнеспособность неинфицированных клеток на 50%, а ЕС50 – концентрация ингибитора, подавляющая на 50% продукцию вируса, инфекционность вируса или вирусиндуцированный цитопатический эффект. Далее на животных исследуют специфическую активность, а также т.н. «острую» и хроническую токсичность препаратов после различных способов их введения. Критерием эффективности здесь служит процент выживания и ХТИ. Препараты, обеспечивающие выживаемость (защиту) не менее 50% животных от 10ЛД50, считаются перспективными для дальнейшего изучения. Острую и хроническую токсичность новых препаратов нужно изучать не менее чем на трех видах животных, включая собак. Аналоги известных химических соединений допускается изучать на животных двух видов, один из которых не относится к грызунам. В качестве подопытных животных для изучения противовирусных препаратов используются самые разнообразные животные, в т.ч. белые мыши, хлопковые крысы, морские свинки, кролики, хомяки, хорьки, поросята, собаки, обезьяны. Оценка на животных является абсолютно необходимой хотя бы потому, что между активностью препарата in vitro и in vivo далеко не всегда существует корреляция. Чем это можно объяснить? Универсального ответа не существует. Это может быть плохая всасываемость препарата (т.е. биодоступность), подверженность препарата непродуктивному метаболизму в макроорганизме и т.д. Следует отметить, что экспериментальная модель вирусной инфекции для оценки противовирусной активности препаратов должна как можно точнее воспроизводить заболевание человека. Чем больше сходство, тем выше корреляция между результатами, полученными на лабораторных животных и у человека. К сожалению, удовлетворительных моделей такого типа для большинства вирусных инфекций мало. В схемах оценки препаратов при изучении на животных моделях предусматривается введение их до и после заражения – для определения профилактического и лечебного эффекта. Обычно ХТИ в опытах на животных выражается отношением ЛД50 к ЕД50, где ЕД50 – суточная доза препарата, защищающая 50% животных. Принято, что препараты с ХТИ меньше 2 – неактивны, а с 4 и выше – перспективные для дальнейшего изучения в клинике. Следует отметить, что кроме высокой специфичности к антивирусным препаратам предъявляется много других требований. Это: • хорошая растворимость в водной среде; • сохранность структуры при введении в организм; • скорость адсорбции слизистыми и элиминации из организма; • способность проникать в ткани-мишени; • стабильность при хранении; • -доступность сырья и простая технология производства и т.д. По поводу последнего по списку (но не по значимости!) требования, необходимо отметить, что именно из-за отсутствия подходящей технологии производства часто внедрение препаратов в практику здравоохранения задерживается на десятки лет. 5.3.2. Успехи химиотерапии Химиотерапия инфекций, вызываемых бактериями, грибками и простейшими, к началу XXI века достигла выдающихся успехов, обеспечив медицину большим числом эффективных препаратов. Применение этих препаратов позволило резко снизить заболеваемость и смертность от указанных выше возбудителей. В то же время химиотерапия заболеваний, вызываемых вирусами, имеет гораздо более скромные успехи. Это объясняется тем, что, как было показано выше, метаболизм вирусов гораздо в большей степени связан с обменом веществ инфицируемых ими клеток, чем это имеет место в случае инфицирования организма другими патогенами. На самом деле, у вирусов только процессы синтеза нуклеиновых кислот (и то не всегда) бывают в определенной мере автономными. Синтез же белков всегда связан с клеточной рибосомальной системой. Посттрансляционный процессинг, протеолитическое фрагментирование полипротеинов-предшественников бывают иногда вирусспецифическими, но чаще зависят от клеточных протеаз. Процессы гликозилирования вирусных ферментов обеспечиваются исключительно за счет клеточных ресурсов. Ведь врусы не синтезируют ни углеводов, ни липидов. Таким образом, большая чисть вирусиндуцированных синтезов в той или иной мере клеточнозависимы. Кроме того, генетический аппарат вирусов отличается чрезвычайным разнообразием и способностью к быстрой изменчивости. Как уже отмечалось в гл. 2, вирионы могут содержать или ДНК или РНК, причем и та и другая нуклеиновые кислоты могут быть как одноцепочечными, так и двухцепочечными. При этом одноцепочечные могут быть позитивно или негативно полярными. Наконец, нуклеиновые кислоты могут быть линейными и кольцевыми, непрерывными и фрагментированными. Все перечисленные свойства вирусов затрудняют поиск веществ, которые, не повреждая клетку-хозяина, эффективно подавляли бы репликацию вируса. В случае бактерий отбор таких агентов основан на том, что их рибосомальные системы настолько отличаются от таковых у животных, что удается легко найти антибиотики (тетрациклин, например) которые подавляют синтез белка бактерий и не действуют на аналогичные системы эукариот. Рис. 5.2. Мишени в цикле репродукции вирусов для действия антивирусных препаратов. Еще более показательный пример. Как известно, клетки животных, в отличие от бактерий, лишены клеточной стенки. Поэтому антибиотики, ингибирующие ее формирование (например, пенициллин), подавляют размножение бактерий, совершенно не действуя на клетки животных. По общепринятому мнению указанные обстоятельства делают малоперспективным поиск химиотерапевтических препаратов с широким спектром действия, напоминающих антибактериальные антибиотики. Пока практика подтверждает этот пессимизм. Большинство изысканных противовирусных средств характеризуются узким спектром действия. Например, препараты на основе амантадина и его производных эффективно подавляют вирус гриппа А, но не действуют на вирус гриппа серотипа В. Учитывая сказанное, препараты с универсальным противовирусным действием, по-видимому, следует искать среди индукторов интерферона, «включающих» эндогенную, эволюционно сложившуюся систему защиты клетки от вирусов. Несмотря на все сложности поиска противовирусных средств, в химиотерапии, а лучше сказать в терапии вирусных инфекций все же имеются хотя и скромные, но несомненные успехи. Рассмотрим некоторые препараты в порядке расположения мишеней их действия в динамике репликативного цикла вирусов (рис. 5.2). 5.3.2.1. Вирулицидные препараты Среди применяемых в настоящее время вирулицидных препаратов можно отметить такие, как оксолин, теброфен, флореналь, госсипол, алпизарин, бонафтон, левамизол, флакозид. Главной особенностью механизма действия всех этих препаратов является то, что они инактивируют только внеклеточный вирус. ОКСОЛИН (1,2,3,4-тетраоксо-1,2,3,4-тетрагидронафталин) обладает активностью в отношении рино-, миксо- и герпесвирусов. O O O O Препарат используют для лечения вирусных заболеваний глаз (герпетические кератиты и кератоконьюктивиты), кожи (опоясывающий лишай), ринитов, а также для профилактики гриппа. Выпускается в форме 0,25-3% мази и порошка (для приготовления растворов). В период эпидемий гриппа или при контакте с больным гриппом для индивидуальной профилактики гриппа применяют 0,25% мазь путем ежедневного двухкратного (утром и вечером) смазывания слизистой оболочки носа. ТЕБРОФЕН (3,5,3’,5’-тетрабром-2,4,2’,4’-тетраоксидифенил) обладает активностью в отношении адено- и герпесвирусов. Br Br OH OH Br OH OH Br Препарат применяют в виде мази для лечения глаз – эпидемического аденовирусного кератоконьюктевита, герпетического кератита, а также заболеваний кожи вирусной этиологии (рецидивирующий герпес, опоясывающий лишай). ГОССИПОЛ [2,2’-ди-(1,6,7-триокси-3-метил-5-изопропил-8нафтальдегид] инактивирует герпесвирусы. Продукт получают из семян или корней хлопчатника. O HO H C OH HO H3C OH CH3 CH3 C O H OH OH H3C H3 C CH3 Применяют госсипол в виде мази для лечения опоясывающего лишая и поражений кожи, вызванных вирусами простого герпеса. В виде раствора применяют при герпетическом кератите. 5.3.2.2. Препараты, ингибирующие адсорбцию, проникновение и раздевание вирусов В принципе, фазу адсорбции репликативного цикла вируса можно блокировать, создав помехи имеющему место здесь взаимодействию рецептора с антирецептором (см. рис. 5.3). Для этого можно использовать либо молекулы, имитирующие структуру вирусного антирецептора, либо молекулы, структурно подобные на рецепторы клетки. В обоих случаях «привычное» взаимодействие рецептора с антирецептором, необходимое для связывания клетки с вирусом, станет невозможным. Рис. 5.3. Некоторые варианты блокирования стадии адгезии вирусов. Предложено использовать в качестве лекарственных средств такого рода соответствующие синтетические пептиды или рекомбинантные белковые молекулы. Примером последних могут служить препараты на основе т.н. молекул межклеточной адгезии (ММА), которые представляют собой рецепторные молекулы для 80-90% из 130 штаммов риновирусов, вызывающих большую часть случаев ОРВИ. В специальных экспериментах показано, что рекомбинантные ММА действительно блокируют адгезию вирусов in vitro и in vivo, смягчая клинические проявления инфекции. Препарат пока не имеет широкого применения из-за достаточно высокой стоимости лечения. С целью терапии СПИДа предложено использовать препараты, блокирующие взаимодействие клеточного рецептора CD4 с антирецептором ВИЧ - гликопротеидом gp120. В частности, интенсивно изучаются синтетические олигопептиды – аналоги участка CD4, к которому прикрепляется gp120. Кроме того, создан рекомбинантный белок, содержащий 368 аминокислотных остатков, который прямо конкурирует с клеточным рецептором за связывание gp120. Клинические испытания проходят препараты на основе анти-gp120 и рекомбинанатных молекул CD4. Последние представляют собой аналоги имуноглобулинов, в которых V-регион заменен связывающим центром CD4. Преимущество подобной структуры по сравнению с нативной молекулой CD4 состоит в более длительном периоде полураспада. Оба препарата (анти-gp120 и рекомбинанатные CD4) эффективно связывают gp120 создавая, таким образом, препятствие для прикрепления вируса к мембране клетки. Поразительно то, что для нейтрализации вирусной частицы достаточно связать всего одну молекулу гликопротеида. Это заставляет предполагать, что активность препаратов может реализоваться также и через блокирование этапа раздевания вируса. Следует отметить, что противоположный подход, основанный на блокировании CD4, пока менее продуктивен, поскольку это оказывает неблагоприятное действие на функционирование Т-лимфоцитов. Ведь CD4 осуществляет рецепцию белков класса II основного антигена гистосовместимости. В этом отношении считается более перспективным использование антиидиопатических антител, т.е. антител к антителам против рецептора CD4, которые имитируют структуру CD4 и способны взаимодействовать с антирецептором gp120. Известно, что стадия раздевания многих вирусов в значительной степени опосредована клеточными ферментами, в связи с чем указанная стадия неудобна для проведения химической атаки против вирусов. Поэтому и препаратов, специфически ингибирующих этот этап вирусной репликации, разработано мало. Из заслуживающих внимания отметим препараты на основе производных адамантана и нуклеаз. В 1961 г. среди соединений класса адамантана с уникальной трициклической структурой открыта селективная активность против вируса гриппа А. Наиболее изученными и перспективно значимыми передставителями этого класса соединений являются амантадин и ремантадин. АМАНТАДИН (1-aминоадамантан; симметрел) и РЕМАНТАДИН (α-метил-1-адамантанметиламин). NН2 NН2 CН Препараты не оказывают прямого вирулицидного действия и не ингибируют адсорбцию вирусов на чувствительных клетках. Главной мишенью для них обоих является матричный белок М2. Кроме того, показано, что картирование гена устойчивости вируса к этим препаратам неизменно приводит к гену, кодирующему структуру гемагглютенина. Цепь событий при обработке клеток амантадином и ремантадином выглядит следующим образом. Взаимодействие этих препаратов с белком М2 (и возможно с гемагглютенином) приводит к блокированию ионных каналов в составе клеточной мембраны. Это, в свою очередь, приводит к неспособности клеток понижать рН внутри эндосом, содержащих вирусы, что является условием для индукции конформационных изменений в структуре гемагглютенина, необходимых для того, чтобы вирусная оболочка и мембрана клетки слились и нуклеокапсид высвободился в цитоплазму. Амантадин выпускается в США, где он применяется для профилактики гриппозных заболеваний у взрослых. При развившейся инфекции препарат выраженным лечебным действием не обладает. Ремантадин – более активное производное амантадина. Применяется в качестве профилактического и лечебного средства не только для взрослых, но и детей от 1 года. Препарат (таблетки и капсулы) наиболее эффективен при приеме в первые два дня заболевания. Ремантадин на завершающих стадиях репродуктивного цикла вируса гриппа А блокирует выделение клеткой инфекционных частиц. Следовательно, заболевание не развивается дальше и предотвращается возможность осложнения. Также снижается вероятность заражения окружающих. РИБОНУКЛЕАЗА и ДЕЗОКСИРИБОНУКЛЕАЗА. Мысль о возможности воздействия ферментами на вирусы возникла у исследователей разных стран в конце 50-х годов прошлого столетия. Впоследствии в опытах с культурами инфицированных клеток было продемонстрировано, что нуклеазы, действительно, подавляют размножение некоторых вирусов. Далее в экспериментах по изучению возможной токсичности экзогенных нуклеаз для самих клеток, удалось показать, что нуклеазы даже в дозах, в десятки раз превосходящих терапевтические, избирательно действуют только на вирусные ДНК и РНК, не нанося ущерба клетке-хозяину. Почему нуклеазы действуют избирательно на вирусы? Ведь химическое строение нуклеиновых кислот вирусов и клетки, в принципе, одинаково. Почему же эти ферменты повреждают нуклеиновые кислоты вирусов, но щадят клетки? Опыты показали, что молекулы нуклеаз проникают в клетки человека и животных путем эндоцитоза, т.е. путем, которым попадают в клетки (см. главу 3) и многие вирусы. Внутри клетки нуклеазы находятся в пузырьках, которые изолируют их от клеточных структур и делают безопасными для клетки. Иначе говоря, фермент не «расплывается» по всей клетке, а сосредотачивается во внутриклеточных пузырьках. Механизм действия. Если вирионы и молекулы нуклеаз оказываются одновременно в околоклеточном пространстве, то они попадают в одни и те же внутриклеточные мембранные пузырьки и нуклеазы атакуют нуклеиновые кислоты раздевающегося вируса. Препараты нуклеаз для медицинских целей получают, главным образом, из поджелудочной железы крупного рогатого скоты. В связи с разрушением РНК, РНКаза обладает способностью задерживать размножение ряда РНК-содержащих вирусов (вируса клещевого энцефалита, полиомиелита, ящура и т.д.). Применяют РНКазу местно, внутриплеврально и внутримышечно. Имеются данные о способности ДНКазы задерживать развитие вирусов герпеса, аденовирусов и др. вирусов, содержащих ДНК. Применяют ДНКазу при герпетических и аденовирусных кератитах (капли, инъекции под коньюктиву), при острых катарах верхних дыхательных путей аденовирусной природы (ингаляции). В России селектирована бактерия – источник дешевой неспецифической нуклеазы (разрушает как ДНК, так и РНК), которую предложено использовать для борьбы с вирусным параличом пчел, вирусом ядерного полиэдроза личинок тутового шелкопряда, а также вирусными заболеваниями дыхательных путей телят и свиней. 5.3.2.3. Препараты, ингибирующие синтез вирусных нуклеиновых кислот Наибольший успех химиотерапии вирусных инфекций связан с изучением аномальных нуклеозидов и нуклеотидов, являющихся ингибиторами биосинтеза нуклеиновых кислот и действующих по принципу антиметаболизма, т.е. вследствие способности вступать (до поры до времени!) в биохимические реакции вместо имитируемых природных продуктов. Этот успех обусловлен тем, что многие вирусы для репликации своих нуклеиновых кислот предпочитают использовать свои собственные ферменты, а не ферменты клетки-хозяина. При этом оказалось, что очень часто субстратная специфичность вирусных ДНК- и РНК-полимераз существенно отличается от специфичности аналогичных клеточных ферментов. Именно это обстоятельство дало возможность использовать стадию синтеза вирусных ДНК и РНК в качестве мишени для антивирусной интервенции (атаки). Указанный подход привел к созданию большинства специфических антивирусных препаратов, которые используются в настоящее время. Следует подчеркнуть, что все нуклеозидные аналоги сами по себе совершенно неактивны и являются фактически «про-лекарствами», так как они для превращения в активную субстанцию должны подвергнуться в клетке метаболической активации. Обобщенная цепь биохимических событий, происходящих при активации аномальных нуклеозидов, представлена на рис. 5.4. На первой стадии активации нуклеозид под действием нуклеозидкиназы трансформируется в нуклеозид-5’-монофосфат (НМФ). Крайне желательно, чтобы это превращение был способен катализировать только вирусный фермент. В этом случае клетки без вируса оказываются вне действия препарата, и он характеризуется исключительно высоким ХТИ. Примером такого препарата может служить ацикловир, который фосфорилируется тимидинкиназой ВПГ-1 в 200 раз эффективнее, чем киназами клетки. Трансформацию образовавшегося на первой стадии НМФ в нуклеозид5’-дифосфат (НДФ) и нуклеозид-5’-трифосфат (НТФ) обычно осуществляют низкоспецифичные клеточные ферменты. Как видно из схемы, конечным продуктом активации является 5’-трифосфат аномального нуклеозида, который приобретает способность конкурировать с каноническими НТФ в реакции синтеза вирусной нуклеиновой кислоты. Рис. 5.4. Общая схема метаболизма и проявления активности модифицированных нуклеозидов (Н). Антиметабилическое действие аномального НТФ может проявляться прежде всего в ингибировании вирусной ДНК- или РНК-полимразы. Кроме того, включающийся в состав нуклеиновой кислоты аномальный нуклеозид приводит к образованию популяции вирионов, которые из-за множества мутаций не обладают инфекционностью. Отдельного внимания заслуживает вариант механизма противовирусного действия, приводящий к терминации роста цепей ДНК или РНК. Это касается нуклеотидов, встраивание которых в растущую цепь нуклеиновой кислоты блокирует её дальнейшую элонгацию, т.к. они лишены 3’-ОН-группы, необходимой для присоединения следующего нуклеотида. В редких случаях антивирусная активность проявляется на стадии нуклеозид-5’-моно- и/или –дифосфатов. Примером может служить виразол (рибавирин) – полусинтетический нуклеозид, который можно рассматривать в качестве аналога гуанозина. Виразол в клетке метаболизируется, превращаясь в виразол-5’-монофосфат. Последний конкурентным образом ингибирует инозинмнофосфатдегидрогеназу, что приводит к угнетению синтеза гуаниновых нуклеотидов. Широко известные в настоящее время нуклеозидные антивирусные препараты по механизму действия можно подразделить на: • ингибиторы ДНК-полимеразы (видарабин и др.); • ингибиторы обратной транскриптазы (диданозин и др.); • препараты, вызывающие синтез дефектных вирусных нуклеиновых кислот (идоксуридин и др.) или терминацию самого синтеза (зидовудин и др.); • нуклеозидые аналоги широкого спектра действия (пример – виразол). ВИДАРАБИН (9-β-D-арабинофуранозиладенин; аденинарабинозид; ара-А; вира-А и др.). NH2 N N N N O HO HO OH Видарабин является аналогом 2’-дезоксиаденозина. Спектр и механизм действия. Препарат активен против широкого спектра ДНК-геномных вирусов, среди них: ВПГ 1-го и 2-го типов, варицелла-зостер, цитомегаловирус, вирусы Эпштейна-Барр и осповакцины. Видарабин способен проникать через гематоэнцефалический барьер (в связи с чем он особо показан при герпетических энцефалитах). В клетках видарабин под действием клеточных ферментов превращается в 5’-трифосфат, который, ингибируя вирусную ДНКполимеразу, нарушает синтез вирусной ДНК. Недостаток видарабина заключается в том, что при введении в организм он под действием аденозиндезаминазы крови быстро трансформируется в малоактивный гипоксантинарабинозид. Показания. Герпетический энцефалит, неонатальный герпес, а также комплексное лечение системных герпетических инфекций. Из-за плохой растворимости препарат назначают внутривенно 15 мг/кг веса в день в течение 10 дней в большом объеме жидкости (1,5-2,5 л). Для повышения терапевтической эффективности видарабин рекомедуется вводить совместно с ингибиторами аденозиндезаминазы (коформицин, пентастатин). В последние годы исследования по совершенствованию лекарственной формы видарабина привели к созданию хорошо растворимого 5’монофосфата (видарабин-монофосфат; ара-АМФ), который можно вводить не только капельным путем, как видарабин, но и путем инъекций. ИДОКСУРИДИН (5-йод-2’-дезоксиуридин; керецид; ИДУ; и др.). Это первый нуклеозидный препарат, который был разрешен для применения в клинике при лечении вирусных инфекций. O I HN O N O HO OH Спектр и механизм действия. Обладает ингибирующей активностью в отношении ВПГ 1-го типа, осповакцины и др. ДНК-содержащих вирусов. Превращаясь в клетке в 5’-трифосфат, идоксуридин становится субстратом вирусной ДНК-полимеразы и включается в структуру вирусной ДНК. Поскольку идоксуридин, попадая в ДНК на место тимидина, способен при репликации образовывать комплементарную пару не с аденином, а с гуанином, в результате образуется популяция вируса с дефектной (из-за множества мутаций) ДНК. Показания. Применяют в офтальмологии практике как местное (0,1%ный раствор или 0,5%-ная мазь) средство при герпетических кератитах. Идоксуридин фосфорилируется как вирусной, так и клеточной (хотя и в меньшей степени) тимидинкиназой. В связи с этим, он довольно легко встраивается в ДНК и неинфицированных клеток. По этой причине при попытках системного применения препарата регистрировались значительные побочные эффекты. Кроме токсичности, к недостаткам идоксиуридина следует отнести также сравнительно быстрое развитие устойчивости к препарату. При этом под влиянием идоксиуридина идет селекция вирусов с низким содержанием вирусспецифической тимидинкиазы. Поэтому длительное применение препарата запрещено. ТРИФТОРИДИН (5-трифторметил-2’-дезоксиуридин; трифтортимидин; ТФТ). O CF3 HN O N O HO OH Трифторидин, как и идоксуридин, является аналогом тимидина, однако степень ингибирующего действия в отношении ДНК-геномных вирусов (герпес-, покс-, аденовирусов) у него существенно выше, чем у идоксуридина. Противовирусные механизмы действия у этих двух нуклеозидов также схожи между собой. Отличие состоит лишь в более высокой (в 15-20 раз) скорости фосфорилирования трифторидина вирусспецифической тимидинкиназой. В результате при герпетических и аденовирусных кератитах 1%-ный раствор трифторидина обеспечивает более высокий терапевтический эффект, чем капли идоксуридина. БВДУ [5-(2-бромвинил)-2‘-дезоксиуридин; уридин; хелпин]. бромвинилдезокси- O H HN O Br H N O HO OH Препарат эффективен в отношении вирусов ВПГ 1-го и 2-го типов, варицелла зостер и псевдобешенства. Вирусингибрующие концентрации составляют всего 0,5-0,01 мкг/мл. Характерно, что вирус ГП-2 в 100-200 раз менее чувствителен к ингибирующему действию БВДУ по сравнению с вирусом ГП-1. В отношении ВГП-1 БВДУ является самым активным препаратом из известных в настоящее время. БВДУ применяют в виде 0,1%-ной мази и иньекций (7,5-25 мкг/кг/день) при лечении глубоких герпетических кератитов и опоясывающего лишая. Особенностью БВДУ является то, что он не влияет на нормальный метаболизм интактных клеток в концентрациях в 3000-10000 раз выше вирусингибирующей. Препарат в клетках фосфорилируется только вирсиндуцированной тимидинкиназой. Превращаясь в БВДУ-5;-трифосфат, он эффективно ингибирует вирусную ДНК-полимеразу. При этом чувствительность клеточной ДНК-полимеразы существенно ниже, чем вирусной. АЦИКЛОВИР [9-(2-гидроксиэтоксиметил)-гуанин; ациклогуанозин; зовиракс, цикловир и др.] – ациклический аналог гуанозина с высокой избирательностью к инфицированным вирусами клеткам. Структура ацикловира напоминает молекулу гуанозина, лишенную большей части углеводного цикла. O N HN H2N HO N N O Спектр и механизм действия. ВПГ 1-го и 2-го типа, варицелла-зостер. Метаболическая активация происходит только в вирусинфицированных клетках. Первый этап катализирует вирусспецифическая тимидинкиназа, экспрессируемая в клетках вскоре после заражения. За реализацию остальных этапов ответственны клеточные киназы. Образующийся ацикловир-5’-трифосфат избирательно ингибирует ДНК-полимеразу вирусов, которая в 30 раз более чувствительна к нему, чем клеточный фермент. Кроме того, включение ацикловира в молекулу ДНК тормозит дальнейший рост цепи из-за отсутствия 3’-гидроксильной группы, к которой должен присоединяться последующий нуклеотид. Таким образом, препарат не влияет на синтез ДНК в незараженных клетках, т.