Культуральное исследование - World Health Organization
реклама
WHO/TB/98.258 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ Информационный центр Отдел по борьбе с инфекционными заболеваниями ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ Авеню Аппиа, 20 СН 1211 Женева, 27 Швейцария Факс: +41 22 791 42 85 e-mail: [email protected] web: http://www.who.int/infectious-disease-news CDS Information Resource Centre WORLD HEALTH ORGANIZATION 20, avenue Appia CH-1211 Geneva 27 Switzerland Fax: +41 22 791 42 85 e-mail: [email protected] web: http://www.who.int/infectious-disease-news ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ – ЧАСТЬ III: КУЛЬТУРАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ ЧАСТЬ III КУЛЬТУРАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ Всемирная организация здравоохранения WHO/TB/98.258 Оригинал: английский Распространение: всеобщее ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ ПО БОРЬБЕ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ КУЛЬТУРАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЧАСТЬ III Авторский коллектив: ISABEL NARVAIZ DE KANTOR SANG JAE KIM THOMAS FRIEDEN ADALBERT LASZLO FABIO LUELMO PIERRE-YVES NORVAL HANS RIEDER PEDRO VALENZUELA KARIN WEYER Проект документа подготовлен: KARIN WEYER Для Глобальной программы по туберкулезу Всемирная организация здравоохранения Женева, Швейцария Всемирная организация здравоохранения 1998 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ ПО БОРЬБЕ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ СОДЕРЖАНИЕ Предисловие...........................................................................................7 1. Введение............................................................................................9 2. Организация работы лаборатории и оборудование ..............................11 План бактериологической лаборатории........................................................................11 Расположение оборудования и материалов ..................................................................13 Уход за основным оборудованием и его хранение ........................................................14 3. Сбор проб.........................................................................................25 Флаконы (контейнеры) для сбора проб ........................................................................25 Методика сбора проб......................................................................................................26 4. Хранение и транспортировка материала .............................................29 5. Правила работы с пробами................................................................31 Прием поступающих проб .............................................................................................31 Техника безопасности при работе с материалом...........................................................31 6. Гомогенизация и деконтаминация ......................................................37 Методы разжижения и деконтаминации.......................................................................39 Метод деконтаминации с использованием гидроокиси натрия (модифицированный метод Петрова) ...........................................................................39 7. Питательные среды ..........................................................................51 Достоинства и недостатки яичных сред ........................................................................47 Предосторожности при приготовлении питательных сред ..........................................48 Приготовление яичных сред ..........................................................................................48 8. Техника посева и инкубации ..............................................................55 Техника посева................................................................................................................55 Инкубация посевов ........................................................................................................55 9. Культуральное исследование и идентификация ...................................57 График просмотра посевов.............................................................................................57 Учет результатов культурального исследования............................................................57 Дифференциальная диагностика M. tuberculosis............................................................57 Ниациновый тест............................................................................................................58 Нитратредуктазный тест ................................................................................................63 Каталазный тест..............................................................................................................71 Рост на среде, содержащей р-нитробензойную кислоту (PNB-тест)...........................74 10.Учет и предоставление результатов лабораторных исследований..............................................................77 11. Контроль качества ...........................................................................79 12. Рекомендуемая литература ...............................................................85 3 СОДЕРЖАНИЕ ПРИЛОЖЕНИЯ Приложение 1 Основное оборудование и материалы для бактериологической лаборатории, использующей модифицированный метод деконтаминации Петрова и питательную среду ЛевенштейнаЙенсена (6000 проб в год) ..........................................................................87 Приложение 2 Сбор мокроты.............................................................................................90 Приложение 3 Направление на лабораторное исследование ...........................................91 Приложение 4 Результаты культурального исследования.................................................92 4а. Предварительное заключение ..............................................................92 4б. Окончательное заключение .................................................................93 Приложение 5 Лабораторный журнал для регистрации результатов культуральных исследований ....................................................................94 РИСУНКИ Рисунок 1 План бактериологической лаборатории для культуральной диагностики туберкулеза ...........................................................................12 Рисунок 2 Оптимальное расположение оборудования и материалов в ламинарном шкафу для обеспечения безопасности и удобства работы.......................................................................................14 Рисунок 3 Настольный ламинарный шкаф 1-го уровня защиты...............................15 Рисунок 4 Настольный ламинарный шкаф 2-го уровня защиты...............................16 Рисунок 5 Система удаления воздуха, рекомендуемая для ламинарных шкафов 2-го класса безопасности .............................................................16 Рисунок 6 Лабораторный автоклав типа скороварки.................................................21 Рисунок 7 Автоклав с замещением воздуха паром .....................................................21 ДИАГРАММЫ Диаграмма 1 Метод деконтаминации с использованием гидроокиси натрия (NaOH) (модифицированный метод Петрова).........................................40 Диаграмма 2 Ниациновый тест для идентификации M. tuberculosis ..............................61 Диаграмма 3 Ниациновый тест с полосками для идентификации M. tuberculosis .........62 Диаграмма 4 Классический метод постановки теста восстановления нитрата для идентификации M. tuberculosis ............................................................65 Диаграмма 5 Тест восстановления нитрата для идентификации M. tuberculosis – Метод с использованием кристаллического реагента ..............................68 4 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ Диаграмма 6 Тест восстановления нитрата для идентификации M. tuberculosis – Метод с использованием бумажных полосок ...........................................69 Диаграмма 7 Тест для выявления термолабильной каталазы (68°С, рН 7,0) при идентификации M.tuberculosis.............................................................74 5 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ ПРЕДИСЛОВИЕ Первоочередной задачей бактериологических лабораторий в рамках национальных программ борьбы с туберкулезом является выявление заразных случаев туберкулеза, мониторинг процесса лечения и подтверждение излечения больного после окончания курса лечения с помощью бактериоскопического исследования. Следующей задачей бактериологических служб является помощь в диагностике легочного и внелегочного туберкулеза. Стандартизация основных методов бактериологического исследования при туберкулезе важна, не вызывает сомнений. Отсутствие стандартизованных методов не только осложняет работу вновь созданных лабораторных служб, но и препятствует объединению уже существующих лабораторий в единую сеть. Стандартизация позволяет получать сопоставимые результаты в масштабах страны, облегчает обучение персонала, разделение обязанностей и выбор закупаемого оборудования, материалов и реактивов; кроме того, упрощается оценка качества работы лабораторий и организация надлежащего контроля для повышения эффективности лабораторных исследований и снижения эксплуатационных расходов. Стандартизованные технологии и методы имеют практическое значение, если они разработаны в соответствии с реальной эпидемической ситуацией и учитывают существование различных уровней лабораторных служб. Эти методы должны быть простым и пригодным для массового использования и не вызывать затруднений у лабораторных работников. В то же время высокая чувствительность и специфичность этих методов должны гарантировать достоверность получаемых результатов. Хотя лабораторная служба и является неотъемлемой частью стратегии борьбы с туберкулезом, рекомендованной ВОЗ (лечение 6–8 месяцев под непосредственным контролем персонала за приемом противотуберкулезных препаратов, реализуемой Национальными программами борьбы с туберкулезом, тем не менее этой службе нередко уделяют недостаточное внимание. Более того, рост заболеваемости туберкулезом, усугубляемый расширяющейся эпидемией ВИЧ и формированием множественной лекарственной устойчивости у возбудителей, привели к повышению требований к качеству исследований и безопасности работы в лабораториях, занимающихся проблемой туберкулеза. Перечисленные выше аргументы послужили основанием для разработки методических рекомендаций для лабораторных служб в рамках Национальных программ борьбы с туберкулезом. Эти рекомендации изложены в трех книгах, две их которых сосредоточены на технических аспектах бактериоскопического и культурального исследований, а третья – на организации работы лабораторий, включая вопросы техники безопасности и профессионального тестирования. Эти рекомендации разработаны для использования в развивающихся странах и странах со средним уровнем экономического развития, с высоким уровнем распространенности туберкулеза и высокими показателями заболеваемости. Эти рекомендации предназначены для использования не только в повседневной работе лаборатории, но и для обучения лабораторных и других медицинских работников. Наконец, для того чтобы приспособить работу функционирующих бактериологических лабораторий к нуждам Национальных программ борьбы с туберкулезом, в рекомендации была включена информация по контролю эффективности реализации этих программ. Авторы надеются, что публикация данных документов по лабораторной диагностике туберкулеза поможет Национальным программам борьбы с туберкулезом разработать свои лабораторные рекомендации, которые будут способствовать повышению эффективности работы этих программ. 7 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ 1 ВВЕДЕНИЕ В настоящее время туберкулез имеет глобальное значение. По оценкам специалистов, треть населения земного шара инфицирована Mycobacterium tuberculosis, а около 8 миллионов человек ежегодно заболевают туберкулезом. Несомненно, что «туберкулезный кризис» существенно усугубился эпидемией ВИЧ/СПИДа, что стало причиной резкого увеличения распространенности туберкулеза. Большинство больных – это люди в наиболее работоспособном возрасте, от 15 до 45 лет. Ежегодно туберкулез убивает более 2 миллионов человек, т. е. больше, чем любая другая отдельно взятая инфекция, включая СПИД и малярию. Возбудители туберкулеза передаются аэрогенным путем, попадая в окружающую среду при кашле больного туберкулезом легких. Инфекционные частицы сохраняются в воздухе в течение длительного времени и могут вдыхаться людьми. При туберкулезе процесс обычно локализуется в верхушках легких. При этом могут образовываться полости (каверны), где содержится огромное количество микобактерий туберкулеза, которые можно обнаружить в образцах мокроты. На наличие у больного туберкулеза легких может указывать длительный (более 3 недель) кашель с мокротой, потеря массы тела, ночные поты и боли в груди. Достоверный диагноз может быть установлен только с помощью лабораторного исследования при обнаружении микобактерий туберкулеза в мокроте с помощью бактериоскопии и/или культурального метода. «Краеугольным камнем» в диагностике туберкулеза является бактериоскопическое исследование правильно окрашенных препаратов мокроты на наличие микобактерий. Чтобы обнаружить микобактерии туберкулеза с помощью микроскопии, в 1 мл мокроты должно содержаться от 5 до 10 тысяч микроорганизмов. Однако такое значительное количество микобактерий, содержится в мокроте только у части больных туберкулезом. Кроме того, с помощью микроскопии практически невозможно дифференцировать различные виды микобактерий. Больные с положительными результатами бактериоскопического исследования мокроты являются массивными бактериовыделителями и поэтому должны быть выявлены в первую очередь, так как они в основном и распространяют инфекцию. Бактериоскопическое исследование мокроты – быстрый, простой и недорогой метод, поэтому он должен быть использован у больных с подозрением на туберкулез. Кроме того, бактериоскопию мокроты используют для определения эффективности терапии, а также для общей оценки эффективности противотуберкулезных программ. Результаты культурального исследования позволяют поставить окончательный диагноз туберкулеза. При использовании соответствующих методов деконтаминации мокроты и оптимальных питательных сред можно выявить микобактерии туберкулеза даже у больных, в мокроте которых содержится всего десять жизнеспособных клеток возбудителя. Однако традиционные приемы бактериологического исследования (посев биологического материала на селективные и дифференциальные питательные среды, а также пересевы для выделения чистых культур возбудителя) непригодны для диагностики туберкулеза. Это объясняется тем, что у других бактерий репликация занимает всего несколько минут, а M. tuberculosis размножаются чрезвычайно медленно (время репродукции составляет 18–24 часа). Более того, у возбудителей туберкулеза потребности в питательных веществах таковы, что они не могут расти в первичных культурах на простых питательных средах с определенным химическим составом. Единственная среда, которая обеспечивает интенсивный рост M. tuberculo- 9 ВВЕДЕНИЕ sis, – это обогащенная яйцом среда с глицерином и аспарагином и агар или жидкая питательная среда с сывороткой крови или бычьим альбумином. Результаты культурального исследования позволяют увеличить число выявленных больных туберкулезом на 30–50%, а также ставить диагноз на более ранних стадиях заболевания, когда пациент еще не представляет опасности для окружающих как источник инфекции. С помощью культурального исследования можно выявлять даже незначительное количество микобактерий туберкулеза, это позволяет гораздо лучше распознавать случаи неудач после курса специфической терапии. Кроме того, выделенные культуры возбудителей можно использовать для определения чувствительности к противотуберкулезным препаратам. Однако стоимость культурального исследования значительно выше, чем бактериоскопии, и для его проведения необходимо иметь специальные питательные среды и высококвалифицированных лабораторных работников. Учитывая вышесказанное культуральное исследование следует использовать лишь в определенных случаях, которые в порядке приоритетности можно расположить следующим образом. Селективное использование культурального исследования 1. Эпиднадзор за лекарственной устойчивостью микобактерий туберкулеза для оценки эффективности программы борьбы с туберкулезом. 2. Диагностика заболевания у больных с клиническими и рентгенологическими признаками, подозрительными на туберкулез, но повторно отрицательными результатами бактериоскопического исследования. 3. Диагностика внелегочного туберкулеза и туберкулеза у детей. 4. Наблюдение за больными туберкулезом с неудовлетворительными результатами стандартного курса химиотерапии, у которых возбудителями заболевания могут быть резистентные штаммы микобактерий туберкулеза. 5. Обследование представителей групп повышенного риска, имеющих подозрительные симптомы – например, лабораторных работников или медицинских работников, осуществляющих уход за больными туберкулезом с лекарственной устойчивостью. 10 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ 2 ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТЫ ЛАБОРАТОРИИ И ОБОРУДОВАНИЕ 2.1 План бактериологической лаборатории У сотрудников, работающих с микобактериями туберкулеза, существует риск лабораторного заражения, преимущественно аэрогенным путем; в то же время хорошо известно, что правильная организация работы лабораторий способствует предупреждению таких случаев. Организация работы лаборатории, в значительной мере зависит от площади и взаиморасположения помещений, специфики лабораторной работы, а также от того, проводятся ли другие исследования в этом же помещении. Тем не менее самым важным в работе лаборатории является правильная организация «движения» проб по направлению от чистой части помещения к более грязной части. Выделение культур микобактерий всегда следует проводить в специальных помещениях, изолированных от остальных комнат лаборатории. Это снижает риск инфицирования не только тех сотрудников, кто занимается диагностикой туберкулеза, но и других лиц, находящихся в том же здании. Специализированные лаборатории обычно не нуждаются в сложном и дорогом оборудовании. Дорогостоящая система кондиционирования воздуха не является непременным атрибутом лаборатории, осуществляющей диагностику туберкулеза. Напротив, в течение всего рабочего дня необходимо обеспечить постоянный отток воздуха из помещений лабораторий наружу – или путем использования настольных ламинарных шкафов, или с помощью обычных вентиляторов, расположенных в стенах или окнах. Объемы вентилируемого воздуха и градиент внутреннего и внешнего давления воздуха должны соответствовать как количеству проб биологического материала, исследуемых в течение года, так и частоте содержания в них возбудителей туберкулеза. Если при проведении бактериологических исследований строго соблюдаются правила техники безопасности, а потенциально опасные процедуры выполняются в настольных ламинарных шкафах, вероятность аэрогенного заражения сводится к минимуму. При замене в течение часа объема воздуха, равного 6–12 объемам рабочего помещения, до 99% находящихся в воздухе частиц будут удалены из помещения в течение 30–45 минут. Устройства, обеспечивающие поступление и удаление воздуха, должны располагаться на противоположных стенах помещения; при этом свежий воздух должен поступать в более чистую часть помещения, а удаляться – из более загрязненной части лаборатории. Для достижения необходимого градиента давления достаточно обеспечить приток 50 кубических футов воздуха в минуту (примерно 24 литра в секунду); в равной мере необходимый градиент может быть создан путем вытяжки из помещения воздуха с той же скоростью. Воздух из лабораторных помещений должен удаляться прямо в атмосферу. Выход потенциально загрязненного воздуха из вентиляционной трубы должен осуществляться на высоте не менее 3 метров от поверхности земли. На рис. 1 показан схематический план лаборатории, осуществляющей диагностику туберкулеза, с движением воздуха в одном направлении – из более чистой рабочей зоны в более грязную. 11 Вытяжной вентилятор Окно Вытяжной вентилятор (постоянно закрыто) 12 Biological Ламинарный safetyшкаф cabine Шкаф Рабочий стол с полками Окно (постоянно закрыто) Направление движения проб Раковина Раковина Шкаф Шкаф с полками Шкаф Мойка Мойка Мойка Окно (постоянно закрыто) Окно для приема образцов Место для приготовления питательных сред Рабочий стол Раковина с решеткой Моечная Рабочий стол Рабочий стол Песок Автоклав Свертыватель Шкаф Место для учета с полками результатов Рабочий стол Холодильник Окно (постоянно закрыто) Ванна Основная рабочая зона Зона регистрации материала Место для микроскопии мазков Рабочий стол Окно (постоянно закрыто) Вытяжной вентилятор Центрифуга Холодильник Термостат на 35–37°С Раковина Полки Окно (постоянно закрыто) ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТЫ ЛАБОРАТОРИИ И ОБОРУДОВАНИЕ Рисунок 1. План бактериологической лаборатории для культуральной диагностики туберкулеза Вытяжной вентилятор ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ 2.2 Расположение оборудования и материалов Вход в лабораторию осуществляется через административную часть, где располагается все, что необходимо для повседневной работы лаборатории. Здесь хранятся лабораторные журналы, бланки, химические вещества и все реактивы. Пробы на исследование поступают в лабораторию через специальное окно и сразу же попадают на стол для приема проб. Здесь сотрудник лаборатории проверяет, не было ли утечки материала в процессе транспортировки, и производит дезинфекцию наружных поверхностей контейнеров. Здесь же проводится сверка бланков направлений на лабораторное исследование и поступивших проб, а необходимые сведения фиксируются в лабораторном журнале. Затем каждая проба передается в основную рабочую зону для дальнейшей обработки. В основной рабочей зоне имеется все необходимое для приготовления препаратов, деконтаминации и предварительной обработки проб, а также для посева на питательные среды и инкубации посевов. Здесь имеются рабочие столы, рН-метр, большой бытовой холодильник, раковина для мытья рук со специальными (хирургическими) кранами, которые можно открывать локтями, и термостаты. Зона для выделения культур располагается в самом дальнем конце рабочего помещения и оборудована настольным ламинарным шкафом и центрифугой. Комната учета результатов предназначена для бактериоскопического исследования препаратов, приготовленных в основной рабочей зоне, и для учета результатов культуральных исследований. Здесь находятся рабочие столы, микроскоп и раковина с хирургическими кранами. Здесь же должны заполняться бланки с результатами лабораторных исследований и передаваться в административную часть лаборатории для внесения данных в лабораторный журнал и последующей отправки в соответствующие медицинские учреждения. Моечная предназначена для уничтожения культур и для последующей мойки и стерилизации стеклянной посуды. В этой части лаборатории находятся рабочие столы, большая двойная раковина из нержавеющей стали и автоклав. Во многих странах изготовление питательных сред осуществляется централизованно. Однако, если питательные среды готовятся непосредственно в лаборатории, рекомендуется для этих целей выделить специальную зону изготовления питательных сред. Здесь находятся рабочие столы, водяная баня, домашний холодильник и раковина с хирургическими кранами. До того как приступить к обработке проб и выделению культур возбудителей, необходимо организовать работу в лаборатории так, чтобы все процедуры выполнялись в логической последовательности и не представляли опасности для персонала. Все манипуляции должны быть стандартизованы, а материалы должны находиться на своих постоянных местах, чтобы обеспечить максимальную безопасность работы, как это показано на рис. 2. Для лаборанта-левши может быть удобнее расположить оборудование и реактивы в противоположном (зеркальном) порядке. 13 ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТЫ ЛАБОРАТОРИИ И ОБОРУДОВАНИЕ Рис. 2. Оптимальное расположение оборудования и материалов в ламинарном шкафу боксе для обеспечения безопасности и удобства работы Дезинфицирующий раствор Стерильные петли 2.3 Метиловый спирт Уход за основным оборудованием и его хранение В приложении 1 приведен перечень основного оборудования и материалов для лаборатории, осуществляющей выделение микобактерий туберкулеза на питательной среде Левенштейна-Йенсена и использующей для деконтаминации проб 4% раствор гидроокиси натрия. Перед тем как приобретать новое оборудование и материалы, целесообразно посоветоваться со специалистом, имеющим личный опыт работы в такой лаборатории. Не полагайтесь целиком на рекламные объявления, каталоги, преувеличенные утверждения торговых представителей и мнение работников отделов снабжения. 