Анаэробы . Выделение чистой культуры анаэробных бактерий.

Тема. ОБЛИГАТНЫЕ АНАЭРОБЫ. ВЫДЕЛЕНИЕ ЧИСТОЙ КУЛЬТУРЫ АНАЭРОБНЫХ БАКТЕРИЙ
Энергетический метаболизм (биологическое окисление)
Для синтеза структурных компонентов микробной клетки и поддержания процессов жизнедеятельности наряду с питательными веществами бактериям требуется достаточное количество энергии.
Эта потребность удовлетворяется за счет биологического окисления, в результате которого синтезируются молекулы АТФ.
Мир микроорганизмов очень разнообразен. Некоторые из них могут получать энергию даже
из минеральных соединений. Так, например, железобактерии получают энергию, выделяющуюся при
непосредственном окислении ими железа (Fe2+ в Fe3+), которая используется для фиксации СО2, бактерии,
метаболизирующие серу, обеспечивают себя энергией за счет окисления серосодержащих соединений.
Однако подавляющее большинство прокариот получает энергию путем дегидрогенирования.
А э р о б ы для этой цели нуждаются в свободном кислороде. Облигатные (строгие) аэробы
(например, некоторые виды псевдомонад) не могут жить и размножаться в отсутствие молекулярного
кислорода, поскольку они используют его в качестве акцептора электронов. Молекулы АТФ образуются
ими при окислительном фосфорилировании с участием цитохромоксидаз, флавинзависимых оксидаз и
флавинзависимых дегидрогеназ. При этом, если конечным акцептором электронов является О2, выделяются значительные количества энергии (схема 1).
А н а э р о б ы получают энергию при отсутствии доступа кислорода путем ускоренного,
но не полного расщепления питательных веществ. Облигатные анаэробы (например, возбудители
столбняка, ботулизма) не переносят даже следов кислорода. Они могут образовывать АТФ в результате
окисления углеводов, белков и липидов путем субстратного фосфорилирования до пирувата (пировиноградной кислоты). При этом выделяется сравнительно небольшое количество энергии.
Отношение бактерий-анаэробов к кислороду1
Облигатные анаэробы делятся на две группы: облигатные анаэробы и аэротолерантные
бактерии.
Облигатные анаэробы характеризуются тем, что молекулярный кислород для этих организмов является токсичным, т.к. вызывает гибель бактерии или ограничивает их рост. Энергию облигатные анаэробы получают при
маслянокислом брожении. Облигатными анаэробами
являются, например Сlostridium tetani, Bacteroides spp.
Аэротолерантные микроорганизмы не используют кислород для получения энергии, но способны существовать в его атмосфере. Аэротолерантными микроорганизмами являются молочнокислые бактерии, которые получают энергию во время гетероферментативного
молочнокислого брожения.
Существуют ф а к у л ь т а т и в н ы е а н а э р о б ы , которые могут расти и размножаться как в присутствии кислорода воздуха, так и без него. Они образуют АТФ при окислительном и субстратном
(фосфорилировании).
Получение энергии путем субстратного фосфорилирования. Брожение
1
Для подготовки к занятию напоминается информация лишь о группе бактерий, являющихся облигатными
анаэробами.
Микроорганизмы расщепляют гексозы (глюкозу) тремя путями — в гликолитическом,
гексозомонофосфатном и 2-кето-3-дезокси-6-глюконатном циклах.
1. Гликолиз ( путь Эмдена – Мейергофа ). В результате расщепления глюкозы расходуется 2 и
синтезируется 4 молекулы АТФ. Таким образом, общий выход составляет 2 молекулы АТФ и 2 молекулы НАД•Н2 (см. схему 1).
вано
с
на
Реакции фосфорилирония, непосредственсвязанные
переносом
фосфата с
промежуточного
продукта
АДФ, называются
суб-
с т р а т н ы м ф о с ф о р и л и р о в а н и е м. Для некоторых микроорганизмов акцептором
электронов в цикле гликолиза могут быть нитраты или СО2. Дальнейшие пути превращения
пирувата предопределяются метаболическими особенностями микроорганизмов. Для анаэробов
брожение является способом получения энергии в результате окислительно-восстановительных
реакций, в которых органические соединения функционируют как доноры и акцепторы электронов. В зависимости от образования конечных продуктов различают несколько типов брожения:
молочнокислое, спиртовое, муравьинокислое, пропионовокислое, маслянокислое и другие, каждое из которых вызывается соответствующими микроорганизмами.