к. в них он не превращается в активную форму. Показания. Препарат назначают внутривенно и перорально для терапии поражений кожи и слизистых оболочек, вызванных вирусами простого герпеса, при тяжелых формах герпеса гениталий, опоясывающем лишае. Мазь назначают при герпетических кератитах, при инфекциях кожи и слизистых оболочек, герпесе губ и половых органов. Следует отметить, что при инфекциях, вызванных прочими герпетовирусами (напр., цитомегаловирусом или вирусом Эпштейна-Барр), ацикловир не назначают, т.к. эти возбудители лишены собственной тимидинкиназы. Препарат способен преодолевать гематоэнцефалический барьер, что позволило увеличить выживаемость больных герпетическим энцефалитом с 25% (без лечения) и 48% (получавших видарабин) до 75%. Ацикловир обладает наименьшей (после БВДУ) токсичностью из всех известных в настоящее время противовирусных антиметаболитов. К недостаткам препарата следует отнести довольно быстрое формирование к нему резистентных штаммов. ГАНЦИКЛОВИР [9-(1,3-дигидрокси-2-пропоксиметил)-гуанин] – ациклический нуклеозидный аналог, который по структуре молекулы еще больше напоминает гуанозин, чем ацикловир. O N HN H2N N N O HO OH Ганцикловир активен против ВПГ 1-го и 2-го типов, цитомегаловируса и вируса Эпштейна-Барр. Препарат в 10 раз более эффективен против цитомегаловируса, чем ацикловир, поскольку он в клетках, пораженных цитомегаловирусом, фосфорилируется только собственной киназой. Мишенью активированной формы ганцикловира – его 5’-трифосфата – является вирусная ДНК-полимераза. Препарат весьма эффективен при применении внутривенно и внутрь при цитомегаловирусных ринитах и энцефалитах. АЗИДОТИМИДИН [1-(3’-азидо-2’-дезоксирибозил)-тимин; зидовудин, ретровир; АЗТ и др.]. Структура азидотимидина (см. рис. 5.5) напоминает тимидин, за исключением наличия азидо-группы, замещающей гидроксил в положении 3’. Спектр и механизм действия. Препарат обладает активностью в отношении ретровирусов, включая ВИЧ. Азидотимидин фосфорилируется клеточными ферментами последовательно до моно-, ди- и трифосфата, который является мощным ингибитором обратной транскриптазы. Помимо этого, азидотимидин, оказываясь встроенным в формирующуюся цепь ДНК, терминирует ее дальнейшую элонгацию. Специфичность азидотимидина обусловлена тем, что он оказывает в 100 и более раз сильный ингибирующий эффект в отношении обратной транскриптазы ВИЧ по сравнению с ДНК-полимеразой клетки-хозяина. Показания. Уже долгое время дискутируется целесообразность использования азидотимидина на ранних (бессимптомных) стадиях СПИДа. Хотя препарат и снижает вирусемию и замедляет прогрессирование дефицита CD4+-лимфоцитов, но эти эффекты нивелируются через 2-3 года, что обусловлено возникновением резистентных вариантов ВИЧ. В результате значительного увеличения продолжительности жизни не наблюдается. Хотя т.н. «качество жизни» таких больных заметно отличается от тех, кто начинет принимать азидотимидин только на поздних стадиях развития болезни. Как правило, азидотимидин рекомендуется в комплексной терапии больных СПИДом и у ВИЧ-ифицированных с содержанием CD4+-клеток менее 200 в 1 мл периферической крови. Вводимые дозы препарата довольно высокие – 1,2-1,5 г в день. При этом у более 40% пациентов, принимающих азидотимидин, развиваются осложнения – анемия и нейтропения. Интересно отметить, что токсичность азидотимидина такова, что вначале он вообще был предложен в качестве цитостатика для терапии опухолей. Азидотимидин Дидезоксицитидин Дидезоксиинозин NH2 O O CH3 HN HN O HO O HO N O N N HN N N O O HO N3 Ламивудин Ставудин O NH2 CH3 H N NH N HO O O H O O N O S Рис. 5.5. Структурные формулы нуклеозидов, активных против ВИЧ. Кроме того, обычно через 6 мес после начала приема препарата регистрируют развитие резистентности, которая связана с мутацией в гене обратной транскриптазы. Азидотимидин показан и для профилактических целей медперсоналу с высокой степенью риска заражения (например, при случайном уколе зараженной иглой), хотя убедительные доказательства, подтверждающие эффективность профилактического приема препарата отсутствуют. ДИДЕЗОКСИЦИТИДИН (2’-3’-дидезоксицитидин; зальцитабин; ДДЦ) назначают, как правило, при устойчивости к азидотимидину либо при отсутствии эффекта последнего. Механизм действия дидезоксицитидина аналогичен таковому азидотимидина. Препарат обладает рядом серьезных побочных эффектов, включая невралгию (у 22-35%) и панкреатит (у 1,1%). ДИДЕЗОКСИИНОЗИН (2’,3’-дидезоксиинозин; диданозин; видекс; ДДИ) – близкий по эффективности аналог дидезоксицитидина, но проявляющий меньшую токсичность. Также, как и дидезоксицитидин, применяют для поддерживающей терапии СПИДа у пациентов, которым противопоказан азидотимидин. ЛАМИВУДИН [(L)-2’-дезокси-3’-тиоцитидин; 3ТЦ] – аналог азидотимидина. Сочетание с ним обеспечивает лучший клинический эффект у ВИЧ-положительных пациентов и больных СПИДом. СТАВУДИН (2’,3’-дидегидро-2’,3’-дидезокситимидин; Д4Т) – ингибирует обратную транскриптазу на том же уровне, что и азидотимидин, но, из-за меньшей токсичности, переносится больными гораздо лучше. НЕВИРАПИН. Обратная транскриптаза ВИЧ является мишенью не только для антивирусных препаратов нуклеозидной природы. В настоящее время уже разработаны и т.н. ненуклеозидные ингибиторы этого фермента. Примером такого препарата может служить невирапин, который по структуре молекулы относится к классу дипиридиндиазапинонов. O H N H 3C N N N Механизм действия. Невирапин связывается непосредственно с обратной транскриптазой ВИЧ 1-го типа и неконкурентно ингибирует РНКзависимую и ДНК-зависимую ДНК-полимеразные активности этого фермента. Существенно, что ни матрицы, ни субстраты обеих полимеразных реакций не являются конкурентами невирапина при связывании его с обратной транскриптазой. При этом важно, что эукариотные ДНКполимеразы (такие как ДНК-полимеразы α, β, γ и δ человека) невирапином не ингибируются. В культуре клеток невирапин демонстрирует синергизм против ВИЧ-1 в комбинациях с зидовудином, диданозином, ставудином и ламивудином. Однако, корреляция между чувствительностью ВИЧ-1 к невирапину и ингибированием репликации ВИЧ-1 в клинике пока только устанавливается. ВИРАЗОЛ (1-β-D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3-карбоксамид; рибавирин; рибамидил и др.). O N H2N N N O HO OH OH Виразол представляет собой полусинтетический нуклеозид, выступающий в клетке как аналог гуанозина и инозина. Испытания препаратов на основе виразола проводятся уже много лет, однако молекулярный механизм его действия полностью не раскрыт и клинические возможности его еще далеко не определены. Спектр и механизм действия. Прежде всего установлено, что виразол обладает очень широким спектром противовирусной активности. Он ингибирует размножение большинства ДНК- и РНК- содержащих вирусов (в т.ч. пикорна-, рео-, тога-, бунья-, рабдо-, корона- и ретровирусов), включая вирусы растений. В клетке виразол метаболизируется, превращаясь последовательно в моно-, ди- и трифосфат. В отличие от многих других нуклеозидных антиметаболитов, действие виразола начинается уже на стадии монофосфатного производного. В частности, виразол-5’-монофосфат ингибирует синтез ГМФ. По-видимому, это происходит на этапе превращения ИМФ в ксантозин-5’-монофосфат. Кроме того, виразол-5’-трифосфат в качестве аналога ГТФ ингибирует инициацию и элогацию процесса синтеза РНК вирусной РНК-полимеразой, а также ингибирует гуанилилтрансферазу, что приводит к нарушению формирования специфической структуры (т.н. «кепа», содержащего метилированный гуанин) на 5’-конце мРНК. Цитотоксические дозы виразола в экспериментах in vitro колеблются от 200 до 1000 мкг/мл (в зависимости от клеточной линии), а его минимальная вирусигибирующая концентрация составляет 0,001 мкг/мл. Таким образом, в вирусингибирующих концентрациях виразол не влияет на ферментативные системы клетки-хозяина. Показания. Виразол используется при стационарном лечении грудных младенцев и детей раннего детского возраста с тяжелыми инфекциями нижних дыхательных путей, вызванных респираторно-синцитиальным вирусом (RSV). Обработка детей проводится в кислородной палатке либо через кислородную маску. Кроме RSV-инфекции, определенный опыт клинических исследований виразола накоплен при лечении гепатита В, кори, генитального герпеса, лихорадки Ласса и ряда других заболеваний вирусной этиологии. Однако наибольшую эффективность виразол (в сочетании с рекомбинантным интерфероном-α-2b) проявил в комбинированной терапии хронического гепатита С. Следует особо подчеркнуть, что комбинированный препарат под общим наименованием REBETRON разрешен для лечения хронического гепатита С в таких странах, как США, Канада, Германия и др. Пока остается неясным, почему комбинация интерферона и виразола намного эффективнее обоих этих агентов, применяемых порознь. Возможно виразол потенцирует эффект интерферона за счет индуцирования более мощной иммунной реакции в отношении вируса. Подтверждением этому могут служить последние работы, посвященные иммуномодулирующему действию виразола. Так, Taмм с соавт. (1999) изучали на изолированных Т-клетках человека способность виразола влиять на экспрессию ими цитокинов, поскольку, как известно противовирусный иммунитет в первую очередь обусловлен цитотоксичными Т-клетками и противовирусными цитокинами (тип 1). Было показано, что виразол увеличивает продукцию цитокинов типа 1 [интерлейкин-2 (ИЛ-2), интерферон-γ и TNF-α], в то же время подавляя экспрессию цитокинов типа 2 (ИЛ-4, ИЛ-5 и ИЛ-10). Авторы связывают активность виразола в комбинации с интерфероном-α против вируса гепатита С с его способностью увеличивать экспрессию цитокинов первого типа. В заключение раздела о противовирусных руклеозидах следует отметить, что недостатком подавляющего большинства препаратов на основе аномальных нуклеозидов (исключение – виразол) является довольно узкий спектр их действия (иногда только на один штамм или серотип). Более серьезный недостаток указанных препаратов – формирование к ним устойчивых вариантов вирусов. Эта устойчивость является результатом изменения наследственных свойств вирусов и развивается при длительном использовании препаратов. В ее основе лежит селекция резистентных мутантов. При этом характер мутаций зависит от типа применяемого препарата. Например, резистентность к ацикловиру обусловлена появлением мутантов с измененной структурой тимидинкиназы или ДНК-полимеразы. Устойчивость к азидотимидину появляется в результате мутаций в генах, кодирующих структуру обратной транскриптазы, приводящих к снижению аффинности фермента к данному нуклеозиду. При этом следует иметь в виду, что появление устойчивых вариантов связано не с возникновением их под действием лекарственного средства, а с селекцией резистентных мутантов, которые возникают вне связи с действием химиопрепаратов. В настоящее время выделяют два основных подхода к преодолению устойчивости к химиопрепаратам: комбинированное применение препаратов с различными механизмами действия и использование препаратов, воздействующих на возможно более ранние этапы репродукции, что резко снижает вероятность развития резистентности. 5.3.2.4. Ингибирование экспрессии вирусных генов Экспрессия вирусных генов меньше подходит для химической атаки на вирус, чем репликация генома, поскольку вирусспецифические процессы транскрипции генома, созревания мРНК и ее трансляция в гораздо большей степени зависят от клеточной биохимической машинерии, чем процессы синтеза вирусных нуклеиновых кислот. Поэтому представляется неслучайным, что никаких клинически значимых лекарственных препаратов, которые бы дискриминировали экспрессию вирусных и клеточных генов, пока не разработано. Однако поиск таких препаратов продолжается, и здесь следует напомнить, что у некоторых вирусов белки (полипротеины) претерпевают посттрансляционный процессинг – протеолитическое разрезание вирусными и клеточными протеазами. Сейчас эти процессы становятся предметом т.н. нетрадиционной химиотерапии вирусных инфекций. В частности, в настоящее время проходят клинические испытания препараты (Indinavir, Ritonavir, Nelvinavir и др.), механизм действия которых заключается в ингибировании протеаз, которые специфически расщепляют вирусные полипротеины. Действующим веществом указанных препаратов являются пептидные аналоги. Эти вещества специфичны для протеазы ВИЧ и конкурентным образом ингибируют фермент, предотвращая созревание вирионов, способных инфицировать другие клетки. Что касается заключительных этапов цикла репликации вирусов, необходимо отметить, что для большинства вирусов процессы сборки, созревания и выхода из клетки до сих пор мало изучены и, поэтому, пока не являются мишенями для антивирусной атаки. В заключение раздела, касающегося характеристики средств борьбы с вирусами, приходится констатировать, что более 90% существующего арсенала антивирусных препаратов используются в отношении очень ограниченного числа вирусных инфекций. Ситуацию скрашивает лишь то, что эти препараты эффективны против наиболее распространенных вирусных заболеваний (грипп и прочие ОРВИ, а также различные герпетические поражения). В то же время химитерапевтических препаратов для эффективного лечения ВИЧ-инфекции, нейровирусных поражений и эндогенных гепатитов крайне недостаточно. Для всей остальной массы вирусных инфекций этиотропных средств нет. Общим недостатком имеющихся антивирусных препаратов является довольно узкий спектр активности, а также быстрое формирование резистентных к ним штаммов. На наш взгляд, наиболее рациональная стратегия противовирусной терапии должна включать вакцины (чтобы стимулировать иммунный ответ), индукторы интерферона для мобилизации неспецифической системы защиты и, наконец, этиотропные химиопрепараты для завершения процесса ингибирования репликации вируса. Рекомендуемая литература Основная Брязжикова Т.С., Юрлова Т.И., Чижов Н.П. Резистентность вируса простого герпеса к ацикловиру: лабораторный и клинический аспекты // Антибиот. и химиотерап. 1995. Т. 40, № 11-12. С. 29-33. Глушков Р.Г., Гуськова Т.А., Николаева И.С. и др. Оригинальный отечественный противовирусный препарат оксолин; уточнение структуры и опыт применения оксолиновой мази в медицинской практике // Хим.-фармац. ж. 1999. Т. 33, № 9. С. 47-53. Елинов Н.П. Основы биотехнологии. СПБ: Наука, 1995. С. 544-555. Ершов Ф.И. Система интерферона в норме и патологии. М.: Медицина, 1996. 239 с. Медицинская микробиология / Под ред. В.И.Покровского, О.К.Поздеева. М.: ГЭОТАР Медицина, 1999. С. 698-715. Михайлопуло И.А. Аналоги компонентов нуклеиновых кислот – источник противовирусных и противоопухолевых препаратов XXI века // Рецепт. 1999. № 3. С. 14-23. Пширков С.Н. Теперь мы будем грозить вирусам // Наука в России. 1999. № 5. С. 83-84. Ручко В.М., Михайлов В.В., Борисевич С.В. и др. Некоторые методические аспекты создания вакцин «нового поколения» // Биотехнология. 2002. № 1. С. 70-77. Садовникова В.Н., Сухинин Н.В. Вакцина – будущее медицины // Бизнес мед. 1999. № 2. С. 14. Фрейдлин И.С. От вирусов нас защищают клетки-убийцы // Сорос. образов. ж. 1997. № 6. С. 33-35. Юркевич А.М. Конструирование новых препаратов с анти-ВИЧ активностью. Новые мишени и новые ингибиторы // ВИЧ/СПИД и родств. пробл. 2000. Т. 4, № 1. С. 65-66. Giese M. DNA-аntiviral vaccines: new development and approaches - a review // Virus Genes. 1998. V. 17, № 3. P. 219-232. Herdewijn P. Structural requirements for antiviral activity in nucleosides // DDT. 1997. V. 2, № 6. Р. 235-242. Дополнительная Дьяков С.И., Чижов Н.П., Сидоренко С.В. Современные антибиотики и противовирусные препараты в экспериментальной химиотерапии бактериальных и вирусных инфекций. Мн.: Беларусь, 1988. С. 81-166. Сэнфорд Д., Гилберт Д., Гербердинг Д., Сэнде М. Антимикробная терапия. Карманный справочник. Перев. с англ. М.: Практика, 1996. С. 142150. Харкевич Д.А. Фармакология. М.: ГЭОТАР Медицина, 1999. С. 548-556. Чижов Н.И., Ершов Ф.И., Индулен М.К. Основы экспериментальной химиотерапии вирусных инфекций. Рига: Зинатне, 1988. 171 с. Tam R.C., Pai B., Bard J. et al. Ribavirin polarizes human T cell responses towards a Type 1 cytokine profile // J. Hepatol. 1999. V. 30, № 3. P. 376-382. Wittendorf M. Therapeutic vaccination. // Virus Res. 2002. V. 82, № 1-2. P. 133-140. Глава 6. ОСНОВНЫЕ СОЦИАЛЬНО-ЗНАЧИМЫЕ ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ И БОРЬБА С НИМИ 6.1. Грипп (influenza) 6.1.1. Характеристика возбудителя Структура и свойства. Вирус гриппа (Mixovirus influenzae) принадлежит к сем. Orthomyxoviridae. Вирион (см. рис. 6.1) относится к категории сложных и имеет размер 80-120 нанометров. Сердцевина вируса, где находится нуклеокапсид, содержит одноцепочечную отрицательную цепь РНК, состоящую из 8 фрагментов, которые кодируют 10 белков. Нуклеокапсид имеет спиральную симметрию. Снаружи он покрыт слоем матриксного (М1) белка, который примыкает к двухслойной липидной оболочке. На поверхности этой оболочки выступают гликопротеидные «шипы» - гемагглютенин, названный по способности агглютенировать эритроциты, и нейраминидаза. Гемагглютенин обеспечивает возможность вируса присоединяться к клетке. Нейраминидаза отвечает за способность вирусной частицы проникать в клетку-хозяина и выходить из клетки после завершения цикла размножения. Белок, связанный с РНК (также называемый S-антигеном) постоянен по своей структуре и определяет тип вируса (А, В или С). Поверхностные антигены (гемагглютенин и нейраминидаза – V-антигены), напротив, изменчивы и определяют разные штаммы одного типа вируса. Рис. 6.1. Структура вируса гриппа. Вирус гриппа при температуре 4оС может сохраняться в течение 2-3 недель. При комнатной температуре разрушается в течение нескольких часов. Быстро погибает вирус при нагревании, высушивании, действии ультрафиолета. Вирус вызывает острое респираторное заболевание, протекающее с явлениями общей интоксикации и поражением респираторного тракта. Следует отметить, что под названием «острые респираторные заболевания» (ОРЗ) объедены грипп и большая группа болезней, характеризующаяся преимущественным поражением дыхательных путей. К ним относятся парагрипп, аденовирусная, риновирусная, коронавирусная, респираторносинтициальная инфекции. Статистика свидетельствует, что каждый взрослый человек в среднем в год болеет 2 раза гриппом или другими ОРЗ. Вирус гриппа А как правило вызывает заболевание средней и сильной тяжести. Поражает как человека, так и некоторых животных. Именно вирусы гриппа А ответственны за появление пандемий и тяжелых эпидемий. Имеется множество подтипов вируса типа А, которые классифицируются по поверхностным антигенам. Согласно меморандуму ВОЗ, гемагглютенин вируса гриппа А имеет 15 антигенно различных типов, из которых только первый, второй и третий вызывают заболевания у человека. Остальные типы вызывают заболевание у птиц и многочисленных млекопитающих: от свиней и лошадей до китов и моржей. Кроме того, у вируса различают 9 типов нейраминидазы. Вирус видоспецифичен: т.