2.3.1 Ламинарный шкаф (защитный бокс с ламинарным потоком воздуха) •Выбор оптимальной модели Самой важной частью оборудования лаборатории, осуществляющей культуральную диагностику туберкулеза, является хорошо функционирующий, надежный и удобный ламинарный шкаф. При правильном использовании и применении соответствующих методов ламинарные шкафы обеспечивают создание безопасных условий работы персонала, а также защиту окружающей среды и исследуемых проб от загрязнения. В таких шкафах используются высокоэффективные фильтры при вытяжной и/или приточной вентиляции. Эти фильтры обеспечивают очистку воздуха от частиц, имеющих в диаметре не менее 0,3 мкм (все бактерии, споры и вирусы имеют больший диаметр), причем эффективность очистки достигает 99,97%. Степень патогенности микроорганизмов делится на 4 уровня – от 1-го до 4-го. Возбудители туберкулеза Mycobacterium tuberculosis относятся к 3-й группе биологической опасности. В эту группу входят микроорганизмы, которые распространяются аэрогенным путем. Основные меры профилактики поэтому состоят в предупреждении образования и рассеивания аэрозолей и частиц, содержащих патогенные микроорганизмы, а также в защите лабораторных работников от вдыхания частиц, которые все-таки могут образоваться в процессе работы. Кроме того, правила техники безопасности предусматривают предупреждение случайного попадания материала в рот, на кожу или слизистые оболочки. По степени защиты все ламинарные шкафы делятся на три группы; для проведения исследований на туберкулез пригодны боксы 1-го и 2-го уровней защиты. Ламинарные шкафы 1-го класса обеспечивают защиту персонала и окружающей среды, но не исключают возможности контаминации исследуемого материала (рис. 3). 14 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ Рис. 3. Настольный ламинарный шкаф 1-го уровня защиты Крышка вытяжной вентиляции Высокоэффективный вытяжной фильтр Контрольная панель Рабочая поверхность Передняя решетка Подвижный щиток Нефильтрованный воздух из помещения поступает в рабочую зону ламинарного шкафа. Защита персонала обеспечивается таким направлением движения воздуха в том случае, если его скорость составляет 75 линейных футов в минуту (около 30 см в секунду). Любые бактерии, находящиеся в воздухе, попадут на высокоэффективный воздушный фильтр и будут здесь задержаны. Ламинарные шкафы 1-го класса обычно подсоединяют к общей системе вентиляции, функционирующей в здании, и вытяжной вентилятор общей системы обеспечивает отрицательное давление, достаточное для втягивания воздуха из помещения лаборатории в ламинарный шкаф. Современные ламинарные шкафы оборудованы индикаторами скорости воздушного потока и сигналом опасности. Если скорость потока воздуха становится ниже определенной критической величины, необходимо произвести замену фильтра. Ламинарные шкафы 2-го класса не только обеспечивают защиту персонала и окружающей среды, но также исключают контаминацию исследуемого материала. Воздух проходит мимо оператора и поступает в ламинарный шкаф , что обеспечивает защиту лабораторных работников. Кроме того, направленный вниз ламинарный поток предварительно профильтрованного воздуха обеспечивает защиту образца от контаминации, так как сводит к минимуму вероятность перекрестного загрязнения в рабочей зоне ламинарного шкафа (рис. 4). Так как воздух, удаляемый из ламинарного шкафа, проходит через вытяжной фильтр, он не содержит бактерий и может вновь поступать в лабораторию (ламинарные шкафы типа А) или выводится за пределы здания (ламинарные шкафы типа В). 15 ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТЫ ЛАБОРАТОРИИ И ОБОРУДОВАНИЕ Рис. 4. Настольный ламинарный шкаф 2-го уровня защиты Крышка вытяжной вентиляции Высокоэффективный вытяжной фильтр Предварительный фильтр Основной высокоэффективный фильтр Контрольная панель Рабочая поверхность Передняя решетка Подвижный щиток Если в лаборатории, осуществляющей исследования на туберкулез, используется ламинарный шкаф 2-го класса безопасности, вместо обычного вытяжного вентилятора следует использовать устройство типа водоструйного насоса (рис. 5). Такое устройство позволяет осуществлять удаление воздуха не только из самого шкафа, но и из рабочего помещения в течение всего времени работы шкафа. Рис. 5. Система удаления воздуха, рекомендуемая для ламинарных шкафов 2-го класса безопасности (адаптировано из Collins CH, Lyne PM. Microbiological Methods. 5th ed. Butterworths, London, 1984) К вытяжному вентилятору Воздух из помещений лаборатории Воздух из ламинарного шкафа 16 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ •Размещение ламинарного шкафа Идеальным местом для размещения ламинарного шкафа является часть комнаты, отдаленная от входной двери (например, задняя часть лаборатории, куда реже всего заходят сотрудники), так как люди, проходящие мимо ламинарного шкафа, могут нарушать воздушный занавес. Этот занавес очень непрочен, так как оптимальная скорость входящего и выходящего потока воздуха составляет около 1 мили в час (примерно 1,6 км/ч). Вблизи ламинарного шкафа не должно быть открытых окон или оборудования, которое во время работы может создать потоки воздуха (например, центрифуги). 2.3.2 Центрифуга Центрифуга является важной частью оборудования, которое используется в лабораториях, проводящих культуральное исследование на туберкулез. Применение центрифуги повышает эффективность исследования по сравнению с методом прямого посева мокроты на питательные среды. В лаборатории, осуществляющей выделение культур микобактерий туберкулеза, целесообразно использовать напольную центрифугу с крышкой и фиксированными в роторе закрывающимися гнездами для центрифужных пробирок. Благодаря значительно большей массе ротора по отношению к массе центрифужных пробирок можно осуществлять центрифугирование пробирок без их тщательного предварительного уравновешивания; при этом не возникает опасности сильной вибрации или повреждения пробирок. Для повышения безопасности рекомендуется гнезда ротора закрывать крышками. Обычно такие крышки изготовлены из нержавеющей стали и снабжены резиновыми прокладками, причем на каждой крышке указан ее вес. Такие закрывающиеся центрифужные стаканы обычно используют попарно, располагая друг напротив друга; при этом удобно заранее пометить каждую пару краской одного цвета, чтобы удобнее было их использовать. Если в центрифуге используется крестовина, надо заранее подобрать пары стаканов. Желательно, чтобы центрифуга была оборудована специальным замком, который предупреждает случайное открывание крышки, пока вращается ротор. Во многих книгах и руководствах описаны методы обработки мокроты при исследовании на туберкулез с указанием скорости вращения ротора, а именно – количества оборотов в минуту (об/мин). Однако эта величина показывает только скорость вращения ротора данной центрифуги, но не характеризует интенсивность осаждения (седиментации), или «относительную силу центрифугирования» (ОСЦ). Величина искусственной силы тяжести, создаваемой вращающимся ротором, зависит от скорости вращения ротора (об/мин) и от расстояния от оси вращения до точки, в которой производится измерение этой силы. Относительную силу тяжести можно увеличить или путем увеличения скорости вращения ротора, или посредством увеличения расстояния от оси ротора до центрифугируемой жидкости. Для характеристики ОСЦ используют величину g – например, 3000 g. Для расчета ОСЦ можно использовать следующую формулу: 2 ОСЦ = 1,12Rmax (об/мин : 1000) , где Rmax – радиус, т. е. расстояние от центра вращающегося ротора до дна центрифужной пробирки. 17 ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТЫ ЛАБОРАТОРИИ И ОБОРУДОВАНИЕ Скорость вращения ротора, необходимую для получения требующейся ОСЦ, можно определить по следующей формуле: ОСЦ 1.12 Rmax об/мин = 1000 Если величина ОСЦ будет недостаточной, многие микобактерии после центрифугирования останутся в суспензии и будут удалены вместе с надосадочной жидкостью. Для получения оптимального результата при выделении культуры микобактерий необходимо добиться осаждения 95% бактериальных клеток. Для этого требуется использовать ОСЦ, равную 3000 g. Многие старые центрифуги, до сих пор используемые в бактериологических лабораториях, имеют не более 2300–3000 об/мин, т. е. позволяют получить ОСЦ, равную всего лишь 1500–2000 g. Большинство лаборантов, применяющих такие центрифуги, обрабатывают исследуемые пробы в течение 15 минут, что позволяет добиться осаждения не более 75–84% бактерий. В зависимости от типа ротора в нерефрижераторной центрифуге и скорости его вращения температура воздуха в центрифуге и соответственно температура исследуемого образца может повышаться на 4–18°С. При этом температура образца в угловом роторе меняется незначительно, однако температура содержимого пробирки в крестовине с отклоняющимися центрифужными стаканами может превышать 40°С, если центрифуга используется повторно 5 раз и более. В этом случае, даже если время центрифугирования образца не превышает 15 минут, количество погибающих бактерий может возрасти с 13% при комнатной температуре 20°С до 22–30% при увеличении температуры до 30–40°С. Поэтому чрезвычайно важно центрифугировать исследуемые образцы в течение фиксированного времени (15 минут) и использовать высокую ОСЦ (3000 g) для достижения 95% седиментации. Применение угловых роторов позволяет свести до минимума нагревание образца, обусловленное сопротивлением воздуха. Под воздействием центробежной силы стеклянные пробирки могут разрушиться. При этом происходит разбрызгивание жидкости и образование аэрозоля. Поэтому при обработке потенциально инфекционного материала необходимо использовать пластиковые пробирки с завинчивающимися пробками. Ротор центрифуги перед началом работы должен быть хорошо уравновешен. Если этого не сделать, может возникнуть сильная вибрация, которая приведет к разрушению ротора. Если проводится исследование одной пробы, то с противоположной стороны ротора должна быть помещена аналогичная пробирка, имеющая такую же массу. Проще всего это сделать, если на центрифужных пробирках имеются метки, указывающие одинаковые объемы жидкости. В качестве дополнительной меры предосторожности можно использовать такой прием: в уравновешивающую пробирку наливают не воду, а 70% этиловый спирт; это снижает риск лабораторного заражения в случае повреждения пробирки. Никогда не прикасайтесь к ротору, который еще продолжает вращаться, так как это не только может послужить причиной травмы, но и привести к ресуспендированию осадка из-за резкой остановки пробирки. Некоторые центрифуги оборудованы специальным тормозом, который обеспечивает плавную остановку ротора. 2.3.3 Термостат с температурой 35–37°С Инкубацию посевов производят при температуре 35–37°С в течение 8 недель. Существуют лабораторные термостаты различных размеров. Как правило, лучше всего приобрести самую большую модель, какую можно без проблем разместить в лаборатории и на какую имеются средства. В термостатах с маленьким объемом при откры- 18 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ вании дверцы происходят резкие колебания температуры воздуха. Старайтесь обеспечить внутри термостата правильную циркуляцию воздуха, не перегружая термостат и используя не сплошные, а решетчатые полки. Поддерживайте постоянную температуру, избегая ненужного открывания термостата. Хотя термостаты редко выходят из строя, тем не менее рекомендуется при покупке этого оборудования убедиться в существовании и доступности сервисной службы. Электрооборудование термостата обычно устроено очень просто, но тем не менее для его ремонта желательно приглашать специалиста. Наибольшие сложности возникают при необходимости транспортировки термостата на завод-изготовитель. В лабораториях с большими объемами культуральных исследований целесообразно использовать термостатную комнату. Такую комнату или большой термостат, в который может входить лабораторный работник, несложно оборудовать из маленького помещения или из угловой части большой лабораторной комнаты. Окна в таком помещении необходимо закрыть наглухо, стены покрыть двумя слоями строительного картона, на которые наклеить пластины из теплоизолирующего полимерного материала (например, полипропилена). Внутреннюю поверхность можно просто оштукатурить или обшить термоизоляционной плитой. Аналогичное покрытие должно быть использовано и для потолка, а в комнате, расположенной этажом ниже, желательно сделать фальш-потолок. Пол также покрывают теплоизолирующим материалом, а для дверей используют уплотняющие прокладки. Для подогрева воздуха в термостатной комнате можно использовать два типа систем. Хорошие результаты дают нагревательные элементы с трубками, укрепленными на стенах комнаты; при этом для поддержания температуры 37°С в комнате площадью 5–7 квадратных метров достаточно мощности электронагревательного оборудования порядка 3 квт. На одной стене рекомендуется укрепить вентилятор, который должен быть постоянно включен, чтобы не формировались зоны холодного и горячего воздуха. Альтернативный вариант обогрева – использование тепличного оборудования или тепловентилятора мощностью 2,5–3 кВт. При этом следует несколько изменить электрическую схему нагревателя, чтобы вентилятор работал постоянно, а к нагревательному элементу был подключен чувствительный датчик (стандартные датчики для теплиц не подходят, так как они недостаточно чувствительны). Рекомендуется иметь два датчика: один на 37°С – для стабильного поддержания необходимой рабочей температуры, и второй (запасной) на 39°С – для предупреждения перегревания помещения и гибели культур в случае выхода из строя первого датчика. Можно использовать и комбинированный способ нагревания воздуха в термостатной комнате: постоянно включенные небольшие трубчатые нагреватели будут создавать «базовую» температуру, а тепловентилятор – обеспечивать ее точную регулировку. Нецелесообразно использовать деревянные полки и перегородки. При высокой влажности воздуха на них могут расти плесневые грибы. Более предпочтительны металлические или пластиковые полки, которые могут быть изготовлены непосредственно на месте. Полки должны быть нефиксированы, чтобы их можно было легко удалять и мыть. Между полками и стенами помещения следует оставить зазоры для обеспечения хорошей циркуляции воздуха. 2.3.4 Сухожаровой шкаф для приготовления питательных сред При приготовлении яичных сред, необходимых для выделения возбудителей туберкулеза, приходится использовать оборудование, позволяющее точно дозировать количество тепла для обеспечения коагуляции белка. Паронагреватели непригодны для этих целей, так как нагревают питательную среду слишком быстро, и температура может быть чрезмерно высокой. 19 ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТЫ ЛАБОРАТОРИИ И ОБОРУДОВАНИЕ Сухожаровой шкаф для приготовления яичных сред должен обеспечивать нагревание до температуры 80–85°С и поддержание такой температуры в течение 45 минут. Современные сухожаровые шкафы имеют автоматическую регулировку температуры и оснащены большим внутренним вентилятором. Внутренние полки, на которых размещаются пробирки в наклонном положении, должны быть изготовлены из проволоки, чтобы не препятствовать циркуляции горячего воздуха. Очень удобно иметь специальные полки из алюминиевой пластины или проволоки, в которых пробирки и флаконы удерживаются в положении с наклоном под углом 5–10°, причем эти полки должны легко скользить по направляющим планкам. Это обеспечивает быструю загрузку и разгрузку горячего сухожарового шкафа. Шкаф должен иметь плотно закрывающуюся стеклянную дверцу, которая обеспечивает поддержание внутри необходимой температуры. Рекомендуется заранее включать сухожаровой шкаф, чтобы к моменту загрузки в нем уже была достигнута необходимая температура. 2.3.5 Автоклав Микобактерии туберкулеза быстрее погибают в условиях высокой температуры и влажности (насыщенный пар), чем при использовании сухого жара. Пар убивает микобактерии туберкулеза, денатурируя их белки. Существенное влияние на эффективность стерилизации паром оказывает воздух, так как его присутствие изменяет соотношение между давлением и температурой. Например, температура насыщенного пара при давлении 15 фунтов на квадратный дюйм (100 кПа) составляет 121°С, но только в том случае, если предварительно воздух был удален из автоклава. Если же будет удалена только половина воздуха, температура паровоздушной смеси составит всего лишь 112°С. Кроме того, наличие воздуха между помещенными в автоклав предметами будет препятствовать проникновению пара в эти пространства. Весь воздух, находящийся в автоклаве, до начала процесса стерилизации паром должен быть удален. Поэтому подлежащий стерилизации материал не следует слишком плотно упаковывать. Контаминированный материал (например, отработанные чашки Петри) должен быть помещен в контейнер с плотным дном глубиной не более 20 см. Между контейнерами следует оставить как можно больше свободного места и ни в коем случае нельзя закрывать контейнеры крышками. Следует использовать только специальные лабораторные автоклавы, в которые можно помещать различную использованную посуду. Стерилизаторы для бутылок с жидкостью не годятся для лабораторных целей. Удобны для работы автоклавы двух типов: • простые модели типа скороварки; • более совершенные модели с автоматическим удалением воздуха и конденсата. •Автоклавы типа скороварки Чаще всего применяют автоклав, в котором осуществляется кипячение воды под давлением. В этом автоклаве имеется вертикальная металлическая камера, которая закрывается прочной металлической крышкой, имеющей плотную резиновую прокладку. На крышке располагаются кран для выпуска воздуха и пара, манометр и предохранительный клапан. Вода на дне сосуда нагревается за счет внешнего источника обогрева (газовые горелки), иммерсионного электронагревателя или парового змеевика. 20 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ Рис. 6. Лабораторный автоклав типа скороварки (адаптировано из Collins CH, Lyne PM. Microbiological Methods. 5th ed. Butterworths, London, 1984) Манометр Предохранительный клапан Выпускной клапан для воздуха и пара Lid Камера Решетка Вода Нагреватель •Автоклавы с замещением воздуха паром Эти автоклавы обычно имеют горизонтальное расположение и прямоугольную форму, благодаря чему упрощается процесс загрузки и выгрузки. Кроме того, может использоваться система тележек. На рис. 7 показано схематическое устройство автоклава такого типа с «рубашкой». Могут быть сделаны аналогичные автоклавы и без «рубашки». Крышка автоклава должна быть оборудована предохранительным устройством, не допускающим ее открывания при наличии в камере избыточного давления. Рис. 7. Автоклав с замещением воздуха паром (адаптировано из Collins CH, Lyne PM. Microbiological Methods. 5th ed. Butterworths, London, 1984) Манометр «Рубашка» Предохранительный клапан Предохранительный клапан Комбинированный манометр для избыточного давления и вакуума Ватный фильтр Valve Клапан К «рубашке» Основной источник пара Клапан К камере Крышка (передняя дверца) Клапан К вакуумному насосу или эжектору пара Улавливатели конденсата Сетчатые фильтры Термометр Клапан Выпускной клапан 21 ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТЫ ЛАБОРАТОРИИ И ОБОРУДОВАНИЕ «Рубашка» вокруг автоклава представляет собой наружный чехол, между ним и наружной стенкой автоклава имеется узкое пространство, заполняемое паром под повышенным давлением, что поддерживает высокую температуру наружной стенки камеры. Пар попадает в «рубашку» по основному паропроводу через специальный клапан, понижающий давление пара до рабочего уровня. Величину этого давления измеряет отдельный манометр, установленный на «рубашке». В камеру автоклава пар попадает по тому же паропроводу, который обеспечивает обогрев «рубашки». Входное отверстие располагается в верхней части камеры, в результате чего пар заполняет камеру сверху вниз, постепенно вытесняя воздух и конденсат, которые удаляются из нижней части камеры. Выпускные трубки снабжены сетчатыми фильтрами для предупреждения засорения выпускного клапана. Выпускной патрубок обычно оборудован термометром для измерения температуры выходящего пара. Нередко температура, фиксируемая этим термометром, ниже, чем температура пара в камере автоклава. В выпускную систему вмонтированы также дополнительные «ловушки для пара». Автоматические «ловушки для пара» устанавливают, чтобы обеспечить сохранение в камере только насыщенного пара и удаление воздуха и конденсата, которые имеют более низкую температуру, чем насыщенный пар. Это устройство называется «ловушкой для пара», оно открывается, когда температура снижается более чем на 2°С по сравнению с температурой насыщенного пара, и закрывается, когда температура выходящего воздуха повышается до этой пороговой величины. В основе этого устройства используется принцип расширения и сжатия металлических пластин, которые открывают и закрывают ловушку. Вытекающий конденсат не соприкасается с жидкостью в поддоне, что исключает ее попадание в камеру автоклава. 2.3.6 Водяная баня Содержимое пробирки, помещенной в водяную баню, нагревается до необходимой температуры значительно быстрее, чем в термостате. Поэтому водяная баня может быть полезной в случаях, когда требуется кратковременная инкубация при повышенной температуре – например, при постановке некоторых биохимических тестов. Современные водяные бани оборудованы приспособлениями для автоматического перемешивания жидкости, а в некоторых банях термометр и мешалка объединены в один блок, который легко снимается для обслуживания. Водяная баня должна быть расположена таким образом, чтобы предотвратить чрезмерные потери тепла через стенки. Самодельные водяные бани могут быть теплоизолированы при помощи полистироловых пластин. Водяная баня должна быть снабжена крышкой, чтобы предупредить потерю тепла и излишнее испарение воды. Крышка должна располагаться наклонно, чтобы капли конденсата не попадали на содержимое бани. Для предупреждения образования накипи на нагревательных элементах и стенках для водяной бани следует использовать только дистиллированную воду. 2.3.7 Бунзеновские горелки Для уничтожения материала, который разбрызгивается при горении или является очень контагиозным, рекомендуется использовать закрытые бунзеновские горелки. Можно применять и электросжигатели. Это – трубчатые сжигатели, в которые помещается бактериологическая петля. Электросжигателями удобно пользоваться в настольном ламинарном шкафу. 22 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ 2.3.8 Лабораторная посуда и инструменты При проведении культуральных исследований на туберкулез можно пользоваться посудой из обычного или термостойкого стекла. Применение значительно более дорогого особо прочного стекла совершенно не оправданно. Новую стеклянную посуду необходимо замочить на ночь в растворе соляной кислоты, чтобы частично нейтрализовать щелочи, содержащиеся в стекле. •Флаконы для культур В бактериологической лаборатории могут понадобиться различных размеров флаконы для культур. Наиболее ходовыми являются маленькие (емкостью 14 мл) и стандартные (емкостью 28 мл) флаконы МакКартни, а также универсальные контейнеры емкостью 28 мл с более широким горлышком, которые также используются для сбора проб мокроты. Эти флаконы обычно имеют завинчивающиеся алюминиевые колпачки с резиновыми прокладками. Прокладки должны быть изготовлены из черной резины, так как красная резина может выделять вещества, обладающие бактерицидной активностью. •Пробирки Наиболее удобными для проведения культуральных исследований на туберкулез являются гладкие пробирки из толстого стекла. Не следует использовать тонкостенные химические пробирки. Наиболее широко используются пробирки размеров 152х16 мм (вместимость 5–10 мл) и 152х19 мм (вместимость 10–15 мл). В течение многих лет для закрывания пробирок использовали ватные или ватномарлевые пробки, однако в последнее время все чаще применяют металлические колпачки. Рекомендуется применять алюминиевые колпачки – они прочнее, подходят к большинству пробирок и лучше удерживаются на месте с помощью маленькой пружинки. Эти колпачки бывают разного цвета; они недороги, пригодны для работы в течение многих лет и существенно сокращают потери времени и трудозатраты. Временные крышки для пробирок, контейнеров и колб могут быть изготовлены из пищевой алюминиевой фольги. •Пастеровские пипетки В неумелых руках пастеровские пипетки являются, по всей вероятности, самым опасным предметом в лаборатории. Меньшую опасность представляют пастеровские пипетки, изготовленные из полипропилена, которые выпускают в стерильной упаковке. Пастеровские пипетки предназначены для одноразового использования. •Градуированные пипетки Нередко используют простые градуированные пипетки емкостью от 1 до 10 мл. Каждая такая пипетка должна быть закрыта маленькой пробкой из негигроскопичной ваты, чтобы предупредить выход контаминированного материала из пипетки. Эти пробки должны быть достаточно плотными, чтобы не выпадать во время пипетирования, и в то же время легко удаляться, если необходимо вымыть пипетку. Чтобы сделать такую пробку, в широкий конец пипетки с помощью проволоки проталкивают негигроскопичную вату так, чтобы образовался «столбик» высотой 25 мм. Затем этим концом проводят над бунзеновской горелкой, чтобы сжечь оставшиеся снаружи волокна ваты. (Если этого не сделать, они могут попасть между стеклом и резиновой грушей, что приведет к просачиванию воздуха и вытеканию материала из пипетки.) 23 ОРГАНИЗАЦИЯ РАБОТЫ ЛАБОРАТОРИИ И ОБОРУДОВАНИЕ •Резиновые груши Вместо очень опасной практики засасывания жидкости в пипетку ртом следует использовать резиновые груши. На пипетку необходимо надевать резиновые груши большего объема, чем емкость пипетки, – например, с пастеровскими пипетками используют резиновые груши емкостью 1 мл, с пипетками емкостью 1 мл – резиновые груши на 2 мл и т.