Молочнокислое брожение.
Бактерии
родов
Lactobacillus,
Streptococcus,
Bifidobacterium способны
образовывать из пирувата
молочную кислоту. При
этом в одних случаях
происходит образование
только молочной кислоты
(гомоферментативное
брожение), в других
(смешанное
брожение)
наряду с молочной кислотой образуются побочные продукты: спирт, ацетон и др., количество
которых может превосходить содержание основного продукта.
Муравьинокислое брожение. Этот тип брожения характерен для представителей семейства энтеробактерий (Enterobacteriaceae). Одним из конечных продуктов данного типа брожения
является муравьиная кислота. Наряду с ней образуются молочная, уксусная кислоты и другие
продукты. Некоторые виды энтеробактерий (например, кишечная палочка) расщепляют муравьиную кислоту до Н2 и СО2. Признаки кислото- и газообразования являются довольно стабильными и используются для идентификации бактерий на средах Хисса ("пестрый" ряд).
Бактерии рода Enterobacter образуют из пирувата небольшое количество кислых продуктов и
ацетилметилкарбинол (ацетоин). Последний определяют в реакции Фогес – Проскауэра с целью
идентификации данных бактерий.
Маслянокислое брожение. Одним из основных продуктов брожения является масляная
кислота. При этом типе брожения образуются также уксусная кислота, СО2 и Н2. Некоторые виды клостридий наряду с масляной и другими кислотами образуют бутанол, ацетон и некоторые
другие соединения. В данном случае они вызывают ацетонобутиловое брожение.
Пропионовокислое брожение характерно для пропионобактерий, которые из пирувата образуют пропионовую кислоту.
Многие бактерии при сбраживании углеводов наряду с другими продуктами образуют этиловый спирт. При этом он, как правило, не является основным продуктом.
2. Фосфогликонатный, или гексозомонофосфатный (ГКМ), путь. Этот путь расщепления глюкозы характерен для многих микроорганизмов. Последовательность реакций
ГМФ-пути (гексозомонофосфатного) у бактерий идентична той, которая присуща клеткам
высших организмов. Основным функциональным назначением данного пути является подготовка углеводных компонентов (пентозофосфатов) для биосинтеза нуклеиновых кислот, а также
основной массы НАДФ•Н2, необходимого для различных биосинтетических реакций.
3. Кетодезоксифосфоглюконитный (КДФГ) путь (Энтнера–Дудорова). Данным путем расщепляют глюкозу некоторые гетеротрофы, у высших организмов КДФГ-путь отсутствует. Пировиноградная кислота образуется у этих микроорганизмов двумя путями: при расщеплении 2-кето-3-дезокси-6-фосфоглюконовой кислоты и при окислении глицеринальдегид-3фосфата так же, как при гликолизе. При расщеплении глюкозы КДФГ-путем синтезируется по 1
молекуле АТФ, НАД Н2 и НАДФ•Н2 без газообразования.
Бактерии, расщепляющие глюкозу КДФГ-путем, не имеют ферментов, необходимых для образования из пировиноградной кислоты молочной, муравьиной и
других кислот.
КДФГ-путь (кетодезоксифосфоглюконитный путь) функционирует в основном у аэробных
микроорганизмов, в связи с чем его называют "аэробным", а метаболизм – "окислительным". В
противоположность этому гликолитический путь, присущий облигатным и факультативным анаэробам, называют "бродильным".
Многие микроорганизмы помимо глюкозы усваивают другие моносахариды, а также ди-,
три- и олигосахариды, которые после определенных катаболических превращений включаются
в тот или иной путь расщепления глюкозы.
Таким образом, при субстратном фосфорилировании из глюкозы или других источников углерода получают лишь незначительную часть энергии. Образующиеся при этом "неокисленные"
продукты брожения не могут использоваться клеткой в анаэробных условиях и выводятся из
нее. Так, например, в молочной кислоте, спирте сохраняются значительные количества энергии,
имеющейся в исходном продукте. Полное освобождение энергии происходит только при окислении глюкозы до СО2 и Н2О.