е., как правило, вирус птиц не может поражать свинью или человека, и наоборот. Однако вспышка птичьего гриппа (H5N1) в Гонконге в 1997 г. (когда было отмечено заражение человека от птиц) подтвердила, что в жизни бывают исключения из правил. Справедливости ради необходимо отметить, что вирус H5N1 поразил в Гонконге только 18 человек. Если бы такой вирус смог переходить от человека к человеку, то в 6-тимиллионном городе была бы колоссальная эпидемия. К счастью, этого не произошло. Предполагается, что резервуаром вирусов в природе являются водоплавающие птицы, поскольку в них обнаружены все известные серотипы гемагглютенина и нейраминидазы. Вирус гриппа В, как и вирус гриппа А, способен изменять свою антигенную структуру. Однако эти процессы выражены менее четко, чем при гриппе типа А. Вирусы типа В не вызывают пандемий и обычно являются причиной локальных вспышек и эпидемий, охватывающих одну или несколько стран. Вирусы гриппа В чаще вызывают заболевания у детей и циркулируют только в человеческой популяции. Вирус гриппа С достаточно мало изучен. Известно, что в отличие от вирусов А и В, он содержит только 7 фрагментов РНК и один поверхностный антиген. Инфицирует только человека. Симптомы болезни обычно легкие. Он не вызывает эпидемий. Чаще заболевают дети. Атигенная структура не подвержена таким изменениям, как у вирусов типа А. Международная система кодировки вирусов гриппа. За многие годы появилось множество вариантов вируса гриппа. В связи с этим возникла необходимость в систематизации с тем, чтобы можно было отличать их друг от друга. Была разработана система кодировки, благодаря которой каждый вариант получил свой код. Например, запись А/Бангкок/1/79/(Н3N2) включает: 1. обозначение типа вируса; 2. географическое место выделения вируса; 3. порядковый номер выделенного в данном году вируса; 4. год выделения; 5. обозначение антигенного подтипа. Если вирус был выделен у животного (а не у человека), то после указания типа вируса указывается сокращенное название животного. История эпидемий гриппа. Первые упоминания о гриппе были отмечены много веков назад – еще в 412 году до н.э. описание гриппоподобного заболевания было сделано Гиппократом. Первая задокументированная пандемия гриппа, унесшая много жизней, случилась в 1580 г. Печально известная «испанка», вызванная вирусом H1N1, произошла в 1918-1920 гг. Это самая сильная из известных пандемий. Она унесла около 40 млн. жизней, что примерно в 3 раза больше, чем погибло в Первую Мировую войну. От нее серьезно пострадали 20-40% населения Земного шара. Смерть наступала крайне быстро, часто в течение одного дня. Возбудитель заболевания был открыт Ричардом Шоупом в 1931 г. Выделен вирус (А) впервые в 1933 г. английскими вирусологами Смитом, Эндрюсом и Лейдлоу. В 1940 г Френсис и Меджил выделили вирус гриппа В. В 1947 г. Тейлору удалось выделить возбудитель гриппа С. В 1940 г. было сделано важное открытие – вирус гриппа может быть культивирован на куриных эмбрионах. Благодаря этому появились новые возможности для изучения этого возбудителя. В 1957-1958 гг. случилась пандемия, вызванная вирусом H2N2, которая получила название «азиатский грипп». Пандемия началась на Дальнем Востоке и быстро распространилась по всему миру. Только в США во время этой эпидемии скончалось более 70000 человек. В 1968-1969 гг. произошла пандемия «Гонконгский грипп», вызванная вирусом H3N2. Пандемия началась в Гонконге. Число погибших составило около 34000 человек, в основном старше 65 летнего возраста. В 1977-1978 гг. произошла относительно легкая по степени тяжести пандемия, названная «русским гриппом». Вирус гриппа (H1N1), вызвавший эту пандемию, уже вызывал эпидемию в 50-х гг. Поэтому в основном пострадали лица, родившиеся после 1950 г. 6.1.2. Патогенез Вирус проникает в клетку в результате рецептор-опосредованного эндоцитоза (рис. 6.2). Перед этим, антирецептор вируса – гемагглютенинсвязывается с гликопротеидным рецептором на поверхности клеток эпителия, выстилающего респираторный тракт. После слияния вирусной и лизосомальной мембран нуклеокапсид попадает в цитоплазму и из нее мигрирует в ядро. В ядре на вирусной (−)РНК как матрице вирионная РНКтранскриптаза синтезирует два класса (+)РНК: • неполные комплементарные копии родительской цепи. Эти 3’полиаденилированные транскрипты содержат 5’-кеп. Они экспортируются в цитоплазму и служат там в качестве мРНК, т.е. транслируются в вирусспецифические белки; • полные комплементарные копии матрицы. Они не полиаденилированы и служат, в свою очередь, матрицами для синтеза (−)РНК потомства. Рис.6.2. Схема репродукции вируса Большинство белков (в т.ч. гемагглютенин и нейраминидаза) остаются в цитоплазме. Однако белок NP (нуклеокапсидный) мигрирует назад в ядро, где он соединяется с вновь синтезированными (−)РНК потомства. Образовавшиеся капсиды мигрируют в цитоплазму. Вирионы потомства выходят из клетки путем отпочковывания. При этом клетка хотя и не лизируется (по крайней мере на начальных стадиях заболевания), но в конечном счете неминуемо погибает. Первоначально возбудитель реплицируется в эпителии верхних отделов дыхательных путей, вызывая гибель инфицированных клеток. Цикл репликации вируса занимает всего 4-6 ч. Через поврежденные эпителиальные барьеры вирус проникает в кровоток. Вирусемия сопровождается множественными поражениями эндотелия капилляров с повышением их проницаемости. Инкубационный период 1-3 дня, после чего повышается температура тела с миалгиями, фарингитом, кашлем, головными болями. Ринит (характерный для других простудных заболеваний) бывает редко. Продолжительность лихорадочного периода – 3-5 сут. Основной путь передачи возбудителя – воздушно-капельный. Риск заражения максимален в местах скопления людей. Заболевший становится заразным за 24 ч до появления основных симптомов. Гриппозная инфекция приводит к подавлению иммунитета, а это, в свою очередь, приводит к пневмонии и обострению сопутствующих хронических заболеваний. Смертность от гриппа пока недооценивается. Дело в том, что бльные умирают чаще всего не во время гриппа, а несколько позже. В тоже время вирус удается выделять от больного только до пятого дня заболевания. Американские физиологи подсчитали, что даже при обычном, средней тяжести гриппе человеку приходиться тратить столько сил на выздоровление, что каждый случай гриппа стоит одного года жизни даже для здорового человека. Характерно, что много хроников умирает через 2-3 месяца после «выздоровления», и им ставится диагноз, не связанный с гриппом. Хотя на самом деле причиной смерти был грипп. Грипп поражает людей всех возрастов, но особую опасность представляет для маленьких детей и пожилых людей из-за отсутствия соответствующего иммунитета у первых и ослабления иммунитета у вторых. Эпидемии гриппа случаются каждый год обычно в холодное время года и поражают до 15% населения Земного шара. Периодически повторяясь, грипп (и ОРЗ) постепенно подрывают сердечно-сосудистую систему, сокращая на несколько лет среднюю продолжительность жизни человека. Грипп и ОРЗ занимают первое место по частоте и количеству случаев заболеваний в мире. В России ежегодно регистрируется от 27 до 41 млн. заболевших гриппом и др. ОРЗ. 6.1.3. Лечение и профилактика гриппа При тяжелых формах гриппа назначают донорский нормальный иммуноглобулин или противогриппозный иммуноглобулин с высоким содержанием противовирусных антител. Амантадин и ремантадин. Эти противовирусные препараты облегчают клинические симптомы гриппа и уменьшают продолжительность болезни на 1,5-3 дня. Однако они обладают специфической активностью только в отношении вируса гриппа А и бессильны против вируса гриппа В. Эффективность данных препаратов составляет около 70%, причем только в случае их приема в течение первых 48 ч после начала заболевания и продолжении приема далее в течение всего времени заболевания до исчезновения симптомов. Амантадин и ремантадин блокируют на завершающих стадиях репродуктивного цикла вируса выделение клеткой инфекционных частиц. Следовательно, заболевание дальше не развивается. Также снижается вероятность заражения окружающих. Следует отметить, что эффективность этих препаратов быстро падает, из-за возникновения к ним резистентных вариантов вируса. Амантадин и ремантадин нельзя широко применят из-за ощутимых побочных эффектов, особенно среди пожилых людей. Кроме того, к ним быстро приобретается устойчивость, да и эффективны они только против гриппа А. Ингибиторы нейраминидазы. Одним из ферментов, играющих ключевую роль в репликации вируса гриппа, является нейраминидаза – фермент, который расщепляет сиаловую кислоту, связывающую гемагглютенин вириона с мембраной клетки-хозяина, давая, таким образом, возможность новым вирионам отсоединиться от клетки и завершить свой репликативный цикл. В присутствии ингибиторов нейраминидазы дочерние вирионы остаются прикрепленными к остаткам сиаловой кислоты на поверхности клетки. Они не могут покинуть старую клетку и инфицировать клетки новые. Не случайно, поэтому, нейраминидаза стала мишенью для препаратов новейшего поколения, основанных на ингибировании этого фермента. В настоящее время разрешены к клиническому использованию два ингибитора нейраминидазы – занамивир и оселтавир. Эти препараты активны против всех 9 известных подтипов нейраминидазы. Достоинством этих препаратов является то, что к ним практически не формируются устойчивые формы вируса. Предварительные исследования показали, что эффективность ингибиторов нейраминидазы составляет 67-82% и сокращает длительность болезни на 1-1,5 дней (если прием препарата начался не позднее 36-48 ч после начала заболевания). Препараты (в отличие от амантадина и ремантадина) не оказывают вредного действия на нервную систему. Однако, необходимо отметить, что в первые 48 ч далеко не всегда представляется возможность диагностировать заболевание, а именно дифференцировать грипп от других ОРЗ. Кроме того, ингибиторы нейраминидазы пока мало изучены и дороги. Профилактика. Для активной иммунизации применяют живые и инактивированные вакцины. Живые вакцины проявляют большую иммуногенность. Такие вакцины применяются повсеместно в странах СНГ и нигде больше. Убитые вакцины – довольно пирогенные и в настоящее время применяются редко. Среди инактивированных вакцин получены вирионные (приготовленные из высокоочищенных культур вирусов, выращенных in vitro), субъединичные (очищенные поверхностные Аг вируса – гемагглютенин и нейраминидазу) и дезинтегрированные (получают обработкой высокоочищенных культур вирусов детергентами) вакцины. К сожалению, поскольку антигенные варианты возбудителя наблюдаются достаточно часто, то набор Аг соответствующего вируса для иммунизации может быть определен только после начала вспышки. Таблица 6.1. Основные лекарственные средства, используемые для терапии и профилактики гриппа Лечение Амантадин и ремантадин (раннее лечение - при начале приема не позже первых 48 ч после начала заболевания). Профилактика Противогриппозные вакцины. Донорский нормальный или противогриппозный Ig человека. Оксолиновая мазь. Ингибиторы вирусной нейраминидазы (занамивир, оселтавир и др), раннее лечение. Интерфероны α и β (экстренняя профилактика). Рибавирин (виразол, вирамид). Индукторы интерферона Ремантадин. Интерфероны α и β (раннее лечение). Огромным недостатком противогриппозной вакцинации является то, что ее проводить надо практически ежегодно. У молодых людей вакцины обеспечивают 80-90% защиту. Однако у пожилого контингента, у которых наблюдается самая большая смертность, эффективность вакцинации не превышает 50%. Химиопрофилактику гриппа А осуществляют приемом небольших доз ремантадина, который дают в течение всей эпидемической вспышки. Хорошо себя зарекомендовала оксолиновая мазь, интраназально утром и вечером. Вакцинопрофилактика гриппа не может обеспечить 100% защиту от сезонных эпидемий, что связано с тем, что только возможных штаммоввозбудителей вируса гриппа насчитывается более 170. Поэтому все шире для профилактики гриппа (как и ОРЗ) начинают применяться препараты, влияющие на интерфероновую систему, которая представляет собой механизм естественной противовирусной защиты. При этом используются как препараты самого интерферона, так и его индукторы (арбидол, амиксин, полудан и др.). Преимуществом этого подхода заключается в том, что включаются универсальные механизмы защиты, т.е. направленные против всех вирусов, вызывающих ОРЗ, а не против конкретных штаммов, что характерно для вакцин. С нашей точки зрения, эти препараты наиболее перспективны для профилактики гриппа в ХХI в. 6.1.4. Угроза пандемии и перспективы создания противогриппозной вакцины История пандемий 20 в. (см. табл. 6.2.) показывает, что величайшая пандемия 1918 г. была вызвана появлением нового вируса (H1N1). Вторую пандемию вызвал в 1957 г. вирус H2N2, а третья имела место, благодаря вирусу H3N2 в 1968 г. В 1977 г. зарегистрирована слабая пандемия, обусловленная вирусом H1N1, потому что еще оставалось некоторое количество людей, которые имели иммунитет, сохранившийся со времен пандемии 1918 г. Сейчас циркулируют вирусы А H3N2 и H1N1 и вирус гриппа В. Следует подчеркнуть, что ежегодные потери от эпидемий в целом намного превышают потери от гораздо более редких пандемий. Таблица 6.2. Основные антигенные шифты вируса гриппа А (эволюция вируса гриппа А) Годы 1874 1890 1902 1918 1947 1957 1968 1977 Серовар H3N8 H2N2 H3N2 H1N1 H1N1 H2N2 H3N2 H1N1 Название Пандемия Эпидемия Испанский грипп (пандемия) Испанский грипп (эпидемия) Азиатский грипп (пандемия) Гонгконгский грипп (пандемия) Русский грипп (эпидемия) В 1997 г. человечество оказалось на пороге возможной пандемии гриппа. Среди населения Гонконга возникла вспышка гриппа А (H5N1), которая ограничилась 18 случаями заболевания (6 – со смертельным исходом). От умершего 3-летнего ребенка был выделен вирус гриппа (H5N1). Вирусы гриппа сероварианта Н5 до этого циркулировали только среди птиц, иногда вызывая эпизоотии со 100% смертельным исходом. Специалисты считают, что следующая пандемия гриппа неизбежна, однако никто не знает, когда именно она случится. Наибольшую эпидемическую опасность представляет в настоящее время серовары H3N2 и H2N2. Пандемии случаются в среднем каждые 30-40 лет, а в настоящее время вирус гриппа А (H3N2) циркулирует уже более 30 лет. Поскольку количество лиц, иммунных к вирусу H2N2, вызвавшему пандемию в 1957 г., неуклонно сокращается, то его также следует рассматривать как эпидемически опасный. Пандемия может начаться практически в любой момент, причем одновременно в разных странах. Воздействие пандемии на здоровье людей может быть очень сильным. По прогнозам только в России будет инфицировано до 120 млн. человек. До 60 млн. человек заболеют. До 500 тыс. человек будет госпитализировано. До 200 тыс. человек умрет. Эпидемии гриппа на Земле никогда не кончаются. Грипп – это заболевание «non stop». Следуя за сменой времен года, оно переходит из Южного полушария в Северное и обратно. И так до бесконечности. Т.е. постоянно где-то на Земле свирепствует грипп. Новая эпидемия возникает тогда, когда возникает новый вариант вируса, к которому старый иммунитет не может дать полной защиты. Изменения антигенной структуры могут происходить (см. рис. 6.3) двумя путями – в результате антигенного дрейфа и благодаря антигенному шифту. Антигенный дрейф обусловлен точечными мутациями, изменяющими первичную структуру поверхностных Аг. Хотя изменения Аг не значительны, специфичность Ат, циркулирующих в популяции снижается. Благодаря антигенному дрейфу каждая страна вынуждена практически ежегодно сталкиваться с эпидемией гриппа. Рис. 6.3. Антигенные дрейф и шифт вируса гриппа. Антигенный шифт обуславливает появление нового антигенного варианта вируса, не связанного либо отдаленно-родственного ранее циркулирующим вариантам. Подобные явления наблюдаются достаточно редко (каждые 20-30 лет). Существует мнение, что антигенный шифт – результат генетической рекомбинации между штаммами вируса человека и животных. В результате образуется новый серовар вируса, обычно вызывающий пандемию, т.к. в популяции практически отсутствует иммунная прослойка. По мере образования последней процесс затухает. Геном вируса гриппа, в отличие от геномов других РНК-содержащих вирусов, не представляет собой единую цепочку, а состоит из 8-ми самостоятельных структур. Такая структура генома вируса гриппа как раз и позволяет этому вирусу очень легко рекомбинировать. То есть, если в одной клетке размножаются два разных вируса гриппа (разных хотя бы по субтипу), то когда будет формироваться вирион, в него могут попасть фрагменты геномов разных вирусов. Именно этот механизм и определяет, каким образом возникают штаммы, способные вызывать пандемию вируса гриппа. Пандемия возникает тогда, когда появляется в результате антигенного шифта совершенно новый тип гемагглютенина. Итак, грипп – нетривиальное заболевание. Он убивает ежегодно тысячи людей, а у десятков тысяч ухудшает здоровье. Экономический ущерб огромен. Но грипп можно победить, и прежде всего, с помощью вакцин. Как известно, противовирусные вакцины готовятся с использованием куриных эмбрионов. Возможности такой технологии при угрозе пандемии окажутся весьма ограниченными. Не случайно ВОЗ постоянно подчеркивает необходимость разработки новых методов производства вакцины, в частности клеточных. В 1997 г. были выявлены новые вирусы в популяции человека. Возникла угроза пандемии не только теоретическая. К счастью, этот вирус не передавался от человека к человеку. Тревога оказалась ложной. Но совершенно ясно – человечеству просто повезло. Однако надеяться, что нам повезет и в следующий раз, не приходится. Вирус гриппа – возбудитель самой массовой инфекции в современном мире. Продолжаются попытки создать такую вакцину, которая бы могла защитить людей от «любого» вируса гриппа. Как уже отмечалось, вакцины есть убитые и живые. Убитые вакцины – довольно пирогенные и в настоящее время применяются мало. Живые вакцины представляют собой суспензию аттенуированных, т.е. ослабленных возбудителей гриппозной инфекции, неспособных вызвать острое заболевание, но способствующих выработке иммунитета против вирулентного вируса. С момента выделения вируса продолжается работа по созданию новых вакцин, и тем не менее, гриппозная инфекция до сих пор не побеждена. В США ежегодно заболевают не менее 70 млн. человек, а периодически – раз в 12-18 лет, гриппозная инфекция в виде пандемии поражает большинство населения планеты. Пандемии, которые поражают всю планету, никакой другой агент, кроме вируса гриппа, вызвать не может. Что мешает создать комплексную вакцину против разных вариантов вируса гриппа? Вирус гриппа, в особенности вирус А, меняются столь быстро, что угнаться за ним с помощью нынешнего поколения вакцин не удается. Особенно драматические события возникают при появлении нового пандемического варианта. В этом случае вакцина против прежнего варианта совсем не предохраняет организм от нового вируса. Как сделать вакцину «на все времена»? Как известно, ведущую роль в проникновении вируса гриппа в клетку и в индукции синтеза противовирусных Ат играют гемагглютенин и нейраминидаза. Они постоянно меняются, и именно за их изменчивостью вирусологам не угнаться. Но в составе вирусной частицы есть белки, которые расположены внутри капсида и не обладают способностью так быстро меняться, т.е. значительно более консервативны. Это – нуклеокапсидный белок, а также белок М1. Вот на основе этих белков, структура и антигенные свойства которых на протяжении десятилетий практически не меняются, планируется сделать вакцину. Эксперименты на животных дали обнадеживающие результаты. Так, показано, что плазмида, кодирующая нуклеокапсидный белок вируса гриппа человека, защищает мышей не только от штамма вируса, из которого взят ген, но и от другого штамма, выделенного из природы более чем 30 лет после первого. Такая перекрестная защита дает возможность думать об универсальной антигриппозной вакцине. 6.2. Вирусные гепатиты (hepatitis virosa) Вирусные гепатиты составляют большую группу инфекционных заболеваний, характеризующихся общей интоксикацией и преимущественным поражением печени. Заболевания вызываются по крайней мере пятью различными вирусами и образуют две группы гепатитов – энтеральные (А и Е) и парентеральные (В, С и D). Впервые высказал предположение об инфекционной природе «катаральной желтухи» (гепатита А) С.П.Боткин в 1888 г. Вирусная природа болезни была доказана в 1937 г. в США Дж.Финдлеем и Ф. Мак Коллюмом. В 1970 г. Д.Дейн выявил вирус гепатита В в крови и клетках печени. В 1973 г. С.Фейнстоуну в фекалиях больного удалось идентифицировать возбудителя гепатита А. В 1977 г. М.Ризетто описал вирус-сателлит D. В конце 80-х годов прошлого века группе специалистов США удалось выделить и идентифицировать геном вируса С. Наконец, вирус гепатита Е был идентифицирован М.С.Балаяном в 1982 г. Для гепатитов первой группы характерны вспышки эпидемий, поражающих порой сотни тысяч человек. Парентеральные гепатиты в свою очередь отличаются тяжелыми и хроническими формами. 6.2.1. Вирусный гепатит А Вирус гепатита А (ВГА) относится к роду Hepatovirus в составе семейства Picornaviridae. ВГА представляет собой сферические частицы диаметром 27-30 нм, построенные по типу икосаэдрической симметрии и лишенные оболочки. Вирусный геном представлен линейной, несегментированной одноцепочечной РНК. Эта РНК имеет положительную полярность, т.