д. (в противном случае придется часто полностью сжимать грушу, что очень утомительно). Многие неопытные лабораторные работники полностью сжимают грушу, затем набирают жидкость до нужной отметки и во время переноса содержимого в другой сосуд пытаются удержать жидкость на нужном уровне. Это – неправильный прием, приводящий к разбрызгиванию материала и неточности в работе. При правильной технике работы следует сдавить грушу настолько, чтобы набрать жидкость немного больше требуемого уровня, затем извлечь конец пипетки из жидкости и слегка сжать грушу, чтобы в пипетке остался нужный объем, и после этого расслабить пальцы. При этом в пипетке останется нужный объем жидкости, который можно перенести в другой сосуд, не утомляя пальцы и не рискуя потерять часть содержимого. Для удаления жидкости из пипетки следует аккуратно сжать резиновую грушу, а затем так же аккуратно освободить ее. При резком сжатии резиновой груши часть жидкости останется в пипетке; кроме того, при обратном токе воздуха появляются пузыри и может образоваться аэрозоль биологически опасного материала. •Бактериологические петли Бактериологические петли обычно изготавливают из нихромовой проволоки. Они должны быть короткими (не длиннее 15 см), чтобы уменьшить дрожание и предупредить разбрызгивание материала. Сама петля не должна быть очень большой (не более 5 мм в диаметре) – пленка в петле большего диаметра может спонтанно лопнуть, при этом произойдет разбрызгивание инфицированного материала. Кольцо петли должно быть полностью замкнутым. Чтобы добиться этого, можно закрутить конец проволоки вокруг гвоздя; другой вариант – взять проволоку длиной 15 см и посередине обернуть ее вокруг гвоздя. Для крепления бактериологической петли не следует использовать стеклянные палочки. Поставщики лабораторного оборудования предлагают для этих целей удобные алюминиевые петледержатели. Очень удобны в работе одноразовые бактериологические петли, однако стоимость их выше. •Штативы и корзинки Предпочтительнее пользоваться штативами для пробирок и флаконов, изготовленными из полипропилена или нейлона – их можно автоклавировать. Кроме того, это способствует уменьшению боя стеклянной посуды, что нередко происходит при использовании металлических штативов. Деревянные штативы негигиеничны. Традиционные проволочные корзинки небезопасны при работе с пробирками. В них пробирки нередко бьются; при этом материал вытекает из таких корзинок. При работе с культурами значительно безопаснее использовать пластиковые коробки различных размеров, выдерживающие автоклавирование. 24 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ 3 СБОР ПРОБ Наличие кислотоустойчивых микобактерий в клиническом материале можно подтвердить с помощью бактериоскопического исследования или путем выделения культуры. Однако в связи с тем, что при бактериоскопии мокроты провести видовую идентификацию возбудителя не представляется возможным, точный диагноз туберкулеза можно поставить только в том случае, когда из клинического образца выделена культура M. tuberculosis. В лабораториях, занимающихся диагностикой туберкулеза, основное внимание обычно сосредоточено на проблемах бактериоскопии, выделения культур и их идентификации, тогда как вопросам правильного сбора проб и их транспортировки должного внимания не уделяется. Преимущества аккуратной деконтаминации проб, применения высокочувствительных питательных сред и простых схем идентификации выделенных штаммов не будут реализованы до тех пор, пока не будет обеспечено правильное взятие проб и их быстрая и правильная транспортировка в лабораторию. 3.1 Флаконы (контейнеры) для сбора проб Существенным компонентом сбора удовлетворительных проб является использование удобных непротекаемых чистых флаконов (контейнеров) для мокроты. Эти флаконы должны быть достаточно прочными, чтобы предупредить возможность их повреждения при транспортировке, и иметь широкую завинчивающуюся крышку, чтобы избежать вытекания материала и его загрязнения. Чтобы облегчить выбор оптимальных флаконов (контейнеров), необходимо помнить о следующих основных требованиях к ним: горлышко (диаметром не менее 35 мм), чтобы больному было удобно со•широкое бирать мокроту, при этом не загрязняя наружной поверхности флакона; •емкость – 50 мл; должен быть из прозрачного материала, чтобы было можно определить •флакон объем пробы и ее качество, не открывая крышку; использовать одноразовые флаконы, изготовленные из легкосжигае•желательно мого материала; должна быть завинчивающейся, чтобы предотвратить вытекание потен•крышка циально опасного материала в процессе транспортировки; поверхность не должна быть чрезмерно гладкой и скользкой, чтобы •наружная можно было легко маркировать флаконы. В качестве контейнеров для проб мокроты можно использовать универсальные флаконы с широким горлом емкостью 28 мл, изготовленные из прочного стекла и снабженные завинчивающимися крышками. Эти флаконы можно использовать повторно после того, как они будут вымыты и простерилизованы в кипящей воде (продолжительность кипячения – не менее 30 минут). 25 СБОР ПРОБ 3.2 Методика сбора проб 3.2.1 Пробы мокроты Хотя M. tuberculosis могут вызывать поражение практически любого органа и любой системы, более 85% больных в странах с высокой распространенностью туберкулеза страдают легочной формой заболевания. Поэтому при проведении исследований на туберкулез основным клиническим материалом является мокрота, которую следует собирать у всех больных с подозрением на это заболевание. Если у больного заподозрена внелегочная форма туберкулеза, помимо других видов биологического материала следует собрать для исследования и мокроту. Хороший клинический образец – это недавно собранная мокрота из бронхиального дерева, с минимальными примесями слюны или слизи из носоглотки. Образец может считаться удовлетворительным, если в нем присутствуют слизистые или слизисто-гнойные комочки – это имеет гораздо большее значение, чем объем собранной пробы. В идеале больной должен собрать 3–5 мл мокроты, хотя при хорошем качестве образца достаточно будет и меньшего объема. Чтобы правильно собрать материал для бактериологического исследования, необходимо предварительно тщательно проинструктировать пациента. Во время продуктивного кашля образуется аэрозоль, содержащая микобактерии туберкулеза. Желательно, чтобы пациент собирал мокроту или вне помещения, или в помещении, где нет других людей; в любом случае нельзя собирать мокроту в маленьких, плохо проветриваемых помещениях (например, в туалете). В некоторых странах пациенты для проведения лабораторного исследования могут обращаться непосредственно в лаборатории. Поэтому необходимо, чтобы лабораторный персонал знал, как следует правильно собирать мокроту. Эта методика описана в приложении 2. Лучше всего, если пациент собирает мокроту утром до завтрака и приема лекарств (частицы пищи и лекарства могут препятствовать росту микобактерий туберкулеза). Если предполагается брать пробы мокроты для культуральной диагностики, не следует до этого момента начинать химиотерапию. Благодаря высокой чувствительности культурального исследования может быть вполне достаточно одного образца, если он удовлетворительного качества. У некоторых больных выделение микобактерий происходит нерегулярно и в небольших количествах; в таких случаях вероятность получения положительного результата культурального исследования будет выше, если будет взято несколько проб мокроты. Материал для исследования должен быть доставлен в лабораторию сразу же после его сбора. Если транспортировка откладывается, то собранный материал следует обязательно хранить в холодильнике, чтобы предупредить рост нежелательных микроорганизмов («контаминантов»). 3.2.2 Другие пробы Если у больного продуктивный кашель, то необходимость сбора мокроты вполне очевидна. Однако, если больной не может собрать мокроту, для получения других биологических материалов из легких можно использовать несколько специальных приемов. Описание методов получения клинических образцов не входит в задачу данной книги. Тем не менее следует напомнить, что индуцированная мокрота по внешнему виду похожа на слюну, поэтому очень важно указать на этикетке такого флакона «индуцированная мокрота», чтобы лабораторный работник по ошибке просто не выбросил этот образец. 26 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ Так как микобактерии туберкулеза могут поражать практически все органы и ткани человека, для исследования в лабораторию помимо мокроты могут поступить самые разнообразные клинические материалы – например, различные биологические жидкости, ткани, гной и т. п. Эти материалы можно разделить на 2 группы: •пробы, собранные с соблюдением правил асептики; которые заведомо содержат постороннюю микрофлору или которые были •пробы, собраны без соблюдения правил асептики. Материалы, собранные с соблюдением правил асептики Биологические жидкости (плевральная, спинномозговая, синовиальная или асцитическая), а также кровь, гной и костный мозг следует брать в стерильный контейнер с соблюдением правил асептики; эту процедуру проводит врач с использованием аспирационной техники или хирургической операции. Если в собранной жидкости могут образоваться сгустки, то предварительно в контейнер следует внести стерильный раствор щавелевокислого натрия (из расчета 0,01–0,02 мл 10% нейтрального раствора оксалата на 1 мл образца биологической жидкости) или раствор гепарина (0,2 мл на 1 мл образца). Собранный материал следует доставить в лабораторию как можно быстрее. Материалы, собранные без соблюдения правил асептики Биологические материалы, собранные без соблюдения правил асептики, необходимо помещать в стерильный контейнер, не содержащий консервантов. Если пересылка собранного материала будет производиться по почте, следует добавить изотонический раствор хлорида натрия для предупреждения высыхания образца и запаковать пробу вместе с сухим льдом или поместить ее в термоконтейнер, где будет обеспечена постоянная температура 4–15°С. Собранный материал следует доставить в лабораторию как можно быстрее. Материалы, заведомо содержащие постороннюю микрофлору Если материалом, который следует использовать для диагностики туберкулеза, является моча, то ее необходимо подвергнуть специальной обработке, прежде чем производить посевы для выделения культуры микобактерий туберкулеза. Для снижения интенсивности загрязнения мочи больной должен предварительно вымыть наружные половые органы, а образец мочи сразу же после сбора следует поместить в холодильник. Рекомендуется исследовать мочу троекратно из средней порции, собранной утром. 27 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ 4 ХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВКА МАТЕРИАЛА Для успешного выделения культуры возбудителя необходимо максимально сократить интервал от момента получения биологического материала до начала его исследования. Поэтому полученные образцы следует направлять в лабораторию с минимальной задержкой. Если есть возможность хранить собранные пробы мокроты в холодильнике, то можно направлять их в лабораторию один раз в неделю. Однако другие виды биологического материала следует пересылать в лабораторию как можно быстрее. Если транспортировка будет осуществляться при температуре окружающей среды, необходимо использовать химические консерванты. Удовлетворительные результаты культурального исследования могут быть получены при использовании следующих приемов: свежесобранный образец биологического материала с равным объемом •Смешать 1% раствора цитилпиридинхлорида в 2% растворе хлористого натрия. В этих условиях микобактерии туберкулеза сохраняют жизнеспособность до 7 дней, а рост контаминирующих микроорганизмов будет ограничен. свежесобранный образец биологического материала с безводным кар•Смешать бонатом натрия – из расчета 50 мг реактива на 2 мл биологической жидкости. задержка материала до отправки его в лабораторию на культуральное иссле•Если дование составит менее 24 часов, собранный материал можно смешать с равным объемом 23% раствора трехзамещенного фосфорнокислого натрия. Однако ни один из перечисленных методов консервации не является оптимальным, поэтому для получения хороших результатов следует направить собранные пробы в бактериологическую лабораторию как можно быстрее. Требования и рекомендации по безопасной транспортировке биологического материала изложены в различных национальных и международных практических руководствах и инструкциях. Кроме того, в большинстве стран у почтовых работников и транспортников, включая Ассоциацию авиаперевозок, имеются специальные инструкции по перевозке таких материалов. Единым требованием является то, что биологический материал должен быть надежно упакован для предупреждения его вытекания из контейнера при ударах, повышении давления и в других ситуациях. Прежде всего, биологический материал, пересылаемый по почте или авиатранспортом, помещают в стандартный прочный герметично закрытый контейнер, который затем упаковывается во второй контейнер, сделанный из металла, дерева или прочного картона и содержащий достаточное количество абсорбирующего материала (чтобы при повреждении внутреннего контейнера вытекающая жидкость полностью абсорбировалась этим материалом). Для пересылки биологического материала в другие страны эта коробка должна быть соответствующим образом упакована в наружный контейнер, а пересылка должна быть надлежащим образом оформлена в почтовом и транспортном управлении. В бактериологические лаборатории, проводящие исследования на туберкулез, чаще всего направляют пробы мокроты, для пересылки которых необходимо иметь специальные транспортные ящики, изготовленные из дерева или металла. В них должно помещаться от 20 до 30 флаконов с мокротой, которые устанавливают вертикально, чтобы предупредить вытекание биологического материала. Такие ящики должны 29 ХРАНЕНИЕ И ТРАНСПОРТИРОВКА МАТЕРИАЛА плотно закрываться крышкой, желательно – на замок. При транспортировке ящики должны храниться в наиболее холодном месте и быть защищены от солнечных лучей. Бланки направлений на лабораторное исследование должны находиться отдельно от флаконов с материалом. Для каждого транспортного контейнера должен быть подготовлен сопроводительный документ, в котором приводят сведения о пациентах и материале, взятом от них. Перед отправкой материала из лечебного учреждения должно быть проверено следующее: флаконов в ящике и указанных в сопроводительном документе совпа•количество дает; номер каждого флакона соответствует номеру в сопроводи•идентификационный тельном документе; документ содержит всю необходимую информацию о каждом •сопроводительный пациенте; сопроводительном документе указана дата отправки и приведены данные о ме•вдицинском учреждении. Пример бланка направления на лабораторное исследование представлен в приложении 3. 30 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ 5 ПРАВИЛА РАБОТЫ С ПРОБАМИ 5.1 Прием поступающих проб Пробы, поступающие на исследование в лабораторию, должны быть приняты в административной части помещения; для этого желательно иметь отдельный стол. Транспортные контейнеры следует открывать в настольном боксе, выполняя следующие рекомендации: поступающих проб и их осмотр следует, по возможности, проводить в од•Прием норазовых перчатках. нет ли на поверхности контейнера следов протечки материала. Если •Проверьте, имеются признаки сильной протечки, уничтожьте этот контейнер (автоклавирование или сжигание). наружную поверхность транспортного контейнера, проте•Продезинфицируйте рев ее тампоном, смоченным дезинфицирующим раствором (например, 5% раствором фенола). откройте крышку и проверьте целостность флаконов с материалом. Ни •Аккуратно в коем случае не используйте поврежденные флаконы (разбитые или с трещинами) – уничтожьте их или автоклавируйте и запросите новые пробы. наличие идентификационных номеров на этикетках и сверьте их с но•Проверьте мерами в сопроводительных документах. внутреннюю поверхность транспортного контейнера, а по•Продезинфицируйте сле работы с флаконами выбросьте одноразовые перчатки и вымойте руки (см. часть I, стр. 30). 5.2 Техника безопасности при работе с материалом 5.2.1 Работа в настольном ламинарном шкафу В связи с высоким риском образования аэрозоля во время выделения культур микобактерий туберкулеза, все манипуляции следует выполнять в ламинарном шкафу. Настольный ламинарный шкаф предназначен для защиты лабораторного работника от аэрогенной инфекции. Однако ламинарный шкаф не может защитить сотрудника лаборатории от разбрызгивания им контаминированного материала и отрицательных последствий плохого качества работы. шкафы предназначены для работы 24 часа в сутки, поэтому для под•Ламинарные держания нормального воздухообмена в помещениях лаборатории их нельзя выключать никогда. Если имел место перерыв в электроснабжении лаборатории или если пришлось выключить ламинарный шкаф на какое-то время (например, для замены фильтра), следует вновь включить ламинарный шкаф и подождать не менее пяти минут, прежде чем приступить к работе в нем. Рабочие поверхности, внутренние стенки и внутреннюю поверхность окна шкафа нужно обрабатывать соответствующими дезиницирующими растворами (например, этиловым спиртом – см. часть I, стр. 30). После обработки дезинфицирующим раствором, все поверхности необходимо протереть тампоном, смоченным стерильной водой. •Составьте список материалов и реактивов, необходимых для выделения культур 31 ПРАВИЛА РАБОТЫ С ПРОБАМИ микобактерий туберкулеза. В дальнейшем это позволит свести к минимуму лишнее введение и выведение рук из ламинарного шкафа, что, в свою очередь, будет способствовать сохранению воздушного занавеса. Поместите в ламинарный шкаф только те материалы и оборудование, которые непосредственно нужны для работы; держите все запасные материалы и реагенты (например, дополнительное количество питательных сред) вне ламинарного шкафа. Лишние предметы, находящиеся в ламинарном шкафу, могут вызывать нарушение правильного тока воздуха, что приведет к появлению турбулентности, перекрестному заражению и вдыханию зараженного аэрозоля лабораторным работником. Поместив руки в ламинарный шкаф, выждите 60 секунд, прежде чем начинать какие-либо манипуляции. Это позволяет добиться стабилизации воздушного потока в ламинарном шкафу и удаления контаминирующих микроорганизмов, находящихся внутри шкафа на различных поверхностях. Проверьте, чтобы передняя решетка не была заблокирована ненужными бумагами, снятой пластиковой упаковкой и другими предметами. Выполняйте все манипуляции на рабочей поверхности на расстоянии не менее 10 сантиметров от передней решетки. Во время работы слегка поднимайте руки, чтобы воздух из комнаты мог свободно поступать в ламинарный шкаф через переднюю решетку. Положите на рабочую поверхность (но не на переднюю или заднюю решетку) бумажное полотенце из абсорбирующего материала. Это облегчит последующую уборку ламинарного шкафа и предупредит разбрызгивание пролитой жидкости и образование аэрозоля. По завершении работы бумажное полотенце может быть свернуто и помещено в пластиковый мешок для последующего автоклавирования. Размещайте все материалы и оборудование, во время работы которого может образоваться аэрозоль (например, магнитную мешалку), как можно ближе к задней стенке ламинарного шкафа и как можно дальше от передней решетки. Размещайте объемные предметы (например, мешки для последующего автоклавирования заразного материала, лотки для пипеток и колбы для отработанного материала) с одной стороны ламинарного шкафа. Располагайте все необходимое для работы в таком порядке, чтобы можно было постепенно переходить от более чистых манипуляций к более грязным. Стремитесь разместить все оборудование и предметы так, чтобы предупредить перемещение загрязненного над чистым. Избегайте широко распространенных ошибок, которые могут приводить к попаданию загрязненного материала за пределы ламинарного шкафа: не держите пластиковые мешки для отработанного материала вне ламинарного шкафа; не размещайте емкости для сбора отработанных пипеток посередине ламинарного шкафа или на полу около ламинарного шкафа. Частые движения рук за пределы ламинарного шкафа для того, чтобы выбросить отработанные предметы, будут нарушать правильный поток воздуха и могут привести как к инфицированию персонала, так и к контаминации исследуемых проб. Используйте для сбора отработанных пипеток только горизонтальные лотки с соответствующим дезинфицирующим раствором (например, с 5% раствором фенола – см. часть I, стр. 30). Правильно проводите все микробиологические манипуляции, чтобы предупредить разбрызгивание материала и образование аэрозолей. Это позволит избежать • • • • • • • • • • • • • 32 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ заражения лабораторных работников инфекционными материалами, с которыми производится работа в ламинарном шкафу. Выполняйте также и другое полезное правило: работайте с чистым материалом на расстоянии не менее 12 см от оборудования, которое может вызвать образование аэрозоля, что позволяет свести к минимуму риск перекрестного заражения. Не держите открытые пробирки или флаконы в вертикальном положении, старайтесь как можно быстрее закрыть их крышками или пробками. Это позволит существенно снизить вероятность перекрестного заражения. Не пользуйтесь в ламинарном шкафу большим открытым пламенем. Это создает турбулентность, которая нарушает приток воздуха в рабочую зону ламинарного шкафа. Для работы в ламинарном шкафу рекомендуется применять специальные бунзеновские горелки. Используйте банки с соответствующими жидкими дезинфицирующими растворами (например, 5% раствор фенола – см. часть I, стр. 30), в которые помещайте весь отработанный материал, прежде чем удалять его из ламинарного шкафа. Старайтесь сбрасывать отработанный материал в эти банки аккуратно, чтобы не допускать разбрызгивания жидкости, и обеспечьте достаточную продолжительность инкубации в дезинфицирующем растворе. Отработанный материал можно также помещать сразу в специальные мешки, находящиеся внутри ламинарного шкафа, которые затем сразу же будут автоклавированы. В такой мешок перед автоклавированием необходимо налить немного воды, чтобы обеспечить образование в нем пара. Прежде чем доставать из ламинарного шкафа какие-либо материалы, обработайте все наружные поверхности дезинфицирующим раствором. (см. часть I, стр. 30). В конце рабочего дня обработайте дезинфицирующим раствором все рабочие поверхности ламинарного шкафа, его заднюю и боковые стенки, а также внутреннюю поверхность переднего окна. Если во время работы в ламинарном шкафу пролит потенциально опасный материал или произошло разбрызгивание, немедленно уберите бумажное полотенце в мешок для автоклавирования. Сразу же обработайте все испачканные рабочие и внутренние поверхности ламинарного шкафа соответствующим дезинфицирующим раствором (например, 5% раствором фенола). Если пролито большое количество жидкости, потребуется более тщательная обработка ламинарного шкафа. Протрите все поверхности бумажным полотенцем, смоченным дезинфицирующим раствором, и затем удалите все предметы из ламинарного шкафа. Проверьте, закрыт ли сточный кран, и налейте на рабочие поверхности и сливную решетку достаточное количество дезинфицирующего раствора (например, 5% раствор фенола). Оставьте этот раствор в ламинарном шкафу по крайней мере на 30 минут. Слейте жидкость из шкафа в банку с дезинфицирующим раствором через эластичный шланг, один конец которого должен быть прикреплен к выпускному патрубку ламинарного шкафа, а второй – погружен в дезинфицирующий раствор. После дезинфекции ламинарного шкафа промойте сток водой и удалите шланг. Всегда проводите дезинфицирующую обработку ламинарного шкафа перед заменой фильтров или выполнением каких-либо ремонтных работ внутри ламинарного шкафа. Наиболее распространенный способ дезинфекции настольных ламинарных шкафов с помощью паров формальдегида описан в первой части данного руководства. • • • • • • • • 33 ПРАВИЛА РАБОТЫ С ПРОБАМИ 5.2.2 Использование центрифуги две центрифужные пробирки одинаковой длины и толщины. Внесите •Выберите центрифугируемый материал в одну пробирку, а во вторую пробирку налейте равное количество 70% раствора этилового спирта. Проверьте, чтобы обе пробирки имели одинаковый вес. пробирки в одинаковые (парные) центрифужные стаканы и вставьте эти •Поместите стаканы в гнезда ротора или крестовины, расположенные друг напротив друга. крышку центрифуги и, прежде чем включить центрифугу, проверьте, •Закройте чтобы индикатор числа оборотов указывал на ноль. (Многие центрифуги снабжены специальным предохранительным устройством, препятствующим пуску центрифуги без такой предварительной проверки.) вращением рукоятки увеличивайте скорость вращения ротора, пока •Медленным она не достигнет необходимой величины. 5.2.3 Предосторожности наличие в центрифужных стаканах резиновых прокладок – иначе про•Проверьте бирки могут разбиться. уравновешивайте центрифужные пробирки и стаканы. Плохо уравно•Тщательно вешенные пробирки приведут к появлению вибрации, износу опор и несчастным случаям. правильно ли размещены пробирки в роторе (друг напротив друга), •Проверьте, имеющем большое количество гнезд. не включайте и не останавливайте центрифугу резкими движениями •Никогда контрольной рукоятки. соблюдайте рекомендации производителя в отношении максимально до•Строго пустимой скорости вращения ротора при различной загрузке центрифуги. •Открывайте заклеенные центрифужные стаканы только в ламинарном шкафу. 