Получение энергии путем окислительного фосфорилирования
Пируват, образующийся в процессе гликолиза, окисляется до ацетил-КоА ("активированная уксусная кислота"), который при взаимодействии с уксусной кислотой включается в
цикл трикарбоновых кислот (ЦТК). В этой универсальной биохимической "машине", присущей как аэробным, так и анаэробным микроорганизмам, происходит расщепление ацильных
групп с освобождением 4 пар атомов Н, которые восстанавливают НАД, ФАД и НАДФ до
НАД•Н2, ФАД•Н2 и НАДФ•Н2. Не менее важная функция ЦТК (цикла трикарбоновых кислот) состоит в образовании предшественников аминокислот, которые вовлекаются в реакции
биосинтеза. Этим можно объяснить наличие большинства ферментов ЦТК (цикла трикарбоновых кислот) у облигатных анаэробов.
У прокариот, так же как и у эукариот, в ЦТК (в цикл трикарбоновых кислот) вовлекаются
продукты катаболизма аминокислот и жирных кислот через ацетил-КоА (см. схему 1).
У всех аэробных и факультативно-анаэробных бактерий дыхательная цепь локализована
на цитоплазматической мембране. Перенос электронов на молекулярный кислород осуществляется комплексом никотинамидных дегидрогеназ либо хинонов и цитохромов. При этом
дыхательная цепь в зависимости от видовой принадлежности бактерий различается по составу промежуточных переносчиков и природы конечного акцептора электронов.
У бактерий распространены системы окисления субстрата, связанные не с цитохромами,
а с флавинзависимыми оксидазами, которые опосредуют взаимодействие субстрата с О2. При
этом водород ФАД•Н2 может непосредственно передаваться О2 с образованием Н2О2, которые аэробные бактерии расщепляют с помощью каталазы. Накопление пероксида гидрогена у
анаэробов, не имеющих каталазы, приводит к задержке их роста и гибели.
У факультативных анаэробов в качестве конечного акцептора электронов в анаэробных
условиях могут использоваться нитраты с образованием NО3- и NО2-. Этот процесс называется нитрификацией. Вместо цитохромоксидазы у них функционирует нитратредуктаза.
Выделение чистой культуры анаэробных бактерий
В настоящее время достаточно часто у пациентов врачи диагностируют заболевания
бактериальной этиологии, причиной которых являются облигатные анаэробы. Соответственно бактериолог, исследуя материал от больных, содержащий бактерий, которые по особенностям дыхания являются облигатными анаэробами, должен придерживаться определенных
правил при выделении чистой культуры возбудителя и его идентификации. Бактериианаэробы, по-сравнению с бактериями-аэробами, более требовательны к питательным средам, чаще требуют специальных ростовых факторов, требуют также исключить контакт возбудителя заболевания с кислородом воздуха и бактериям-анаэробам характерен длительный
период роста на питательной среде. Соответственно работа с исследуемым материалом, содержащим бактерий-анаэробов, более сложная.
Придерживаясь правила, что кислород воздуха токсичен для возбудителя, забор материала из очага гнойной инфекции рекомендуется производить во время пункции при помощи
шприца, а время между забором исследуемого материала и его посевом на питательную среду должен быть максимально коротким.
Для культивирования бактерий-анаэробов используют специальные питательные среды, которые не должны содержать кислород и должны иметь низкий окислительновосстановительный потенциал (20-150мВ), поэтому в питательные среды добавляют индикаторы – резазурин, метиленовый синий, которые реагируют на изменение окислительновосстановительного потенциала. В случае если возрастает окислительно-восстановительный
потенциал, восстановленные бесцветные формы индикаторов изменяют свой цвет: резазурин
окрашивает питательную среду в розовый цвет, а метиленовый синий – в голубой. Такие изменения указывают на невозможность использования среды для культивирования бактериианаэроба.
Снижение окислительно-восстановительного потенциала достигается добавлением в
среду не менее 0,05 % агара, который одновременно повышает плотность питательной среды
и уменьшает поступление кислорода. Эти особенности достигаются также использованием
свежих (не позже двух часов после приготовления) и редуцированных питательных сред.
Бактериологу необходимо учитывать еще и тот факт, что из-за особенностей бродильного типа метаболизма, характерного для бактерий-анаэробов, эти бактерии при работе с
исследуемым материалом требуют применения сред, обогащенных питательными веществами и витаминами. Чаще всего применяют среды, содержащие кусочки сердца, мозга и печени, соевые и дрожжевые экстракты, гидролитический перевар казеина, пептон. Обязательным является добавление в питательную среду факторов роста (например, твина-80, гемина,
менадиона, цельную или гемолизированную кровь).
