1% - Молекулярная диагностика

Роль молекулярных методов
в диагностике состояния
биоценоза влагалища
Шипулина О.Ю.
ФГУН «ЦНИИЭ» Роспотребнадзора
Биоценоз влагалища и
репродуктивное здоровье женщины.


-
От бактериального биоценоза влагалища зависит не
только здоровье самой женщины, но и здоровье ее
новорожденного ребенка.
Изменения микробиоценоза влагалища могут
приводить к неблагоприятными последствиями:
преждевременные роды,
воспалительные заболевания органов малого таза
(ВЗОМТ),
значительное увеличение риска инфицироваться
ВИЧ, сифилисом, другими инфекциями,
передающимися половым путем (ИППП).
Синдром патологических выделений из
влагалища может быть обусловлен






Бактериальный вагиноз
Вагинальнй кандидоз
Трихомоноз
Гоноррея
Хламидиоз
Неспецифический
вагинит
Разная этиология – разные терапевтические подходы.
Традиционные методы диагностики

Клинический
-
осмотр - гиперемия, выделения, запах, жалобы
по критериям Амселя – выделения, pH, КОН-тест

Лабораторный
-
-
-
-
микроскопия окрашенного по Граму мазка по критериям
Ньюджента (стандарт), по степени чистоты влагалища
микроскопия окрашенного по Р-Г мазка – по преобладающей
флоре
посев на питательные среды (MRS – для Lactobacillus spp., для
G.vaginalis, Enterobacter, Streptococcus, Streptococcus, Yeast и др.)
«Игра в кости» в диагностике
влагалищных выделений.
новые лабораторные методы в коррекции диагноза
Образцы от 220 женщин с дз «рецидивирующий вагинит» поставленным в
течение 3 месяцев на основании идентичных симптомов (53 вр и 31 гин)
Лабораторная диагностика:
посев (идентификация Lfctobacillus
+ ДНК-гибр-ция на G.vaginalis, Candida, T.vaginalis (Affirm VPIII, BD) > 10^4
+ ПЦР Atopobium vaginae (Ferris et all.)
Клинический
диагноз
Неправильный
диагноз
Использованы
критерии Амселя
Неправильный
диагноз
Бактериальный
вагиноз
(N=80)
49 (61%)
54
34 (63%)
Кандидоз
(N=109)
84 (77%)
60
45 (75%)
Andreas Schwiertz et all, 2006
«Throwing the dice for the diagnosis of vaginal complaints»
«Классические» методы диагностики
Метод
Задачи и проблемы
Микроскопия исследование
окрашенного мазка
-определение степени воспалительного процесса,
-приблизительная оценка микрофлоры:
Бактерии - форма, морфотип, условное количество,
Грам+ палочки – не только Lactobacillus
Lactobacillus – не только Грам+ палочки
Грибы – мицелий, споры (если количество > 10^5
-по Граму,
-по Романовскому-Гимзе,
-др.)
клеток/мл)
-трудности стандартизации и низкая
Посев на
питательные среды воспроизводимость (влияние забора материала,
хранения, приема а/б, качество питательных сред,
контрольных штаммов)
-не выявляет некультивируемые УПМ, трудности
высева анаэробных м-мов
-ошибки в определить количество бактерий
Сравнение результатов выявление
Lactobacillus в микроскопии и в посеве
Рост на Lactobacillus MRS Agar, пересев на Rogosa SL Agar
Микроскопия с окраской по Граму
Кол-во
Lactobacillus в
мазке по
Граму*
Количество
Lactobacillus в посеве, N **
образцов
Выявлены
(взятых в посев) отсутствуют
10^5 – 10^6
отсутствуют
21 (12)
2
10 (83%)
Всего
обнаружено
30 (21)
4
17 (81%)
7 (5)
0
5
23 (16)
4 (25%)
12
скудно
умеренно+
много
ФГУН ЦНИИЭ, 2010
Микроскопия культур
лактобацилл
(окраска по Граму)
Lactobacillus iners
Lactobacillus gasseri
Ellen De Backer et all, BMC Microbiology, 2007
Значение ПЦР в изучении БВ