5.2.4 Использование автоклава типа скороварки •В автоклаве должно быть достаточное количество воды. автоклав и закройте крышку, не закрывая выпускной клапан. Затем по•Загрузите ставьте предохранительный клапан в положение, соответствующее необходимой температуре, и включите нагревательный элемент. вода закипит, пар начнет выходить через выпускной клапан и удалит имею•Когда щийся в камере воздух. Выпускной клапан следует держать открытым до тех пор, пока из стерилизатора не будет удален весь воздух. Это можно проверить следующим образом. Наденьте на патрубок выпускного клапана эластичный шланг и погрузите его свободный конец в ведро или какой-либо другой большой сосуд с водой. Пар конденсируется в воде, а воздух выходит на поверхность воды в виде пузырьков. Когда весь воздух будет удален из камеры автоклава, образование пузырьков прекратится. После этого постепенно увеличивают давление в камере, пока оно не достигнет требуемой величины (обычно 15 фунтов на квадратный дюйм (100 кПа)) и избыточный пар не начнет выходить через предохранительный клапан. 34 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ того как температура обрабатываемого материала достигнет необходимой •После величины, установленное давление следует поддерживать в течение 30 минут. окончании периода стерилизации выключите нагревательный элемент и ос•По тавьте автоклав до полного его остывания. того как указатель давления внутри камеры автоклава возвратится к нуле•После вой отметке (что соответствует атмосферному давлению), медленно откройте клапан для выпуска пара и воздуха. Если открывать клапан слишком быстро, когда в автоклаве еще имеется избыточное давление, произойдет вскипание жидкостей внутри стерилизатора, а флаконы с жидкостью могут даже взорваться. разгружайте автоклав до полного охлаждения его содержимого. В зависимости •Не от того, какие материалы подвергались автоклавированию, процесс охлаждения может занять несколько часов. 5.2.5 Использование автоклава с замещением воздуха паром этот автоклав оборудован «рубашкой», необходимо вначале довести ее тем•Если пературу до рабочего уровня. камеру автоклава, закройте крышку (не закрывая клапан для выхода па•Загрузите ра) и начните впускать пар в верхнюю часть камеры. Воздух и конденсат начнут выходить из нижней части автоклава. того как показания термометра на выпускном патрубке достигнут необхо•После димой величины, выждите еще какое-то время, чтобы температура содержимого камеры автоклава также достигла необходимого уровня (продолжительность этого периода должна быть определена для каждого конкретного автоклава в самом начале работы). До момента достижения этой температуры нельзя считать процесс стерилизации начавшимся. продолжите цикл автоклавирования, поддерживая заданную температуру в •Затем течение необходимого времени. После завершения цикла стерилизации закройте клапан для выпуска пара и оставьте автоклав до тех пор, пока температура в его камере не снизится до 80°С. Только после этого можно без опаски открывать крышку автоклава. крышку автоклава только слегка приоткройте и оставьте в таком положе•Вначале нии на несколько минут, чтобы позволить пару выйти из камеры, а ее содержимому дополнительно охладиться. Серьезные несчастные случаи с ожогами лица и рук происходили именно в тот момент, когда открывалась крышка автоклава, даже если термометр показывал, что температура в камере снизилась до 80°С, и крышка была сначала слегка приоткрыта. В этот момент температура жидкости во флаконах могла еще превышать 100°С, поддерживая в них избыточное давление. При проникновении в камеру автоклава воздуха, имеющего комнатную температуру, эти флаконы могли взрываться. Во время открывания автоклава и его разгрузки оператор должен использовать защитный щиток для лица, закрывающий подбородок и горло. Кроме того, при этом необходимо пользоваться термозащитными рукавицами. 35 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ 6 ГОМОГЕНИЗАЦИЯ И ДЕКОНТАМИНАЦИЯ Обычные микробиологические методики, заключающиеся в посеве исследуемого биологического материала на селективные или дифференциальные питательные среды с последующими пересевами с целью выделения чистых культур возбудителей, не могут быть использованы при проведении бактериологических исследований на туберкулез. Это объясняется тем, что для роста M. tuberculosis в питательных средах должны присутствовать специальные вещества, но даже при этом рост микобактерий туберкулеза происходит очень медленно: колонии, видимые невооруженным глазом, появляются только через 3–6 недель. Для посевов обычно применяют не чашки Петри, а флаконы, потому что микобактерии туберкулеза содержатся в клиническом материале в небольших количествах, и для распределения по большей поверхности питательной среды следует использовать большие объемы проб. Из-за длительного периода инкубации посевов необходимо плотно закрывать флаконы, чтобы не происходило высыхания питательных сред (что неизбежно случится при использовании чашек Петри). Большинство проб клинического материала, поступающего в бактериологическую лабораторию для культурального исследования на туберкулез, контаминированы в различной степени более быстро растущими бактериями, являющимися частью нормальной микрофлоры организма человека. Эти бактерии очень быстро покроют всю поверхность питательной среды и израсходуют имеющиеся в ней питательные вещества до того, как начнется рост микобактерий туберкулеза. Поэтому большинство клинических образцов следует до проведения исследования на туберкулез подвергнуть специальной обработке, необходимой для разжижения пробы и ее деконтаминации, т. е. удаления нежелательной микрофлоры. Все препараты, используемые в настоящее время для гомогенизации и деконтаминации клинического материала, по отношению к туберкулезным микобактериям обладают более или менее выраженной токсичностью. Поэтому для сохранения жизнеспособности максимального количества микобактерий туберкулеза необходимо при проведении гомогенизации и деконтаминации исследуемых проб строго придерживаться методических рекомендаций. Чтобы обеспечить выживание достаточной части микобактерий туберкулеза, что необходимо для выделения культур возбудителя и подтверждения диагноза туберкулеза, следует использовать щадящие методы обработки, в результате чего неизбежна контаминация части посевов посторонней микрофлорой. Как правило, частота контаминации в лабораториях, проводящих исследование свежесобранных проб, составляет 2–3%. Если клинический материал хранится в течение нескольких дней до поступления в лабораторию, частота контаминированных посевов может достигать 5–10%. Очень важно отметить, что, если в лаборатории не наблюдается случаев контаминации посевов, это может означать, что для обработки биологического материала используются слишком жесткие методы деконтаминации, которые убивают не только сопутствующие микроорганизмы, но и возбудителей туберкулеза. При выполнении посевов на микобактерии туберкулеза необходимо иметь в виду три важных аспекта: Клинические образцы должны быть гомогенизированы, чтобы освободить микобактерии туберкулеза от тканей, в которых они могут находиться. • гомогенизация, ни деконтаминация не должны существенно уменьшать со•Ни держание жизнеспособных микобактерий туберкулеза в диагностическом материале. 37 ГОМОГЕНИЗАЦИЯ И ДЕКОНТАМИНАЦИЯ •Успех гомогенизации и деконтаминации зависит от ряда факторов: • повышенной устойчивости микобактерий к резкощелочной или кислой реакции растворов, используемых для гомогенизации материала; • продолжительности обработки материала этими веществами; • температуры образца в процессе его центрифугирования; • эффективности центрифугирования, используемого для осаждения микобактерий. В литературе описано множество различных способов гомогенизации и деконтаминации мокроты, однако единого мнения об оптимальном методе до сих пор нет. Выбор наиболее подходящего способа в значительной мере зависит от конкретных условий работы в данной лаборатории и квалификации персонала, а также от вида и качества используемого оборудования. Каждый метод имеет свои достоинства и недостатки; рекомендуется, чтобы региональные или центральные лаборатории в качестве стандартного способа гомогенизации и деконтаминации применяли один и тот же метод. Для получения оптимальных результатов выделения культур придется использовать методы, которые требуют: наличия хорошо подготовленного персонала; • относительно дорогостоящего оборудования (например, центрифу•применения ги) и соответствующих материалов; •тщательного ухода за оборудованием и контроля качества работы персонала. Любой метод, основанный на применении центрифуги, чреват возможными техническими проблемами, которые следует учитывать при выборе способа деконтаминации. Центрифуга должна быть высокоскоростной, чтобы обеспечивать «относительную силу центрифугирования» (ОСЦ ) порядка 3000 g. Если величина ОСЦ будет недостаточной, часть микобактерий останется в биологическом материале во взвешенном состоянии и будет удалена вместе с надосадочной жидкостью. Результаты недавних исследований показали, что при ОСЦ 3000 g в течение 15 минут в образце гомогенизированной мокроты произойдет осаждение 95% микобактерий. Относительная плотность микобактерий варьирует от 1,07 до 0,79, вследствие чего концентрация микобактерий в исследуемом материале будет неэффективной, если величина ОСЦ не достигнет 3000 g. • предпринимать специальные меры предосторожности, чтобы в слу•Необходимо чае разрушения пробирки во время центрифугирования не произошло заражения персонала. В число таких мер входят следующие: • Используйте напольную центрифугу с крышкой и фиксированным угловым ротором. Относительно большая масса такого ротора позволяет центрифугировать пробирки, несколько отличающиеся по весу друг от друга; при этом не появляется вибрация и не возникает угроза разрушения пробирок. • Всегда старайтесь уравновесить пробирки в центрифуге. Вес центрифужной пробирки можно уравновесить, добавляя стерильный изотонический раствор хлорида натрия в обрабатываемую пробу или размещая напротив пробирки с исследуемым образцом пробирку со стерильной водой или 70% этиловым спиртом (применение вместо воды 70% этилового спирта снижает риск контаминации в случае разрушения пробирки). • Применяйте, по возможности, пробирки с колпачками для предупреждения образования аэрозоля. 38 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ • Размещайте центрифуги в специальных комнатах или боксах, имеющих вентиляцию. 6.1 Методы разжижения и деконтаминации 6.1.1 Образцы мокроты Образцы мокроты нельзя объединять из-за риска перекрестного загрязнения материала. Поскольку продолжительность обработки материала должна строго соблюдаться, целесообразно проводить одновременную обработку нескольких проб в количестве, эквивалентном пропускной способности центрифуги (например, по 8 проб). Всегда проводите обработку (разжижение и деконтаминацию) всей пробы, т. е. не пытайтесь выбрать какие-то части образца, как это обычно делают при бактериоскопическом исследовании мокроты. Если мокрота достаточно жидкая, перелейте ее аккуратно из флакона или контейнера в центрифужную пробирку. Если образец слишком густой, добавьте в контейнер с мокротой равный объем жидкости, используемой для гомогенизации и деконтаминации, и затем аккуратно перелейте смесь в соответствующую центрифужную пробирку. Так как чаще всего для культурального исследования на туберкулез в лабораторию присылают именно пробы мокроты, разработанные способы разжижения и деконтаминации рассчитаны прежде всего именно на этот биологический материал. Другие биологические жидкости и ткани требуют еще более тщательной обработки, так как в них обычно содержится меньшее количество микобактерий туберкулеза, чем в мокроте. 6.2 Метод с использованием гидроокиси натрия (модифицированный метод Петрова) Этот метод широко применяется в развивающихся странах, так как отличается простотой и основан на использовании легкодоступных реагентов. Гидроокись натрия токсична по отношению как к контаминантным микроорганизмам, так и к микобактериям туберкулеза. Поэтому при использовании данного метода необходимо строго соблюдать указанное время обработки. •Реагенты 4% раствор гидроокиси натрия (NaOH) Гидроокись натрия (химически чистая) 4г Дистиллированная вода 100 мл Растворите NaOH в дистиллированной воде и стерилизуйте автоклавированием при 121°С в течение 15 минут. Стерильный изотонический раствор хлорида натрия Хлорид натрия (химически чистый) 0,85 г Дистиллированная вода 100 мл Растворите NaCl в дистиллированной воде и стерилизуйте автоклавированием при 121°С в течение 15 минут. 39 ГОМОГЕНИЗАЦИЯ И ДЕКОНТАМИНАЦИЯ Другой способ приготовления 4%-го раствора хлорида натрия: Внесите в флакон с 250 г NaOH 500 мл дистиллированной воды и добавьте воду до отметки 625 мл. Будьте осторожны, так как при этом происходит выделение тепла. При необходимости приготовления 4%-го раствора NaOH добавляйте 40%-й раствор NaOH к дистиллированной воде в соотношении 1:10. •Методика Смотрите диаграмму 1. Диаграмма 1. Метод деконтаминации с использованием гидроокиси натрия (NaOH) (модифицированный метод Петрова) МЕТОДИКА К х мл мокроты добавьте 2х мл 4%-го раствора NaOH ➜ Закройте флакон крышкой и встряхните ➜ Оставьте на 15 минут при комнатной температуре, периодически встряхивая ➜ Центрифугируйте при 3000 g в течение 15 минут 2x мл – 4% NaOH ➜ x мл мокроты Удалите надосадочную жидкость ➜ Добавьте 15 мл стерильного изотонического раствора NaCl или дистиллированной воды и ресуспендируйте осадок ➜ Центрифугируйте при 3000 g в течение 15 минут ➜ Удалите надосадочную жидкость и немедленно произведите посев осадка на питательную среду 40 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ 6.2.1 Достоинства метода с использованием NaOH прост и дешев; при этом достигается хорошая •Метод очистка образца от контаминантов. обработки одного образца необходимо около 1 часа, обработка 20 образцов •Для занимает около двух часов, причем количество обрабатываемых проб ограничивается пропускной способностью центрифуги. раствор NaOH можно хранить в течение нескольких недель. Храните •Стерильный этот раствор в пластиковых бутылях. 6.2.2 Недостатки строго соблюдать продолжительность каждого этапа обработки про•Необходимо бы, чтобы предупредить гибель микобактерий туберкулеза. с помощью NaOH является достаточно жесткой и может приводить к •Обработка гибели до 60% микобактерий туберкулеза, содержащихся в исследуемом образце. Этот показатель не зависит от дополнительной гибели бактерий за счет повышенной температуры при центрифугировании и других факторов. В странах с достаточными материальными и людскими ресурсами могут применяться более дорогие и трудоемкие методы разжижения и деконтаминации (Kent P.T., Kubica G.P. Public health mycobacteriology: guide for the level III laboratory. US Department of Health and Human Services, Centres for Disease Control, USA, 1985). Ниже приведено краткое описание некоторых таких методов. АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ МЕТОД МЕТОД С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ N-АЦЕТИЛ-L-ЦИСТЕИН И ГИДРОКСИДА НАТРИЯ (NALC-NaOH) муколитического препарата NALC (используемого для быстрого •Применение разжижения мокроты) позволяет снизить концентрацию деконтаминирующего субстрата (NaOH) до 1%. Цитрат натрия включен в литическую смесь для связывания ионов тяжелых металлов, которые могут присутствовать в пробе и инактивировать действие ацетилцистеина. правильном использовании данный метод позволяет получить больше по•При ложительных результатов культурального исследования, чем любой другой метод; в этом случае в процессе обработки мокроты погибают около 30% микобактерий туберкулеза. обработки одной пробы мокроты требуется около 40 минут; обработка •Для 20 проб займет около 1 часа. в растворе быстро теряет свою активность, поэтому данную •Ацетилцистеин литическую смесь приходится готовить ежедневно. строго соблюдать рекомендованное время экспозиции; кроме •Необходимо того, для уменьшения концентрации токсических веществ, которые могут угнетать рост микобактерий туберкулеза, следует при ресуспендировании осадка разводить его в соотношении 1:10. использовании данного метода нужны некоторые дорогостоящие реаген•При ты (например, бычий сывороточный альбумин) и фильтры. 41 ГОМОГЕНИЗАЦИЯ И ДЕКОНТАМИНАЦИЯ АЛЬТЕРНАТИВНЫЙ МЕТОД МЕТОД С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЗЕФИРАН-ТРИНАТРИЙФОСФАТА (Z-TSP) При использовании для гомогенизации и деконтаминации проб тринатрийфосфата и зефирана (хлорида бензалкония) процесс протекает в более мягких условиях. При данном способе обработки мокроты нет необходимости очень строго соблюдать рекомендованное время экспозиции. • правильном использовании данного метода в процессе обработки мокро•При ты погибают около 30% микобактерий. обработки одной пробы мокроты требуется около двух часов; обработка 20 •Для проб займет около 4 часов. Иногда лабораторным работникам в некоторых регионах или в определенный период приходится сталкиваться с чрезмерно высокой частотой контаминации проб от больных; это может создавать большие сложности в работе. В таких случаях можно применить более жесткие методы деконтаминации с использованием 5%-й щавелевой кислоты или 4%-й серной кислоты1. АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ МЕТОДЫ МЕТОД С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ЩАВЕЛЕВОЙ КИСЛОТЫ Этот метод нередко дает хорошие результаты в тех случаях, когда пробы мокроты оказываются постоянно контаминированы Pseudomonas sp. МЕТОД С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СЕРНОЙ КИСЛОТЫ Иногда этот метод дает хорошие результаты при бактериологическом исследовании мочи и других жидких биологических материалов, если при использовании щелочной обработки отмечается интенсивная контаминация проб. 6.2.3 Другие биологические материалы Промывные воды желудка Исследование промывных вод желудка должно быть проведено в течение первых четырех часов после их получения от больного, так как из-за высокой кислотности микобактерии туберкулеза могут быстро погибнуть. Обычно при исследовании промывных вод желудка нет необходимости осуществлять деконтаминацию, если проба была взята в стерильный контейнер с соблюдением правил асептики. Центрифугируйте весь объем пробы при 3000 g в течение 30 минут. Если предполагается наличие контаминации пробы, следует ресуспендировать осадок в 2 мл 4%-й серной кислоты и оставить на 15 минут, после чего к смеси добавить 15 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия. Центрифугируйте эту смесь при 3000 g в течение 15 минут и нейтрализуйте осадок 4%-м раствором NaOH, используя феноловый красный в качестве индикатора. Сразу же после этого произведите посев материала на питательную среду. 42 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ Моча Центрифугируйте весь объем пробы при 3000 g в течение 15 минут. Осторожно слейте надосадочную жидкость и добавьте к осадку 2 мл 4%-й серной кислоты. Оставьте на 15 минут, затем к смеси добавьте 15 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия и центрифугируйте при 3000 g в течение 15 минут. Нейтрализуйте осадок 4%-м раствором NaOH, используя в качестве индикатора феноловый красный. Сразу же после обработки материала произведите его посев на питательную среду. Носоглоточная слизь Добавьте в пробирку с тампоном 5%-й раствор щавелевой кислоты и оставьте на 15 минут. Перенесите тампон в другую пробирку со стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. Через несколько минут извлеките тампон из пробирки и проведите посев на питательную среду. Для получения оптимальных результатов раствор щавелевой кислоты (в котором могут находиться микобактерии туберкулеза, смытые с тампона) необходимо перенести в центрифужную пробирку и центрифугировать при 3000 g в течение 15 минут. Промойте осадок стерильным изотоническим раствором хлорида натрия, центрифугируйте при 3000 g в течение 15 минут и сразу же произведите посев на питательную среду. Ткани Лимфатические узлы, биоптаты и другие ткани, резецированные во время хирургического вмешательства, необходимо измельчить с помощью стерильного скальпеля или ножниц. Гомогенизируйте образец в стерильной фарфоровой ступке или в гомогенизаторе тканей, добавив 0,5–1 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия и небольшое количество стерильного песка (при необходимости). Эту суспензию можно использовать для посева на питательную среду в тех случаях, если указанные выше манипуляции были проведены с соблюдением правил асептики. Если правила асептики не соблюдались, проведите деконтаминацию пробы 4%-м раствором серной кислоты, как это рекомендуется делать при обработке мочи. После работы необходимо тщательно вымыть и простерилизовать ступки, пестики и гомогенизаторы тканей, чтобы избежать получения ложноположительных результатов или контаминации при обработке последующих проб. Гной Гной можно обрабатывать таким же образом, как и аспирированные жидкости. Если гной очень густой, его следует обрабатывать так же, как мокроту. Спинномозговая жидкость Спинномозговую жидкость необходимо концентрировать с помощью мембранной фильтрации, высокоскоростного центрифугирования или преципитационных методов. Для преципитации можно к 10 мл спинномозговой жидкости добавить 0,1 мл стерильной кроличьей сыворотки или эквивалентное количество раствора альбумина, перемешать до появления равномерного помутнения, центрифугировать при 3000 g в течение 15 минут и произвести посев осадка на питательную среду, если предполагается, что контаминация отсутствует. Если при центрифугировании осадок не образовался, добавляйте стерильный 20%-й раствор сульфосалициловой кислоты по каплям до тех пор, пока не образуется по- 43 ГОМОГЕНИЗАЦИЯ И ДЕКОНТАМИНАЦИЯ мутнение. Из такого преципитата легче получить осадок при центрифугировании. Если возможна контаминация спинномозговой жидкости, смешайте осадок с 2 мл 4%-й серной кислоты и оставьте на 15 минут. Затем к смеси добавьте 15 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия, центрифугируйте при 3000 g в течение 15 минут и сразу же произведите посев осадка на питательную среду. Сгустки Если в исследуемом образце может образоваться большой сгусток (например, в плевральной или асцитической жидкости), рекомендуется предупредить это нежелательное явление, добавив цитрат натрия к биологическому материалу в момент его сбора. Для этого добавьте 2 капли 20%-го раствора цитрата натрия на каждые 10 мл собранной жидкости. Если сгусток все-таки образовался, его можно после предварительногой разжижения растворить с помощью щелочного метода Петрова. Другие биологические жидкости (включая плевральную жидкость) Слизисто-гнойная жидкость: Обрабатывайте так же, как и мокроту, когда объем пробы составляет 10 мл или меньше. Чистая жидкость: Если материал получен с соблюдением правил асептики, центрифугируйте при 3000 g в течение 15 минут и сразу же произведите посев осадка на питательную среду. Если объем пробы превышает 10 мл, обрабатывайте так же, как промывные воды желудка. Микобактерии туберкулеза могут «приклеиваться» к стеклу или пластику. Чтобы добиться максимального извлечения микобактерий, ополосните контейнер стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. Центрифугируйте раствор при 3000 g в течение 15 минут и произведите посев 2–3 капель осадка на питательную среду. Интенсивность контаминации проб может варьировать в значительной степени, поэтому выбирайте способ деконтаминации соответственно исследуемому материалу. Выбор метода деконтаминации зависит также от того, как давно была взята проба, и в каких условиях она хранилась и транспортировалась в лабораторию. Следующие биологические жидкости и ткани не нуждаются в деконтаминации, если они были взяты в стерильные флаконы с соблюдением правил асептики: спинальная, синовиальная и другие жидкости (обычно стерильные); • •костный мозг; •гной из холодных абсцессов; •резецированные ткани (за исключением материала аутопсии); •пунктаты печени и лимфоузлов, а также биоптаты (при отсутствии свищей). Если возникают сомнения в контаминации образцов, можно провести посев части пробы без какой-либо предварительной обработки на неселективную питательную среду (например, на простой питательный агар) и инкубировать в течение 24 часов для того, чтобы проконтролировать наличие в образце быстрорастущих бактерий (не микобактерий). Остальную часть пробы хранят без какой-либо обработки в холодильнике до тех пор, пока не будет подтверждено отсутствие контаминирующих бактерий. Если при этом будет установлен факт контаминации, оставшуюся часть пробы можно деконтаминировать одним из описанных выше методов. 44 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ Культура Mycobacterium tuberculosis на среде Левенштейна-Йенсена. Микобактерии растут в виде типичных морщинистых колоний кремового цвета на зеленом фоне яичной среды. Тест образования ниацина используется для дифференцирования Mycobacterium tuberculosis от микобактерий других видов; появление желтого окрашивания указывает на положительный результат теста. 45 ГОМОГЕНИЗАЦИЯ И ДЕКОНТАМИНАЦИЯ Исследование культуры Mycobacterium tuberculosis в люминесцентном микроскопе; видны характерные тяжи. Тест на восстановление нитратов для дифференцирования Mycobacterium tuberculosis от микобактерий других видов; появление пурпурного окрашивания указывает на положительный результат теста. 