е. она непосредственно может выполнять матричную функцию, а, будучи изолированной, полностью сохраняет инфекционность. Подобно другим РНК, выполняющим функцию мРНК, геном ВГА содержит на 3’конце участок поли-А. Капсид ВГА построен из множества копий четырех структурных белков, обозначаемых как VP1, VP2, VP3 и VP4. Известен только один серотип ВГА. Это означает, что вакцина, изготовленная из любого штамма ВГА, будет эффективной в предотвращении заболевания привитого, в какой бы эпидемической ситуации он не оказался. Конечно, ВГА, как всякий другой вирус, подвержен естественным вариациям в результате мутаций. Различия в нуклеотидных последовательностях между отдельными штаммами могут достигать 15-25%. Однако, как бы ни велики были генные вариации ВГА, они не затрагивают структуру основного участка, который ответственен за выработку антител. ВГА считается одним из наиболее устойчивых вирусов к факторам внешнего воздействия. При комнатной температуре может сохраняться в течение нескольких недель, а при 4оС – несколько месяцев (однако кипячение приводит к разрушению вируса за 5 минут). Вирус устойчив к рН в пределах 3-10 и к органическим растворителям (таким как эфир, хлороформ, фреон и др.). Эффективно устраняют вирус дезинфекционные средства: хлорамин в концентрации 2-2,5 мг/мл или 3% формалин. Эпидемиология. ВГА распространен повсеместно, а гепатит А относится к числу наиболее широко распространенных в мире кишечных инфекций. Уровень заболеваемости кореллирует с санитарно-гигиеническим состоянием данной территории. Источник инфекции – больные люди. Механизм передачи фекально-оральный. Заражение происходит при употреблении инфицированной воды и пищи. Дети до 1 года малочувствительны к заражению ввиду сохранения у них пассивного иммунитета, полученного от матери. Патогенез. Вирус через портальную вену проникает в печень и поражает гепатоциты. При этом поражение клеток происходит не за счет прямого цитопатического действия, а в результате иммунологических механизмов. Проникая в печеночные клетки, ВГА видоизменяет их поверхностные структуры настолько, что организм начинает распознавать такие клетки как чужеродные и атакует их средствами своей иммунологической защиты. Стратегия репликации вируса в клетке-хозяине в общих чертах подчинена тем же закономерностям, которые свойственны и другим вирусам – членам 4-ой группы Балтимора (см. рис. 3.9). Репликация происходит в цитоплазме. В результате трансляции образуется функционально неактивный полипротеин, который «нарезается» протеазами на различные вирусспецифические белки. Высвобождение вируса сопровождается лизисом клетки. Типичная форма заболевания (инкубационный период – от 7 до 50 дней) имеет две стадии. Преджелтушная стадия (5-7 дней) сопровождается развитием гриппоподобного синдрома с тошнотой и анарексией. Желтушная стадия (2-3 недели) характеризуется желтушностью кожных покровов и склер, гепатомегалией. При этом, как правило, степень желтушности соответствует тяжести болезни. Сопутствующими признаками желтухи считают также обесцвеченный кал и темную мочу. Летальность, по данным мировой литературы, составляет 0,1-0,4%. Болезнь не оставляет хронических последствий. Гепатит А не завершается формированием хронического гепатита и вирусоносительства. Лечение и профилактика. Средства эффективной специфической противовирусной терапии отсутствуют, лечение симптоматическое. В настоящее время доступен сывороточный Ig, введение которого после заражения способно значительно смягчить течение болезни. Для профилактики людей, выезжающих в неблагополучные районы, разработаны эффективные убитые вакцины. Поствакцинальный иммунитет сохраняется 10 лет. Кроме того, широко используется иммунопрофилактика нормальным донорским Ig (невосприимчивость к возбудителю сохраняется до 4 мес.). пассивная человека 6.2.2. Вирусный гепатит Е Этиология. В 1980 г. М.Гуро сообщил о больных гепатитом с энтеральным способом заражения, в сыворотке крови которых лабораторно не определялись специфические маркеры известных гепатитов А и В. Заболевание получило название – фекально-оральный гепатит «ни А, ни В». В 1982 г. М.С.Балаян, обладавший иммунитетом к ВГА, заразил себя материалом, полученным от больных гепатитом «ни А, ни В», и заболел. В сыворотке крови появились антитела, отличные от антител против ВГА. Это наблюдение послужило экспериментальным доказательством существования этиологически самостоятельного возбудителя гепатита (ВГЕ), передающегося энтеральным путем и отличающегося от ВГА. ВГЕ принадлежит к сем. Caliciviridae и представляет собой икосаэдрические частицы диаметром 27-34 нм. Вирус отнесен к разряду простых (из-за отсутствия наружной оболочки). Он относительно неустойчив во внешней среде. Вирусным геномом служит одноцепочечная позитивная РНК. Эпидемиология. Гепатит Е широко распространен в странах с тропическим и субтропическим климатом, а также в среднеазиатском регионе. Считается, что ежегодно около 1 млн. человек заболевает гепатитом Е. Восприимчивость ВГЕ всеобщая, однако заболевание регистрируется чаще всего в возрастной группе 15-29 лет. Источником инфекции являются больные люди. Механизм передачи – фекально-оральный. Патогенез. ВГЕ изучен недостаточно. Инкубационный период составляет 15-40 дней. В общих чертах течение заболевания напоминает гепатит А. Хроническое течение для гепатита Е не характерно. Летальность в целом не превышает 0,4%. Особого внимания заслуживает гепатит Е у беременных женщин. У них это заболевание в 20-25% случаев сопровождается гибелью новорожденных. Лечение и профилактика. Специфические химиотерапевтические средства против ВГЕ (как и в случае с ВГА) не разработаны. Профилактика заболевания аналогична проводимой при гепатите А. 6.2.3. Вирусный гепатит В Гепатит В отличается тяжелыми и хроническими формами протекания заболевания. Не случайно его называют не меньшей проблемой, чем СПИД. Правда, в отличие от последнего, гепатит В пока еще излечим. А вот по распространенности он превосходит СПИД в тысячи раз. Этиология. Вирус гепатита В (ВГВ) является представителем рода Orthohepadnavirus, входящего в состав сем. Hepadnaviridae (от «hepar» печень; «dna» - ДНК). Помимо ВГВ человека, в это семейство входят вирусы гепатита сурков, земляных белок, сусликов, пекинских уток и др. животных. Объединяющие характеристики этих вирусов: сходное строение вириона, кольцевая ДНК, преимущественное размножение в клетках печени, возможность длительной (иногда пожизненной) циркуляции вируса в организме, взаимосвязь с развитием рака печени. Вирионы ВГВ (рис. 6.4) диаметром 42-45 нм (т.н. «полные частицы Дейна») имеют наружную оболочку, внутреннюю оболочку и нуклеокапсид, имеющий форму икосаэдра. Последний включает ДНК, фермент – ДНКполимеразу и сердцевинный белок - HBcorAg (HBcAg). Рис. 6.4. Схематическое изображение структуры вируса гепатита В. В составе внешней оболочки вируса находится основной поверхностный антиген - HBsAg (от англ. hepatitis B surface antigen), который ранее назывался «австралийским антигеном»). Этот белок имеет в своем составе несколько специфических антигенных детерминант. Димер из двух молекул основного белка составляет антигенный спектр, в соответствии с которым выделяют несколько подтипов вируса. Общей для HBsAg любого вируса является субдетерминанта «а». Другие субдетерминанты обозначаются буквами d, y, w, и r, а их комбинации составляют четыре главных подтипа ВГВ – adw, adr, ayw, ayr. Протективные свойства связаны в основном с антителами к групповой детерминанте «а». В организме людей, инфицированных ВГВ, выявляют вирусспецифические антигены: HBsAg – поверхностный антиген, HBcAg - сердцевинный антиген, HBeAg – антиген инфекционности, малоизученный антиген HBxAg, а также антитела ко всем этим антигенам. Как было указано выше, HВcAg находится в сердцевинной части вириона. Этот белок синтезируется в ядре гепатоцитов и, хотя он не способен проникать в кровь, играет важную роль в индукции иммунного ответа на вирус. В частности, экспрессия HBcAg на поверхности гепатоцита является сигналом для клеток-эффекторов. Кроме того выяснено, что в гене, кодирующем HВcAg, заложена информация и об HВeAg. Так, оказалось, что после синтеза HВcAg от него отщепляется HВеAg и активно секретируется в кровоток. Следует особо отметить, что HВeAg синтезируется и попадает в кровь только при активной вирусной репликации, поэтому считается её маркером. Здесь отметим, что вторым ключевым серологическим маркером, свидетельствующим о заражении ВГВ, является HBsAg. Функции HВxAg (кроме того, что он играет особую роль в развитии гепатокарциномы) сегодня еще не вполне ясны. ДНК-полимераза, которая может выполнять функцию обратной транскриптазы, принимает участие в процессе вирусной репликации. ВГВ обладает мутационной изменчивостью. Так, кроме «дикого» варианта ВГВ, существуют мутантные формы, напр., вариант «Сенегал», у которого не определяются антитела к HВсAg, или вариант ВГВе(-), у которого не определяются антитела к HВеAg. Вирусный геном представлен двухцепочечной молекулой ДНК, одна из цепочек которой короче (на 40%) другой и нуждается в достройке. ВГВ отличается чрезвычайно высокой устойчивостью к различным физическим и химическим воздействиям: к низкой и высокой температуре, УФ-облучению, длительному воздействию кислотной среды. Инактивируется вирус при кипячении, стерилизации сухим жаром (180оС, 60 мин). Биология вируса. ВГВ во многом уникален. • Геном ВГВ представлен двухцепочечной кольцевой молекулой ДНК (состоящей из 3200 нуклеотидов) – наименьшей среди всех известных в настоящее время вирусов. • Удивительное свойство генома ВГВ – его высокая информационная емкость. Это достигается тем, что в ДНК имеется 6 рамок считывания, перекрывающих друг друга. • Из всех известных ДНК-содержащих вирусов ВГВ имеет самый сложный цикл размножения. Его особенностью является наличие дополнительного этапа, когда при помощи клеточной ДНК-зависимой РНК-полимеразы синтезируется РНК, называемая «прегеномом», с которой при помощи вирусной ДНК-полимеразы синтезируется новая цепь ДНК (см. рис. 3.12). Наличие этапа обратной транскрипции позволяет обозначить ВГВ как «скрытый ретравирус». Усложненная схема репликации определяет повышенную возможность ошибок во вновь синтезированных цепях ДНК, что приводит к появлению мутантных форм ВГВ. Следует отметить, что в настоящее время все более широкое подтверждение находит идея о возможности интеграции генома или части его в хромосому клетки-хозяина. Эпидемиология. В настоящее время на Земле существует 350 млн. носителей ВГВ. По данным ВОЗ, более 1/3 населения мира были инфицированы ВГВ. Ежегодно от патологий, связанных с этой болезнью, умирает около 2 млн. человек. По сути дела, каждые 15-20 лет от ВГВ в мире погибает больше людей, чем за всю Вторую мировую войну. Из них ежегодно погибают: 600 тыс. – от острой и хронической инфекции, 700 тыс. – от цирроза и 300 тыс. – от рака печени. Экономический ущерб от ВГВ, к примеру, в США (страна с низкой эндемичностью) ежегодно превышает 300 млн. долларов. Распространенность ВГВ-инфекции в разных регионах колеблется в широких пределах. Особенно неблагополучными в этом отношении являются Юго-Восточная Азия и Африка, где частота хронически инфицированных достигает 15%. Более благополучная эпидемиологическая обстановка отмечается в Западной Европе, Северной Америке м Австралии (менее 2% носителей вируса). Среди населения Республики Беларусь хроническая персистенция ВГВ регистрируется с частотой от 0,7% в Витебской области до 1,5% в Гомельской. В США (а по некоторым оценкам и в России) число больных хроническим гепатитом В составляет около 1 млн. человек. Инфицирование вирусом происходит через кровь и другие жидкости организма. Вирус обнаруживается практически во всех секретах (сперма, моча, вагинальный секрет, слюна, грудное молоко, слезы и др.) Однако, помимо крови, возможность заражения доказана только через слюну и сперму. Установлено, что у значительной части больных имеет место заражение при парентеральных манипуляциях в медицинских учреждениях. Широкое использование гемотрансфузий до введения вирусологического контроля за донорами благоприятствовало распространению заболевания при переливании крови и ее препаратов. Кроме того, широкому распространению ВГВ способствует чрезвычайно высокая инфекционность вируса и устойчивость к различным физико-химическим факторам. Так, минимальная инфицирующая доза ВГВ на три порядка меньше, чем возбудителя СПИДа, и составляет всего 0,00004 мл вируссодержащей крови. Достигая клеток печени, вирус адсорбируется на их поверхности. В процессе адсорбции принимают участие, помимо вирусных антирецепторов (HВsAg), рецепторы на поверхности печеночных клеток. Имеются также сведения и о репродукции ВГВ в клетках костного мозга, селезенки, поджелудочной железы и т.д. Хотя гепатит В вызывается вирусом, сам по себе ВГВ не обладает прямым цитотопатогенным эффектом. Инфицированные гепатоциты, однако, атакуются и разрушаются в ходе защитных иммунологических реакций. При этом механизм разрушения гепатоцитов в самых общих чертах может быть описан следующим образом. Попав в кровь, вирус вызывает активацию В- и Т-клеточного звена иммунитета человека. Т-киллеры взаимодействуют с антигенами ВГВ и антигенами главного комплекса гистосовместимости, представленными на поверхности печеночной клетки, вызывая разрушение гепатоцитов. В типичных случаях принято выделять четыре периода заболевания гепатитом В: инкубационный период (60-180 дней), преджелтушный (5-7 дней), желтушный (5-10 дней) и реконвалесценцию. Наиболее постоянными симптомами (помимо желтушности склер и кожных покровов) являются общая астения, лихорадка, тошнота, увеличение и болезненность печени, потемнение мочи и обесцвечивание кала. Летальность острого гепатита В составляет 1-4%. Примерно 10% случаев переходит в хроническую форму, около 25% из которых становится непосредственной причиной смерти (от самого гепатита В, цирроза и рака печени). Причины развития хронического процесса окончательно не установлены. Считается, что, прежде всего, это связано с наличием у больного нарушений в клеточном звене иммунитета и с низкой продукцией интерферона. При этом существует общая закономерность – чем в более раннем возрасте человек инфицируется вирусом, тем больше вероятность развития хронического гепатита. Этиотропная терапия и профилактика. Средства специфической лекарственной терапии в настоящее время находятся в стадии разработки и лечение в основном симптоматическое. Отмечен положительный эффект от применения α-интерферона и противовирусных препаратов (азидотимидин, ламивудин и др.). Однако, лечение хронического гепатита В интерфероном и модифицированными нуклеозидами на сегодня недоступно подавляющему большинству больных из-за очень высокой стоимости препаратов. К сожалению, на терапию интерфероном отвечают менее 50% пациентов. При этом такая терапия сопряжена с риском развития побочных эффектов (психозов, поражений щитовидной железы и др.). Показано, что хронически циркулирующий ВГВ способен подавлять ламивудин – нуклеозидный аналог, применяющийся для лечения ВИЧинфицированных. В настоящее время препарат интенсивно изучается, и рассматривается возможность его комбинированного применения с αинтерфероном. По последним данным сочетанное применение ламивудина с интерфероном в течение 1 года вызывает высокий (93%) уровень вирусологического и биохимического ответа по окончании терапии, однако уровень устойчивого ответа (спустя год) остается пока низким – 14%. Более впечатляющие результаты достигнуты при решении проблемы вакцинопрофилактики. Создание вакцины против гепатита В - одно из важнейших завоеваний человечества. Основой вакцины служил поверхностный антиген вируса гепатита В, поскольку было установлено, что лица, имеющие антитела к нему, повторно не заболевают. Источником антигена являлись сыворотка или плазма крови носителей HBsAg. Антиген очищали, подвергали инактивации, адсорбировали на гидроокиси алюминия и использовали в качестве вакцинного препарата. По источнику получения антигена такие вакцины обозначали как "плазменные". Эти вакцины обладали высокой иммуногенностью и были эффективны, однако имели существенный недостаток. Несмотря на то, что не было зарегистрировано ни одного случая заражения гепатитом В от введения вакцины, существовал теоретический риск возможного попадания ВГВ в готовую серию вакцины, так как она изготавливалась из заведомо зараженного материала. Открытие ВИЧ добавило опасений, связанных и с этим вирусом. Кроме того, прогресс молекулярной биологии позволил приступить к созданию вакцин против гепатита В нового поколения - рекомбинантных. Общая схема их получения включает следующие этапы: из молекулы ДНК ВГВ выделяют ген, отвечающий только за синтез HBsAg, который вводят в клетки Saccharomyces cerevisiae. Клетки дрожжей начинают синтезировать антиген, который очищают от балластных белков и используют в качестве вакцинного препарата. Благодаря высокой иммуногенности и чрезвычайно низкой реактогенности, рекомбинантные вакцины (напр., Рекомбивакс В и Энджерикс В) широко используются во всем мире. Сейчас разрабатываются наиболее рациональные стратегия и тактика вакцинопрофилактики. Во многих странах вакцинации подлежат новорожденные, родившиеся от матерей, инфицированных ВГВ, медицинские работники – хирурги, стоматологи, акушеры-гинекологи и др. персонал, деятельность которого связана с кровью и различными биосубстратами. Кроме того, для профилактики используют специфический гипериммунный иммуноглобулин. Его введение показано (напр., половым партнерам) не позднее чем через 48 ч после вероятного заражения. 6.2.4. Вирусный гепатит D Возбудитель гепатита D (ВГD) – дефектный вирус (cателлит), способный репродуцироваться в организме хозяина только при обязательном участии вируса-помощника, роль которого играет ВГВ. Поэтому ВГD выделяют только от пациентов, инфицированных ВГВ. ВГD не имеет собственной оболочки; её формирует поверхностный антиген ВГВ – HbsAg (см. рис. 6.5). Геном ВГD представлен одноцепочечной РНК, которая кодирует синтез вирусного антигена (HDAg) и не имеет гомологии с ДНК вирусапомощника. Геном ВГD представляет собой химерную молекулу со свойствами сателлитного вируса и вироида. Вироид напоминает ковалентно-замкнутая молекула РНК размером около 1700 нуклеотидов, палочковидной конфигурации. Около 70% нуклеотидов РНК входят в состав УотсонКриковских комплементарных пар. Геном ВГD - это самый маленький геном среди всех вирусов животных. В пределах группы вирусов V он помещен в свою собственную таксономическую ячейку (Deltavirus), где должны находиться вирусы, содержащих негативную РНК. Инфекционная частица ВГВ: 40 нм оболочка + поверхностный антиген ВГВ; 27 нм нуклеокапсид, содержащий обратную транскриптазу и ДНК ВГВ. Инфекционная частица ВГD: 40 нм оболочка + поверхностный антиген ВГВ; 19 нм нуклеокапсид, образованный дельта-антигеном и содержащий геномную РНК ВГD. Рис. 6.5. Схематический состав вирионов ВГВ и ВГD. ВГD довольно термоустойчив и не теряет инфекционности даже при УФ-облучении. ВГD встречается повсюду, хотя основной ареал его распространения – Северная Америка и Северо-Запад Европы. Заподозрить гепатит D можно на основании характера клинической картины гепатита В с необычно тяжелым и затяжным течением, поскольку установлено, что суперинфекция ВГD резко утяжеляет течение и исходы гепатита В. Так, у 60-70% пациентов со смешанной инфекции наблюдается развитие цирроза печени. Скоротечный гепатит (смертность около 80%) встречается в 10 раз чаще при смешанной инфекции по сравнению с инфицированием только ВГВ. Механизм передачи ВГD – через кровь – аналогичен таковому для ВГВ. Иммунитет после перенесенного заболевания нестойкий. ВГD, в отличие от ВГВ, обладает прямым цитотоксическим действием. На протяжении всего репликативного цикла ВГD не обнаружено никаких ДНК-содержащих интермедиатов. Полагают, что РНК ВГD реплицируется при помощи хозяйской РНК-полимеразы по т.н. механизму «катящегося кольца». В результате образуются длинные катеннаты, которые для приобретения инфекционности должны быть расщеплены на куски, соответствующие по длине вирусному геному. Разрыв производится рибозимным доменом, который входит в состав самой РНК ВГD. Следует отметить, что это - единственный случай, когда рибозимной активностью обладает геном вируса животных. Однако, в отличие от других вироидов, в репликативном цикле ВГD имеется мРНК (см. рис. 6.6), но которой синтезируется белок – дельтаантиген. Как полагают некоторые исследователи, дельта-антиген необходим для репликации РНК, а также играет какую-то роль в сборке и высвобождении вирионов из клетки. Родительский (−)геном Комплементарный (+)геном мРНК Участок, кодирующий HDAg Сайт, проявляющий рибозимную активность Поли-А Рис. 6.6. Формы вирусспецифических РНК, присутствующие в клетках, инфицированных ВГD. Недавно идентифицирован клеточный белок, который по первичной структуре очень напоминает дельта-антиген ВГD. Эта находка позволила предположить, что ВГD произошел от вироида, который когда-то «захватил» клеточный РНК-транскрипт. Терапия и профилактика. Специфические методы борьбы с ВГD пока не разработаны. Однако, поскольку ВГD не способен репродуцироваться в отсутствии ВГВ, то основные лечебные и профилактические мероприятия должны быть направлены на борьбу с вирусом-помощником. 6.2.5. Вирусный гепатит С Этиология. Вирус гепатита С (ВГС) – мелкий (30-60 нм) РНКсодержащий вирус, относящийся к сем. Flaviviridae. Геном вируса представлен однонитевой (+)РНК, которая одновременно является и мРНК. В геноме ВГС всего один ген, который кодирует структуру 9 белков. Ранее он носил название «вирус парентерально-трансмиссивного ни А, ни В гепатита». Занимая скромную роль среди других гепатитов (около 15%), ВГС обладает наиболее высокой склонностью к хронизации. Вирус устойчив к нагреванию до 50оС, но инактивируется органическими растворителями и УФ-облучением. Во внешней среде нестоек. К структурным белкам ВГС (рис. 6.7) относятся нуклеокапсидный белок С (core protein) и оболочечные (envelop) гликопротеиды – Е1 и Е2. Идентифицированы и пять неструктурных белков ВГС. Белки внешней оболочки Е1 и Е2 являются гипервариабельными. Рис. 6.7. Схема структуры ВГС. Существуют 6 основных типов ВГС, которые на основании данных п первичной структуре РНК подразделяют на несколько подтипов. Типы 1-3 ответственны за все случаи инфекции в Европе, тип 4 превалирует в Египте и Заире, тип 5 – в Южной Африке, тип 6 – в Гон-Конге. Эпидемиология ВГС во многом сходна с характерной для ВГВ. Основное отличие – более низкая способность ВГС к передаче от беременной плоду и при половых контактах. Частота заболеваемости в большинстве стран колеблется от 1 до 4,9%. Чаще всего заражение ВГС происходит при переливании крови и её препаратов. От гепатита С во всем мире страдают по меньшей мере 200 млн человек. Только в США в год регистрируется от 8 до 10 тыс. смертей от последствий инфекции ВГС. По данным ВОЗ, сегодня ВГС инфицировано в среднем 1% населения, в т.