Методы создания анаэробных условий
Учитывая тот факт, что молекулярный кислород токсичен для бактерий-анаэробов,
обязательным условием культивирования таких микроорганизмов является ограничение его
поступления. Существует ряд методов (физических, химических, биологических), применение которых исключает контакт бактерии с кислородом воздуха.
Физические методы
1. Перед посевом бактерии в жидкую питательную среду ее обязательно регенерируют для
удаления избытка растворенного кислорода. С этой целью среду кипятят в течение 15-20
минут на водяной бане, а затем быстро охлаждают до определенной температуры.
2. Для предупреждения проникновения кислорода в жидкую питательную среду поверхность
питательной среды заливают слоем стерильного вазелинового масла или пробку в пробирке
или флаконе герметизируют парафином.
3. Культуру сеют уколом в высокий столбик питательной среды (высота питательной среды в
пробирке должна быть 10-12 см). Кислород обычно диффундирует в толщину столбика на
глубину до 2 см, поэтому ниже в питательной среде создаются благоприятные условия для
культивирования бактерий-анаэробов.
4. Эвакуационно-заместительный метод состоит в использовании анаэростата, аппарата Аристовского, эксикатора.
Анаэростат – это герметически закрытая металлическая или пластмассовая банка, из которой выкачали кислород и пространство анаэростата заполнили другим газом например азотом, но обычно пространство
заполняют инертным газом (гелием или аргоном). Допускается использование трехкомпонентной газовой смеси, состоящей из N2 – 85 %, СО2 –
10 % та Н2 – 5 %. Для поглощения кислорода, который остается в анаэростате, применяют катализаторы из палладия или платины. Для поглощения водяного пара применяют СаСl2, силикагель, которые помещают на
дно анаэростата.
Аппарат Аристовского состоит
из металлического цилиндра и
герметической крышки. В цилиндр помещают металлическую
подставку в виде полуведерка, на
которую ставят чашки с посевами
и на другую половинку чашки с
химическими поглотителями кислород-водяной смеси: натрий
гидрогенкарбоната и натрий гидрогенсульфита.
Эксикатор – толстостенный
стеклянный сосуд с притертой
крышкой и подставкой для чашек
Петри. На дно эксикатора ставится запаленная свеча или применяются химические поглотители кислорода. Потом посевы помещают в эксикатор. Притертые поверхности эксикатора
смазывают тонким слоем вазелина, эксикатор закрывают крышкой и ставят в термостат.
Химические методы
1. Применение веществ, поглощающих кислород. С этой целью можно использовать
щелочной раствор пирогалола. При этом учитывают поглотительную активность вещества:
на 100 мл емкости герметического сосуда, в котором находятся чашки Петри, используют 1 г
пирогалола и 10 мл 2,5 N раствора натрия гидроксида.
Кислородсвязывающим эффектом обладает также натрий гидрогенсульфит (NaНSО3).
Для связывания кислорода в 1 л воздуха применяют смесь, состоящую из 100 мл свежего 20 %
раствора NaНSО3 и 16 мл 50 % калий гидроксида.
2. Применение веществ-редуцентов. Учитывая тот факт, что рост облигатно-анаэробных
бактерий происходит в питательных средах с низким уровнем окислительновосстановительного потенциала, в них добавляют специальные восстановители: цистеин (0,030,05 %), тиогликолевую кислоту или натрия тиогликолят (0,01-0,02 %), натрий сульфид, аскорбиновую кислоту (0,1 %), различные сахара.
Функцию восстановителей могут выполнять кусочки паренхиматозных органов животных (печени, почек, сердца)2.
Степень поглощения кислорода или степень восстановления среды измеряют или электрометрически при помощи индикаторов (резазурина, нейтрального красного, феносафранина), или при помощи типичной тест-культуры.
3. Использование специальных газогенерирующих систем, позволяющих создать бескислородные условия в микроанаэростатах, транспортных пластиковых пакетах. Наиболее
распространенной системой является система "Gas Pak". В ее состав входят химические генераторы: натрий гидрогенборат (Na2HBO3) и углекислый газ, натрий карбонат и лимонная
кислота (в таблетках), а также палладиевый катализатор, поглощающий кислород.