46 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ 7 ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ Для подтверждения диагноза туберкулеза необходимо выделить культуру Mycobacterium tuberculosis на искусственной питательной среде и правильно идентифицировать ее, используя дифференциальные тесты in vitro. Для культивирования микобактерий туберкулеза было разработано множество различных питательных сред, которые делятся на три основные группы – яичные, агаровые и жидкие. Идеальная среда для выделения микобактерий туберкулеза должна быть: а) экономичной и простой в приготовлении, состоять из легкодоступных компонентов; б) угнетать рост сопутствующей микрофлоры (контаминантов); в) стимулировать обильный рост немногочисленных микобактерий туберкулеза, содержащихся в исследуемом материале; г) позволять осуществлять предварительную дифференциальную диагностику выделенных культур по морфологии колоний. Для выделения микобактерий туберкулеза яичные среды являются средами выбора, так как именно они удовлетворяют всем требованиям, перечисленным выше. Появляются новые данные, что при исследовании других видов биологического материала преимущества могут иметь жидкие питательные среды. Рутинному использованию жидких сред при исследовании мокроты препятствует их более высокая стоимость, однако в тех случаях, когда получение повторного клинического образца может быть затруднительно или невозможно (например, при исследовании спинномозговой жидкости или биопсированных тканей), рекомендуется для выделения микобактерий туберкулеза одновременно использовать две среды – яичную и жидкую. Рекомендуется при получении мокроты для культурального исследования обязательно проводить бактериоскопию всех проб по методике, изложенной во второй части данного руководства. 7.1 Достоинства и недостатки яичных сред 7.1.1 Достоинства •просты в приготовлении; дешевые из всех имеющихся специальных сред и в то же время поддержи•самые вают хороший рост микобактерий туберкулеза; храниться в холодильнике в течение нескольких недель, если были приго•могут товлены из свежих яиц и находятся во флаконах с плотно закрытыми крышками для предупреждения высыхания среды; возможность контаминации в процессе приготовления сводится к минимуму, так как после разлива во флаконы подвергаются тепловой обработке; кроме того, добавляемый к этим средам малахитовый зеленый угнетает рост сопутствующей микрофлоры. • 7.1.2 Недостатки колоний становится заметным через большой промежуток времени – иногда •рост через 8 недель, особенно если в исследуемом материале содержалось небольшое количество микобактерий туберкулеза или если процесс деконтаминации был слишком жестким; если в процессе культивирования появляется рост сопутствующей микрофлоры, он отмечается на всей поверхности питательной среды, из-за чего данные пробы приходится выбрасывать. • 47 ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ 7.2 Предосторожности при приготовлении питательных сред Чтобы приготовить наиболее качественные питательные среды, необходимо использовать химически чистые реагенты, чистую посуду и свежеприготовленную стерильную дистиллированную воду. Следует тщательно выполнять рекомендации по приготовлению питательных сред и не вносить в стандартную процедуру никаких модификаций. Ниже приведено несколько советов, которые позволяют приготовить высококачественные питательные среды и помогают предупредить их контаминацию. Содержите рабочие помещения в максимальной чистоте. Обрабатывайте рабочие столы дезинфицирующими растворами (например, 5%-м раствором этилового спирта) до того, как разместить на них стерильные реактивы и питательные среды. Вытирайте пол мокрой тряпкой, чтобы удалить пыль. Используйте стерильную стеклянную посуду. Используйте химически чистые реагенты и химикалии (если инструкцией не предусмотрена другая степень их чистоты). Контролируйте температуру в сухожаровом шкафу и водяной бане. В процессе приготовления питательных сред строго соблюдайте правила асептики – например, обжигайте на пламени горелки горло флаконов и пробирок. При приготовлении яичных сред всегда тщательно очищайте поверхность скорлупы яйца перед ее вскрытием. Не перегревайте питательные среды в процессе тепловой обработки. Не оставляйте приготовленные питательные среды на свету (в том числе не подвергайте воздействию ультрафиолетовых лучей); храните до употребления в холодильнике в темноте. Не экономьте на объеме питательной среды. Вносите в каждый флакон 6–8 мл среды, а в каждую пробирку – 20 мл среды. • • • • • • • • • 7.3 Приготовление яичных сред 1 Среда Левенштейна-Йенсена Среда Левенштейна-Йенсена чаще всего используется для выделения культур микобактерий туберкулеза. Для практической работы лучше использовать эту среду, модифицированную в соответствии с рекомендациями Международного союза по борьбе с туберкулезом и болезнями легких (International Union Against Tuberculosis and Lung Diseases – IUATLD); ниже приведено ее подробное описание. Среда Левенштейна-Йенсена, содержащая глицерин, стимулирует рост микобактерий туберкулеза, а среда Левенштейна-Йенсена, содержащая вместо глицерина пируват, в большей степени стимулирует рост M. bovis. В тех странах и регионах, где больные могут быть инфицированы микобактериями обоих видов, следует одновременно использовать оба варианта этой среды. •Ингредиенты Раствор минеральных солей Фосфат калия однозамещенный, безводный (КН2РО4) Сульфат магния Цитрат магния Аспарагин 48 2,4 г 0,24 г 0,6 г 3,6 г ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ Глицерин (чистый) Дистиллированная вода 12 мл 600 мл Растворите все ингредиенты в указанном порядке в дистиллированной воде при нагревании. Стерилизуйте автоклавированием при 121°С в течение 30 минут. Охладите до комнатной температуры. Этот раствор можно хранить в холодильнике в течение неопределенно длительного времени. Раствор малахитового зеленого, 2% Малахитовый зеленый (порошок) Стерильная дистиллированная вода 2,0 г 100 мл Растворите, строго выполняя правила асептики, порошок малахитового зеленого в стерильной дистиллированной воде, оставив флакон в термостате на 1–2 часа. Этот раствор нельзя хранить в течение очень длительного времени – в процессе хранения может выпасть осадок или может уменьшиться интенсивность окраски раствора. При появлении этих изменений вылейте старый раствор и приготовьте свежий. Гомогенизированные цельные яйца Используя щетку, тщательно вымойте теплой водой с простым мылом поверхность свежих (не более 7 дней) куриных яиц. Оставьте яйца в мыльном растворе на 30 минут, затем тщательно вымойте проточной водой и оставьте на 15 минут в 70%-ном растворе этилового спирта. Тщательно вымойте руки щеткой с мылом и ополосните чистой водой. Вскройте яйца стерильным ножом, вылейте содержимое в стерильную колбу и взбейте с помощью стерильного миксера. •Приготовление среды В большую стерильную колбу внесите, соблюдая правила асептики, следующие ингредиенты и тщательно их перемешайте. Раствор минеральных солей Раствор малахитового зеленого Гомогенизированные яйца (20–25 штук, в зависимости от размера) 600 мл 20 мл 1000 мл Готовую питательную среду перелейте в стерильные флаконы МакКартни, емкостью 14 мл или 28 мл (по 6–8 мл среды), или по 20 мм в пробирки размерами 20х150 мм с завинчивающимися крышками и плотно завинтите крышки. Для предупреждения выпадения осадка подвергайте флаконы или пробирки с яичной средой тепловой обработке не позже чем через 15 минут после разлива среды. •Свертывание среды До загрузки флаконов со средой в аппарат для свертывания питательных сред нагрейте его до 80°С. Поместите сосуды со средой в шкаф в наклонном положении, чтобы получить скошенную поверхность, и оставьте на 45 минут при температуре 80–85°С (так как среда была приготовлена из стерильных ингредиентов с соблюдением правил асептики, эта процедура предназначена не для стерилизации, а для ко- 49 ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ агуляции питательной среды). Двукратное или трехкратное прогревание среды в дальнейшем приводит к ухудшению ее качества. Качество яичной питательной среды ухудшается, если ее тепловая обработка производится при более высокой температуре или в течение более длительного времени. Обесцвечивание готовой питательной среды может происходить из-за избыточной тепловой обработки. Появление маленьких углублений или пузырьков на поверхности готовой среды также указывает на нарушение теплового режима в процессе приготовления питательной среды. Некачественные питательные среды следует просто выбрасывать. •Контроль стерильности После тепловой обработки (коагуляции) для проверки стерильности оставьте все флаконы и пробирки (или выборочные экземпляры) при 35–37°С на 24 часа. •Хранение Укажите на флаконах или пробирках со средой Левенштейна-Йенсена дату ее приготовления и храните в холодильнике; длительность хранения может достигать нескольких недель, если крышки сосудов плотно завинчены для предупреждения высыхания среды. Для получения оптимальных результатов не следует хранить среду Левенштейна-Йенсена более 4 недель. Для культивирования M. bovis среда Левенштейна-Йенсена должна быть обогащена пируватом натрия (0,5%). Для приготовления этой модификации среды глицерин не используют, но вместо него добавляют 8,0 г пирувата натрия. 2 Среда Огавы Эта среда дешевле, чем среда Левенштейна-Йенсена, так как в ее состав не входит аспарагин. •Ингредиенты Раствор минеральных солей Фосфат калия однозамещенный, безводный (КН2РО4) Глютамат натрия Дистиллированная вода 3,0 г 3,0 г 300 мл Растворите все ингредиенты в дистиллированной воде при нагревании. Стерилизуйте автоклавированием при 121°С в течение 30 минут. Охладите до комнатной температуры. Этот раствор можно хранить в холодильнике в течение неопределенно длительного времени. Раствор малахитового зеленого, 2% Малахитовый зеленый (порошок) Стерильная дистиллированная вода 2,0 г 100 мл Порошок малахитового зеленого растворите, строго выполняя правила асептики, в 50 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ стерильной дистиллированной воде, оставив колбу на 1–2 часа в термостате. Этот раствор нельзя хранить в течение очень длительного времени (может выпасть осадок или уменьшиться интенсивность окраски раствора). При появлении таких изменений вылейте старый раствор и приготовьте свежий. Гомогенизированные цельные яйца С помощью щетки тщательно вымойте теплой водой с простым мылом поверхность свежих (не более 7 дней) куриных яиц. Оставьте яйца в мыльном растворе на 30 минут, затем тщательно вымойте проточной водой и погрузите на 15 минут в 70%-й раствор этилового спирта. Тщательно вымойте руки щеткой с мылом и ополосните чистой водой. Вскройте яйца стерильным ножом, вылейте содержимое в стерильную колбу и взбейте с помощью стерильного миксера. •Приготовление среды В большую стерильную колбу внесите, соблюдая правила асептики, следующие ингредиенты и тщательно их перемешайте. Раствор минеральных солей Раствор малахитового зеленого Гомогенизированные яйца (12–16 штук, в зависимости от размера) Глицерин 300 мл 18 мл 600 мл 18 мл Готовая среда должна иметь рН 6,8. Готовую среду тщательно перемешайте и внесите по 6–8 мл среды в стерильные флаконы МакКартни емкостью 14 мл или 28 мл или по 20 мл в пробирки размерами 20х150 мм с завинчивающимися крышками. •Свертывание среды До загрузки флаконов со средой в аппарат для свертывания питательных сред нагрейте его до 80°С. Установите флаконы в наклонное положение, чтобы получить скошенную поверхность среды, и оставьте на 45 минут при температуре 80–85°С (так как среда была приготовлена из стерильных ингредиентов с соблюдением правил асептики, эта процедура предназначена для коагуляции питательной среды, а не для стерилизации). Повторное прогревание среды в дальнейшем приводит к ухудшению ее качества. Качество яичной питательной среды ухудшается, если тепловая обработка проводится при более высокой температуре или в течение более длительного времени. Обесцвечивание готовой среды может происходить из-за избыточной тепловой обработки. Появление маленьких углублений или пузырьков на поверхности готовой среды также указывает на нарушение теплового режима в процессе приготовления этой среды. Некачественные питательные среды следует просто выбрасывать. •Контроль стерильности После тепловой обработки (коагуляции) оставьте все флаконы и пробирки (или выборочные экземпляры) при 35–37°С на 24 часа для проверки стерильности. 51 ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ •Хранение Укажите на флаконах или пробирках со средой дату ее приготовления и храните в холодильнике; длительность хранения может достигать нескольких недель, если крышки сосудов плотно завинчены для предупреждения высыхания среды. Если в лаборатории нет центрифуги, можно использовать следующий простой прием для выделения культур микобактерий туберкулеза. Пробу мокроты обработайте равным объемом 4%-го раствора NaOH и произведите посев материала непосредственно на модифицированную или забуференную кислотой среду Огавы. При использовании этого метода частота получения положительных результатов примерно такая же, как и при культивировании проб после предварительной концентрации. 3 Среда Огавы, забуференная кислотой •Ингредиенты Модифицированная среда Огавы Забуференная среда Огавы Фосфат калия однозамещенный (КН2РО4) Цитрат магния Глютамат натрия Глицерин Дистиллированная вода 2г 3г 0,1 г 0,5 г 4 мл 100 мл – 1,0 г 6 мл 100 мл Гомогенизированные цельные яйца 2%-й раствор малахитового зеленого 200 мл 4 мл 200 мл 6 мл 6,4 6,2 Окончательная рН 2,0 г •Приготовление среды Растворите все ингредиенты в дистиллированной воде и прокипятите в течение 30 минут. Охладите до комнатной температуры добавьте гомогенизированные яйца и раствор малахитового зеленого. Внесите по 6–8 мл среды в стерильные флаконы и проведите коагуляцию среды при 85°С в течение 45–60 минут. В странах, имеющих людские и материальные ресурсы в достаточном объеме, можно использовать более дорогие и трудоемкие методы выделения культур микобактерий туберкулеза*. Некоторые из этих методов перечислены ниже. АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ Жидкая среда Германа Кирхнера Эта питательная среда – самая эффективная и наименее дорогая из имеющихся жидких питательных сред для культивирования микобактерий туберкулеза. Еще одно ее преимущество – для посева на эту среду можно использовать большой объем пробы. * См.: Kent P.T., Kubica G.P. Public health mycobacteriology: guide for the level III laboratory. US Department of Health and Human Services, Centres for Disease Control, USA, 1985. 52 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ Жидкая среда Дюбуа с масляной кислотой и альбумином Эту питательную среду рекомендуют применять для выделения микобактерий туберкулеза из спинномозговой, плевральной или перитонеальной жидкости. Ее можно готовить из основных ингредиентов или приобретать в виде готовой к употреблению основы, к которой в лаборатории добавляют альбумин или сыворотку крови. Плотная среда Миддлбрука 7Н-10 и 7Н-11 Среду Миддлбрука 7Н-10 можно готовить из основных ингредиентов или приобретать в виде готовой к употреблению основы, в которую в лаборатории вносят специальную добавку Миддлбрука, содержащую масляную кислоту, альбумин, глюкозу и каталазу (добавка OADC). Питательная среда 7Н-11 – это фактически плотная среда 7Н-10, обогащенная добавлением казеина, предварительно подвергнутого ферментативной обработке. Среды 7Н-10 и 7Н-11 лучше готовить в небольшом количестве (200–400 мл), чтобы свести к минимуму тепловую обработку, необходимую для расплавления агара. Не следует кипятить основную среду до автоклавирования (к этому иногда прибегают для растворения агара или для приготовления некоторого запаса основы, которую можно хранить в течение некоторого времени), так как повторная тепловая обработка этой питательной среды значительно снижает ее качество. При использовании для выделения микобактерий туберкулеза питательных сред Миддлбрука 7Н-10 или 7Н-11 посевы следует инкубировать в атмосфере с 10% СО2. При воздействии на питательную среду Миддлбрука дневного света или повышенной температуры происходит выделение формальдегида в концентрации, достаточной для угнетения роста микобактерий туберкулеза. АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ ВАРИАНТЫ Селективная среда Если материал очень сильно загрязнен сопутствующей микрофлорой, для его посева можно использовать селективные питательные среды с антибиотиками. При этом можно применять антибиотики, к которым микобактерии туберкулеза нечувствительны, но которые будут задерживать рост контаминирующей микрофлоры, – например, пенициллин (50–100 ЕД/мл), налидиксовую кислоту (35 мкг/мл) или полимиксин (20–25 мкг/мл). Антибиотики можно: •добавлять к яичной среде до ее свертывания; •наносить на поверхность скошенной плотной среды; •смешивать с исследуемой пробой. Коммерческая питательная среда «Микобактозель» содержит несколько антибиотиков – циклогексимид (0,4 мг/мл), линкомицин (0,002 мг/мл) и налидиксовую кислоту (0,035 мг/мл). Питательные среды с антибиотиками можно хранить в холодильнике в темноте не более 4 недель. 53 ПИТАТЕЛЬНЫЕ СРЕДЫ АЛЬТЕРНАТИВНЫЕ ВАРИАНТЫ Использование радиометрических методов при выделении микобактерий туберкулеза К числу новейших достижений в усовершенствовании методов диагностики туберкулеза можно отнести разработку автоматизированной системы для выявления роста микобактерий на ранней стадии с помощью радиометрического метода (система «BACTEC», разработанная компанией «Beckton Dickinson»). При этом мокроту или другой биологический материал вначале освобождают от сопутствующей микрофлоры с помощью одной из стандартных методик, а затем вносят во флаконы со средой Миддлбрука 7Н-12, содержащей смесь антибиотиков (для предупреждения роста других микроорганизмов) и пальмитиновую кислоту, меченную радиоактивным углеродом 14С. Среда выпускается производителем (компания «Beckton Dickinson») под коммерческим названием «BACTEC 12в» во флаконах, герметично закрытых резиновыми пробками; посев материала производится через иглу с помощью шприца. При наличии роста микобактерий происходит ассимиляция пальмитиновой кислоты, меченной радиоактивным углеродом, и образование 14С. В автоматическом анализаторе производится периодический контроль воздуха во флаконах с посевами на наличие радиоактивного углерода, появление которого фиксируется автоматически. Контаминированный аэрозоль не может выходить из аппарата во внешнюю среду, так как очищается при прохождении через специальный высокоэффективный фильтр. Рост микобактерий может быть обнаружен уже через 5–7 суток, однако положительный ответ может быть выдан только после проведения дополнительных исследований, необходимых для дифференцировки микобактерий туберкулеза от других микобактерий. В аппарате «BACTEC» используется тест с р-нитро-α-ацетиламино-β-приофеноном (NAР), который позволяет дифференцировать микобактерии туберкулеза от других микобактерий в течение 5 дней. Обычно NAР ингибирует рост M. tuberculosis, но не оказывает влияния на рост других (нетуберкулезных) микобактерий. Результаты сравнительных исследований показали, что этот метод очень эффективен и достаточно надежен; результаты подтверждающих тестов для окончательной идентификации M. Tuberculosis могут быть получены в течение 2 недель. Однако стоимость аппарата «BACTEC» очень высока, так что обычные лаборатории не имеют возможности приобрести его и использовать в повседневной работе. Кроме того, при эксплуатации этой системы следует иметь в виду два опасных момента: использование инъекционных игл чревато опасностью случайных уколов, питательная среда содержит радиоактивное вещество, что затрудняет ее утилизацию. В заключение следует отметить, что применение аппарата «BACTEC» дает прекрасные результаты при исследовании спинномозговой жидкости, когда оперативное получение результатов имеет исключительно важное значение для правильного ведения больного. Однако очень высокая стоимость аппарата и питательных сред, меченных радиоактивным веществом, препятствуют широкому внедрению данного метода в большинстве стран с высокой распространенностью туберкулеза. 54 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ 8 ТЕХНИКА ПОСЕВА И ИНКУБАЦИИ 8.1 Техника посева В нижней части флакона со скошенной питательной средой нередко наблюдается образование конденсата. До посева биологического материала этот конденсат желательно удалить. При проведении культурального исследования нередкой ошибкой является использование слишком малого количества биологического материала. Для первичного посева можно использовать как бактериологическую петлю (металлическую или одноразовую), так и пастеровскую пипетку; чаще всего для этих целей рекомендуют применять пластиковые пастеровские пипетки. На каждый косяк питательной среды следует нанести 0,2–0,4 мл (2–4 капли или 2–4 бактериологические петли) осадка, полученного после центрифугирования, и распределить материал по поверхности среды. Для посева в жидкую питательную среду используют биологический материал в объеме до 1 мл. Для посева каждой пробы берут два флакона со средой Левенштейна-Йенсена. Там, где патологический процесс у больного может быть обусловлен M. bovis, необходимо использовать дополнительный флакон со средой, содержащей пируват. 8.2 Инкубация посевов Все посевы следует инкубировать при 35–37°С до тех пор, пока не появится рост колоний; если в течение 8 недель роста бактерий нет, пробирки выбрасывают. После посева флаконы желательно инкубировать так, чтобы поверхность скошенного агара оставалась горизонтальной – по крайней мере в течение первых суток после посева. Затем, если необходимо освободить место в термостате, флаконы можно сложить так, чтобы поверхность питательной среды была направлена вниз. Крышки флаконов должны быть плотно закрыты, чтобы уменьшить испарение жидкости и высыхание питательной среды. При использовании сред Миддлбрука посевы для получения роста микобактерий туберкулеза необходимо инкубировать в атмосфере, содержащей 90% воздуха и 10% СО2. При использовании яичной среды рост микобактерий происходит и в отсутствие СО2, однако наличие повышенной концентрации углекислого газа стимулирует более ранний и более интенсивный рост микобактерий. Приобретать для этих целей специальный углекислотный инкубатор нет необходимости – можно использовать металлический или пластмассовый контейнер с двумя патрубками, через которые ежедневно производится «продувка» этого контейнера газовой смесью, состоящей из 90% воздуха и 10% СО2. Альтернативный вариант – поместить чашки Петри в герметичный пластиковый мешок и наполнять его 3 раза в неделю газовой смесью с СО2. 55 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ 9 КУЛЬТУРАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ 9.1 График просмотра посевов Все посевы следует просмотреть через 72 часа, чтобы проконтролировать, полностью ли испарилась жидкость конденсата, плотно закрутить крышки для предотвращения высыхания питательной среды, убедиться в отсутствии роста сопутствующих бактерий. В дальнейшем посевы просматривают один раз в неделю, а если это по каким-либо причинам невозможно, то не менее трех раз: неделю после посева, чтобы проверить отсутствие быстрорастущих бакте•через рий, которые могут быть по ошибке приняты за M. tuberculosis; 3–4 недели, чтобы выявить рост культур M. tuberculosis или других медленно•через растущих микобактерий, которые могут быть как безвредными сапрофитами, так и потенциально патогенными микроорганизмами; через 8 недель после посева, чтобы выявить рост медленнорастущих микобактерий, включая культуры M. tuberculosis, прежде чем результаты культурального исследования будут признаны отрицательными. • Целесообразно на флаконах с посевами заранее написать даты контрольных исследований, а флаконы располагать в термостате в хронологическом порядке. Если при контрольном просмотре обнаружен рост контаминантов по всей поверхности питательной среды или если произошло разжижение или обесцвечивание питательной среды, необходимо такие флаконы простерилизовать и выбросить. Некоторые контаминанты из веществ, входящих в состав питательной среды, образуют кислоту, которая снижает рН среды и освобождает часть связанного яичным белком красителя (на это указывает появление темно-зеленого окрашивания среды). Туберкулезные микобактерии в этих условиях расти не могут, поэтому такие флаконы следует выбросить. Посевы с частично контаминированной поверхностью питательной среды следует инкубировать в течение 8 недель. При позднем появлении контаминантов не исключается возможность роста M. tuberculosis, поэтому в подобных случаях рекомендуется приготовить препараты с поверхности питательной среды. Если при бактериоскопии будут обнаружены кислотоустойчивые микобактерии, необходимо произвести повторную деконтаминацию и вновь провести посев на питательную среду. 