В норме влагалище здоровых женщин,
колонизировано лактобактериями - L.crispatus,
L.jensenii, L.gasseri L.iners
БВ – это полимикробный синдром, спектр УПМ
большой, но Gardnerella vaginalis и
Atopobium vaginae наиболее часто
встречаемые микроорганизмы.
Важность выявления других УПМ необходимо
доказать.
Sujatha Srinivasan and David N. Fredricks, 2008
ПЦР: развитие технологий
ПЦР с ЭФ-детекцией
ПЦР с детекцией в РРВ





Качественное определение ДНК
Визуальная оценка
(субъективность)
Подбор количества циклов или
серия разведений для
полуколичественной оценки
Ограничение по использованию
гена 16S-rRNA (низкая
специфичность)
90-е годы


Количественное определение ДНК
Автоматический учет результатов
Возможность использования 16SrRNA (специфичность за счет
зонда)
21 век
Проблемы внедрения в практику
-необходимо специальное оборудование,
-наборы реагентов должны пройти клиническую
валидацию,
-валидированный контрольный материал
(контроль качества лабораторных исследований),
-обучение специалистов лабораторной
диагностики работе с новыми тестами,
-обучение врачей интерпретировать результаты
тестов и использовать их в практике
Нормофлора
Нормальная микрофлора - микрофлора Додерлейна - состоит в
основном из:
Резидентная
-ацидофильных лактобактерий (Lactobacillus spp.) до 95%,
-бифидумбактерии (Bifidum) - до 10%,

Транзиторная
-Грам+ кокки, Грам- кокки, Грам- палочки – до 5%
Роль нормофлоры:
 Образование молочной кислоты
 Образование биопленки (колонизационная резистентность)
 Образование перекиси водорода и ферментов, обладающих
противомикробными свойствами
 Стимуляция местной иммунной защиты организма - активизация
макрофагов ,стимуляция выработки интерферона и секреторных
иммуноглобулинов класса А.
УПМ, ассоциированные с БВ
1990 год:
 Gardnerella vaginalis
H.Gardner, C.Dukes
1955 г.
2000 год:
 Gardnerella vaginalis
 Mobiluncus cursii
 Prevotella spp.
Насколько важно
выявлять их, если это
не изменяет протокол
лечения БВ?
УПМ, ассоциированные с БВ,
выявляемые с помощью ПЦР
15 видов:








BVAB1
BVAB2
BVAB3
Gardnerella vaginalis
Atopobium spp.
Eggerthella-like uncult.
Leptotrichia spp.
Megasphaera
David N. Fredricks et al, 2005
3 семейства и



8 основных родов:








Выявление - имеет больше
научное значение, чем клиникодиагностическое.
Firmicutes
Actinobacteria
Fusobacteria
Gardnerella
Atopobium
Megasphaera
Eggerthella
Aerococcus
Leptotrichia/Sneathia
Prevotella
Papillobacter
Ling et al. BMC Genomics, 2010
Лечение БВ – метронидазол,
другие УПМ важны для диагностики, если при
их наличии меняется протокол лечения
Серия Фемофлор – на какие вопросы отвечает тест?
Группа
Вы являемы е показатели
ФФ 4
ФФ 8
ФФ 16
1
общая бактериальная масса / контроль взятия
материала
*
*
*
2
нормофлора – Lactobacillus spp. /ВК
*
*
*
3
Enterobacterium spp.
*
*
4
Streptococcus spp.
*
*
5
Staphylococcus spp.
6
Gardnerella vaginalis/Prevotella/Porphyromonas spp.
7
Eubacterium spp.
8
Sneathia spp./Leptotrihia spp./Fusobacterium spp.
*
9
Megasphera spp./Veilonella spp./Dialister spp.
*
10
Lachnobacterium spp./Clostridium spp.
*
11
Mobiluncus spp./Corynebacterium spp.
*
12
Peptostreptococcus spp.
*
13
Atopobium vaginae
*
Группа
Микоплазм
14
Mycoplasma spp.
15
Ureaplasma spp.
Грибы
16
Candida spp.
Диагностика
нормоценоза
Аэробны е
микроорганизмы
Анаэробны е
микроорганизмы
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
На какие вопросы отвечает Фемофлор?
(по методическим рекомендациям к тесту)
Показатель
Абсолютный
показатель
ОтносительОценка показателя
ный показатель
ОБМ
< 10^5
> 10^6
> 10^8
нет
Сниженный
Нормальный
Повышенный
Не имеет
значения
(% от ОБМ)
80-100%
20- 80%
< 20%
Нормальный уровень
Умеренно-сниженный
Значительно сниженный
Не имеет
значения
< 0,1%
Нормальный уровень
0,1 – 1%
Слабо увеличенный
1 – 10%
Умеренно увеличенный
> 10%
Значительно
увеличенный
(общая
бактериальная
масса)
ЛБ
(Lactobacillus spp.)
УПМ
(аэробные и
анаэробные
бактерии)
(% от ОБМ)