ч. в России более 1 млн. человек. Гепатит С, подобно гепатиту В, имеет повсеместное, но не равномерное распространение. В США ежегодно регистрируется от 150 до 175 тыс. новых случаев гепатита С, в Западной Европе – 170 тыс., в Японии – более 350 тыс. заболеваний. Частота обнаружения маркеров ВГС (среди доноров крови) варьирует от 0,2% в странах Северной Европы до 1,2% в Южной Европе, 3-6% в Японии и 10-20% в странах Африканского континента. В России этот показатель составляет 1-5%. По понятны причинам, уровень инфицированности среди медицинских работников в среднем в 3-5 раз выше, чем среди обычного населения. В распространении гепатита С на разных территориях важная роль принадлежит экологическим факторам. Как и в отношении гепатита В, это подтверждает анализ последствий аварии на Чернобыльской АЭС. Так, в экологически неблагополучной Гомельской области Беларуси частота выявления антител к ВГС среди взрослого населения составляет 5,4%, что в 8 раз превышает аналогичный показатель среди лиц, постоянно проживающих на «чистых» территориях (0,7%). Патогенез. Гепатит С считается наиболее коварным и опасным среди всех вирусных гепатитов. Более того, по опасности гепатит С сравним с «чумой ХХ века» СПИДом. Значительная часть поражений протекает субклинически, однако у 8090% заболевших развивается хронический гепатит, что приводит к фатальным осложнениям – циррозу и карциноме печени (см. рис. 6.8). Инкубационный период составляет от 35 до 85 дней. Острая стадия гепатита С обычно протекает легко, нередко без желтухи, в связи с чем своевременная диагностика заболевания значительно затруднена. Надежный диагноз может быть поставлен только с помощью ПЦР. Острая стадия может заканчиваться полным выздоровлением. Однако у большинства больных развивается хронический гепатит с последующей эволюцией в первичный рак печени. После проникновения в организм человека ВГС реплицируется преимущественно в гепатоцитах. Кроме того, по современным представлениям, он может реплицироваться (как и ВГВ) в клетках периферической крови. Рис. 6.8. Естественное течение гепатита С. ВГС обладает слабой иммуногенностью, что определяет замедленный, неинтенсивный Т-клеточный и гуморальный ответ иммунной системы на инфекцию. Лишь через 2-10 недель от начала заболевания в крови больных начинают определяться антитела к ядерному антигену. Однако они обладают слабым вируснейтрализующим действием. Антитела же к неструктурным белкам ВГС в острой фазе инфекции вообще не выявляются. Зато в крови в течение острой стадии болезни (и при реактивации хронической) определяется присутствие РНК вируса. Причиной слабой иммуногенности ВГС, не приводящей к выработке неполноценного протективного иммунитета, является не имеющая прецедентов гетерогенность ВГС. Еще раз подчеркнем, что из-за быстро меняющегося «антигенного лица», приводящего к формированию т.н. «квазивидов», антитела не узнают и соответственно не могут уничтожать вирус. В результате вирус ускользает из-под иммунного контроля и постепенно разрушает печень. Особенностью гепатита С является тот факт, что наиболее часто это заболевание протекает практически без каких-либо ярко выраженных проявлений или с минимальными жалобами на повышенную утомляемость, слабость, снижение аппетита, чувство тяжести в правом подреберье. Не случайно ВГС называют «ласковым» убийцей. Передача вируса возможна при нанесении татуировки, использовании общих с больным предметов личной гигиены – зубной щетки, бритвы, ножниц и т.д. У 50% инфицированных ВГС источник заражения установить не удается. Очень часто и острый и хронический гепатит С протекают бессимптомно, из-за чего инфицированные люди вовремя не обращаются за медицинской помощью и могут заражать окружающих. Лечение. Достижения в терапии гепатита С выглядят пока достаточно скромно. Лечение гепатита С является одной из наиболее сложных проблем современной клинической медицины. Ежегодно во всех развитых государствах расходуются огромные средства, направленные на поиск путей повышения эффективности и разработку новых схем терапии гепатита С. Основным действительно эффективным препаратом для терапии гепатита С долгое время являлся рекомбинантный интерферон альфа-2b. Однако, его применение (в принятых дозах - 3 млн ед. 3 раза в неделю в течение 6 мес.) связано с большим количеством проблем: • высока стоимость препарата; • большой процент рецидивов заболевания после отмены терапии (устойчивый ответ в лучшем случае у 20-28% больных; у пожилых людей – 10%); • резистентность к препарату; • выраженные побочные эффекты, в ряде случаев вызывающие необходимость его отмены; • иньекционная форма введения, что при длительных курсах лечения создает серьезный дискомфорт для пациента. С 1998 г., благодаря комбинации интерферона с виразолом, эффективность терапии повышена до 40%. Курс лечения предусматривает введение 3 млн ед. интерферона + 1,0 г виразола 3 раза в неделю в течение 6 мес. Такая терапия приводит к снижению содержания РНК ВГС до неопределяемого уровня спустя 6 мес. после окончания лечения. Комбинированный препарат интерферона-α-2b с виразолом носит название «Ребетрон» и выпускается фирмой Schering Corporation (CША). Следует отметить, что монотерапия виразолом также приводит лишь к временному эффекту. Таким образом, только при использовании виразола в комбинации с интерфероном можно добиться высокой частоты устойчивого ответа при лечении гепатита С. К сожалению, этиотропная терапия гепатита С очень дорогостояща, учитывая длительность курса и высокую стоимость интерферона и виразола. Один курс лечения обходится в 2,5 тыс. долларов США. В последнее время исследования германских ученых показали, что интерферон, примененный на ранней стадии заболевания гепатитом С – сразу после появления первых симптомов болезни – уничтожает все следы присутствия вируса в организме, т.е. эффективность лечения приближается к 100%. К сожалению, применять такой метод лечения удается не часто, поскольку гепатит С очень трудно идентифицировать на ранней стадии. Однако для тех, кто все-таки начнет лечение в течение первых 2-3 месяцев после инфицирования, интерферон дает возможность вылечиться с вероятностью практически 100%. Информации о применении индукторов интерферона для лечения гепатита С в литературе нет. Профилактика. В отличие от гепатитов А и В специфическая профилактика гепатита С в настоящее время отсутствует. Вакцина против гепатита С пока не создана, и по прогнозам экспертов, из-за гипервариабельности структурных белков ВГС, вероятность её получения в ближайшие годы невелика. Ситуация усугубляется тем, что ВГС не способен размножаться в культуре клеток и что отсутствуют животные модели (кроме шимпанзе) для изучения и наработки ВГС. Кроме того, особенностью ВГС является то, что он находится в сыворотке крови в низкой концентрации. Это затрудняет его тестирование, выделение и изучение. Однако, по предварительным данным (пока не подтвержденным в ведущих лабораториях мира) исследователям Института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН удалось найти экспериментальную модель (культуру клеток головного мозга новорожденных мышей) для репликации ВГС. Разработанная in vitro модель хронической и острой инфекции ВГС открывает широкую перспективу для скрининга эффективных антивирусных препаратов, что естественно было немыслимо проводить на больных людях. Итак, исследователи научились получать в больших количествах инфекционный ВГС, что должно помочь в создании штаммов, которые могут стать основой для получения вакцины против ВГС. 6.3. Герпетическая инфекция (herpes simplex) Герпетическая инфекция объединяет заболевания, обусловленные вирусом простого герпеса (ВПГ), которые характеризуются поражениями кожи, слизистых оболочек, ЦНС, а иногда и других органов. 6.3.1. Характеристика возбудителя Этиология. Возбудитель относится к сем. Herpesviridae. Это семейство включает около 100 представителей, из которых только 8 (табл. 6.3) поражают человека: вирусы простого герпеса 1 и 2 типов (ВПГ-1 и ВПГ-2), вирус ветряной оспы и опоясывающего лишая (varizella-zoster), цитомегаловирус, вирус Эпштейна-Барр, вирусы герпеса человека 6-го, 7-го и 8-го типов. Таблица 6.3. Основные герпесвирусные инфекции Герпесвирусы человека Обозначение Вирус простого герпеса 1-го типа ВПГ-1 Вирус простого герпеса 2-го типа Вирус ветряной оспы и опоясывающего лишая (varizella-zoster) Вирус Эпштейна-Барр ВПГ-2 ВВО (ВОЛ) ВЭБ Цитомегаловирус ЦМВ Вирус герпеса человека 6-го и 7-го типов Вирус герпеса человека 8-го типа ВГЧ-6 ВГЧ-7 ВГЧ-8 Основные заболевания, вызываемые данным типом герпесвирусов Герпес кожи и слизистых Офтальмогерпес Генитальный герпес Герпетический энцефалит Пневмония Генитальный герпес Неонатальный герпес Ветряная оспа Опоясывающий лишай Инфекционный мононуклеоз Лимфома Беркита Врожденная и приобретенная цитомегалия Ложная краснуха Синдром хронической усталости Саркома Капоши у больных СПИДом Значительная часть герпесвирусов способна вызывать острые и латентные инфекции, а также обладает определенным онкогенным потенциалом и вызывает развитие болезней злокачественного роста у животных (напр., болезнь Марека у цыплят), а также эпидемиологически связана с образованием некоторых опухолей у человека. Среди герпесвирусов наиболее известен ВПГ, вызывающий поражения практически у каждого человека. Герпесвирусы относительно нестабильны при комнатной температуре, термолабильны и быстро инактивируются органическими растворителями и детергентами. Представителей герпесвирусов отличает морфологическое сходство. Размер вириона у ВПГ (схематическое строение представлено на рис. 6.9) колеблется от 100 до 160 нм. Для него характерна сферическая форма и уникальная 4-х слойная структура, включающая сердцевину, икосаэдрический капсид, внутреннюю белковую оболочку и внешнюю липидсодержащую оболочку. Сердцевина содержит линейную двухцепочечную ДНК. В состав вириона входит около 35 гликопротеидов, 7 из которых находятся на поверхности и вызывают образование вирусспецифических антител. По крайней мере 9 гликопротеидов входят в состав капсида. Несколько десятков белков (в т.ч. тимидинкиназа) являются неструктурными и образуются в ходе жизненного цикла вируса. По антигенной структуре ВПГ подразделяют на 2 типа. Геномы вирусов 1-го и 2-го типов на 50% гомологичны. ВПГ-1 поражает преимущественно респираторные органы. С ВПГ-2 в основном связано возникновение генитального герпеса и генерализованного герпеса новорожденных. Рис. 6.9. Схематическое изображение структуры герпесвируса. Эпидемиология. Герпетическая инфекция широко распространена. У 80-90% взрослых обнаруживают антитела к ВПГ. Источник инфекции – человек. ВПГ-1 обычно передается воздушно-капельным путем, при поцелуях или других контактах между слизистыми, в тоже время инфекция ВПГ-2 - обычно следствие сексуального контакта. Возможна трансплацентарная передача вируса. Обычно заражение ВПГ-1 происходит в самые ранние месяцы жизни, а ВПГ-2 после начала половой жизни. Перинатальное заражение происходит при прохождении плода по родовым путям. Поражения появляются через 510 суток после первого инфицирования. Инфицированные люди сохраняют серопозитивность пожизненно. ВПГ не способен проникать через неповрежденную кожу, что обусловлено отсутствием рецепторов на клетках ороговевающего эпителия. 6.3.2. Патогенез Воротами инфекции является кожа или слизистые оболочки. Проникновение вируса в клетку-хозяина является сложным процессом и включает в себя прикрепление вириона к клеточным рецепторам с последующим слиянием оболочки с клеточной мембраной. Эндоцитоз не является обязательной, хотя и возможной, стадией. Оказавшись в цитоплазме, капсид мигрирует через поры в ядро. Вирионная ДНК выходит в нуклеоплазму, циклизуется и транскрибируется клеточной РНК-полимеразой по каскадному принципу: вначале синтезируются сверхранние, затем ранние и, наконец, поздние мРНК. Образовавшиеся незрелые капсиды путем отпочковывания проникают сквозь ядерную мембрану в цитоплазму, где формируются зрелые вирусные частицы. При выходе вируса из клеток (спустя 24 ч после инфекции) клетки неминуемо погибают с образованием очагов некроза и местных воспалительных изменений в виде везикул. Для синтеза сверхранних мРНК не требуется присутствия синтезированных de novo белков. На ранних мРНК синтезируются вирусспецифическая ДНК-полимераза и тимидинкиназа, необходимые для синтеза вирусной ДНК. Среди этих белков есть белки, индуцирующие транскрипцию поздних генов, кодирующих структурные белки. Считается, что гликопротеиды герпесвируса, синтезирующиеся в инфицированных клетках, приводят к изменению их фенотипических свойств, т.е. к трансформации. Трансформация клеток вызывает развитие определенных иммунопатогенных реакций, направленных против собственного организма и являющихся одним из механизмов вируссиндуцированной иммуносупрессии. Таким образом, герпесвирус может приводить к развитию первичного иммунодефицита, но наиболее тяжелые клинические формы иммунодефицита наблюдаются у лиц с имунодефицитными состояниями, обусловленными другими причинами, в т.ч. ВИЧ-инфекцией. Значительная часть герпесвирусов способна вызывать острые и латентные инфекции. При латентной инфекции возбудитель мигрирует из первичного очага в сенсорные ганглии: ВПГ-1 в тройничный, а ВПГ-2 в поясничный узлы. Основными этапами развития герпетической инфкции являются: первичная инфекция кожи и слизистых, колонизация и острая инфекция ганглиев с последующим установлением латентности, когда только вирусная ДНК, находящаяся в ядрах нейронов, свидетельствует о наличии инфекции. По окончании острой фазы инфекции, свободный вирус более не обнаруживается в чувствительном ганглии. Механизмы, определяющие переход из острой фазы инфекции в латентную, пока не выяснены. Этот переход параллелен развитию иммунных факторов: иммунная реакция хозяина уменьшает размножение вируса в коже, и клетки ганглия становятся непермессивными – устанавливается латентная инфекция. Механизмы латентной инфекции, а также механизмы, лежащие в основе реактивации вируса, неизвестны. Пусковым механизмом реактивации является избыточное УФ-облучение, переохлаждение, травма кожи или ганглия, стрессовая ситуация, а также иммуносупрессия. В настоящее время разработаны две рабочие гипотезы, объясняющие латентную циркуляцию и увеличение риска рецидивов клинических проявлений. • Cтатическая гипотеза предполагает циркуляцию вирусной ДНК в виде эписомы в ганглиях и (возможно) интеграцию ее в хромосомы клеток. Активация репликативного цикла происходит под действием уже указанных выше факторов. По центробежным нейронам дочерние популяции достигают нервных окончаний, откуда проникают в эпителиальные клетки и репродуцируются в них, вызывая появление везикул. • Динамическая гипотеза подразумевает перманентное образование и выброс из ганглиев небольших количеств возбудителя, постоянно циркулирующего по нейронам и попадающих в эпителий кожи. При этом незначительное число вирусных частиц не способно вызывать видимые поражения, но их количество способно резко возрастать под действием различных факторов, стимулирующих репликативный процесс. Следует отметить, что помимо нейрогенного пути распространения герпетической инфекции, большое значение имеет и гематогенный путь её распространения. Клинические проявления. Инкубационный период при герпетической инфекции продолжается от 2 до 12 дней. Оба вируса вызывают аналогичные поражения, однако их локализация имеет некоторую специфичность (табл. 6.4). Лабиальный герпес. Локализованная герпетическая инфекция обычно сопровождает какое-либо другое заболевание (ОРЗ, пневмония и др.). Инфекция развивается в разгар основного заболевания или уже в период выздоровления. Общие симптомы маскируются проявлениями основного заболевания. Герпетическая сыпь локализуется обычно вокруг рта и на губах. На месте высыпания больные ощущают жар, жжение или зуд кожи. На коже появляются мелкие пузырьки, заполненные прозрачным содержимым. Пузырьки вскрываются, образуя эрозии, или подсыхают и превращаются в корочки. Возможно наслоение вторичной бактериальной инфекции. При рецидивах герпес поражает, как правило, одни и те же участки кожи. Генитальный герпес. Первичная инфекция характеризуется умеренным повышением температуры тела, недомоганием, мышечными болями, болями в нижних отделах живота, увеличением и болезненностью паховых лимфатических узлов. Поражения обычно исчезают через 10-12 дней, но часто рецидивируют. Генитальный герпес представляет особую опасность у беременных, т.к. может вызывать тяжелую генерализованную инфекцию новорожденных. Может также способствовать возникновению рака шейки матки. Таблица 6.4. Основные поражения, вызываемые ВПГ Основные возрастные группы Все Рецидивы Высокая Взрослые мужчины + ВПГ-2 Высокая Подростки, взрослые + Герпес новорожденных ВПГ-2 Низкая Дети до 4-х недель − Герпетический энцефалит ВПГ-1 Очень низкая Все − Герпетический менингит ВПГ-2 Очень низкая Подростки, взрослые − Диссеминированный герпес ВПГ-1 Низкая Все − Тип поражений Доминирующий тип возбудителя Частота поражений Лабиальный герпес ВПГ-1 Очень высокая Герпетический кератит ВПГ-1 Генитальный герпес + Герпетические поражения глаз. Такие поражения чаще наблюдаются у мужчин в возрасте 20-40 лет. Различают поверхностные и глубокие поражения. Они могут быть первичными и рецидивирующими. Последние способны приводить к необратимой потере зрения. Герпетические энцефалиты. Чаще заболевают лица в возрасте от 5 до 30 лет и старше 50. В 95% случаев заболевание вызывается вирусом типа 1. В большинстве случаев вначале появляются признаки герпетического поражения кожи и слизистых оболочек и потом развиваются симптомы энцефалита. Клиническими проявлениями являются быстрое повышение температуры тела, общая интоксикация, наличие психических, а затем и неврологических нарушений. Патогенез вызывает прогрессирующую демиелинизацию нервных волокон. Течение болезни тяжелое. Летальность достигает 30%. После перенесенного энцефалита могут быть стойкие нарушения психики. Герпетический менингит обычно протекает стерто. Развивается чаще у лиц с первичным генитальным герпесом. Повышается температура тела, появляются головные боли, светобоязнь. Через неделю больные выздоравливают без существенных осложнений. Герпес новорожденных возникает в результате внутриутробного инфицирования (а также при родах) преимущественно вирусом типа 2. Это тяжелое генерализованное поражение многих органов и систем. В большинстве случаев в процесс вовлекается головной мозг. Летальность равна 65%. Диссеминированный герпес чаще наблюдается у лиц с врожденными или приобретенными иммунодефицитами (больные лимфогрануломатозом, новообразованиями, получающие химиотерапию, больные гематологическими заболеваниями, лица, длительно получающие кортикостероиды, иммунодепрессанты, а также ВИЧ-инфицированные). Характерны распространенные поражения кожи и слизистых оболочек, развитие энцефалита и менингита, гепатита, пневмонии. Заболевание без использования современных противовирусных препаратов обычно заканчивается летальным исходом. 6.3.3. Профилактика и лечение герпетической инфекции Разработаны инактивированные вакцины для профилактики рецидивов герпетической инфекции, однако их эффективность еще недостаточно изучена. Иногда для предотвращения инфекции или в качестве дополнения к химиотерапии используется пассивная иммунизация иммунной или гипериммунной сывороткой, включая моноклональные антитела. Большинство используемых в клинике противогерпетичексих препаратов (см. табл. 6.5) – это аналоги нуклеозидов, селективно ингибирующих вирусную ДНК-полимеразу, а именно: ацикловир, ИДУ, БВДУ, видарабин. При этом действие некоторых из этих препаратов (ацикловир, идоксуридин, БВДУ) является зависимым от вирусной тимидинкиназы. Как следует из табл. 6.5, основным препаратом, назначаемым при химиотерапии большинства форм герпетической инфекции, является ацикловир. Препарат назначают внутрь не позже 72 ч после появления первых признаков заболевания. Также возможно его наружное применение в составе специальных мазей и кремов. Таблица 6.5. Химиотерапия герпетической инфекции Диагноз Герпетический кератит Препараты выбора Трифлуридин или идоксуридин Генитальный герпес Ацикловир Герпетический энцефалит Ацикловир или видарабин Герпес новорожденных Ацикловир Герпес кожи и слизистых Ацикловир Кроме представленных в табл. 6.5, применяются и некоторые другие препараты. Так, при плохой переносимости ацикловира можно использовать фамцикловир, который дает меньше побочных эффектов. Для лечения кожного и генитального герпеса, обусловленных штаммами, устойчивыми к ацикловиру, рекомендуется препарат ВИРА-МП (5’-монофосфат видарабина). При терапии кератитов хорошо зарекомендовали себя интерферон и его индуктор – полудан. Отдельного упоминания заслуживает БВДУ. Этот модифицированный нуклеозид проявляет активность против ВПГ-1 и ВПГ-2, причем по активности против ВПГ-1 он намного превосходит все другие антигерпетические препараты, включая самый популярный в настоящее время – ацикловир. Одной из главных проблем, возникающих в процессе применения химиопрепаратов, является появление вариантов герпесвирусов, резистентных к используемым лекарствам. В первую очередь это касается людей, подвергшихся длительному лечению противогерпетическими препаратами и имеющих нарушения в иммунной системе: больные, страдающие иммунодефицитами, с подавленной иммунной системой после операций по трансплантации органов и основная группа – это больные СПИДом. Устойчивость к ацикловиру проявляется в основном за счет мутаций в гене тимидинкиназы, приводящих к потере (полной или частичной) тимидинкиназной активности. В редких случаях устойчивость возникает в результате мутации в гене ДНК-полимеразы. В заключение следует отметить, что в настоящее время отсутствуют противогерпетические препараты, удовлетворяющие требованием, предъявляемым к «идеальному химиотерапевтическому средству», поэтому постоянно ведется поиск новых препаратов с более широким спектром противовирусной активности, с улучшенными фармакокинетическими свойствами. Направленный поиск новых препаратов ведется в нескольких направлениях: скрининг препаратов с высоким ХТИ, действующих на разных стадиях репродукции вирусов в клетках или вызывающих специфическое ингибирование «ключевых» ферментов. Наконец, регулярно проводится поиск комбинированных препаратов с различным механизмом действия, что обеспечивает синергидный эффект в отношении подавления репродукции вирусов в клетках и уменьшение вероятности возникновения резистентных вариантов вирусов к используемым препаратам. Весьма перспективным сочетанием считается комбинация α-интерферона с противовирусными нуклеозидами. В качестве возможных препаратов против герпесвирусов рассматриваются антисмысловые олигонуклеотиды, 2’-5’-олигоаденилаты и большой спектр других соединений, которые находятся на различных стадиях противовирусных испытаний. 6.4. ВИЧ-ИНФЕКЦИЯ/СПИД 6.4.1. Общие вопросы Этиология. ВИЧ-инфекция – заболевание, возникающее вследствие заражения вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ; английская аббревиатура – HIV), поражающего иммунную систему, в результате чего развиваются различные оппортунистические инфекции и опухоли. ВИЧинфекция имеет ряд стадий. Последнюю из них, сопровождающуюся т.