9.2 Учет результатов культурального исследования Типичные колонии M. tuberculosis – шероховатые, сморщенные, восковидные, непигментированные (кремового цвета) и растут медленно, появляясь только через 3 недели после посева. Если колонии не совсем типичны или учет результатов производят недостаточно опытные лабораторные работники, рекомендуется подтвердить кислотоустойчивость выделенных микобактерий с помощью окраски по Цилю-Нильсену. Для этого бактериологической петлей берут небольшой кусочек колонии и аккуратно гомогенизируют на предметном стекле в капле стерильного изотонического раствора хлорида натрия. В это время следует обратить внимание на то, легко ли готовится суспензия бактерий: микобактерии туберкулеатуберкулеза в отличие от некоторых других микобактерий эмульгируются в жидкости с большим трудом и не образуют гомо- 57 КУЛЬТУРАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ генной суспензии. Приготовленный препарат оставляют до высыхания, фиксируют на пламени и окрашивают по Цилю-Нильсену. Для предварительной идентификации микобактерий туберкулеза используют следующие признаки этих микроорганизмов: туберкулеза не дают роста первичных колоний ранее, чем через •микобактерии неделю после посева, а обычно колонии становятся видны невооруженным глазом только через 3–4 недели; колонии имеют цвет буйволовой кожи (никогда не бывают желтыми) и шероховатую поверхность, несколько напоминая хлебные крошки или цветную капусту; они с трудом растираются в капле изотонического раствора хлорида натрия, образуя зернистую суспензию; при бактериоскопии микобактерии нередко располагаются в виде змеевидных жгутов различной длины или линейных структур. Отдельные клетки имеют в длину от 3 до 4 мкм. • • • 9.3 Дифференциальная диагностика M. tuberculosis Хотя предварительная идентификация микобактерий туберкулеза может быть произведена опытным лабораторным работником на основании описанных выше характерных признаков, все-таки лучше использовать подтверждающие тесты. К сожалению, до сих пор не существует какого-либо одного теста, с помощью которого можно было бы точно дифференцировать M. tuberculosis от других микобактерий. Тем не менее результаты описанных далее тестов в сочетании с культуральными признаками позволяют провести окончательную идентификацию более 95% штаммов M. tuberculosis. 1 Ниациновый тест У всех микобактерий ниацин (никотиновая кислота) играет существенную роль в окислительно-восстановительных реакциях, которые имеют место в процессе метаболизма. Хотя все микобактерии обладают способностью продуцировать ниацин, результаты сравнительных исследований показали, что вследствие блокирования метаболизма M. tuberculosis накапливают ниацин в большом количестве, поэтому его определение может быть полезным для окончательной идентификации. Штаммы M. tuberculosis, не продуцирующие ниацин, встречаются очень редко; в то же время другие виды микобактерий практически никогда не образуют ниацин. Ниациновый тест дает наиболее убедительные результаты в тех случаях, когда для его постановки используют колонии, выросшие на яичной среде, поэтому и рекомендуется применять среду Левенштейна-Йенсена. Возраст культур должен быть не менее 3–4 недель, причем для постановки ниацинового теста необходимо иметь не менее 50 колоний. Так как растущие колонии M. tuberculosis выделяют ниацин в питательную среду, посевы со сливающимися колониями могут давать ложноотрицательные результаты, так как экстрагирующая жидкость в этом случае не может контактировать с питательной средой. При наличии сливающихся колоний необходимо обеспечить контакт жидкости с питательной средой – для этого можно соскрести колонии с поверхности среды или проткнуть бактериальную массу пастеровской пипеткой в нескольких местах. Большое значение имеет правильная аэрация культур, которые предполагается ис- 58 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ пользовать для постановки ниацинового теста. На этих флаконах крышки не должны быть плотно завинчены в течение всего периода инкубации; для этих целей лучше использовать специальные колпачки типа «Cap-o-Test». 9.3.1 Ниациновый тест с химическими реактивами Контроли При постановке теста используют контроль реагентов – для этого тестируют экстракт с поверхности чистой (не засеянной) питательной среды (отрицательный контроль) и экстракт из культуры референс-штамма M. tuberculosis H37Rv в качестве положительного контроля. •Реагенты Раствор анилина, 4% • Анилин обладает онкогенной активностью и способностью проникать через кожу. Работайте в перчатках и будьте максимально осторожны. • Анилин может менять окраску при воздействии света и воздуха, поэтому по мере необходимости используйте свежеприготовленные растворы. Свежий бесцветный раствор анилина Этиловый спирт, 95% 4 мл 96 мл Смешайте анилин со спиртом во флаконе из темного стекла и храните в темноте в холодильнике. Не используйте раствор, если он приобрел желтую окраску. Раствор бромида цианогена, 10% • Бромид цианогена обладает сильным слезоточивым действием и токсичен при вдыхании, поэтому готовить раствор этого вещества нужно в хорошо вентилируемом вытяжном шкафу, а постановку теста производить в настольном ламинарном шкафу. • Бромид цианогена обладает онкогенной активностью и способностью проникать через кожу. Работайте в перчатках и будьте максимально осторожны. • В кислой среде бромид цианогена гидролизуется с образованием гидроциановой кислоты, которая обладает очень высокой токсичностью. Все отработанные пробирки сбрасывайте в щелочной дезинфицирующий раствор (щелочную реакцию получают, добавляя гидроокись натрия. Кристаллы бромида цианогена 5г Дистиллированная вода 50 мл • Внесите кристаллы бромида цианогена в колбу с дистиллированной водой. • Закройте горло колбы фольгой и оставьте в вытяжном шкафу при комнатной температуре. В этих условиях кристаллы растворятся примерно через 24 часа. • Не подогревайте раствор на пламени горелки. • Перелейте раствор в бутыль из темного стекла и поставьте на хранение в холодильник. 59 КУЛЬТУРАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ • Если в процессе хранения раствора в нем образовался преципитат, подогрейте раствор до комнатной температуры. • Готовьте раствор в небольшом количестве, так как бромид цианогена является легколетучим веществом и, кроме того, теряет свою активность в процессе хранения. Применение растворов с утраченной активностью дает ложноотрицательные результаты. Чтобы избежать излишнего контакта с бромидом цианогена в процессе взвешивания вещества, выполняйте эту процедуру следующим образом: • запишите вес пустой колбы вместе с крышкой из алюминиевой фольги; • перенесите примерное количество кристаллов бромида цианогена (например, примерно 1/10 содержимого стограммового флакона, если необходимо приготовить 10%-й раствор) в колбу, закройте фольгой и взвесьте; • подсчитайте разницу в весе колбы с кристаллами и пустой колбы, чтобы определить точный вес кристаллов бромида цианогена, находящихся в колбе; • добавьте в колбу дистиллированную воду в таком количестве, чтобы получить 10%-й раствор. В некоторых странах используют 4%-й водный раствор цианида калия, содержащий бром, который готовят следующим образом: • бромовая вода обладает высокой агрессивностью и летучестью, поэтому ее необходимо хранить отдельно от других химических реактивов; • цианид калия очень ядовит, поэтому работать с ним нужно в вытяжном шкафу; • вскройте ампулу брома (50 мл) и перенесите ее содержимое в колбу из темного стекла емкостью 1 л (со стеклянной пробкой), в которую предварительно налейте 150 мл холодной дистиллированной воды; • приготовьте 4%-й водный раствор цианида калия, растворив 4 г KCN в 100 мл дистиллированной воды (проверьте, чтобы цианид калия был чистым и не гидратированным); • наберите в пипетку 1 мл жидкости из слоя брома, находящегося в более глубокой части бромовой воды, и перенесите на дно конической колбы емкостью 250 мл. Быстро добавьте по каплям раствор цианида калия (при непрерывном перемешивании раствора вращательными движениями) до полного обесцвечивания раствора. •Методика Порядок постановки теста показан на диаграмме 2. •Результаты и их интерпретация • Отрицательный – нет окрашивания жидкости. • Положительный – в течение 5 минут появляется желтое окрашивание в виде кольца на границе соприкосновения двух реагентов, а если пробирку встряхнуть – в виде столбика жидкости желтого цвета. 60 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ Диаграмма 2. Ниациновый тест для идентификации M. tuberculosis МЕТОДИКА ➜ Добавьте во флакон с культурой микобактерий 1 мл стерильной дистиллированной воды. При наличии сливного роста колоний проткните биомассу бактерий пастеровской пипеткой в нескольких местах, чтобы обеспечить контакт воды с питательной средой Положите пробирку горизонтально, чтобы жидкость покрыла всю поверхность питательной среды ➜ Оставьте на 30 минут для экстракции ниацина. Если колоний мало, время экстракции может быть увеличено ➜ Поставьте пробирки в вертикальное положение на 5 минут, чтобы вода полностью стекла на дно ➜ Перенесите 0,5 мл экстракта в чистую пробирку с завинчивающейся крышкой ➜ Добавьте последовательно 0,5 мл 4%-го раствора анилина и 0,5 мл 10%-го раствора бромида цианогена ➜ Закройте пробирку и контролируйте появление желтого окрашивания (обозначает положительный результат теста) в течение 5 минут. Желтое окрашивание появляется в виде кольца на границе соприкосновения двух реагентов, а если пробирку встряхнуть – в виде столбика жидкости желтого цвета ➜ Добавьте 2–3 мл 4%-го раствора NaOH в каждую пробирку и затем выбросьте пробирки в контейнер для отработанной посуды 61 КУЛЬТУРАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ Ниациновый тест с бумажными полосками Бумажные полоски для ниацинового теста выпускаются централизованно для коммерческой реализации. Результаты, получаемые с помощью полосок, сопоставимы с результатами классического ниацинового теста. Применение полосок исключает необходимость готовить и хранить растворы нестойких и токсичных субстратов, которые используются для демонстрации образования ниацина. Широкому применению полосок для постановки ниацинового теста препятствует их высокая стоимость. •Методика Порядок постановки теста показан на диаграмме 3. •Результаты и их интерпретация • Отрицательный – нет окрашивания жидкости. • Положительный – желтое окрашивание на дне пробирки. Если желтое окрашивание появилось на самой полоске, выбросьте эту пробирку (в этом случае появление желтого окрашивания может быть обусловлено окислением химических веществ, особенно в верхней части полоски). •Предосторожности • всегда проверяйте, не истек ли срок годности полосок; • для предупреждения ложноотрицательных результатов быстро закройте крышку сразу же после внесения в пробирку полоски. Если пробирка не будет закрыта герметично, образующийся на поверхности полоски газ может поступать в атмосферный воздух. Диаграмма 3. Ниациновый тест с полосками для идентификации M. tuberculosis МЕТОДИКА ➜ Добавьте во флакон с культурой микобактерий стерильный изотонический раствор хлорида натрия. При наличии сливного роста колоний проткните биомассу бактерий пастеровской пипеткой в нескольких местах, чтобы обеспечить контакт воды с питательной средой Положите пробирку горизонтально, чтобы жидкость покрыла всю поверхность питательной среды ➜ Оставьте на 30 минут для экстракции ниацина. Время экстракции может быть увеличено, если колоний слишком мало ➜ Поставьте пробирки в вертикальное положение на 5 минут, чтобы вода полностью стекла на дно. Перенесите 0,5 мл экстракта в чистую пробирку с завинчивающейся крышкой 62 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ ➜ Поместите полоску в пробирку так, чтобы ее идентификационный конец был сверху (стрелка на полоске может показывать, каким концом следует вводить ее в пробирку) и немедленно герметично закройте пробирку. Не допускайте попадания жидкости на среднюю часть полоски ➜ Оставьте при комнатной температуре на 15–20 минут. Периодически слегка встряхивайте пробирку, но не переворачивайте ее ➜ Контролируйте (лучше на белом фоне) появление желтого окрашивания на дне пробирки (желтый цвет означает положительный результат теста). Если желтое окрашивание появилось на самой полоске, выбросьте эту пробирку (в этом случае появление желтого окрашивания может быть обусловлено окислением химических веществ, особенно в верхней части полоски) ➜ Нейтрализуйте полоски 10%-м раствором NaOH или выбросьте их в контейнер со щелочным дезинфектантом 2 Нитратредуктазный тест Из всех микобактерий нитратредуктазная активность наиболее выражена у M. tuberculosis. Это позволяет использовать данный тест в сочетании с ниациновым тестом для дифференциальной диагностики M. tuberculosis и микобактерий других видов. Для определения способности микобактерий восстанавливать нитраты используют четырехнедельные культуры, которые дают обильный рост на яичной среде Левенштейна-Йенсена. Классический метод с использованием жидких реактивов •Реактивы Субстрат нитрата натрия в буферном растворе Приготовьте 0,01 М раствор нитрата натрия в 0,022 М фосфатном буферном растворе (рН 7,0) следующим образом: КН2РО4 3,02 г Дистиллированная вода 1000 мл Растворите фосфат калия в дистиллированной воде, чтобы получить 0,022 М раствор . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Раствор 1 63 КУЛЬТУРАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ Na2НРО4 3,16 г Дистиллированная вода 1000 мл Растворите фосфат натрия в дистиллированной воде, чтобы получить 0,022 М раствор . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Раствор 2 Добавьте 611 мл раствора 2 к 389 мл раствора 1 и хорошо перемешайте; проверьте, чтобы рН раствора составляла 7,0 . . . . . . . . . . . . .Раствор 3 Полный забуференный раствор субстрата нитрата натрия 0,85 г NaNО3 Раствор 3 1000 мл Растворите нитрат натрия в буферном растворе и разлейте в емкости по 100 мл. Стерилизуйте автоклавированием при 121°С в течение 15 минут. При необходимости этот раствор субстрата можно переносить по 2 мл в пробирки с завинчивающимися крышками. Раствор соляной кислоты Концентрированная соляная кислота 10 мл Дистиллированная вода 10 мл Медленно влейте концентрированную соляную кислоту в дистиллированную воду (никогда не вливайте воду в кислоту), чтобы получить разведение 1:1. Храните полученную смесь в бутыли из темного стекла в холодильнике в темноте. Раствор сульфаниламида Сульфаниламид 0,2 г Дистиллированная вода 100 мл Растворите сульфаниламид в дистиллированной воде и храните полученный раствор в бутыли из темного стекла в холодильнике в темноте. Раствор N-нафтилэтилендиамина, 0,1%-й N-нафтилэтилендиамин 0,1 г Дистиллированная вода 100 мл Растворите нафтилэтилендиамин в дистиллированной воде и храните этот раствор в бутыли из темного стекла в холодильнике в темноте. • Контроли Для контроля реактивов необходимо поставить тест с экстрактом из незасеянной пробирки со средой (отрицательный контроль) и с использованием экстракта из референс-штамма M. tuberculosis H37Rv (положительный контроль). •Методика См. диаграмму 4. 64 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ Диаграмма 4. Классический метод постановки теста восстановления нитрата для идентификации M. tuberculosis МЕТОДИКА Внесите 0,2 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия в пробирку с завинчивающейся крышкой ➜ С помощью бактериологической петли или лопатки суспендируйте в этом растворе четырехнедельную культуру микобактерий (используйте две петли/лопатки биомассы бактерий) ➜ Добавьте 2 мл субстрата NaNO3 ➜ Хорошо встряхните и оставьте на 3 часа в водяной бане при температуре 37°С ➜ 1 капля соляной кислоты 2 капли сульфаниламида 2 капли N-нафтилэтилендиамина ➜ Добавьте в следующем порядке: 1 каплю разведенной соляной кислоты (хорошо встряхните пробирку); 2 капли 0,2%-го раствора сульфаниламида; 2 капли 0,1%-го раствора N-нафтилэтилендиамина ➜ Немедленно проконтролируйте появление розового или красного окрашивания, сравнив его интенсивность с цветовым стандартом 65 КУЛЬТУРАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ •Результаты и их интерпретация • Отрицательный результат: окрашивания нет. Если раствор остается бесцветным, это означает, что результат теста отрицательный или что процесс восстановления прошел дальше. Добавьте в пробирку немного порошка цинка (небольшой объем порошка цинка перенесите из флакона на кончике слегка увлажненного аппликатора). а) Если в растворе остался нитрат, цинк катализирует реакцию и появится красное окрашивание, что свидетельствует об истинно отрицательном результате теста. б) Если после добавления порошка цинка красного окрашивания раствора не произошло, это означает, что результат теста положителен, но процесс восстановления прошел стадию нитрита. Повторите тест, чтобы подтвердить его результат. • Положительный результат: красное окрашивание (оттенки от розового до темнокрасного): бледно-розовый = +/розовый = 1+ темно-розовый = 2+ красный = 3+ темно-красный = 4+ пурпурно-красный = 5+ Результат считают положительным только в тех случаях, когда интенсивность окраски составляет от 3+ до 5+. Модифицированный метод с использованием кристаллического реагента Сухой кристаллический реагент легко приготовить, его можно хранить минимум 6 месяцев. Еще одно преимущество этой модификации – для выявления способности бактерий восстанавливать нитраты достаточно добавить только один реагент, тогда как при классической постановке теста необходимо использовать три жидких реактива. •Реактивы Субстрат нитрата натрия в буферном растворе Приготовьте так, как указано выше при описании классического метода определения нитратредуктазы (стр. 63). Кристаллический реагент Сульфаниловая кислота 1 часть N-(1-нафтил)-этилендиаминдигидрохлорид 1 часть L(+)-винная кислота 10 частей Поместите все реактивы во флакон из темного стекла и хорошо перемешайте, интенсивно встряхнув флакон не менее 30 раз (винная кислота может иметь вид круп- 66 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ ных кристаллов, поэтому для получения гомогенной смеси может потребоваться предварительно растереть эти кристаллы в порошок в фарфоровой ступке). Сухая смесь реактивов имеет вид гомогенного порошка. Храните эту смесь («кристаллический реагент») во флаконе из темного стекла при комнатной температуре. •Контроли Для контроля реагента необходимо использовать экстракт из незасеянной пробирки (отрицательный контроль) и экстракт из референс-штамма M. tuberculosis H37Rv (положительный контроль). •Методика См. диаграмму 5. •Результаты и их интерпретация • Отрицательный результат: окрашивания нет. Если раствор остается бесцветным, это означает, что результат теста отрицательный или что процесс восстановления прошел дальше. Добавьте в пробирку немного порошка цинка (небольшой объем порошка цинка перенесите из флакона на кончике слегка увлажненного аппликатора). а) Если в растворе остался нитрат, цинк катализирует реакцию и появится красное окрашивание, что свидетельствует об истинно отрицательном результате теста; б) Если после добавления порошка цинка красного окрашивания раствора не произошло, это означает, что результат теста положителен, но процесс восстановления прошел стадию нитрита. Повторите тест, чтобы подтвердить его результат. • Положительный результат: красное окрашивание (оттенки от розового до темнокрасного). бледно-розовый розовый темно-розовый красный темно-красный пурпурно-красный = = = = = = +/1+ 2+ 3+ 4+ 5+ Результат считают положительным только в тех случаях, когда интенсивность окраски составляет от 3+ до 5+. 67 КУЛЬТУРАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ Диаграмма 5. Тест восстановления нитрата для идентификации M. tuberculosis Метод с использованием кристаллического реагента МЕТОДИКА Внесите 0,2 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия в пробирку с завинчивающейся крышкой ➜ С помощью бактериологической петли или лопатки суспендируйте в этом растворе четырехнедельную культуру микобактерий (используйте две петли/лопатки биомассы бактерий) ➜ Добавьте 2 мл субстрата NaNO3 ➜ Хорошо встряхните и оставьте на 3 часа в водяной бане при температуре 37°С ➜ Добавьте в пробирку небольшое количество кристаллического реагента (на кончике лопаточки). Количество реагента не имеет особого значения ➜ Немедленно проконтролируйте появление розового или красного окрашивания, сравнив его интенсивность с цветовым стандартом Модифицированный метод с использованием бумажных полосок В настоящее время для определения способности бактерий восстанавливать нитраты можно использовать коммерческие бумажные полоски. При использовании данной модификации нитратредуктазного теста надежные результаты получаются в тех случаях, когда микобактерии интенсивно редуцируют нитраты (например, M. tuberculosis). Поэтому при идентификации микобактерий туберкулеза этот метод дает вполне приемлемые результаты и позволяет сократить трудозатраты, хотя стоимость бумажных полосок значительно выше. 68 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ •Методика См. диаграмму 6. •Результаты и их интерпретация • Отрицательный – окрашивания нет. • Положительный – верхняя часть бумажной полоски становится красной (оттенки от розового до темно-красного). •Предосторожности • всегда проверяйте, не истек ли срок годности коммерческих тест-полосок; • так как полоски чувствительны к солнечному свету, а также к повышенной температуре и влажности, их следует хранить в оригинальной упаковке при температуре от 2°С до 8°С, в плотно закрытом контейнере; • выбрасывайте полоски, если произошло их обесцвечивание, так как это свидетельствует о снижении активности реагента; • не доверяйте результатам теста с бумажными полосками, если в положительном контроле получены слабоположительные или отрицательные результаты. Диаграмма 6. Тест восстановления нитрата для идентификации M. tuberculosis Метод с использованием бумажных полосок МЕТОДИКА Внесите 1 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия в пробирку с завинчивающейся крышкой ➜ С помощью бактериологической петли или лопатки суспендируйте в этом растворе четырехнедельную культуру микобактерий (используйте две петли/лопатки биомассы бактерий) ➜ С помощью стерильного пинцета аккуратно внесите в пробирку бумажную полоску для нитратредуктазного теста; при этом не допускайте увлажнения полоски каплями жидкости на стенках пробирки ➜ 69 КУЛЬТУРАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ Тщательно завинтите крышку и оставьте пробирку в вертикальном положении на 2 часа при температуре 37°С ➜ После 1 часа инкубации осторожно встряхните пробирку, не наклоняя и не переворачивая ее ➜ После 2 часов инкубации наклоните пробирку 6 раз, чтобы полностью смочить бумажную полоску ➜ Оставьте пробирку на 10 минут в наклонном положении, чтобы жидкость покрывала всю полоску ➜ Появление красного окрашивания в верхней части полоски означает положительный результат теста 9.4 Стандарты для нитратредуктазного теста Чтобы обеспечить унификацию положительных результатов теста по выявлению способности бактерий восстанавливать нитраты, рекомендуется использовать заранее приготовленную серию стандартов, соответствующих различной интенсивности нитратредуктазной активности – от «+/-» до «5+». Эти стандарты можно хранить неопределенно долго и использовать при каждой постановке нитратредуктазного теста. •Реагенты Растворы 1. 0,067 М раствор фосфата натрия двузамещенного (9,47 г безводного Na2HPO4 на 1000 мл воды) 2. 0,067 М раствор фосфата калия однозамещенного (9,07 г КН2PO4 на 1000 мл воды) 3. 0,067 М раствор фосфата натрия (25,47 г Na3PO4 С12Н2О на 1000 мл воды) 4. 1%-го раствор фенолфталеина (1 г в 100 мл 95% этилового спирта) 5. 1%-го раствор бромтимолового синего (1 г в 100 мл 95%-го этилового спирта) 6. 0,01%-го раствор бромтимолового синего: для приготовления внесите 1,0 мл 1%-го раствора бромтимолового синего в 100 мл дистиллированной воды. Рабочий буферный раствор Смешайте 35 мл раствора 1, 5 мл раствора 2 и 100 мл раствора 3. 70 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ •Методика • Поставьте в штатив 8 чистых пробирок (пробирки № 1–8). Используйте пробирки такого же размера, как и для постановки нитратредуктазного теста. • Внесите 2 мл рабочего буферного раствора в 7 пробирок (с № 2 до № 8) • К 10 мл рабочего буферного раствора добавьте 0,1 мл раствора 4 и 0,2 мл раствора 6 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .Раствор 7 • Внесите 2 мл раствора 7 в пробирку № 1. Это – цветовой стандарт, соответствующий максимально интенсивной реакции («5+»). • В пробирку № 2 внесите 2 мл раствора 7. Хорошо перемешайте и перенесите 2 мл в следующую пробирку (№ 3). Продолжите серию двукратных разведений вплоть до пробирки № 8, из которой вылейте 2 мл смеси. • В результате будут получены следующие цветовые стандарты: пробирка № 1 пробирка № 2 пробирка № 3 пробирка № 5 пробирка № 6 пробирка № 8 = = = = = = 5+ 4+ 3+ 2+ 1+ +/- • Автоклавируйте пробирки, закройте их герметично и храните при 5°С. 3 Каталазный тест Каталаза – это внутриклеточный растворимый фермент, который способен расщеплять перекись водорода на воду и кислород, т. е. обеспечивает следующую химическую реакцию: 2Н2О2 ☛ 2Н2О + О2. При этом в реагирующей смеси образуются пузырьки кислорода, что указывает на наличие каталазной активности. Почти все микобактерии обладают каталазной активностью, за исключением некоторых мутантных штаммов M. tuberculosis, резистентных к изониазиду, и штаммов M. bovis. У микобактерий может быть фермент каталаза нескольких типов, которые отличаются по термостабильности. Для демонстрации количественных различий в каталазной активности микобактерий может быть использован один из следующих тестов: при комнатной температуре или так называемый капельный тест (результаты •тест указывают на наличие каталазы); •полуколичественный тест (указывает на уровень каталазной активности); •тест при 68°С и рН 7,0 (указывает на термостабильность каталазы). Чувствительные к противотуберкулезным препаратам штаммы M. tuberculosis образуют каталазу, на что указывают результаты капельного метода, при постановке полуколичественного теста столбик пузырьков газа не превышает 45 мм, а после прогревания бактерий при 68°С в течение 20 минут каталазная активность утрачивается. Для постановки этих тестов следует использовать двухнедельные культуры, выращенные на столбике среды Левенштейна-Йенсена, для чего пробирки с этой средой помещают в аппарат для свертывания питательных сред в вертикальном положении. Пробирки должны быть закрыты колпачками, которые обеспечивают газообмен (например, можно использовать колпачки типа «Cap-o-Test»). Пробирки с не полностью закрытыми колпачками следует инкубировать в течение 14 дней в термостате, обеспечивающем высокую влажность воздуха. 