Здравствуйте!
Я сдала анализ микробиоценоза влагалища.
Результаты следующие:
Общая бактериальная масса (ОБМ) 7,1 Имеет нормальный уровень (норма:
6-9);
Лактобактерии 6,3 (Менее 20% ОБМ);


Enterobacterium spp. 2,7
Streptococcus spp. 1,3
Staphylococcus spp. 3,2 ;
Gardnerella/Prevotella/Porphyromonas 3,9
Eubacterium spp. 5,9 (Более 5% ОБМ);
Snethia/Leptotrihia/Fusobacterium - ;
Megasphaera/Veilonella/Dialister - ; Lachnobacterium/Clostridium 2,6;
Mobiluncus/Corynebacterium 1,2;
Peptostreptococcus 2,2; Atopobium vaginae - ;
Mycoplasma (hominis+genitalium) - Mycoplasma: Не обнаружены;
Ureaplasma 4,9 (Более 3% доли лакт.) (норма: менее
3%);
Candida spp. 1,1 Грибы Candida: Менее 0,01% ОБМ (норма: менее 3%)
ЗАКЛЮЧЕНИЕ: Умеренный дисбаланс
Меня мучают обильные выделения, прозрачные и непрозрачные,
запаха нет.
Подскажите, пожалуйста, что из данного результата анализа
требует лечения и вызывает такие выделения?
Что вне пределов нормы, поскольку не везде это указано?
Спасибо заранее. С уважением, Ирина




Данное исследование констатирует факт дисбактериоза
влагалища: на фоне снижения количества нормальной
лактофлоры повышено количество условно-патогенной флоры.
Каждый индивидуальный представитель этой флоры по
отдельности не лечат антибиотиками!!! Ситуацию решают в
целом: необходимо восстановить нормальную флору.
Кроме этого, информации для окончательной диагностики не
хватает: нужны специфические тесты на Chlamydia trachomatis
(по мазку и по крови) и на трихомонады.
Кроме этого, нужен бактериологический посев и посев на
уреаплазму, так как говорить о лечении уреаплазмы можно
только в том случае, если будет культуральный рост - более
10^4 ЦОЕ/мл и выбирать препарат только по результатам
антибиограммы.
Желаю удачи!
Исключить влияние ИППП – включить в диагностику Тесты на ИППП
«Условно-патогенное Море»
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
C.alb
αβγ
αβγ
Enter
G.vag
Bact.
U.ure
M.hom
C.lus
A.vag
Mob
Staph
M.pri
C.cru
C.kef
M.spe
Pept.
Prev.
αβγ
C.gla
U.par
Strep
αβγ
αβγ
Lept.
M.fer
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
Разнообразие УПМ огромно, но значение каждого в развитии синдрома не изучено
Что с этим делать?