н. СПИД-индикаторными болезнями, обозначают термином синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД). Главная опасность ВИЧинфекции – неизбежная гибель инфицированных пациентов, наступающая при отсутствии лечения в среднем через 10-11 лет после заражения. ВИЧ – это РНК-содержащий вирус, который относят к сем. Retroviridae (подсем. лентивирусов). В настоящее время выделено 2 типа ВИЧ: ВИЧ-1 – это основной возбудитель ВИЧ-инфекции; места его распространения – Северная и Южная Америка, Европа и Азия. ВИЧ-2 – эволюционно родственный, но менее вирулентный вариант ВИЧ-1, распространен не так широко; редко вызывает типичные проявления СПИДа. Место его распространения – Западная Африка. Кроме того, обнаружен вирус иммунодефицита обезьян (ВИО). ВИЧ-2 по иммунологическим свойствам занимает промежуточное положение между ВИЧ-1 и ВИО. Возможно, что они произошли от общего предка, а затем эволюционировали самостоятельно. Помимо ВИЧ 1-го и 2-го типов и ВИО, к лентивирусам относятся вирусы иммунодефицита кошек и крупного рогатого скота, а также инфекционной анемии лошадей, прогрессирующей пневмонии овец и некоторых др. заболеваний животных. Поражение клеток иммунной системы и высокая антигенная вариабельность являются общими характерными особенностями лентивирусов, с которыми связаны основные трудности специфической профилактики и лечения лентивирусных инфекций. ВИЧ размножается с высокой продуктивностью в Т-хелперных лимфоцитах, несущих на поверхности дифференцировочный антиген CD4 (CD – аббревиатура от английского claster of differentiation), что приводит к быстрому разрушению клеток данной популяции. Исследования показали, что для ВИЧ характерна очень высокая степень изменчивости – в 5-40 раз превышающая изменчивость вируса гриппа. Морфология ВИЧ. Зрелые вирионы (см. рис. 2.7) имеют шаровидную форму диаметром 100-140 нм. ВИЧ относится к сложным вирусам, т.к. его капсид окружен дополнительной двухслойной липидной оболочкой. Эта оболочка имеет клеточное происхождение. Она захватывается вирусом, когда он «протаранивает» клеточную мембрану, выходя из клетки-хозяина. Главными вирусными белками, ассоциированными с оболочкой и формирующими морфологически различимые «шипы», являются гликопротеиды gp120 и gp41. Белок gp41 заякорен в липидном бислое, а белок gp120 (этот белок функционирует в качестве вирусного антирецептора) находится на внешней поверхности и нековалентно соединен с gp41. Гликопротеид gp120 – высокоиммуногенный белок, содержащий консервативный и гипервариабельный участки, а также область, связывающую молекулу CD4 Т-лимфоцитов. Установлено, что 95% антител, вырабатываемых в организме к ВИЧ, вырабатывается к этому гипервариабельному участку из 35 аминокислот. Кроме того подсчитано, что ни один из вирионов-потомков не является точной антигенной копией родительского вириона. Под внешней оболочкой расположена прослойка из матриксного белка (р17). Еще глубже расположен капсид, имеющий форму усеченного цилиндра, образованный из множества идентичных копий белка р24. Внутри капсида находится геном вируса, представленный двумя идентичными не фрагментированными цепями (+)РНК. Геномная РНК связана с т.н. нуклеокапсидными белками. Такие белки обычно положительно заряжены с тем, чтобы нейтрализовать отрицательно заряженную нуклеиновую кислоту и, таким образом, облегчить упаковку ее в капсид. Нуклеопротеиновый тяж обладает спиральной симметрией. В состав вируса входят следующие ферменты: обратная транскриптаза, интеграза и протеаза. Обратная транскриптаза состоит из трех доменов, обладающих соответственно активностью РНК-зависимой ДНК-полимеразы, РНКазы-Н и РНК-зависимой ДНК-полимеразы. ВИЧ не стоек во внешней среде. Он инактивируется при нагревании при 54оС в течение 30 мин. Кипячение убивает вирус за 1-5 мин. ВИЧ быстро погибает под воздействием любых дезинфектантов в концентрациях, обычно применяемых в лабораторной практике. История открытия ВИЧ. В 1981 г. в ряде крупных городов США была зарегистрирована вспышка инфекционного заболевания, вызываемого грибком, который при нормальном состоянии иммунитета не вызывает заболеваний. В ходе проверки выяснилось, что заболевание распространяется только среди лиц, имевших интимные контакты с тем или иным инфицированным индивидуумом. В основе доселе неизвестного заболевания лежало резкое ослабление иммунитета, что и приводило к развитию инфекции. Неизвестную ранее форму подавления работы иммунной системы стали обозначать как синдром приобретенного иммунодефицита. ВИЧ 1-го типа был открыт в 1983 г. французским исследователем Л.Монтанье и его американским коллегой Р.Галло. В 1986 г. Л.Монтанье выделил у жителей Западной Африки ВИЧ-2. Мишени для вирусов обоих типов одинаковы: Т-лимфоциты и др. клетки иммунной системы. Ретроспективный анализ сывороток, хранящихся в Национальном Центре контроля за инфекционными заболеваниями, показал, что первые случаи СПИДа у человека относятся к 50-м годам прошлого столетия, и, что заболевание возникло в Африке, а затем распространилось на территории Европы и США. Есть предположение о том, что ВИЧ «перепрыгнул» с шимпанзе на человека в период между 1675 и 1700 гг. и с тех пор не проявлял себя до 1930 г. Исследователи, конечно, не располагают образцами крови, датированными 1675 г. Самые старые образцы ее датированы только 1959 г. Поэтому вывод о возрасте ВИЧ сделан с помощью т.н. методики «молекулярных часов», основанной на расчетной оценке скорости изменения генома вируса. По общепринятому мнению, выход вируса из «тени» произошел благодаря сексуальной революции и появлению новых способов (инструментальной) передачи возбудителя от человека к человеку. 6.4.2. Эпидемиология Источником ВИЧ-инфекции является только человек – больной или вирусоноситель. У этих людей вирус содержится в крови, сперме, грудном молоке. Основным путем заражения считают половые контакты. Вторым по значимости фактором передачи считается использование одних и тех же игл и шприцев наркоманами, стоматологический инструмент. Несколько меньшее значение имеет трансплацентарная передача от матери к ребенку. Известны случаи заражения людей путем переливания ВИЧ-инфицированной крови. Теоретически (достоверных фактов мало) возможна передача возбудителя также при трансплантации органов и с материнским молоком. Следует особо подчеркнуть, что до сих пор не известны случаи передачи ВИЧ путем поцелуев, укусов насекомых, а также через пищевые продукты или рукопожатия. По данным ВОЗ, с конца 70-х годов и к началу 1999 г. ВИЧ-инфекция унесла жизни более 13,9 млн. жителей Земли. Еще около 34 млн. человек к этому времени были инфицированы. Инфекция за последние 20 лет постепенно проникла из первоначальных очагов – США и Центральной Африки – на все континенты и во все страны мира. Считается, что каждый сотый взрослый житель планеты уже заражен ВИЧ. В ряде стран Африки заражено ВИЧ до 20% населения. ВИЧ-инфекция не редкость в странах Западной Европы, где ею заражено до 0,5% всех взрослых. Эпидемия ВИЧ-инфекции в РФ и странах бывшего Советского Союза началась поздно, однако темпы ее развития из-за низкой культуры быта превосходят таковые, характерные для Европы. В России в 1999 г. официально зарегистрировано 11 тыс. ВИЧинфицированных, в то время как оценочное общее число инфицированных составляло не менее 50 тыс. человек. Согласно статистическим данным, которыми располагает Минздрав РФ, всего за период с 1 января 1987 по 1 октября 2000 г. зарегистрировано 83249 ВИЧ-инфицированных граждан России. Умерло 634 ВИЧинфицированных. За 9 месяцев 2000 г. зарегистрировано 32140 новых случаев ВИЧ-инфекции. В 2000 г. было выявлено больше случаев заболевания, чем за весь предыдущий период тринадцатилетний период. В общей структуре ВИЧ-инфицированных преобладают (около 80%) мужчины. Пораженность населения РФ ВИЧ-инфекцией достигла к 1 октября 2000 г. 43 на 100 тыс. населения. 1 января 1996 г. этот показатель был равен только лишь 0,6. По расчетным данным в конце 2000 г. в РФ проживало 600 тыс. ВИЧ-инфицированных. Динамика выявления ВИЧ-инфицированных граждан России по годам: 1987 – 23 1988 – 47 1989 – 265 1990 – 103 1991 – 84 1992 – 88 1993 – 107 1994 – 161 1995 – 196 1996 – 1511 1997 – 4353 1998 – 4034 1999 – 18218 2000 – 32140 (9 месяцев). Первый ВИЧ-инфицированный в Республике Беларусь был обнаружен в ноябре 1986 г. Им оказался прибывший из Бурунди студент одного из ВУЗов РБ. Не прошло и года, как была выявлена первая инфицированная из числа коренных жителей республики. Если в РБ в начальном периоде преобладал гетеросексуальный путь трансмиссии, то в настоящее время ведущую роль играют инфицированные шприцы и иглы наркоманов. Вплоть до 1996 г. эпидемическую ситуацию в РБ можно было характеризовать как относительно благополучную (по сравнению со странами Америки и Европы). В тот период преобладал гетеросексуальный путь передачи инфекции. Как правило, удавалось установить сексуальную связь инфицированного партнера-иностранца с нашими соотечественницами. Начиная с 1990 г., положение существенно изменилось. ВИЧ-инфекция стала выявляться в основном у мужчин (что как раз было характерно для начального периода развития эпидпроцесса на Западе). Исследователи объясняют такой характер развития ситуации следствием изменившегося в последние годы уклада жизни населения. Основным резервуаром ВИЧинфекции теперь являются не студенты-иностранцы, а соотечественники – сексуально активные мужчины, юношеского и подросткового возраста, преимущественно употребляющие наркотические вещества. Итак, в 1996 г. начался новый период в развитии эпидпроцесса в РБ – период эпидемического неблагополучия. В ряде областей (например, в Гомельской) показатель инфицированности достиг в 1998 г. более 1000 на 1 млн. жителей и вплотную приблизился к уровню наиболее пораженных стран Европы. Иными словами, начавшаяся в середине 80-х годов прошлого века в РБ эпидемия СПИДа достигла в последние годы небывало высокого уровня. По состоянию на 1 июня 2001 г. в Республике Беларусь зарегистрировано 3587 случаев ВИЧ-инфекции, что составляет 37 случаев на 100 тыс. населения. Особую озабоченность вызывает тот факт, что подавляющее число ВИЧ-инфицрованных, а именно – 80% от общего числа, составляют молодые люди репродуктивного возраста. 6.4.3. Патогенез На ранней вирусемической стадии инфекции вирус реплицируется очень слабо. Только к 20 суткам после заражения в крови появляются специфические антитела. На фоне выработки и увеличения количества антител к вирусу клинически выраженные симптомы этой стадии (лихорадка, боли в горле, мышцах, головная боль), за исключением увеличения лимфоузлов, исчезают. В течение 10-15 лет у ВИЧ-инфицированных можно не обнаружить никаких симптомов болезни. При этом в организме неуклонно снижается количество CD4-лимфоцитов и нарастают другие иммунные сдвиги. Они приводят больного к стойкой нетрудоспособности и, в конечном счете, к гибели. При уровне CD4-лимфоцитов ниже 500 в 1 мл крови могут наблюдаться бактериальная пневмония, легочный туберкулез, опоясывающий лишай, кандидоз полости рта и пищевода. Из неинфекционных проявлений наиболее часто отмечается саркома Капоши, рак шейки матки, В-клеточная лимфома, анемия. Обычно, для того чтобы инфицировать клетку человека, гликопротеиды gp120 на поверхности ВИЧ (см. рис. 6.10) должны провзаимодействовать с двумя молекулами на поверхности восприимчивых клеток – молекулой CD4 (играющей роль рецептора) и рецептором хемокинов (выступающим здесь в роли корецептора). Корецептор CCR5 находится на поверхности макрофагов, корецептор CXR4 – на поверхности Т4-лимфоцитов. Напомним, что хемокины – полипептиды, вызывающие движение клеток в том или ином направлении. Популяция клеток, обладающих молекулами CD4, включает Тлимфоциты – хелперы (их еще также называют Т4-клетками, CD4+-клетками, Т-хелперами), моноциты, макрофаги и родственные клетки (промиелоциты, мегакариоциты, дентритические клетки лимфоузлов, глиальные клетки мозга, астроциты, клетки Лангерганса и ряд других). Все эти клетки становятся доступными ВИЧ только при его проникновении через поврежденные внешние покровы, что и ограничивает пути передачи инфекции. Рис. 6.10. Схематическое изображение белков, необходимых для проникновения ВИЧ в клетку. После прикрепления к клетке антирецепторы gp120 отодвигаются, а гидрофобные концы белка gp41 проникают сквозь мембрану клетки и оболочка вируса и мембрана клетки сливаются (см рис. 3.5). В результате слияния мембран вируса и клетки геном вируса оказывается в цитоплазме. Иногда вирус проникает в клетку путем эндоцитоза. Затем оболочка вируса сливается с мембраной эндосомы, в результате чего вирусный геном попадает в цитоплазму. На пути к ядру капсид разрушается, высвобождая геномную РНК с ассоциированными с ней белками. РНК с ферментами проникает в ядро. Используя ревертазу, ВИЧ синтезирует ДНК-копию с РНК-генома (имеет место транскрибирование РНК в ДНК). После завершения этого процесса РНКаза-Н деградирует вирусную РНК. Далее с помощью РНК-зависимой ДНК-полимеразы синтезируется вторая цепь ДНК, в результате чего образуется двухцепочечный интермедиат вирусной ДНК. Двухцепочечная вирусная ДНК встраивается в хромосому клетки с образованием провируса. Этот процесс протекает под действием вирусной интегразы. После интеграции провирусная ДНК ВИЧ может находиться как в латентном состоянии, так и в активном (продуктивном) состоянии. Большая часть (93-95%) вирусной ДНК интегрирует в хромосому Т4-лимфоцитов. Причем эти клетки продуцируют вирус. Однако существует малый процент ВИЧ-инфицированных клеток, где провирус годами находится в латентном состоянии. Эти клетки (наряду с инфицированными моноцитами, макрофагами, дентритными клетками и клетками Лангерганса) играют роль стабильного резервуара ВИЧ, который избегает ответа организма-хозяина и антиретровирусной химиотерапии. Пребывание в неактивном состоянии может длиться 10 и более лет. С момента активации вируса начинается сама болезнь. ДНК провируса транскрибируется с образованием геномной РНК и мРНК. Последние с помощью клеточной белоксинтезирующей машинерии транслируются в полипротеины различной длины. Специфическая протеаза разрезает полипротеины на структурные белки и ферменты. Белки gp120 и gp41 встраиваются в цитоплазматическую мембрану клетки-хозяина. Вокруг вирусной РНК-потомства собирается капсид, который выпячивается из клетки, обволакиваясь ее цитоплазматической мембраной. Как правило инфицированные Т4-хелперный лимфоциты при репликации вируса погибают. В то же время инфицированные моноциты, макрофаги и некоторые клетки обычно остаются жизнеспособными. Покинувшие клеткухозяина вирионы-потомства способны инфицировать новые чувствительные клетки. На основании четкой связи прогрессирования заболевания со снижением у больного количества клеток, несущих рецептор CD4, было показано, что уменьшение количества этих клеток является главной особенностью патогенеза заболевания, а динамика этого уменьшения полностью коррелирует с клиническим прогрессированием заболевания. В результате иммунных сдвигов у заразившихся снижается сопротивляемость к некоторым инфекциям и опухолям, т.е. у больного развивается СПИД. 6.4.4. Химиотерапия ВИЧ-инфекции В настоящее время медицина пока не располагает средством, которое бы позволили полностью излечить человека от СПИДа. Однако разработаны схемы лечения, которые могут существенно задержать развитие заболевания. Ингибиторы обратной транскрипции. Исследователи предлагают несколько возможностей воздействия на вирус. Однако пока наиболее достоверный клинический эффект был получен путем блокирования важнейшего этапа жизненного цикла ВИЧ, а именно процесса синтеза провирусной ДНК, при помощи ревертазы. Большинство ингибиторов обратной транскрипции являются нуклеозидными аналогами (см. рис. 5.5). Эти соединения в клетке трансформируются в нуклеозид-5’-трифосфаты, которые по химической структуре напоминают обычные нуклеотиды – блоки строительства ДНК. Далее эти трифосфаты с помощью ревертазы включаются в растущую полинуклеотидную цепочку, после чего дальнейшее ее удлинение прекращается. Причина такой терминации – отсутствие у молекулы аналога при С’-3 атоме гидроксильной группы, которая абсолютно необходима для продолжения роста цепи. Первым препаратом из этой группы лекарств был азидотимидин (AZT), выпускаемый за рубежом под названиями ретровир, зидовудин и т.д., а в России – как тимазид. В настоящее время в клинике применяются или проходят испытание до десятка препаратов этой группы. Они отличаются друг от друга видом азотистого основания и модифицированного углеводного фрагмента, присоединенного к нему. Так AZT представляет собой тимидин с азидной группой, присоединенной к С3-атому дезоксирибозы. К этой же группе ингибиторов обратной транскрипции принадлежит диданозин (ddI) – аналог дезоксиаденозина, зальцитабин (ddC) и ламивудин (3ТС) – аналоги дезоксицитидина, ставудин (d4T) – аналог тимидина и некоторые др. препараты, находящиеся в процессе клинического изучения. В нашей стране успешно прошел клинические испытания препарат под названием замицит – отечественный аналог зальцитабина. Оригинальную технологию синтеза этого препарата разработали исследователи Института биоорганической химии НАН Беларуси. Другая группа ингибиторов обратной транскрипции – игибиторы ненуклеозидной природы. Они не встраиваются в ДНК вируса, подобно нуклеотидам, а связываются с аллостерическим участком ревертазы и инактивируют ее. Это также приводит к прекращению образования провирусной ДНК. В клинической практике нашли применение препараты невирапин (см. раздел 5.3.2.3), делавирдин и эфаверенц. Ингибиторы протеазы ВИЧ. Достаточно удачными оказались поиски агентов, угнетающих процесс сборки вирусных частиц, в котором участвует вирусный фермент протеаза. Этот фермент расщепляет полипротеины с образованием функционально активных ферментов, структурных и регуляторных белков (рис. 6.11). Ингибиторы протезы связываются с активным центром протеазы и выводят ее из строя. В результате стадия созревания ВИЧ блокируется, и образование новых инфекционных вирионов не происходит. Поскольку протеаза ВИЧ (аспартатпротеаза) отличается от протеазы человека, ингибиторы вирусной протеазы действуют избирательно, не блокируя функцию фермента клеток человека. К концу 1999 г. в клиническую практику уже прочно вошли препараты группы ингибиторов протеазы ВИЧ: саквинавир, индинавир, ритонавир, нельфинавир. По химической природе эти препараты представляют собой пептидные аналоги. К сожалению, в последнее время выявился общий нежелательный эффект ингибиторов протеазы – нарушение обмена липидов, липодистрофия. Клинически это проявляется перераспределением жировой ткани: она исчезает на лице, голенях, но в избытке откладывается на животе и груди. В результате некоторые пациенты отказываются от лечения. Следует подчеркнуть, что в каждом больном имеются в наличии миллионы мутантных форм вируса, поэтому исследователи понимают, что лечение одним препаратом – бесполезно, поскольку среди такого чудовищного разнообразия мутантов быстро происходит отбор устойчивых форм. Только тщательно подобранные комбинации лекарств замедляют течение инфекции и ограничивает появление новых устойчивых штаммов вируса. Сейчас в стадии разработки находится множество клинических схем применения различных комбинаций этих препаратов. Лучшие на сегодняшний день результаты достигнуты при использовании ингибитора протеазы в комбинации с одним или двумя ингибиторами ревертазы. Рис. 6.11. Механизм действия препаратов на основе ингибирования протеазы ВИЧ. Проблема усугубляется тем, что стоимость лечения коктейлем из трех лекарств составляет 8-10 тыс. дол. США в год. Многие пациенты не способны оплатить такое лечение. Особенно если учесть, что 90% ВИЧинфицированных проживает в развивающихся странах. Следует подчеркнуть, что ни один из существующих анти-ВИЧагентов не убивает и не элиминирует вирус, они только ингибируют его репликацию и снижают тяжесть протекания болезни, продлевая на несколько лет жизнь. Практика показала, что у пациентов, регулярно принимающих препараты «тритерапии», отмечаются уменьшение количества вируса в крови вплоть до неопределяемого современными методами уровня, возрастание количества CD-клеток, исчезновение сопутствующих инфекций. В России и Беларуси внедрение комбинированной терапии пока существенно затруднено из-за финансовых проблем. Основной научной проблемой терапии ВИЧ-инфекции стала борьба с развитием резистентности вируса к применяемым препаратам. Исследования и наблюдения показали, что у ВИЧ довольно быстро возникают мутации, обеспечивающие устойчивость к применяемым противоретровирусным препаратам. Если пациенты, у которых возникли резистентные штаммы ВИЧ, будут вести половую жизнь, то это приведет к массовому распространению устойчивых к лечению штаммов. Отсюда возникает необходимость в замене одной комбинации лекарств на другую. К сожалению, все лекарства довольно токсичны. Самый известный – AZT –сильный яд для ЦНС и костного мозга. По вине других препаратов развивается диабет, страдают почки и печень. Кроме того, все эти лекарства довольно дороги. Поэтому постоянно проводится поиск более эффективных и менее дорогостоящих лекарств. 