71 КУЛЬТУРАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ •Реактивы 0,067 М фосфатный буферный раствор 9,47 г Na2НРО4 Дистиллированная вода 1000 мл Растворите двузамещенный фосфат натрия в дистиллированной воде, чтобы получить 0,067 М раствор . . . . . . . . . . . . .Раствор 1 9,07 г КН2РО4 Дистиллированная вода 1000 мл Растворите однозамещенный фосфат калия в дистиллированной воде, чтобы получить 0,067 М раствор . . . . . . . . . . . . .Раствор 2 Перекись водорода, 30%-я 30%-й раствор перекиси водорода (Н2О2), которую фирма «Мерк» выпускает под названием «Супероксоль», хранят в холодильнике. • Проверьте, чтобы при постановке теста был использован 30%-й раствор перекиси водорода, а не 3%-й раствор, который обычно получают из аптек. • При работе с 30%-м раствором перекиси водорода используйте резиновые или пластиковые перчатки и защитный щиток для глаз. Твин 80, 10%-й Твин 80 10 мл Дистиллированная вода 90 мл Смешайте твин 80 с дистиллированной водой и автоклавируйте при 121°С в течение 10 минут. В процессе автоклавирования твин может образовать осадок, который можно растворить при покачивании флакона сразу же после автоклавирования или в процессе охлаждения. Храните готовый раствор в холодильнике. Полный каталазный реагент (смесь твина с перекисью водорода) Непосредственно перед постановкой теста смешайте равные объемы 10%-го раствора твина 80 и 30%-го раствора перекиси водорода. Для каждого штамма потребуется 0,5 мл готового реагента. •Контроли • Капельный метод В качестве отрицательного контроля используйте пробирку с питательной средой без культуры микобактеерий, а в качестве положительного контроля – столбик среды Левенштейна-Йенсена, на котором выращен референс-штамм M. tuberculosis H37Rv. • Полуколичественный метод и тест при 68°С В качестве отрицательного контроля используйте пробирку с питательной средой без культуры микобактерий, а в качестве положительного контроля – столбик среды Левенштейна-Йенсена, на котором выращен референс-штамм M. terrae. 72 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ •Методика • Капельный метод Проверьте двухнедельную культуру на скошенной среде Левенштейна-Йенсена, чтобы убедиться в наличии роста микобактерий. Добавьте в пробирку, где имеется рост микобактерий, 1–2 капли свежеприготовленной смеси твина с перекисью водорода. Наблюдайте в течение 5 минут, имеется ли образование пузырьков газа. Результаты и их интерпретация Отрицательный Положительный (медленный) Положительный (быстрый) – пузырьки газа не образуются – небольшое количество медленно образующихся пузырьков газа Положительный результат – немедленное образование большого количества пузырьков газа • Полуколичественный метод Проверьте двухнедельную культуру на скошенной среде Левенштейна-Йенсена, чтобы убедиться в наличии роста микобактерий. Добавьте в пробирку, где имеется рост микобактерий, 1 мл свежеприготовленной смеси твина с перекисью водорода, плотно закройте пробирку и оставьте на 5 минут при комнатной температуре. В пробирке образуется столбик пены. Измерьте высоту этого столбика пены (например, от уровня жидкости в пробирке до верхнего края пены). Результаты и их интерпретация Каталазная активность слабая или отсутствует – высота столбика пены менее 31 мм Неопределенный результат – высота столбика пены от 31 до 45 мм Высокая каталазная активность – высота столбика пены более 45 мм • Тест при 68°С и рН 7,0 См. диаграмму 7. Результаты и их интерпретация • Положительный – пузырьки газа образуются • Отрицательный – пузырьков газа нет В редких случаях может наблюдаться небольшое количество пузырьков, поднимающихся от осадка бактериальных клеток; при этом пена в пробирке не образуется. В таких случаях результаты каталазного теста также считают положительными. 73 КУЛЬТУРАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ И ИДЕНТИФИКАЦИЯ Диаграмма 7. Тест для выявления термолабильной каталазы (68°С, рН 7,0) при идентификации M. tuberculosis МЕТОДИКА С помощью стерильной пипетки внесите с соблюдением правил асептики 0,5 мл 0,067 М фосфатного буферного раствора (рН 7,0) в пробирку размерами 16х125 мм с завинчивающейся крышкой ➜ С помощью стерильной бактериологической петли суспендируйте в этом растворе исследуемую культуру микобактерий (используйте несколько петель биомассы) ➜ Поставьте пробирки с бактериальными суспензиями в предварительно нагретую водяную баню на 2 часа при температуре 68°С. Температура и продолжительность инкубации имеют чрезвычайно важное значение ➜ Достаньте пробирки из водяной бани и оставьте при комнатной температуре до полного остывания ➜ Внесите в каждую пробирку 0,5 мл свежеприготовленной смеси твина с перекисью водорода и плотно закройте крышки ➜ Наблюдайте за образованием пузырьков, появляющихся на поверхности жидкости. Не встряхивайте пробирку, так как при этом твин 80 может спонтанно образовывать пузырьки, что станет причиной ложноположительного результата ➜ Пробирки с отрицательными результатами не выбрасывайте раньше чем через 20 минут 4 Рост на среде, содержащей р-нитробензойную кислоту (PNB-тест) В лабораториях, где запасы оборудования и реагентов не позволяют производить ниациновый и нитратредуктазный тесты, для идентификации микобактерий туберкулеза может быть использована комбинация одного или нескольких каталазных тестов, описанных выше, и определения способности к росту при 25°С на среде Левенштейна-Йенсена, а также и определения способности к росту при 37°С на среде Левенштейна-Йенсена, содержащей р-нитробензойную кислоту (PNB-тест). В условиях тропических стран могут возникнуть сложности с инкубацией посевов при 25°С. Для решения проблемы можно использовать охлаждаемый термостат, а также водяную баню или холодную комнату. 74 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ •Методика • Произведите посев в две пробирки со скошенной средой Левенштейна-Йенсена с глицерином и в одну пробирку со средой Левенштейна-Йенсена, содержащей рнитробензойную кислоту в концентрации 500 мг/л. • Инкубируйте одну пробирку со средой Левенштейна-Йенсена и одну пробирку со средой Левенштейна-Йенсена, содержащей р-нитробензойную кислоту, при 37°С в термостате, имеющем внутреннее освещение, и исследуйте эти пробирки на 3, 7, 14 и 21-й день. Когда появится рост на среде Левенштейна-Йенсена, обратите внимание на наличие пигмента. Если термостат с внутренним освещением в лаборатории отсутствует, то после появления роста колоний, видимых невооруженным глазом, достаньте пробирки из термостата, приоткройте крышки, чтобы внутрь мог поступать кислород, и оставьте их на 1 час на дневном свету (но чтобы на них не падали прямые солнечные лучи) или при искусственном освещении на расстоянии 1 м от настольной лампы. Затем вновь поместите пробирки в термостат и проверьте, появился ли пигмент. • Инкубируйте вторую пробирку со средой Левенштейна-Йенсена при 25°С и исследуйте ее на 3, 7, 14 и 21-й день. • Результаты и их интерпретация Рост культуры M. tuberculosis не может быть обнаружен при инкубации при 37°С на 3-й день, а при 25°С или на среде с р-нитробензойной кислотой микобактерии туберкулеза вообще не могут расти. Кроме того, микобактерии туберкулеза не продуцируют желтый или оранжевый пигмент в темноте или после инкубации на свету. РЕЗЮМЕ Идентификация M. Tuberculosis •микобактерии туберкулеза растут медленно •рост имеет место только при 35–37°С •пигментообразование отсутствует •ниациновый тест положителен •тест на восстановление нитратов положителен •каталазный тест при 68°С отрицателен среде Левенштейна-Йенсена, содержащей р-нитробензойную кислоту, рост •на отсутствует 75 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ 10 УЧЕТ И ПРЕДСТАВЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Лаборатории, осуществляющие диагностику туберкулеза, должны выработать единый подход к представлению результатов культуральных исследований. Если мы хотим с пользой применить эти данные, их следует представлять так, чтобы они действительно имели значение для специалистов разных категорий. Медицинские работники должны использовать эти результаты для диагностики туберкулеза и лечения больных, органы управления здравоохранением – для сбора статистических данных и эпидемиологической информации, а руководители противотуберкулезных программ – для доказательства того, что больные с бактериологически подтвержденным диагнозом туберкулеза получают соответствующую специфическую терапию. Культуральные методы, используемые при проведении лабораторных исследований на туберкулез, очень трудоемки и длительны – нередко для их завершения необходимо потратить недели и даже месяцы. Поэтому особое значение имеют сообщения о предварительных результатах. Рекомендуется представлять результаты исследований на туберкулез в следующие сроки: культуры оказались загрязнены сопутствующей микрофлорой, следует не•если медленно сообщить об этом лечащему врачу и запросить повторный материал для исследования; если были выделены культуры микобактерий, которые уже удалось идентифицировать как M. tuberculosis, необходимо немедленно сообщить об этом лечащему врачу; через четыре недели может быть направлено предварительное заключение об отрицательных результатах культурального исследования с информацией о том, что если позже будет получен положительный результат, то об этом врач будет извещен дополнительно; через восемь недель должно быть направлено окончательное заключение о результатах культурального исследования; в этом отчете должны быть приведены все результаты, о которых сообщалось ранее, чтобы извещения о предварительных результатах могли быть уничтожены, а в истории болезни хранилось только заключительное сообщение. Результаты культурального исследования должны быть представлены в виде не только качественной информации (например, «положительный» или «отрицательный» результат), но и количественной информации (например, с указанием числа выделенных колоний). Необходимо указывать среднее количество колоний, выделенных во всех флаконах или пробирках, в которые был произведен посев данного образца. При этом рекомендуется использовать следующую схему ответа: • • • 77 УЧЕТ И ПРЕДСТАВЛЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ЛАБОРАТОРНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Формулировка извещения Результаты исследования Роста микобактерий нет Отрицательный результат 1–19 колоний Результат положительный (число колоний) 20–100 колоний Результат положительный (1+) 100–200 колоний Результат положительный (2+) 200–500 колоний (почти сливающийся рост) Результат положительный (3+) > 500 колоний (сливающийся рост) Результат положительный (4+) Рост сопутствующей микрофлоры Контаминированный образец В странах с высокой распространенностью туберкулеза более 85% случаев заболеваний обусловлены M. tuberculosis, а микобактерии других видов редко являются возбудителями патологических процессов. Кроме того, используемые методы деконтаминации проб биологического материала предназначены для облегчения выделения именно M. tuberculosis и инактивации других, менее устойчивых видов микобактерий. Поэтому если при использовании описанных выше методов удается выделить культуры бактерий, скорее всего они окажутся микобактериями туберкулеза. О результатах культурального исследования рекомендуется сообщать следующим образом: «При проведении культурального исследования получен _________ рост микобактерий, имеющих характерные признаки M. tuberculosis». Образец представления результатов культурального исследования на туберкулез показан в приложении 4. Очевидно, что все технические детали каждого лабораторного исследования не могут быть приведены в этом сообщении, однако они должны быть описаны в методических рекомендациях, а все результаты должны быть вписаны в лабораторный журнал. Кроме того, в лаборатории следует оставлять копию извещения о результатах лабораторных исследований, направленного лечащему врачу. При учете результатов культурального исследования на этом извещении должна быть приведена следующая информация: •скорость роста (медленная / быстрая); •число выделенных колоний; •образование колониями пигмента (нет / есть и его цвет); •морфология колоний (шероховатые / гладкие / блестящие / плоские); •результаты дифференциальных тестов. Образец лабораторного журнала приведен в приложении 5. 78 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ 11 КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА (см. часть 1) Контроль качества при проведении культурального исследования на туберкулез – это система мероприятий, направленная на постоянное улучшение надежности и эффективности применения результатов бактериологических исследований для целей диагностики и мониторинга. Целью программ по контролю качества является улучшение эффективности и надежности работы лабораторий, производящих культуральные исследования. Компонентами программ по контролю качества являются: •контроль качества (см. часть 1); •улучшение качества (см. часть 1); •профессиональное тестирование (см. часть 1). В следующем разделе основное внимание будет сосредоточено на аспектах контроля качества работы лабораторий, производящих культуральные исследования. Вопросы улучшения качества и профессионального тестирования более подробно освещены в первой части данного руководства. Контроль качества культуральных исследований – это процесс эффективного и систематического внутреннего мониторинга всех производящихся манипуляций в лаборатории, осуществляющей культуральные исследования. Контроль качества должен гарантировать, что данные, представляемые лабораторией, являются точными, надежными и воспроизводимыми. Это достигается с помощью оценки (конечно, в пределах имеющихся возможностей) качества образцов; тщательности их деконтаминации; правильности выделения культур; качества реагентов, питательных сред и оборудования; а также с помощью анализа результатов культуральных исследований и документального подтверждения правильности использования культуральных методов. Контроль качества в лаборатории, осуществляющей культуральные исследования, должен проводиться на регулярной основе, чтобы гарантировать надежность и воспроизводимость получаемых лабораторных данных. Чтобы программа контроля качества имела ценность, система контроля качества должна быть практичной и реальной. Контроль качества – это обязанность всех лабораторных работников Контроль качества должен касаться: •организации работы лаборатории; •оборудования; •сбора и транспортировки проб; •обработки поступающих проб; •качества реагентов и питательных сред; •надежности используемых культуральных методов; •представления результатов. Ключевыми моментами для успешного осуществления контроля качества являются: •хорошо подготовленный, заинтересованный и ответственный персонал; •рациональное применение практических методик; 79 КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА •желание признать и исправить ошибки в работе; •эффективный обмен информацией. Меры по контролю качества, которые должны применяться во всех лабораториях, проводящих культуральные исследования на туберкулез, включают следующее: Организация работы лаборатории и администрирование двери в лабораторию должны быть всегда закрыты. Рабочие зоны, обо•Входные рудование и запасы расходных материалов должны быть организованы оптимальным образом в логической последовательности, чтобы обеспечивать эффективное выполнение работы. Рабочие зоны должны быть чистыми, пыль необходимо регулярно удалять. Рабочие столы следует хотя бы один раз в день обрабатывать дезинфицирующим раствором (например, 5%-м раствором фенола). Каждая процедура, проведенная в лаборатории, должна быть тщательно и правильно фиксирована в лабораторных журналах; эти записи должны быть легкодоступны. Любые изменения порядка работы или методик должны быть завизированы руководителем лаборатории с указанием даты. Все записи должны храниться в лаборатории в течение двух лет. В повседневной работе должны использоваться только те методики, которые описаны в наиболее авторитетных руководствах по бактериологии, монографиях и научных журналах. • • • Лабораторное оборудование оборудование должно полностью соответствовать техническим пас•лабораторное портам и спецификациям; иметь специальную папку, где хранятся все инструкции по работе на •необходимо всех видах оборудования и уходе за ним; каждого прибора должен иметься журнал обслуживания с указанием дат кон•утрольного осмотра и ремонта; должны проводиться регулярные осмотры и проверки всего оборудования, чтобы •гарантировать надежность и точность его работы. • Настольный ламинарный шкаф. Настольный ламинарный шкаф является одной из основных единиц лабораторного оборудования, так как он защищает сотрудников лаборатории и окружающую среду от контактов с возбудителями туберкулеза. Надежность работы ламинарного шкафа должна контролироваться в момент его установки, а в дальнейшем – ежегодно. Во время контрольных проверок ламинарного шкафа необходимо убедиться в том, что существует равновесие между объемами воздуха, поступающего в ламинарный шкаф и выходящего из него, а также в правильности направления потока воздуха внутри шкафа. Кроме того, следует периодически проверять надежность электрообеспечения ламинарного шкафа и его общее состояние. Ежедневные проверки ламинарного шкафа включают следующее: – проверьте, достаточно ли интенсивно поступает воздух в ламинарный шкаф: 75 линейных футов в минуту (22,86 см в секунду) для ламинарных шкафов 1-го класса и 75–100 линейных футов в минуту (от 22,86 до 30,48 см в секунду) для ламинарных шкафов 2-го класса; – проверьте с помощью специального прибора перепад давления в выходном воз- 80 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ духоводе и замените воздухофильтр, если прибор укажет на то, что интенсивность воздухообмена ниже оптимальной. Следующие проверки должны выполняться ежегодно для контроля качества работы ламинарных шкафов 1-го и 2-го классов. • Скорость воздушного потока и интенсивность воздухообмена Эту пробу выполняют, чтобы определить скорость воздушного потока, проходящего через рабочую зону ламинарного шкафа. • Проверка скорости поступающего воздуха Эту пробу выполняют, чтобы определить расчетную или фактическую скорость потока воздуха через входное окно ламинарного шкафа, чтобы проверить номинальный показатель скорости воздушного потока и рассчитать объем воздуха, выходящего из ламинарного шкафа. Для измерения скорости воздушного потока необходимо использовать электронный анемометр. Показатель скорости воздушного потока следует определить не менее чем в пяти рабочих точках и затем рассчитать средний показатель. Измеренные показатели не должны отличаться друг от друга более чем на 20 линейных футов в минуту (10 см в секунду). Если разница в скорости воздушных потоков будет больше, неизбежно возникновение турбулентности внутри ламинарного шкафа. В ламинарных шкафах 2-го класса скорость воздушного потока в нижней части рабочей зоны больше, чем в верхней ее части. Средний объем воздуха, поступающего в ламинарный шкаф, рассчитывают, определив скорость воздуха в вытяжной трубе и площадь ее сечения. На основании этих измерений определяют объем воздуха, проходящего через ламинарный шкаф за одну минуту. Если же эту величину разделить на площадь входного отверстия, можно установить среднюю скорость воздушного потока. Скорость перемещения воздуха в рабочей зоне следует измерять в 18 точках на высоте около 10 см над рабочей поверхностью. Различия в величинах не должны превышать 20%. • Пробы с дымом для определения направлений воздушного потока Эту пробу выполняют для того, чтобы определить пути перемещения воздуха по всему периметру рабочей зоны и для выявления «мертвых зон» и участков обратного тока воздуха. Для этих целей используют в качестве индикатора дым, который указывает на направления воздушных потоков, но не на их скорость. Рекомендуется использовать коммерческие тестеры для определения воздушных потоков. Они представляют собой небольшие стеклянные трубки, запаянные с обеих сторон. Оба конца трубки обламывают, используя прилагаемый к комплекту стеклорез, и на один конец надевают резиновую грушу. При сжатии груши из свободного конца стеклянной трубки начинает выходить белый дым. • Проба для проверки герметичности высокоэффективного фильтра Этот тест выполняют для того, чтобы определить целостность и правильность установки воздушных фильтров, а также герметичность гнезд для этих фильтров; проверку выполняют при работе ламинарного шкафа в нормальном режиме. Для доказательства отсутствия утечки воздуха, минуя фильтры, применяют специальный аэрозоль в виде производимых специальным генератором частичек диоктилфталата (ДОФ) или какого-либо другого аналогичного субстрата. Хотя установлено, что ДОФ является потенциальным канцерогеном, квалифицированные работники соответствующих служб умеют применять это вещество, не создавая опасности для пер- 81 КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА сонала лабораторий и других людей. Аэрозоль генерируется в воздушном потоке, направленном на принимающую сторону фильтра, а проходящие через фильтр или рядом с ним частицы регистрируются с помощью фотометра. Эта проба очень удобна для определения качества установки и функционирования воздушных фильтров. • Проба для проверки утечки воздуха из ламинарного шкафа Для проведения этой пробы используют избыточное давление, при наличии которого можно установить утечку воздуха из воздуховодов, швов и соединений. Пробу проводят еще до установки ламинарного шкафа на рабочий стол, затем после каждой его установки и перестановки, а также после каждого ремонта и после каждой замены воздушных фильтров. • Проверка безопасности электрооборудования Эту проверку выполняют, чтобы определить, нет ли где-либо замыкания электрической цепи, чреватого опасностью поражения лабораторного работника электрическим током, а также для проверки защиты от статического электричества. Кроме того, с помощью специального тестера проверяется полярность электрооборудования. Автоматический предохранитель должен срабатывать в каждом случае, когда сила тока превышает 5 миллиампер. • Определение интенсивности освещения Этот тест выполняют для определения интенсивности освещенности рабочих поверхностей ламинарного шкафа, с тем чтобы свести к минимуму утомляемость лабораторных работников, выполняющих манипуляции в ламинарном шкафу. • Проба на вибрацию Эту пробу выполняют для того, чтобы определить интенсивность вибрации, возникающей в процессе работы электродвигателей; знать это необходимо, чтобы иметь представление о качестве работы ламинарного шкафа, а также для предупреждения чрезмерной утомляемости персонала и для исключения возможности повреждения хрупкой посуды и образцов. • Проверка уровня шума Выполняется для определения интенсивности шума, возникающего в процессе функционирования ламинарного шкафа; данный параметр указывает на качество работы шкафа и может помочь в снижении утомляемости лабораторных работников. • Центрифуга. Проверяйте электрощитки и контакты один раз в 6 месяцев. • Термостат на 35–37°С. Регистрируйте температуру ежедневно, желательно – в утренние часы. Измеряйте температуру внутри термостата в нескольких местах, помещая термометр в сосуде с водой (например, в колбе). Проверяйте проникновение света в термостат. • Сухожаровой шкаф. Регистрируйте температуру ежедневно. Чистите после обработки каждой партии пробирок. • рН-метр. Вносите в полученные показатели поправки в соответствии с температурой. Указывайте даты изготовления буферных растворов и выбрасывайте растворы с истекшими сроками годности. Перед каждой серией измерений стандартизуйте показатели рН-метра с помощью буферных растворов, имеющих рН 4,0 и 7,0. • Водяная баня. Контролируйте температуру до начала работы и в процессе использования водяной бани. Мойте не реже одного раза в месяц. 82 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ • Холодильник на 2–8°С. Регистрируйте температуру ежедневно. Мойте холодильник внутри один раз в месяц. Проверяйте намерзание льда в морозильной камере не реже одного раза в 3 месяца и проводите размораживание в необходимых случаях. • Морозильные камеры. Регистрируйте температуру ежедневно. Мойте морозильные камеры один раз в полгода. • Стеклянная посуда. Сразу же выбрасывайте посуду с трещинами или острыми краями. Проверяйте, чтобы после мытья посуда не была загрязнена детергентами. Стерильную посуду нельзя хранить более трех недель. Исследуемый материал и бланки направления на исследование исследование только при наличии письменного направления на ана•Проводите лиз, подписанного соответствующим работником; никогда не начинайте исследование по устной заявке, до получения письменного направления. Добивайтесь того, чтобы бланки направлений на исследование пересылались отдельно от клинических проб. Если бланки направлений были контаминированы пробами биологического материала, их следует стерилизовать с помощью автоклавирования. Добивайтесь правильного заполнения бланков направлений на исследование и правильной маркировки всех проб, чтобы иметь возможность в дальнейшем идентифицировать соответствующего больного. Не принимайте в лабораторию пробы, которые не имеют маркировки. Оценивайте качество проб мокроты и обращайте внимание на то, не похожа ли поступившая мокрота на слюну. В таких случаях в ответе обязательно укажите: «Поступивший образец похож на слюну – интерпретируйте отрицательные результаты исследования с осторожностью» (чтобы облегчить процедуру внесения результатов исследования в бланки направлений, можно заказать и использовать специальные резиновые штампы). Сразу же выбрасывайте протекающие или поврежденные контейнеры для клинического материала, предварительно обезвредив их автоклавированием; после этого попросите прислать на исследование новый образец. Обязательно фиксируйте на бланке направления время поступления образца в лабораторию и любые задержки в доставке материала; особое значение это имеет для проб с отрицательными результатами исследования и для контаминированных образцов. • • • • • Реактивы и краски всех флаконах с реактивами должна быть указана дата поступления в лабора•На торию и дата первого вскрытия флакона. Если возникли сомнения в качестве реактива, необходимо сделать в лабораторном журнале соответствующую запись и немедленно удалить из лаборатории такой реактив. В лаборатории необходимо иметь запас реактивов, рассчитанный примерно на 6 месяцев работы; следует периодически обновлять этот запас, чтобы не пришлось использовать реактивы с истекшим сроком годности. 