Чашки с посевами помещают в микроанаэростат, на дне
которого находится слой палладиевого катализатора. Кончик
пакета "Gas Pak" надрезают
ножницами и в него наливают
10-15 мл воды. Пакет помещают
в микроанаэростат. Через 15-20
минут в микроанаэростате создаются анаэробные условия.
Выделяющийся гидроген взаимодействует с кислородом, образуя воду, а карбонатная кислота образуется при взаимодействии натрий карбоната с лимонной кислотой.
Биологические методы
1. Метод Фортнера. Метод состоит в одновременном культивировании на одной питательной среде аэробных и анаэробных микроорганизмов. Сначала по диаметру чашки вырезают
полоску агара шириной до 0,5-1,0 см. Затем с одной стороны от полоски сеют исследуемый
материал, содержащий возбудителя анаэробной инфекции, а с противоположной –
микроорганизм, являющийся индикатором анаэробных условий (Serratia marcescens или "чудесная палочка"). Край чашки Петри парафинируют. Через определенное время на поверхности
среды сначала вырастает бактерия - аэроб (микроорганизм во время культивирования использует кислород в чашке Петри), а затем вырастает бактерия-анаэроб. При поглощении кисло2
В среде Китта-Тароцци функцию поглотителя кислорода выполняют кусочки печени.
рода Serratia marcescens вырастает в виде бледно-розовых или бесцветных колоний, а при нарушении герметичности – в виде ярко-красных колоний.
В настоящее время созданы стационарные
анаэробные боксы, содержащие все необходимое
для создания анаэробных условий для культивирования бактерий-анаэробов, включая термостаты.
Как правило, такие камеры заполняются трехкомпонентной газовой смесью. Бактериолог, работая в
боксе, находится снаружи и применяет резиновые
перчатки, вмонтированные в стационарный анаэробный бокс. Такое оборудование, безусловно,
имеет значительное преимущество, состоящее в
том, что полностью исключает контакт исследуемого материала с кислородом воздуха.
Выделение и идентификация анаэробных микроорганизмов
Учитывая современный уровень развития микробиологической науки, выделение и
идентификацию культуры анаэробных микроорганизмов можно проводить аналогично выделению аэробных бактерий. Обязательным условием при этом является соблюдение на всех
этапах исследования условий анаэробиоза, используя для этого трехкомпонентную газовую
смесь из N2 – 85 %, СО2 – 10 % та Н2 – 5 % или систему "Gas Pak".
На первом этапе (І день исследования) изучают макроскопические особенности клинического материала, готовят микропрепарат и окрашивают его по методу Грама. Затем исследуемый материал сеют в среду Кúтта-Тарóцци и молоко по Тукаеву. Предварительно среды
регенерируют на кипящей водяной бане в течение 10-20 минут и охлаждают. Непосредственно после посева исследуемого материала среды нагревают на водяной бане при температуре
80°С в течение 20 минут для уничтожения вегетативных неспоровых форм микроорганизмов.
Питательные среды ставят в термостат и культивируют 1-3 суток при температуре 37 °С.
На втором этапе изучают характер
роста микроорганизмов (помутнение, образование осадка и газа в среде КиттаТароцци, пептонизацию молока). Поскольку среда Китта-Тароцци сверху залита слоем вазелинового масла для предупреждения поступления кислорода, пастеровскую пипетку для взятия жидкости погружают в питательную среду, набирают
жидкость, из этой жидкости готовят микропрепарат, окрашивают его по методу
Грама. В микропрепарате бактериолог
должен увидеть большие грамположительные палочковидные бактерии. После
этого бактериолог пересевает культуру по
методу Вейнберга или Цейсслера для получения изолированных колоний.
По методу Вейнберга готовят несколько узких высоких пробирок (3-4) с расплавленным
и охлажденным до температуры 42-45 °С сахарным мясо-пептонным агаром. Возможно использование среды Вильсона-Блера. Материал из среды Китта-Тароцци вносят в первую пробирку при помощи пастеровской пипетки и тщательно перемешивают, затем переносят во вто-
рую, а затем - в третью. Для застывания агара все пробирки быстро охлаждают под струей
холодной водопроводной воды. В результате такой операции живые микробные клетки фиксируются в определенных участках агара. После застывания агара пробирки культивируют
при оптимальной температуре в течение 1-2 суток для образования изолированных колоний.