6.4.5. Перспективы борьбы с ВИЧ-инфекцией Итак, спустя 20 лет после своего официального появления на свет, СПИД считается абсолютно смертельным заболеванием. А ведь только в США на решение проблемы СПИДа тратят ежегодно больше бюджетных денег, чем на национальную космическую программу. Но защиты от ВИЧ так и нет. ВИЧ-носители заболевают в среднем через 10 лет после заражения. Половина больных умирает в течение первого года, еще через два года в живых остается лишь 10% заболевших, а через 5 лет – 2%. Случаев излечения пока не зафиксировано. Что мешает справиться с этой болезнью? Чем отличается ВИЧ от других известных науке инфекций? ВИЧ оказался абсолютным чемпионом биологического мира по изменчивости. Со времени появления вируса возникло огромное количество его вариаций. Именно с этим и связаны главные трудности создания лекарства против СПИДа. Существующие лекарства бессильны против вируса, интегрированного в геном. Поэтому многие врачи основные надежды сегодня возлагают на создание эффективной вакцины. Иммунопрофилактика. Долгое время создание вакцины против ВИЧ представлялось неразрешимой задачей по причине слишком высокой изменчивости вируса. Однако, сегодня, благодаря титаническим усилиям многих исследователей, в мире уже созданы и испытываются десятки вариантов такой вакцины. Тем не менее, следует признать, что проблема вакцинотерапии и профилактики СПИДа еще не решена. Перспектива применения живых, хотя и ослабленных или дефектных штаммов ВИЧ в целях иммунизации встречается со скептицизмом. Дело в том, что никто не может исключить риск интеграции вирусной ДНК в геном хозяина (что может вызвать рак) или реверсии вируса в вирулентную форму (что воспроизведено на обезьянах). Инактивированный ВИЧ, из-за низкой иммуногенности и не способности индуцировать выраженный клеточный иммунитет, не может быть основой эффективной вакцины. К тому же сама процедура инактивации трудно осуществима без разрушения структуры внешних белков, ответственных за антигенность. Кроме того, потенциальный риск, связанный с недостаточной инактивацией вируса, заставляет многих отказаться от иммунизации такими вакцинами. Субъединичные вакцины представляют собой очищенные фрагменты вириона. Техника рекомбинантных ДНК позволяет наработать их в достаточных количествах. Главным недостатком субъединичных вакцин является то, что они не индуцируют полноценного клеточноопосредованного иммунного ответа. В этой связи следует особо отметить, что показана возможность перехода вируса из зараженных клеток в другие, минуя стадию отпочковывания – контактным путем. Тем самым доказана возможность распространения возбудителя в организме в присутствии значительного количества антител к ВИЧ. Идеальная протекция против вирусной инфекции достигается сочетанием гуморального и клеточного иммунного ответа. Для индукции обоих типов ответа разрабатываются новые методы, основанные на вакцинации синтетическими пептидами. Этот подход использует пептидный антиген, взятый из вариабельного домена гликопротеида gp120 ВИЧ, который содержит нейтрализующие, Т-хелперные и Т-цитотоксические эпитопы. Такой подход кажется очень перспективным, но он еще очень далек от широкого применения. Более насущная задача сегодня – повысить иммуногенность и эффективность рекомбинантных субъединичных вакцин. Итак, успехи в создании традиционных вакцин против ВИЧ очень скромны. В настоящее время нет достоверных данных, которые бы свидетельствовали о значительных успехах в этой области. Причина тому – значительная генетическая вариабельность вируса, особенно тех участков генома, где кодируются антигены, подвергающиеся иммунным атакам. ДНК-вакцинация. Это направление многие ученые называют революцией в вакцинологии. ДНК-вакцинация предусматривает доставку генов, кодирующих вирусные иммуногенные белки, в организм человека, что приводит к синтезу в нем соответствующих белков. Обычно иньекцию ДНК проводят в скелетные мышцы или обстреливают эпителий частицами золота, покрытыми ДНК, при помощи т.н. «генной пушки». Механизм ответственные за усвоение ДНК и последующую презентацию вирусных антигенов, пока не ясны. Известно только, что ДНК-вакцинация вызывает индукцию не только гуморального, но и клеточного иммунитета. Генная вакцинация имеет громадное преимущество перед обычными имунологическими методами – она не способна сама по себе вызвать инфекцию. По мере усовершенствования техники рекомбинантных ДНК вакцины могут нарабатываться быстро и в большом количестве. Они хорошо хранятся, легко транспортируются и сравнительно дешевы. Полученные к настоящему времени данные испытаний ДНК-вакцин против ВИЧ на здоровых добровольцах свидетельствуют о их безопасности и хорошей иммунногенности. Генотерапия. Генотерапия – метод контроля экспрессии вирусных генов посредством использования синтетических олигонуклеотидов. Имеется два подхода, приводящих к ингибированию репликации вируса. В первом используются олигонуклеотиды, которые, взаимодействуя с регуляторными вирусными белками, инактивируют их. Второй подход предусматривает применение т.н. антисмысловых олигонуклеотидов (АСОНов), которые связываются с комплементарными участками вирусных нуклеиновых кислот. Большинство АСОНов связываются с вирусными мРНК и блокируют тем самым синтез вирусных белков. Следует отметить, что препараты для генотерапии очень дороги и сложны в применении, что пока ограничивает использование их терапевтического потенциала. Так есть ли надежда на спасение от СПИДа? При обследовании одной из групп высокого риска было установлено, что некоторые индивидуумы, которые неоднократно имели возможность заразиться, тем не менее не были носителями ВИЧ. Оказалось, что все они гомозиготны по аллелю, несущему делецию в гене, кодирующем хемокиновый рецептор, т.е. корецептор ВИЧ. В связи с этим, исследователи предлагают несколько вариантов использования полученных результатов для борьбы с инфекцией ВИЧ: 1) генно-терапевтическое подавление экспрессии гена корецептора ВИЧ; 2) введение делеции в этот ген с помощью сайт-направленного мутагенеза. Интересно, что частота указанной мутации (данным разных авторов) колеблется у представителей европеоидной популяции от 11 до 17%, а у африканцев – от 0 до 1,7%. Обсуждается идея ликвидации в организме больного всех Т4лимфоцитов с последующей пересадкой собственных, законсервированных ранее (и еще не инфицированных) лимфоцитов. Еще одним многообещающим подходом является создание химиотерапевтических препаратов, препятствующих инфицированию клеток ВИЧ. Теоретическая основа этого подхода возникла в результате серии работ, показавшей, что ВИЧ начинает реплицироваться еще до проникновения в клетки – в крови за счет присутствия в ней небольших концентраций 2’-дезоксинуклеозид-5’-трифосфатов. И если эту репликацию подавить, инфекционность вируса по отношению к лимфоцитам резко падает. Известно, что большинство ингибиторов репродукции ВИЧ относится к группе модифицированных 2’-дезоксинуклеозид-5’трифосфатов. Поэтому, если создать достаточно стабильные в крови модифицированные 2’-дезоксинуклеозид-5’-трифосфаты, способные селективно ингибировать обратную транскриптазу ВИЧ, можно надеяться, что основная инфицируемая ВИЧ популяция клеток крови окажется защищенной. Рекомендуемая литература Основная Змушко Е.И., Белозеров Е.С. ВИЧ-инфекция: руководство для врачей. СПб.: Питер, 2000. 320 с. Исаков В.А., Борисова В.В., Исаков Д.В. Герпес: патогенез и лабораторная диагностика. Руководство для врачей. СПб.: Лань, 1999. 192 с. Ключарева А.А. Диагностика и лечение хронических вирусных гепатитов // Мед. новости. 1997. № 4. С. 21-26. Коломиец А.Г., Савицкая Т.В., Матвеев В.А. и др. Изучение эпидемиологии герпетических вирусных инфекций в Республике Беларусь // Ж. микробиол. эпидемиол. и иммунол. 1997. № 3. С. 24-29. Львов Д.К. Многоликий гепатит // Медицина для всех. 1996. № 1. С. 2-3. Львов Д.К., Слепушкин А.Н., Ямникова С.С., Бурцева Е.И. Грипп остается непредсказуемой инфекцией // Вопр. вирусол. 1997. Т. 42, № 3. С. 141-144. Сергеев О.В. Современный подход к созданию анти-ВИЧ-вакцины // Вопр. вирусол. 1997. Т. 42, № 2. С. 50-53. Свердлов Е.Д. Надежда на спасение от СПИДа? // Биоорган. химия. 1997. Т. 23, № 2. С. 159-160. Справочник по инфекционным болезням / Под ред. Ю.Ф.Лобзина, А.П.Казанцева. СПб.: Феникс, 1997. 736 с. Шмид Д. Гепатит В – болезнь, передаваемая половым путем, которой мы пренебрегали // Вестн. дерматол. и венерол. 2000. № 6. С. 56-59. Ackermann M., Engels M., Fraefel C., Metzler A., Schwyzer M., Suter M., Tobler K. Herpesviruses: balance in power and powers imbalanced // Vet. Microbiol. 2002. V. 86, № 1-2. Р. 175-181. Johnston S.L. Anti-influenza therapies // Virus Res. 2002. V. 82, N 1-2. P. 147-152. Padgett D.A., Sheridan J.F., Dorne J. et al. Social stress and reactivation of latent herpes simplex virus type 1 // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1998. V. 95, № 12. P. 7231-7235. Pommier Y., Marchand C., Neamati N. Retroviral integrase inhibitors year 2000: update and perspectives // Antiviral Res. 200. V. 47, No 2. P. 139-148. Shi S.T., Lai M.M. Hepatitis C viral RNA: challenges and promises // Cell. Mol. Life Sci. 2001. V. 58, N 9. P. 1276-1295. Дополнительная Галегов Г.А. Синтетические ингибиторы протеиназы ВИЧ и новые возможности лекарственной терапии ВИЧ-инфекции и СПИДа // Вопр. вирусол. 1997. Т. 42, № 6. С. 284-286. Зубрицкий П.К., Себут Н.С., Голуб В.С. Вирусные гепатиты в Республике Беларусь: состояние проблемы и тенденции // Вирусные гепатиты с парентеральным механизмом передачи возбудителей и их исходы. Киев, 2001. С. 35-38. Коломиец А.Г., Лозинский В.П., Коломиец Н.Д. Этиологическая структура вирусных заболеваний респираторного тракта и современные возможности их этиопатогенетической терапии // Мед. новости. 1997. № 2. С. 3-11. Майер К.П. Гепатит и последствия гепатита. М.: ГЕОТАР Медицина, 1999. 423 с. Новиков П.Л. Генерализованная герпетическая инфекция // Медицина. 1997. № 2. С. 24-27. Шкарин В.В., Соринсон С.Н. ВИЧ/СПИД-инфекция. Двадцать лет спустя после начала пандемии.-Н.Новгород: Изд-во НГМА, 1999. 145 с. DiBisceglie A.M., Bacon B.R. The unment challenges of hepatitis C // Sci. Amer. 1999. V. 281, № 4. P. 58-63. Gubareva L.V., Kaiser L., Hayden F.G. Influenza virus neuraminidase inhibitors // Lancet. 2000. V. 355, № 5. P. 827-835. Mary C. Virus et hepatitis // Biofutur. 1996. № 156. Р. 17-28. Raulin J. Human immunodeficiency virus and host cell lipids. Interesting pathways in research for a new HIV therapy // Progr. Lipid Res. 2002. V. 41, № 1. P. 27-65. Shortridge K.F. The influenza conundrum // J. Med. Microbiol. 1997. V. 46, № 10. Р. 813-815. Справочник основных терминов Абортивная инфекция – инициация инфекции без завершения инфекционного цикла и, отсюда, без продукции инфекционных частиц. Агглютинация – склеивание и выпадение в осадок из однородной взвеси бактерий, эритроцитов и др. клеток. Адсорбция – первый этап вирусной инфекции, сопровождающийся взаимодействием между вирусной частицей и рецепторной молекулой восприимчивой клетки. Адьювант – субстанция, которая, будучи одновременно введенной в организм со специфическим антигеном, повышает иммунный ответ на этот антиген. Такие соединения, напр., сульфат алюминия, эмульсия микобактерий (т.н. адьювант Фройнда) обычно входят в состав убитых вирусных вакцин или субклеточных вакцин. Амантадин – химиопрепарат, который используется для профилактики гриппозных заболеваний. В отечественной практике распространен его аналог – ремантадин. Антиген (Аг) – вещество, несущее признаки генетически чужеродной информации и вызывающее в организме развитие специфических иммунологических реакций. В случае вирусов, антигенами являются вирионы, белки внешней оболочки, капсид и неструктурные белки. Нуклеиновые кислоты антигенной активностью не обладают. Антигенный дрейф – незначительные изменения в структуре поверхностных антигенов (гемагглютенина и нейраминидазы), вызванные точечными мутациями в генах, которые их кодируют. Антигенный шифт – изменения, которые серьезно затрагивают антигенную структуру гемагглютенина, а реже и нейраминидазы. Антирецепторы вирусные – вирионные белки (напр., гемагглютенин вируса гриппа), которые связываются с рецепторами восприимчивой клетки. Антитело (Ат) – иммуноглобулин, появляющийся в сыворотке крови и жидкостях организма в результате антигенной стимуляции и специфически взаимодействующий со своим антигеном. Противовирусные антитела вызывают агрегацию и распад вирионов, экранируют антирецепторы, совместно с комплементом оказывают цитотоксическое действие на клетки, инфицированные вирусом. На вегетативный вирус не действуют. Аттенуация – искусственное снижение вирулентности инфекционного агента. Ацикловир – ациклический аналог гуанозина. Структура напоминает молекулу гуанозина, лишенную части углеводного цикла. Применяют ацикловир при простом герпесе и опоясывающем лишае. Бактериофаг (фаг) – вирус, репродуцирующийся в бактериальных клетках. Бляшка – видимая невооруженным глазом зона массовой гибели клеток на газоне или монослое восприимчивых клеток в области инокуляции. Подсчет бляшек - бляшкообразующих единиц (БОЕ) – используют для выражения дозы или степени цитопатогенности вируса. Вакцина – препарат, содержащий Аг или смесь Аг и предназначенный для формирования иммунного ответа. Противовирусные вакцины подразделяют на три основные типа: 1) инактивированные, 2) живые и 3) субъединичные вакцины. Последние состоят из фрагментов вириона или вирусных Аг, которые продуцируют микроорганизмы, измененные генноинженерными методами. Видарабин (аденинарабинозид; ара-А) – антивирусный препарат, применяемый против инфекций, вызванных герпесвирусами. Виразол (рибавирин; 1-β-D-рибофуранозил-1,2,4-триазол-3карбокс-амид) – полусинтетический противовирусный нуклеозид - аналог инозина или гуанозина, обладающий широким спектром противовирусной активности. Вирион – элементарная вирусная частица, представляющая собой внеклеточную (покоящуюся) форму вируса. Размеры различных вирионов колеблются от 20 до 300 нм. Вирионы простых вирусов (напр., аденовирусы, пикнавирусы) состоят из сердцевины (нуклеоид), содержащей ДНК либо РНК, и белковой оболочки (капсид). У сложных вирусов (герпесвирусы, миксовирусы) капсид заключен в дополнительную липопротеиновую оболочку, на поверхности которой часто локализуются т.н. «шипы». Вирогения – длительное сосуществование вируса с клеткой-хозяином, при котором геном вируса интегрирован с геномом клетки. В случае бактериофагов, такое явление носит название «лизогения». Вироид – облигатный внутриклеточный паразит, представляющий собой мелкую (200-400 нуклеотидов) кольцевую одноцепочечную РНК с характерной палочкообразной вторичной структурой. Вироиды не обладают оболочкой и не кодируют каких-либо белковых продуктов. Виропексис – процесс пенетрации (проникновния) вируса в клеткухозяина путем пиноцитоза, включающего инвагинацию клеточной стенки с рецепторами, на которых адсорбируется вирус. Вирулентность – степень патогенности; способность данного вируса вызывать заболевание у определенного хозяина. Вирулицидность – способность физических и химических факторов уничтожать вирусные частицы. Вирус – ДНКили РНК-содержащий микроорганизм, репродуцирующийся только в живых клетках, заставляя их синтезировать вирионы, которые содержат геном вируса и способны перемещать его в другие клетки. Вирусоид (сателлит) – вироид-подобная молекула РНК (около 1000 нуклеотидов), которая зависит от присутствия в клетке другого реплицирующегося вируса (помощник), поставляющего сателлиту свой капсид для упаковки РНК. Все изученные к настоящему времени вирусоидные РНК обладают рибозимной активностью. Вирус-помощник – вирус, геном которого содержит информацию, необходимую для размножения вирусоида (сателлита). Восприимчивость (чувствительность) – способность клетки или многоклеточного организма заражаться тем или иным вирусом. Ганцикловир – производное ацикловира, которое токсичнее последнего, но проявляет высокую активность по отношению к цитомегаловирусу. Гель-фильтрация – метод очистки вирусов, основанный на различной скорости перемещения в геле частиц, имеющих разные размеры. Гемагглютенация – явление склеивания эритроцитов вирусами, которые имеют на своей поверхности гемагглютенины. Гемагглютенин – белок (гликопротеид), формирующий «шипы» на поверхности некоторых вирионов. Выполняет функцию антирецептора. Обеспечивает адгезию вируса к мерцательному эпителию дыхательных путей и склеивание (агглютенацию) эритроцитов. Генная инженерия – раздел биотехнологии, который разрабатывает методы создания искусственных рекомбинантных ДНК, используемые для получения организмов со смешанными геномами. Геном (вирусный) – совокупность генетической информации, которая закодирована в ДНК, либо в РНК вируса. Геном может быть монолитным (представлен одной молекулой нуклеиновой кислоты), фрагментированным (состоит из нескольких сегментов, которые несут одинаковую или различную информацию). Одноцепочечные РНК-геномы имеют две полярности: позитивную (+), если последовательность нуклеотидов представлена нуклеотидными триплетами, кодирующими последовательность аминокислот в белках, и негативную (–), которая комплементарна (+)РНК. Дезоксирибонуклеаза – фермент, который гидролизует молекулы ДНК. Препараты дезоксирибонуклеазы используют для лечения герпетического стоматита (в форме полоскания), герперических и аденооовирусных кератитов (в виде капель). Дидезоксинуклеозиды (дидезоксиинозин - ddI; дидезоксиаденозин – ddA; дидезоксицитидин – ddC, замицит) – препараты на основе модифицированных нуклеозидов, используемые для терапии СПИДа. Зидовудин (азидотимидин; AZT) – противовирусный препарат, структура которого напоминает тимидин. Используется для комплексной терапии СПИДа. Иммуноглобулины (Ig)- белковая фракция крови, содержащая Ат. По составу иммуноглобулинов можно судить о присутствии в организме того или иного возбудителя, а также о том, какой срок прошёл после его внедрения. Обычно иммуноглобулины класса М (IgМ) вырабатываются организмом вскоре после вторжения возбудителя, но они и рано исчезают из крови, поэтому IgМ считают маркерами острой инфекции (либо признаком обострения хронической инфекции). Иммуноглобулины класса G (IgG) начинают синтезироваться организмом значительно позже, но и вырабатываются очень долго (именно они отвечают за долговременный иммунитет). Обнаружение специфических для какого-либо возбудителя IgG считают признаком того, что организм с данной инфекцией уже встречался. Соответственно, одновременное обнаружение IgG и IgМ - признак обострения хронической инфекции. Интеграция – процесс включения ДНК вируса в хромосомную ДНК клетки-хозяина. Характерна для ретровирусов, умеренных (лизогенных) фагов, вируса гепатита В Интерферон – гормоноподобный белок, вырабатываемый клетками позвоночных в ответ на вирусную инфекцию или воздействие различных индукторов. Выделяют три типа интерферонов: α-, или лейкоцитарный (продуцируется лейкоцитами); β-, или фибробластный (продуцируется фибробластами); и γ-, или иммунный (продуцируется естественными киллерами и Т-лимфоцитами). Интерфероноген (индуктор интерферона) – фактор, который индуцирует образование интерферона клетками позвоночных. Из природных факторов таким свойством обладают вирусы и некоторые другие микроорганизмы, нуклеиновые кислоты, полисахариды, полифенолы. Из синтетических соединений интерферон индуцируют полифосфаты, основные красители, поликарбоксилаты. Самым мощными индукторами интерферона являются двухцепочечные вирусные РНК. Инфекция (вирусная) – процесс взаимодействия вирусов и чувствительных к ним клеток. Выделяют острую и хроническую продуктивную (литическую) инфекцию, которая завершается образованием нового поколения вирионов и (часто) гибелью клетки; абортивную инфекцию и вирогению (интегральную инфекцию), при которой геном вируса встраивается в геном клетки-хозяина. Капсид – белковая оболочка вириона. Состоит из капсомеров с использованием спирального или икосаэдрического типа симметрии. Стабилизирует геном и защищает его от неблагоприятных внешних воздействия. Кроме того (у простых вирусов) выполняет антирецепторную и ферментативную функции. Капсомер – морфологическая единица капсида. Кеп – (буквально, шапочка, колпачок) – нуклеотидная структура на 5’концах мРНК многих эукариотических клеток и некоторых вирусов; состоит из N7-метилгуанозина, 5’-гидроксил которого соединен через трифосфатную группировку с 5’-гидроксилом последнего нуклеозида. Керецид (йоддезоксиуридин, ИДУ) – модифицированный аналог тимидина, угнетающий репродукцию ДНК-содержащих вирусов. Используется наружно для терапии герпетических кератитов. Константа седиментации – частное от деления скорости осаждения частиц (v) в гравитационном поле на центробежное ускорение (c). Обычно выражают в единицах Сведберга (S), равных скорости седиментации в воде при 20оС при бесконечном разведении под влиянием единицы центробежной силы. Используют для идентификации вирусов и анализа чистоты вирусных препаратов. Ламивудин (2’,3’-дидезокси-3’-тиоцитидин; ЗТС) – противовирусный препарат. Аналог зидовудина, проявляющий с ним синергическое действие, т.к. сочетанное применение обусловливает лучший эффект у больных СПИДом. Латентная инфекция – инфекция, при которой вирус находится в организме хозяина в скрытой форме; он выделяется при этом из организма с перерывами, обычно связанными с рецидивами болезни. Латентный период – период времени от начала инфекции клетки до первого появления вне ее новых вирусных частиц. Лизогения – сосуществование генома бактерии и умеренного фага в виде единой хромосомы, которая наследуется дочерними клетками, с возможностью высвобождения фагового генома, развития и размножения фага с последующим лизисом бактерии. Лизоцим (КФ 3.2.1.17) – фермент (гидролаза), разрушающий клеточные стенки некоторых бактерий. Фермент типа лизоцима находится на конце отростка, через который фаг инъецирует нуклеиновую кислоту в бактериальную клетку. Медленная (вирусная) инфекция – инфекция, характеризующаяся очень длительным инкубационным периодом, который может измеряться месяцами и годами. Нейраминидаза – фермент, который отщепляет Nацетилнейраминовую кислоту от гликопротеидов в составе оболочек клеток животных, тем самым нарушая их проницаемость. Находится в составе некоторых вирусов (напр., вируса гриппа) и способствует выходу зрелых вирионов из клетки-хозяина. Нуклеоид – генетический аппарат вирусов. Представлен одной целой или фрагментированной молекулой одноцепочечной или двухцепочечной РНК либо ДНК. У некоторых вирусов имеются два идентичных генома. Нуклеиновая кислота в составе нуклеоида часто связана с положительно заряженным внутренним белком. Нуклеокапсид – упорядоченный комплекс генома вируса с капсидом. Обратная транскриптаза (ревертаза) – фермент (РНК-зависимая ДНК-полимераза), который осуществляет синтез копии ДНК на РНК. Встречается у некоторых РНК-содержащих вирусов, которые имеют одноцепочечный негативный геном. Обеспечивает возможность интеграции генетического материала таких вирусов в хромосомную ДНК клеткихозяина. Онкогенность - способность вызывать злокачественное перерождение, рак. Пандемия – эпидемия, охватывающая значительную часть населения страны, группы стран, континента. Паразитизм вирусов – вирусы являются облигатными внутриклеточными паразитами, что обусловлено отсутствием у них систем синтеза белка и генерации энергии. Парентеральный - механизм передачи инфекции, когда она внедряется в организм, минуя желудочно-кишечный тракт, т.