83 КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА Гомогенизация и деконтаминация проб одновременно несколько проб мокроты – в соответствии с пропу•Обрабатывайте скной способностью центрифуги. записывайте в журнале, какой процент проб оказался контаминиро•Регулярно ванным: показатель 2–5% может считаться удовлетворительным. Если число контаминированных проб менее 2%, это может свидетельствовать о чрезмерно жестком режиме деконтаминации проб (при этом погибает слишком большое количество микобактерий туберкулеза). Если пробы нередко поступают в лабораторию со значительной задержкой, число контаминированных образцов может превышать 5%. Если количество контаминированных проб постоянно превышает 5%, проверьте правильность предварительной обработки образцов, так как при неполном разжижении мокроты очень трудно добиться ее полной деконтаминации. Тщательно перемешивайте содержимое центрифужных пробирок, чтобы хорошо деконтаминировать материал на внутренних стенках пробирок. Питательные среды приготовления среды Левенштейна-Йенсена используйте только свежие яй•Для ца (менее 7 дней). контролируйте продолжительность коагуляции яичной среды и темпе•Тщательно ратурный режим. Не используйте обесцвеченные среды и среды, в которых после коагуляции появились пузырьки воздуха. Проверяйте каждую серию питательной среды на стерильность, инкубируя флаконы и пробирки со средой при 35-37°С в течение 24 часов. Храните все питательные среды в холодильнике в темноте; среды, не использованные в течение 4 недель, выбрасывайте. • • Методы культивирования перекрестного загрязнения культур, используя в работе отдельные пи•Избегайте петки и бактериологические петли для каждой пробы, а также строго соблюдая правила асептики. С настороженностью относитесь к положительным результатам культурального исследования нескольких проб мокроты подряд, а также к выделению небольшого числа колоний после того, как при исследовании предыдущей пробы был отмечен интенсивный рост микобактерий туберкулеза. • Биохимические тесты Готовьте реагенты в полном соответствии с рекомендованными методиками; контролируйте правильность постановки биохимических тестов по результатам положительных и отрицательных контролей. Вода Регулярно контролируйте качество дистиллированной и водопроводной воды для исключения наличия в ней кислотоустойчивых сапрофитных бактерий. Если вода мутная или с хлопьями, центрифугируйте в нескольких пробирках 200–250 мл воды и из осадка приготовьте препараты для бактериоскопического исследования. Кроме того, в этих случаях можно профильтровать 1 л воды через стерильный мембранный фильтр с диаметром пор 22 мкм, разрезать фильтр стерильными ножницами на тонкие полоски и поместить их на среду Левенштейна-Йенсена. 84 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ 12 РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА 1. Collins CH, Lyne PM. Microbiological Methods. 5th ed. Butterworths, London, 1984. 2. Collins CH, Grange JM, Yates MD. Tuberculosis bacteriology. 2nd ed. Organization and practice. Oxford: Butterworth-Heineman, 1997. 3. Fadda G, Virgilio GD, Mantellini P, Piva P, Sertoli M. The organization of laboratory services for a tuberculosis control programme. JPMA 1988; 38(7): 187–93. 4. Grange JM, Yates MD. Guidelines for speciation within the Mycobacterium tuberculosis complex. WHO/Zoon/94.174. WHO Veterinary Public Health Unit, 1994. 5. Kent PT, Kubica GP. Public health mycobacteriology: Guide for the Level III Laboratory. US Department of Health and Human Services, Centres for Disease Control, USA, 1985. 6. Kleeberg HH, Koornhof HJ, Palmhert H. Laboratory Manual of Tuberculosis Methods. 2nd. ed. revised by EE Nel, HH Kleeberg, EMS Gatner. MRC Tuberculosis Research Institute Pretoria, South Africa, 1980. 7. Kubica GP. Correlation of acid-fast staining methods with culture results for mycobacteria. Bull Int Union Tuberc 1980; 55(3-4): 117–124. 8. Mitchison DA. Examination of sputum by smear and culture in case-finding. Bull Int Union Tuberc 1968; 41: 139–147. 9. Mitchison DA, Keyes AB, Edwards EA, Ayuma P, Byfield SP, Nunn AJ. Quality control in tuberculosis bacteriology: The origin of isolated positive cultures from the sputum of patients in four studies of short course chemotherapy in Africa. Tubercle 1980; 61: 135–144. 10. PAHO / WHO Advisory Committee on Tuberculosis Bacteriology. Manual of Technical Standards and Procedures for Tuberculosis Bacteriology. Part II: The culture of Mycobacterium tuberculosis. Pan American Health Organization, Martinez, Argentina, 1998. 11. PAHO / WHO Advisory Committee on Tuberculosis Bacteriology. Manual of Technical Standards and Procedures for Tuberculosis Bacteriology. Part III: Sensitivity of Mycobacterium tuberculosis to anti-tuberculosis drugs. Pan American Health Organization, Martinez, Argentina, 1998. 12. Salfinger M, Pfyffer GE. The new diagnostic mycobacteriology laboratory. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 1994; 961–979. 13. Strong B, Kubica GP. Isolation and identification of Mycobacterium tuberculosis. US Department of Health and Human Services, Centres for Disease Control, USA, 1981. 85 РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА 14. Urbanczik R. Present position of microscopy and a culture in diagnostic mycobacteriology. Zbl Bakt Hyg A 1985; 260: 81–87. 15. US Department of Health and Human Services. Primary containment for biohazards: selection, installation and use of biological safety cabinets. Centres for Disease Control and Prevention and National Institutes of Health, USA, 1995. 86 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ Приложение 1 ОСНОВНОЕ ОБОРУДОВАНИЕ И МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРИИ, ИСПОЛЬЗУЮЩЕЙ МОДИФИЦИРОВАННЫЙ МЕТОД ДЕКОНТАМИНАЦИИ ПЕТРОВА И ПИТАТЕЛЬНУЮ СРЕДУ ЛЕВЕНШТЕЙНА-ЙЕНСЕНА (6000 ПРОБ В ГОД) Наименование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Необходимое количество/объем Оборудование Автоклав, лабораторный, типа скороварки или с замещением воздуха паром, с автоматическим удалением конденсата и воздуха . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 Весы чашечные . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 Ламинарный шкаф, 1-го или 2-го класса, соответствующий международным стандартам . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3 Газовая горелка Бунзена на бутане . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 Центрифуга с крышкой, мощность 3000 g, с угловым ротором, закрывающимися стаканами и предохранителем . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 Установка для мытья флаконов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 Гомогенизатор для куриных яиц . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 Микроскоп, бинокулярный, с иммерсионным объективом (100х), окуляром (8х или 10х) и запасной лампой . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3 Холодильник . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 Паровые кастрюли . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 Миксер . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 Термостатная комната, с нагревателями и вентиляторами, со стальными или алюминиевыми подносами . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2 Водяная баня, с крышкой, термостатом и нагревателем . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 Материалы и реактивы Фольга алюминиевая, плотная . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .8 рулонов Этикетки самоклеящиеся для контейнеров с мокротой . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7000 Колба с патрубком для отсоса воздуха, емкостью 5–10 литров . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 Липкая лента («скотч») для автоклава . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12 рулонов Стаканы стеклянные, емкостью 100, 250, 500 и 1000 мл . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5 Чашки пластиковые, 50х30 см . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4 Канистры для стерилизации пипеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4 Пробирки центрифужные, стеклянные или пластиковые, с завинчивающимися крышками и круглым дном . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7000 Вата, белая гигроскопическая . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2 кг Коробки для культур, на 50 культур каждая . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10 Штативы для пробирок, с 48 гнездами, полипропиленовые или металлические с полипропиленовым покрытием . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5 Карандаши по стеклу . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2 Бутыли для отработанных жидкостей . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2 Поддоны для отработанной посуды, из нержавеющей стали или полипропилена . . . .3 Дезинфицирующий раствор, бактерицидный – например, 5%-й раствор фенола, 5%-й раствор гипохлорита натрия . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .40 л Воронки фильтровальные, стеклянные, диаметром 45 или 60 мм и 90 или 125 мм . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .по 2 Бумага фильтровальная, диаметр 15 см, № . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4 коробки Пинцет из нержавеющей стали, 15 см . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2 87 ПРИЛОЖЕНИЕ 1 Колбы стеклянные, Эрленмейера и простые, на 250 и 500 мл . . . . . . . . . . . . . . . . . .по 2 Перчатки одноразовые . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .400 Ручная лупа . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 Петли бактериологические, из никелево-хромовой проволоки, длина 15 см, диаметр 5 мм ИЛИ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .500 Петли бактериологические, одноразовые . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7000 Журнал лабораторный . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2–4 Бланки направления на лабораторное исследование . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .7000 Бланки лабораторные для ответов, предварит. и заключит. . . . . . . . . . . . . . . . . .по 7000 Куски ткани для протирания линз . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 коробка Петледержатели . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10 Маски для лица, промышленные, одноразовые . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .400 Флаконы МакКартни, широкогорлые, на 14 мл или 28 мл . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9000 Цилиндры мерные, стеклянные, емкостью 25, 100, 250 и 1000 мл . . . . . . . . . . . . . .по 2 Стекла предметные, 25 мм х 75 мм, толщиной 1,1–1,3 мм . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .600 Никелево-хромовая проволока, для бактериологических петель . . . . . . . . . . .20 метров Халаты лабораторные (на каждого сотрудника) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .по 2 Полотенца бумажные, одноразовые . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2 коробки Пипетки пастеровские, полипропиленовые . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .500 Ручки, шариковые, с красными чернилами . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12 Ручки, шариковые, с черными или синими чернилами . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .24 Мойка для пипеток . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .1 Пипетки, на 1 мл, 5 мл и 10 мл (на каждого сотрудника) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .по 5 Штативы для свертывания среды во флаконах . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .10 Флаконы для реактивов, емкостью от 50 мл до 1 л . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25 Груши резиновые для пипеток, емкостью 2 мл и 5 мл . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .по 5 Ножницы из нержавеющей стали, 25 см . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4 Шприцы самонаполняющиеся, емкостью 5 мл и 10 мл . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .по 1 Штатив для предметных стекол, пластмассовый, на 12–25 стекол . . . . . . . . . . . . . . . .4 Коробки для хранения предметных стекол, картонные/железные, на 12–25 стекол .20 Лопатки бактериологические из нержавеющей стали . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4 Контейнеры для сбора отработанного материала, пластмассовые, одноразовые, емкостью 50 мл, с широким горлом и завинчивающейся крышкой, легко сгораемые . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3 Флаконы для красок, темного стекла, емкостью 100 мл . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3 Флаконы для красок, пластиковые, емкостью 10 мл . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .3 Штативы для окрашивания препаратов . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2 Ведра из нержавеющей стали, широкие, с крышками . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4 Палочки для перемешивания жидкости . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5 Пробирки, стеклянные, без бортика, 16 мм х 152 мм . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .200 Пробирки, стеклянные, без бортика, 19 мм х 152 мм . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .200 Колпачки для пробирок, алюминиевые, типа «Cap-o-Tests» . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .600 Термометры . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2 Таймеры, на 0–60 минут, со звонком . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2 Треножник с проволочной сеткой . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2 Колбы мерные, стеклянные, емкостью 500 мл . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4 Сосуды для промывки, пластмассовые, емкостью 500 мл . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2 Маркеры несмываемые . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .12 Реактивы Спирт солянокислый, для окраски по Цилю-Нильсену . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6 литров Анилин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .125 мл Раствор метиленового синего, водный . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .4 литра 88 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ Фуксин основной . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .125 г Карболовый фуксин, для окраски по Цилю-Нильсену . . . . . . . . . . . . . . . . . .12 литров Бромид цианогена (BrCN) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .250 г Цинковый порошок, сухой . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2 г Яйца куриные . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .120 на мес Этиловый спирт (70%) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2,5 л х 2 Глицерин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2,5 л х 1 Кислота соляная, концентрированная (чистая) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2,5 л х 1 Перекись водорода (30%) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .250 мл Масло иммерсионное . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .100 мл L-аспарагин . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .250 г Магния сульфат (MgSO4 . 7H2O) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .250 г Магния цитрат . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .250 г Малахитовый зеленый . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .25 г Этиловый спирт . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .750 мл х 5 N-нафтилэтилен-диамин-дигидрохлорид . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2,5 г Фосфат натрия двузамещенный (Na2HPO4), безводный . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .250 г Р-нитробензойная кислота (PNB) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .200 г Фенол кристаллический . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .125 г Калия перманганат (KMNO4) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .250 г Калия фосфат однозамещенный (KH2PO4), безводный . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .500 г Натрия гидроксид (NaOH) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .500 г Натрия хлорид . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .250 г Натрия пируват . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .100 г Натрия нитрат . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .125 г Сульфаниламид . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .15 г Кислота серная (чистая) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .2,5 л х 1 Твин 80 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .100 мл Ксилол . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .400 мл 89 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ Приложение 2 СБОР МОКРОТЫ МЕТОДИКА взаимопонимания с больным и объясните ему, для чего необходимо •Добейтесь провести исследование мокроты. больного, чтобы он прополоскал рот перед сдачей мокро•Проинструктируйте ты. При этом из полости рта удаляются остатки пищи и контаминирующие бактерии. должен сделать 2 глубоких вдоха, задержать дыхание на несколько се•Пациент кунд после каждого вдоха, а затем медленно выдохнуть. Затем попросите больного вдохнуть в третий раз и с силой выдохнуть воздух. Потом попросите вдохнуть еще раз и затем покашлять. Это способствует получению мокроты из глубоких отделов легких. После появления продуктивного кашля пациент должен поднести к губам флакон и аккуратно сплюнуть в него мокроту. Нередко мокрота бывает густой и слизистой, хотя может быть жидкой, с частицами некротических тканей из пораженных участков легких. Цвет мокроты может быть грязно-белым или грязновато-светло-зеленым. Мокрота с кровью имеет красный или коричневый цвет. Жидкая прозрачная слюна или выделения из носоглотки не являются мокротой и имеют небольшую диагностическую ценность при туберкулезе. мокроты собрано недостаточно, попросите больного покашлять еще, •Если чтобы получить образец в нужном количестве. Надо помнить о том, что многие пациенты не в состоянии за несколько минут собрать мокроту из глубоких отделов легких. Необходимо предоставить им достаточно времени и дождаться действительного глубокого кашля. все-таки мокроту получить не удалось, считайте, что данный флакон все •Если равно использован и уничтожьте его в соответствии с инструкцией. чтобы флакон был плотно закрыт, и затем четко маркируйте сам •Проверьте, флакон (а не его крышку). •Вымойте руки водой с мылом. пациенту новый флакон и объясните, что он должен собрать мокроту ут•Дайте ром, как только проснется. •Покажите пациенту, как следует плотно закрыть флакон. больному, куда он должен доставить мокроту (в медицинское уч•Объясните реждение или в лабораторию). 90 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ Приложение 3 НАПРАВЛЕНИЕ НА ЛАБОРАТОРНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ Наименование медицинского учреждения _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Дата _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Фамилия больного _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Возраст _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Пол: М ❐ Ж ❐ Точный адрес: _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ __________________________________________________ Номер истории болезни* _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Откуда получен образец: Причина обследования: ❐ Из легких ❐ Из внелегочного очага Локализация _ _ _ _ _ _ _ _ ❐ Диагностика ❐ Мониторинг лечения Номер образца_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Дата _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ Подпись лица, направляющего пробу на исследование _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ * Не забудьте указать номер истории болезни (по районному журналу учета больных туберкулезом) при мониторинге процесса лечения больного. 91 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ РЕЗУЛЬТАТЫ КУЛЬТУРАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ (предварительное заключение) Приложение 4а ____________________________________________________________ Номер по лабораторному журналу __________________ Дата получения пробы ____________________________ Результаты культурального исследования Метод выделения культуры ____________________________________ Роста нет ❐ 3+ ❐ 1–19 колоний ❐ 4+ ❐ 1+ ❐ Контаминация ❐ 2+ ❐ При культивировании проб получен ________________ рост микобактерий с характерными признаками M. tuberculosis Окончательное заключение будет выдано в течение последующих 4 недель. Дата ______________________ Подпись ____________________ 92 LABORATORY SERVICES IN TUBERCULOSIS CONTROL РЕЗУЛЬТАТЫ КУЛЬТУРАЛЬНОГО ИССЛЕДОВАНИЯ (окончательное заключение) Приложение 4б Номер по лабораторному журналу __________________ Дата получения пробы ____________________________ Результаты бактериоскопии ❐ по Цилю–Нильсену Метод окраски ❐ флюорохромом Результат отрицательный ❐ 1+ ❐ Бактериоскопию не проводили ❐ 2+ ❐ 1–9 кислотоустойчивых бактерий ❐ 3+ ❐ Результаты культурального исследования Метод выделения культуры ____________________________________ Роста нет ❐ 1–19 колоний ❐ Контаминация ❐ 1+ ❐ Не проводили ❐ 2+ ❐ 3+ ❐ 4+ ❐ Результаты идентификации культур Скорость роста ________________ Морфология колоний __________________ Ниациновый тест ❐ Положительный ❐ Отрицательный Нитратредуктаза ❐ Положительный ❐ Отрицательный Тест ____________ ❐ Положительный ❐ Отрицательный Тест ____________ ❐ Положительный ❐ Отрицательный Выделенная культура идентифицирована как: Mycobacterium tuberculosis ❐ Другие микобактерии ❐ Дата ______________________ Подпись ____________________ 93 Лабораторный номер Фамилия (полностью) Пол М/Ж Возраст Полный адрес (для новых больных) Примечания Приложение 5 Ниацино- Каталаза ПодтвержНазвание Результаты медицинскодение при вая проба культуральго учрежде- РезультаМорфология Скорость окраске по Подпись ния, напра- ты бакте- ного исследо- колоний роста НитратPNB– Цилю– вившего вания Нильсену пробу на ис- риоскопии редуктаза тест следование ЛАБОРАТОРНЫЙ ЖУРНАЛ ДЛЯ РЕГИСТРАЦИИ РЕЗУЛЬТАТОВ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ 94 ЛАБОРАТОРНАЯ СЛУЖБА В ПРОГРАММАХ БОРЬБЫ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ СООТНОШЕНИЕ ЕДИНИЦ ИЗМЕРЕНИЯ Приложение 6 Длина 1 мм = 1м = 1м = 1м = 0,0394 дюйма 39,37 дюйма 3,28 фута 1,09 ярда 1 дюйм 1 дюйм 1 фут 1 ярд = = = = 25,4 мм 0,0254 м 0,305 м 0,91 м Температура 0°С = (°F - 32) x 5/9 °F = (°С x 9/5) + 32 100°С = 212°F Масса 1г = 0,035 унции 1 кг = 2,2 фунта Площадь = 1 см2 1 кв. дюйм = 0,155 кв. дюйма 6,452 см2 1 унция = 28 г 1 фунт = 0,454 кг 1 м2 = 104 см2 = 10,76 кв. фута 1 кв. фут = 144 кв. дюйма = 0,0929 м2 Объем 1 литр = 1000 см2 = 10-3 м3 = 0,0351 куб. фунта = 61,02 куб. дюйма 500 мл = 16 унций = 1 пинта 1 куб. фунт = 0,02832 м3 = 28,32 литра = 7,477 галлона 1000 мл = 1 л = 33,8 унции = 1 кварта 1 галлон, США = 3,7 л 1 галлон, Англия = 4,55 л 1000 мл = 0,22 галлона, Англия = 0,26 галлона, США 1 мл = 1 см3 = 0,034 унции Скорость 1 см/сек = 0,03281 фут/сек 1 фут/сек = 30,48 см/сек 1 км/ч = 0,2778 м/с Давление 1 Па = 1 N/м2 = 1,451 х 10-4 фунта/кв. дюйм = 0,209 фунта/кв. фут2 1 фунт/кв. дюйм = 6891 Па 1 фунт/кв. фут = 47,85 Па 1 атм = 1,013 х 105Па = 14,7 фунта/кв. дюйм = 2117 фунт/фут2 95 © Всемирная организация здравоохранения – 1998 г. Этот документ не является официальной публикацией Всемирной организации здравоохранения, но все права остаются за Организацией. Тем не менее этот документ можно свободно рецензировать, реферировать, воспроизводить или переводить (частично), но не для продажи либо иного его использования в коммерческих целях. Для получения разрешения на перевод всего документа необходимо обращаться в Глобальную программу по туберкулезу (Global Tuberculosis Programme, World Health Organization, Geneva, Switzerland), которая с удовольствием предоставит самую новейшую информацию о каких-либо изменениях в тексте, о предполагаемых новых изданиях, а также о имеющихся вариантах книги, адаптированных для отдельных регионов, и переводах. Всю ответственность за любые взгляды, выраженные авторами в данном документе, несут сами авторы. Русская версия руководства напечатана издательством «Права человека» по заказу Всемирной организации здравоохранения Москва, 2002 ISBN 5-7712-0235-5