Содержимое каждой пробирки можно, кроме того, засосать в пастеровскую пипетку или
трубку Виньяля-Вейона, контролируя, чтобы не было пузырьков воздуха. Длина пастеровской
пипетки и трубки 30 см и диаметр 0,5-0,6 см. Верхний конец их, закрывающийся ватой, является вытяжкой, а нижний вытянут виде капилляра. После заполнения пипетки ее вытянутый
конец запаивают и помещают в термостат для культивирования. Через 1-2 суток в агаре вырастают колонии анаэробных бактерий. Для дальнейшей работы с культурой трубку надрезают на определенном уровне, разламывают, культуру берут бактериальной петлей или иголкой,
переносят в соответствующую среду.
Для получения изолированных колоний по методу
Цейсслера3 материал из среды Китта-Тароцци или молока по Тукаеву вносят бактериальной петлей или пастеровской пипеткой (1-2 капли) на чашку Петри с сахарно-кровяным агаром и делают посев шпателем по
методу Дригальского. Не стерилизуя шпатель, засевают
исследуемой культурой вторую чашку Петри со средой,
а затем – третью. Чашки переворачивают вверх дном,
подписывают, помещают в анаэростат, в котором создают анаэробные условия, а затем анаэростат ставят в
термостат и инкубируют при температуре 37 °С 2-3 суток. В последней чашке Петри вырастают изолированные колонии.
Третий этап исследования начинается из изучения особенностей морфологии колоний,
выросших в чашках Петри или в трубках Виньяля-Вейона. Бактериолог обращает внимание на
форму колоний, их размеры, цвет, характер края, рельеф колонии, их консистенцию. Из колоний готовят микропрепараты, окрашивают по методу Грама. После этого колонии пересевают в
среду Китта-Тароцци для получения чистой культуры. Посевы инкубируют определенное
время при оптимальной температуре.
На четвертом этапе обращают внимание на особенности роста чистой культуры возбудителя на соответствующих средах, проверяют их на чистоту и идентифицируют. Идентификация
выделенной культуры анаэробных бактерий подобна идентификации аэробных бактерий, т.е.
идентификацию проводят, изучая особенности морфологии, оценивают культуральные, биохимические и биологические свойства. Обязательно изучают токсигенные свойства возбудителя
при помощи биологической пробы и реакции нейтрализации на лабораторных животных. При
необходимости изучают антигенные свойства возбудителя.
Таким образом, на основании изучения различных свойств микроорганизмов бактериолог определяет вид возбудителя, вызвавшего заболевание.
3
Кровяной агар Цейсслера состоит из мясо-пептонного агара, 1% глюкозы и 20% свежей дефибринированной
крови. Колонию Clostridium perfringens окружает зона гемолиза. Учет роста культуры на среде Цейсслера бактериолог проводит через 10-24 часа и наблюдает за ростом культуры последующие 4-6 суток.
Алгоритм выделения чистой культуры бактерии–анаэроба
І этап
Для накопления возбудителя исследуемый материал посеять в специальую питательную
среду для культивирования бактерий-анаэробов (среду Кúтта-Тарóцци, бульйон Мартена). Посевы залить вазелиновым маслом и инкубировать в термостате (t = 37 °C)
ІІ этап
Сделать учет изменений, которые произошли в среде накопления
(появление помутнение, газообразование)
Приготовить микропрепарат, окрасить
его по методу Грама (изучить особенности морфологии и тинкториальные
свойства возбудителя)
Бульонную культуру набрать
пастеровской пипеткой, материал взять со дна питательной
среды, пройдя через слой вазелинового масла
Пересеять культуру со среды накопления на специальные плотные питательные среды (агар Цейсслера, среду Вильсона-Блера) для получения изолированных колоний.
Инкубировать посевы в термостате
Метод Цейсcлера
Методы получения изолированных колоний
Метод последовательных разведений
Вейнберга
ІІІ этап
Изучить культуральные свойства бактерий. Из типичных колоний приготовить
микропрепараты, окрасить по методу Грама. Остаток колонии посеять в среду Китта-Тароцци для накопления чистой культуры.
ІV этап
Культуру, выросшую после инкубации в среде Китта-Тароцци, проверить на чистоту и идентифицировать по особенностям морфологии, тинкториальным, культуральным, биохимическим, антигенным свойствам
V этап
Сделать учет и анализ результатов исследования.
Окончательный ответ