е. через кровь (в том числе при многоразовом использовании шприца). Пенетрация (проникновение) – ранняя стадия вирусного репликационного цикла, на котором вирион (или вирусный геном) проникает в клетку-хозяина. Пермиссивная клетка – клетка, способная обеспечить продуктивную инфекцию вируса. Персистентная инфекция – инфекция, при которой инфекционный вирус выделяется из организма-хозяина в течение значительно большего, чем при обычной инфекции, периода. Плазмида – необязательный экстрахромосомальный генетический элемент клетки, способный к автономной (независимо от хромосомы) репликации. Полипротеин – крупный, функционально неактивный белок, который расчленяется специфическими протеазами с образованием нескольких более мелких (функционально активных) белков. Прион – молекула белка (PrPSc), способная через взаимодействие с другой белковой молекулой передавать последней свое конформационное состояние. Считается, что прионы ответственны за ряд нейродегенеративных инфекций у людей и животных. Провирус – геном ДНК-содержащего вируса или ДНК-копия РНКсодержащего вируса, которые интегрированы в хромосомную ДНК клеткихозяина. Возникновение провирусов характерно для умеренных фагов, онкогенных и некоторых вирулентных вирусов (напр., ВИЧ, вирус гепатита В). ПЦР - полимеразная цепная реакция. Молекулярно-биологический метод, выявляющий наличие специфических участков ДНК и РНК. Представляет собой циклический процесс увеличения в геометрической прогрессии числа копий ограниченного синтетическими олигонуклеотидами (праймерами) определенного фрагмента ДНК, протекающий под воздействием ДНК-полимеразы. Используется, в частности, для обнаружения возбудителей различных заболеваний. Отличается исключительно высокой чувствительностью и специфичностью. Оказалась настолько значимой для медицины и биологии, что в 1993 г. за разработку этого метода Кэри Б. Мюллис был удостоен Нобелевской премии. Раздевание (вируса) – стадия вирусной инфекции, которая следует за проникновением вируса в клетку-хозяина и состоит в распаде вириона на составные части под действием хозяйских протеаз. Рекомбинантный - созданный методами генной инженерии. Ремантадин – противовирусный препарат близкий по химической структуре к амантадину. Активен в отношении вируса гриппа А. Рецептор – белок поверхности клетки, который специфически связывается с вирусным антирецептором, после чего происходит проникновение вируса в клетку. Сборка (вируса) – поздняя стадия вирусной инфекции, во время которой все компоненты, необходимые для образования зрелого вируса, собираются в определенном месте клетки, формируя вирусную частицу. Сегментированный геном – геном, который состоит из нескольких молекул вирионной нуклеиновой кислоты. Серотип - подвид какого-либо микроорганизма, отличающийся от других представителей своего вида особыми антигенными свойствами. Скрининг (screening - просеивание) – первичный отбор. Иными словами, массовое предварительное обследование, использующее относительно недорогие и нетрудоёмкие технологии. Обычно не отличается высокой точностью и для достоверности результата данные, полученные при скрининге, проверяются более сложными и дорогостоящими методами. Созревание (вируса) – фаза вирусной инфекции (между фазой эклипса и выходом вирионов из клетки), во время которой в клетке нарастает титр инфекционных вирусных частиц. Ставудин (d4T; 2’,3’-дидегидро-2’,3’-дидезокситимидин) – антивирусный препарат, аналог тимидина. Механизм действия подобен таковому у AZT, но переносится больными легче, из-за меньшей токсичности. Тип симметрии – способ упаковки капсомеров в капсиде. При этом различают спиральный, икосаэдрический и смешанный типы симметрии. При спиральном типе капсомеры укладываются вдоль линейно вытянутой молекулы нуклеиновой кислоты. При икосаэдрическом – они формируют многогранник типа икосаэдра. При смешанном типе симметрии (напр., фаги) капсид формируется с использованием обоих указанных выше типов симметрии. Трансдукция – опосредуемый бактериофагами перенос генетического материала бактерий от одной клетки к другой. Транскрипция – процесс переноса генетической информации с генома на мРНК. Осуществляется ДНК-зависимой РНК-полимеразой (у ДНКсодержащих вирусов) и РНК-зависимой РНК-полимеразой (у (-)РНКгеномных вирусов. У (+)РНК-геномных вирусов геномная РНК сама выполняет функции мРНК. Трансляция – процесс формирования полипептидной цепочки на ассоциированной с рибосомами мРНК. Трифтортимидин (ТФТ) – противовирусный препарата, аналог тимидина с высокой степенью селективного воздействия на ДНКсодержащие вирусы (герпеса, аденовирусов, оспы). Тропизм вируса – спектр клеток-хозяев данного вируса. Может быть представлен каким-либо одним (монотропизм) или несколькими (пантропизм) типами клеток. Обусловлен тем, что для первого (и обязательного) этапа в цикле размножения вируса – прикрепления к клеточной мембране – необходима комплементарность рецептора клетки с антирецептором вируса. Ультрафильтрация (вирусов) – фильтрование вирусной суспензии через мелкопористые мембранные фильтры. Используется для концентрирования, очистки и определения размеров вирионов, а также для освобождения вирусной субстанции от бактерий и более крупных частиц. Ультрацентрифугирование – центрифугирование при центробежных скоростях порядка 100 тыс. g выше. Используется для очистки вирусов, определения константы седиментации и плавучей плотности вирионов. Фаза выхода – поздняя фаза вирусной инфекции, во время которой вновь синтезированные вирионы покидают клетку-хозяина. Фекально-оральный - механизм проникновения возбудителя из кишечника больного (через грязную почву, немытые руки, воду и продукты питания) через рот в организм другого человека. Химиотерапия (вирусных инфекций) – самостоятельный раздел вирусологи, основной задачей которого является поиск, испытания и отбор новых противовирусных лекарственных средств синтетического или природного происхождения. Цитоплазма - всё внутреннее содержимое клетки, за исключением ядра. В цитоплазме содержатся органеллы и включения. Штамм – клоновая (из одной клетки) по происхождению культура микроорганизма, генетическая однородность которого по какому-либо признаку поддерживается искусственным путем. Эклипс-фаза – период времени от проникновения вируса в клеткухозяина до появления в ней зрелых вирусных частиц нового поколения. Экспрессия (гена) - проявление, реализация заключённой в нём генетической информации. Чаще всего осуществляется посредством синтеза специфических белков, состав которых закодирован в гене. Эпидемия – массовое распространение инфекционного заболевания человека в какой-либо местности, стране, значительно превышающее обычный уровень заболеваемости. Предметный указатель А Абортивная инфекция, 38, 157, 160 Агглютинация, 42, 157 Адсорбция (прикрепление) вируса, 23, 27, 41, 42, 157 Адьювант, 78, 157 Азидотимидин (зидовудин), 104, 105, 106, 149, 152, 159, 163 Амантадин, 97, 116, 117, 118, 157 Антиген(ы), 67, 78, 79, 81, 112, 113, 114, 117, 119, 120, 121, 125, 128, 129, 131, 134, 137, 143, 144, 153, 157 антигенный дрейф, 120, 157 антигенный шифт, 120, 157 Антирецептор, 36, 41, 43, 56, 94, 95, 96, 127, 144, 148, 157, 159, 160, 162, 163 Антитело, 56, 79, 80, 81, 82, 83, 88, 96, 116, 122, 124, 125, 133, 137, 144, 147, 153, 157 Аттенуация, 157 аттенуированные вакцины, 6, 78, 80 аттенуированные вирусы, 77 Ацикловир, 103, 108, 110, 142, 157, 159 Б Бактериофаг (фаг), 6, 7, 14, 26, 32, 36, 38, 40, 65, 157, 158, 163 БВДУ, 5, 102, 103, 141, 142 Бляшка (негативная колония), 88, 89, 157 В Вакцина, 79, 81, 82, 110, 135, 158 живая аттенуированная, 80 живая рекомбинантная, 81 против бешенства, 6, 80 против гепатита А против гепатита В, 79, 81, 82 против кори, 79, 80 против краснухи, 80 против полиомиелита, 80 против свинки, 80 субклеточная, 78 убитая (инактивированная), 80 Вакцинный штамм, 6, 76 Вакцины, 75, 78, 79, 80 Видарабин, 100, 158 Виразол (рибавирин), 84, 99, 107, 108, 118, 135 Вирион(ы), 11, 12, 31, 35, 40, 50, 56, 112, 115, 120, 125, 138, 158, 162 архитектоника, 2, 32 измерение плотности, 20, 25 очистка, 20, 21, 159 свойства, 20 Вирогения, 158 Вироид, 7, 65, 66, 67, 68, 129, 158 Виропексис, 158 Вирулентность, 158 Вирулицидные препараты, 93 госсипол, 93, 94 оксолин, 93, 110, 118 теброфен, 93 Вирус простого герпеса (ВПГ), 5, 16, 98, 100, 101, 102, 103, 104, 136, 137, 138, 139, 140, 142 геном, 137 Вирус табачной мозаики (ВТМ), 5, 7, 8, 22, 29, 33, 35, 38 Вирусные гепатиты, 122, 155 гепатит D (ВГD), 5, 67, 129, 130, 131 гепатит А (ВГА), 5, 122, 123, 124 гепатит В (ВГВ), 5, 124, 125, 126, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 133 гепатит С (ВГС), 5, 131, 132, 133, 134, 135, 136 Вирусоид, 7, 158 Вирусы, 3, 11, 13, 15, 17, 18, 22, 23, 38, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 64, 113, 119 классификация и номенклатура, 17, 19 открытие, 6 природа, 11 происхождение, 12 ВИЧ-инфекция, 143, 145, 147, 155 морфология, 144 патогенез, 147 химиотерапия, 149 ингибиторы ревертазы, 149 эпидемиология, 145 этиология, 143 Восприимчивость, 124, 159 Выделение и очистка вирусов (методы), 20 гель-фильтрация, 26 гомогенизация клеток, 21 дифференциальное центрифугирование, 23 ионообменная хроматография, 27 лизис клеток, 38 обработка клеток ультразвуком, 21 осаждение спиртами, 22 ультрафильтрация, 23, 163 центрифугирование в градиенте плотности, 24 Г Ганцикловир, 104, 159 Гель-фильтрация, 20, 26, 159 Гемагглютинин, 42, 112, 159 Генная инженерия, 11, 78, 79, 158, 159, 162 Геном (вирусный), 51, 66, 120, 126, 129, 131, 159 сегментированный, 48, 50, 54, 159, 163 Генотерапия, 153 Герпесвирусы, 17, 40, 41, 44, 55, 94, 136, 137, 138, 158 классификация, 112, 136 репликация, 46 структура, 137 экспрессия генов, 55 Герпетичесая инфекция, 136 Герпетическая инфекция, 136, 138 менингит, 140, 141 офтальмогерпес (кератиты), 85, 140 патогенез, 138 профилактика и лечение, 141 энцефалиты, 140 эпидемиология, 138 этиология, 136 Грипп, 4, 17, 26, 27, 41, 42, 62, 79, 81, 82, 85, 93, 96, 97, 112, 113, 114, 116, 117, 118, 119, 120, 121, 144, 155, 157, 161, 162 лечение и профилактика, 116 патогенез, 114 характеристика возбудителя, 112 вирус гриппа А, 113 вирус гриппа В, 113 вирус гриппа С, 113 система кодирования, 113 структура вириона, 112 Группы Балтимора, 16, 31, 46 Д Дезоксирибонуклеаза, 97 Дидезоксинуклеозиды, 159 дидезоксиинозин, 106, 159 ДНК-вакцина, 79, 153 ДНК-содержащий вирусы, 13, 17, 38, 59, 89, 101, 126, 130, 160, 163 классификация, 17 Ж Живые вирусные вакцины, 77 аттенуированные, 76 рекомбинантные, 78 З Зидовудин (азидотимидин AZT), 99, 104, 149, 159, 161 И Икосаэдрический капсид, 33 число триангуляции, 36 Иммунизация, 82, 83 нормальным иммуноглобулином, 82 пассивная, 82 специфическим иммуноглобулином, 83 Иммуноглобулин G, 5, 159 Иммуноглобулин M, 5, 62, 159 Иммуноглобулин А, 5 Интеграция, 160 Интерферон, 58, 59, 60, 75, 160 индукция, 57 механизм действия, 60, 118 продукция, 57, 58 типы, 58 эффекты, 134 Инфекции (вирусные) абортивные, 157, 160 иммунопрофилактика, 152 иммунотерапия, 75 латентные, 136, 139 медленные, 39 персистентные, 38 продуктивные, 42, 160, 162 химиотерапия, 74, 91 К Капсид, 31, 36, 122, 160 икосаэдрический, 137, 163 спиральный, 35, 163 Капсомер, 31 Керецид (йоддезоксиуридин ИДУ), 160 Классификация (вирусов), 15, 17 группы Балтимора, 46, 123 Константа седиментации, 23, 24, 160 Л Ламивудин (2’,3’-дидезокси-3’ тиоцитиидин 3ТС), 106, 128, 150, 161 Латентная инфекция, 38, 139, 161 Латентный период, 39, 161 Лизогения, 38, 158, 161 Лизоцим, 44, 161 Литическая (продуктивная) инфекция, 38, 160 стадии цикла, 39 М Матриксный белок, 36 Медленные инфекции, 39 Мишени для антивирусных препаратов, 145 мРНК, 9, 31, 45, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 58, 60, 107, 109, 115, 122, 131, 138, 149, 154, 160, 163 Н Невирапин, 106 Нейраминидаза, 42, 112, 161 Нуклеиновые кислоты (вирусов), 7, 9, 10, 17, 22, 29, 31, 32, 36, 55, 59, 66, 68, 69, 78, 89, 91, 97, 99, 157, 159, 160, 163 Нуклеоид, 7, 158, 161 Нуклеокапсид, 112, 161 Нуклеопротеин, 36, 144 Нуклеотиды, 58, 85, 143, 154 О Обратная транскриптаза (ревертаза), 51, 106, 144, 161 Онкогенные вирусы, 17 Ортомиксовирусы, 17 П Пандемия, 114, 119, 120, 121, 156, 161 Паразитизм (вирусов), 11, 67, 161 Парентеральный механизм передачи инфекции, 162 Пассивная иммунизация, 82 Пенетрация (проникновение вируса в клетку), 162 слияние мембран, 44 Пермиссивность, 41, 162 Персистентная инфекция, 162 Полипротеин, 46, 49, 123, 162 Прион, 7, 67, 68, 70, 72, 74, 162 Провирус, 52, 148, 149, 162 Р Раздевание (вируса), 45, 60, 94, 162 Ребетрон, 84, 135 Ревертаза (обратная транскриптаза), 53, 144 Рекомбинантные интерфероны, 83 Ремантадин, 97, 118, 162 Репликативный цикл (вируса) адсорбция, 27, 41, 157 раздевание, 45, 60, 94 репликация генома, 109 сборка, 55, 56 созревание, 52, 56, 109 экспрессия генов, 45 Рецепторы, 41, 42, 94, 127 вирусов, 157 хемокинов, 147 Рибавирин (виразол), 99, 107, 118, 158 РНК (вирусные), 5, 7, 8, 9, 11, 17, 18, 29, 31, 35, 36, 41, 45, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 59, 60, 62, 63, 65, 66, 67, 78, 85, 89, 91, 97, 98, 99, 106, 107, 112, 113, 115, 120, 122, 124, 126, 129, 130, 131, 132, 134, 135, 138, 143, 144, 148, 149, 158, 159, 160, 161, 162, 163 двухспиральные, 63 РНКаза-L, 60 РНКаза-Н, 51, 144, 148 РНК-содержащие вирусы, 9, 11, 17, 31, 89, 97, 120, 131, 143, 158, 161, 162 классификация, 17 репликация, 41, 46, 109 С Сборка (вирионов), 55 Седиментация константа седиментации, 23, 24 созревание (вирусов), 52, 56, 109 Т Терапия вирусных инфекций, 131 Транскрипция, 47, 163 каскадная, 47 Трансляция, 163 Трансмембранные гликопротеин, 36, 159 Трансмиссивные спонгиоформные энцефалиты, 67 животных, 67 человека, 67 Трифтортимидин (ТФТ), 101, 163 Тропизм (вирусов), 163 У Ультрафильтрация, 23, 163 Ультрацентрифугирование, 24, 164 в градиентах плотности, 24 дифференциальное, 20 Х Химиотерапевтический индекс, 87 Химиотерапия (вирусных инфекций), 86, 91, 142, 149, 164 Ш Штамм, 8, 9, 70, 72, 76, 80, 81, 95, 103, 108, 109, 112, 118, 120, 136, 150, 151, 152, 164 вакцинный, 76 Э Эволюция вирусов, 13 Эклипс-фаза, 164 Экспрессия генов, 54 Эндоцитоз, 138 Эпидемия, 119, 146, 164 ОГЛАВЛЕНИЕ ПРЕДИСЛОВИЕ......................................................................................... 3 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ .......................................................................... 5 ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ. НАУКА ВИРУСОЛОГИЯ. ОБЩИЕ ВОПРОСЫ .................................................................................. 6 1.1. Зачем необходимо изучать вирусы............................................................. 7 1.2. Природа вирусов .......................................................................................... 11 1.3. Происхождение вирусов.............................................................................. 12 1.4. Эволюция вирусов ....................................................................................... 13 1.5. Классификация и номенклатура вирусов............................................... 15 РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА......................................................... 19 ГЛАВА 2. СВОЙСТВА ВИРИОНОВ ........................................................................ 20 2.1. Выделение и очистка вирусов ................................................................... 20 2.1.1. Выделение вирусов из зараженных клеток .......................................... 20 2.1.2. Концентрирование и очистка вирусов .................................................. 21 2.1.3. Критерии чистоты вирусных препаратов ............................................. 28 2.2. Структурно-функциональная организация вирионов......................... 29 2.2.1. Химический состав вирусов................................................................... 29 2.2.2. Принципы вирусной архитектоники..................................................... 32 РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА......................................................... 37 ГЛАВА 3. ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ВИРУСА С КЛЕТКОЙ-ХОЗЯИНОМ ........................................................................ 38 3.1. Типы взаимодействия вируса с клеткой................................................. 38 3.2. Общая характеристика продуктивного процесса ................................. 39 3.3. Этапы взаимодействия вируса с клеткой-хозяином............................. 40 3.3.1. Прикрепление вируса к клетке .............................................................. 41 3.3.2. Проникновение вируса в клетку............................................................ 42 3.3.3. Раздевание вируса ................................................................................... 45 3.3.4. Стратегия репликации генома и экспрессия генов.............................. 45 3.3.5. Сборка вирионов ..................................................................................... 55 3.3.6. Созревание и выход вирионов из клетки.............................................. 56 3.4. Система интерферона.................................................................................. 56 3.4.1. Основные биологические свойства интерферонов.............................. 59 3.4.2. Механизмы действия интерферона ....................................................... 59 РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА......................................................... 64 ГЛАВА 4. ВИРУСОПОДОБНЫЕ ИНФЕКЦИОННЫЕ АГЕНТЫ .................................................................. 65 4.1. Сателлиты и вироиды................................................................................. 65 4.2. Прионы........................................................................................................... 67 РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА......................................................... 74 ГЛАВА 5. ТЕРАПИЯ И ПРОФИЛАКТИКА ВИРУСНЫХ ИНФЕКЦИЙ ........................................................................ 75 5.1. Вакцинотерапия и вакцинопрофилактика............................................. 75 5.1.1. Типы вакцин ............................................................................................ 76 5.1.2. Вакцины, находящиеся в употреблении в настоящее время .............. 79 5.2. Клиническое применение интерферона .................................................. 83 5.3. Химиотерапия вирусных инфекций ........................................................ 86 5.3.1. Разработка и испытания противовирусных препаратов ..................... 88 5.3.2. Успехи химиотерапии............................................................................. 91 5.3.2.1. Вирулицидные препараты............................................................... 93 5.3.2.2. Препараты, ингибирующие адсорбцию, проникновение и раздевание вирусов ....................................................................................... 94 5.3.2.3. Препараты, ингибирующие синтез вирусных нуклеиновых кислот ............................................................................................................. 98 5.3.2.4. Ингибирование экспрессии вирусных генов............................... 109 РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА....................................................... 110 ГЛАВА 6. ОСНОВНЫЕ СОЦИАЛЬНО-ЗНАЧИМЫЕ ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ И БОРЬБА С НИМИ................................... 112 6.1. Грипп (influenza) ......................................................................................... 112 6.1.1. Характеристика возбудителя ............................................................... 112 6.1.2. Патогенез................................................................................................ 114 6.1.3. Лечение и профилактика гриппа ......................................................... 116 6.1.4. Угроза пандемии и перспективы создания противогриппозной вакцины ............................................................................................................ 119 6.2. Вирусные гепатиты (hepatitis virosa)....................................................... 122 6.2.1. Вирусный гепатит А ............................................................................. 122 6.2.2. Вирусный гепатит Е.............................................................................. 124 6.2.3. Вирусный гепатит В.............................................................................. 124 6.2.4. Вирусный гепатит D ............................................................................. 129 6.2.5. Вирусный гепатит С.............................................................................. 131 6.3. Герпетическая инфекция (herpes simplex) ............................................. 136 6.3.1. Характеристика возбудителя ............................................................... 136 6.3.2. Патогенез................................................................................................ 138 6.3.3. Профилактика и лечение герпетической инфекции .......................... 141 6.4. ВИЧ-ИНФЕКЦИЯ/СПИД ........................................................................ 143 6.4.1. Общие вопросы ..................................................................................... 143 6.4.2. Эпидемиология...................................................................................... 145 6.4.3. Патогенез................................................................................................ 147 6.4.4. Химиотерапия ВИЧ-инфекции ............................................................ 149 6.4.5. Перспективы борьбы с ВИЧ-инфекцией ............................................ 152 РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА....................................................... 155 СПРАВОЧНИК ОСНОВНЫХ ТЕРМИНОВ ........................................... 157 Предметный указатель .................................................................................... 165