Путь «от микробов»
Выявлять максимально
много
пытаться разбираться, что
бы это значило и надо ли
это лечить (?)
Путь «от синдромов и терапии»
• Выделить синдромальные и/или
терапевтические группы
• Искать минимальное и
достаточное количество
микроорганизмов в соответствие с
существующими знаниями
Убрать лишнее, оставить значимое
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
C.alb
αβγ
αβγ
Enter
G.vag
Bact.
U.ure
M.hom
C.lus
A.vag
Mob
Staph
M.pri
C.cru
C.kef
M.spe
Pept.
Prev.
αβγ
C.gla
U.par
Strep
αβγ
αβγ
Lept.
M.fer
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
αβγ
Выделить группы в соответствие с синдромом
или вариантом терапии
C.alb
Enter
G.vag
U.ure
M.hom
A.vag
Staph
C.cru
Strep
C.gla
U.par
Основные «синдромально-терапевтические»
группы условно-патогенных
микроорганизмов
U. parvum
U. urealyticum
M. hominis
ДНК человека
C. albicans
C. glabrata
C. krusei
ВКО
Dx
MZ
Микоплазмы
УГТ
BVассоциированные
анаэробы
Кандиды
Аэробы
G. vaginalis
A. vaginae
Lactobacillus spp.
Bacteriae (ОКБ)
E. coli
Staphylococcus
Streptococcus
Bacteriae (ОКБ)
АмплиСенс ФЛОРОЦЕНОЗ
Необходимость и достаточность
выявления G.vaginalis и A.vaginae как
специфических маркеров БВ
Источник
Выявляемые
ЧувствиСпецимикроорганизмы тельность фичность
Jean-Pierre Menard et all.
CID, 2008
G.vaginalis
A.vaginae
95%
Ellen De Backer et all.
Antibiotic susceptibility of Atopobium vaginae
BMC Infectious Diseases, 2006,
Для других БВ-ассоциированных УПМ устойчивость к
метронидазолу не установлена.
99%
На какие вопросы позволяет ответить тест
«ФлороЦеноз-Бактериальный вагиноз»
Контроль взятия клинического материала (соскоб, мазок из вл-ща) –
общее кол-во бактерий (ОКБ) в мл образца – не менее 10^6 ГЭ/мл
Интерпретация
по доле LB
КС
(lg Lac – lg Bac)
Доля LB к Количество УПМ
(доля от ОКБ)
ОКБ
G.vaginalis/A.vaginae
Нормоценоз
≥ -0,5
(нормоценоз)
> 30%*
Легкий дисбиоз
≥ -2,0 < – 0,5
10 - 30%
Умеренный
дисбиоз
Выраженный
дисбиоз
(мезоценоз,
промежуточный
тип)
< -2,0
(дисбиоз,
бактериальный
вагиноз)
1 – 10%
< 1%
Абсолютное количество не
имеет самостоятельного
значения
< 1% - незначимое количество
≥ 1 < 10% - повышенное
≥ 10% - значимое
Что показывают результаты теста?

При сниженном количестве лактобактерий (< 1%)
смотрим на результаты по G.vaginalis и A.vaginae:
Результат
анализа
G.vaginalis
A.vaginae
1
> 1%
0%
0%
2
> 1%
0%
> 1%
Лечение
Метронидазол
Клиндамицин
Если будут опубликованы данные об устойчивости
других BVAB-УПМ, то они будут включены в тест.
05
.0
3.
20
09
07
.0
3.
20
09
09
.0
3.
20
09
11
.0
3.
20
09
13
.0
3.
20
09
15
.0
3.
20
09
17
.0
3.
20
09
19
.0
3.
20
09
21
.0
3.
20
09
23
.0
3.
20
09
25
.0
3.
20
09
27
.0
3.
20
09
29
.0
3.
20
09
Динамика маркеров БВ при терапии
клиндамицином
10.0
9.0
8.0
7.0
6.0
5.0
клиндацин
4.0
3.0
2.0
1.0
0.0
ОКБ
LB
Gard
Atop
Возможности применения тестов в
диагностике дисбиоза влагалища



В дополнение к традиционному методу
(микроскопия мазка из влагалища по Граму)
у женщин репродуктивного возраста
предъявляющих жалобы при исключении ИППП
Изучение эффективности новых лекарственных
средств для лечения БВ – в научных целях
Вопросы оптимального использования теста:



В середине м/цикла (после 10-12 дня) или динамика
Использовать мазок/соскоб из влагалища (соскоб из уретры не
является оптимальным материалом для диагностики биоценоза
у женщины)
Мониторинг терапии?
К вопросу о спектре выявляемых УПМ



Спор о количестве выявляемых УПМ в тесте
предназначенном для диагностики БВ не имеет
смысла, т.к. это не влияет на выбор терапии
На сколько пазлов разбита картинка?
Чем меньше – тем дешевле и быстрее собирать. Но
чем больше – тем дольше и интереснее.
Для практических врачей важен
простой и понятный ответ на вопрос:
лечить или не лечить и чем лечить