приспособление микроорганизмов к белому фосфору

Сборник 4‐й Всероссийской интернет‐конференции «Грани науки – 2015» ПРИСПОСОБЛЕНИЕ МИКРООРГАНИЗМОВ К БЕЛОМУ ФОСФОРУ
Миндубаев А.З.,а Волошина А.Д.а, Кулик Н.В.а, Горбачук Е.В.b, Панкова А.В.b,
Яхваров Д.Г.а
а
ФГБУН Институт органической и физической химии им. А.Е. Арбузова КазНЦ РАН,
г. Казань, Россия
b
ФГАОУ ВПО Казанский (Приволжский) федеральный университет, г. Казань, Россия
e-mail: [email protected]
Предыдущие работы нашего коллектива [1, 2] позволили пролить свет на токсичность
белого фосфора для прокариот. Однако, до сих пор биодеградация Р4 наблюдалась в осадках
сточных вод. Данный субстрат имеет важное преимущество – богатое видовое разнообразие
микробного сообщества, позволяющее добиться биодеградации даже такого ксенобиотика,
как белый фосфор [3]. Но ОСВ имеет непостоянство состава и свойств. Следовательно,
дальнейшую работу было необходимо вести в искусственных культуральных средах. Только
в таких средах можно вести селекцию микроорганизмов на способность обезвреживать все
возрастающие концентрации белого фосфора.
Культуры бактерий, выделенных из ОСВ с добавлением белого фосфора, были
идентифицированы на приборе Bruker Daltonik MALDI Biotyper на базе протеомного центра
КФУ. Посев Aspergillus niger, споры которого были внесены вместе с белым фосфором,
производили на среду, источник фосфора в среде – белый фосфор в концентрации 0.01 и
0.05% по массе. В контрольные среды К (+) вносился фосфат. В контрольные среды К (–)
источники фосфора не вносились. В среды попали споры A. niger, вероятно, с белым
фосфором, который не подвергался стерилизации. Через пять суток произвели посев
выросших A. niger на контрольные среды К (+) и К (–). Пересев данной культуры гриба
спустя 42 дня на среду идентичного состава показал, что эмульсия белого фосфора уже не
содержала жизнеспособные споры аспергилла. Через 63 дня был произведен второй пересев
аспергилла на среды аналогичного состава, содержащие 0.01 и 0.05% белого фосфора. Через
84 дня после первого посева был произведен третий пересев A. niger на среды с увеличенной
концентрацией белого фосфора: 0.05, 0.1 и 0.2% по массе. Через 112 дней после первого
посева был произведен четвертый пересев A. niger на среды с еще более увеличенной
концентрацией белого фосфора: 0.5, и 1% по массе. Одновременно был произведен посев
Streptomyces sp. A8, 16S РНК которого была отсеквенирована [4], а также гриба Trichoderma
harzianum на концентрации 0.1%, 0.5 и 1% Р4. Бактерии Pseudomonas alcaliphila, выделенные
на кафедре биохимии КФУ, высевали на среды идентичного состава, содержащие 0.01 и
0.05% белого фосфора. Контролем служил посев на среду с фосфатом. Рост культур
отслеживался по изменению оптической плотности сред. Оптическая плотность измерялась
на фотоэлектроколориметре АР-101 (Apel, Япония) при длине волны 540 нм. Анализ
рибосомных белков, проведенный на кафедре биохимии Казанского федерального
университета, позволил обнаружить пять видов бактерий [5].
По всей видимости, споры плесневого гриба Aspergillus niger попали в среды с
навесками белого фосфора. На средах с 0.01% белого фосфора выросло множество мелких
колоний A. niger, а на средах с 0.05% - меньшее число колоний, но более крупных. Это
означает, что на среде с большей концентрацией ксенобиотика не все споры смогли
прорасти. На пятые сутки пересеяли культуру A. niger, выросшую на 0.05% белого фосфора,
на контрольные среды К (+) и К (–). На среде К (+) с фосфатом выросло значительное число
сравнительно мелких колоний: это означает, что большинство спор проросло, что
естественно в благоприятных условиях. На среде К (–) без источников фосфора колонии
выросли немногочисленные, занимающие сравнительно большую площадь, но очень слабые.
Сказалась нехватка фосфора: агар, используемый для приготовления среды, содержит
примесь фосфата, но недостаточную для полноценного роста грибов. На среде с 0.05%
белого фосфора колоний выросло меньше, чем на К (+), однако они производят впечатление
совершенно нормальных, не испытывающих дефицит питательных веществ. Отсюда следует
Сборник 4‐й Всероссийской интернет‐конференции «Грани науки – 2015» вывод, что на среде с белым фосфором выживают не все споры гриба, но выжившие
обладают способностью использовать в качестве источника фосфора либо сам белый
фосфор, либо продукты его химических превращений.
В четвертом пересеве аспергилла (и втором стрептомицетов) концентрацию белого
фосфора в среде снова увеличили до 0.5 и 1% по массе. Через четверо суток на среде с
содержанием белого фосфора 0.5% наблюдался рост мелких колоний аспергилла, имеющих
еще белый цвет (то есть рост сильно замедлен). Одновременно с четвертым посевом
аспергилла и вторым посевом стрептомицетов был также произведен посев Streptomyces sp.
A8. Кроме того, был посеян гриб Trichoderma asperellum, любезно предоставленный
кафедрой биохимии ИФМиБ КФУ, на концентрации 0.1, 0.5 и 1 %. Через четверо суток в
среде с самой малой концентрацией выросла одна крупная колония триходермы, т.е. данный
гриб тоже способен усваивать белый фосфор. S. sp. A8 растет на 0.2% Р4. В средах с 1% Р4
рост триходермы стал наблюдаться только на 11 сутки после посева. То есть триходерма T.
asperellum проявила бóльшую устойчивость к белому фосфору, чем A. niger и тем более
стрептомицеты [6]. Концентрация белого фосфора 1% это превышение ПДК в сточных водах
в 5000 раз [7]! Третий пересев Streptomyces sp. впервые продемонстрировал рост
устойчивости микроорганизмов к белому фосфору в процессе селекции. На 22 сутки после
посева наблюдался рост стрептомицета в среде, содержащей 0.5% белого фосфора! В
предыдущих посевах S. sp. рос на концентрациях не более 0.2%, т.е. устойчивость к белому
фосфору – признак, усиливающийся в результате направленной селекции. После шестого
посева Aspergillus niger наблюдается начало роста гриба в среде с 1% белого фосфора. То
есть, A. niger после нескольких пересевов тоже выработал большую устойчивость. Бактерии
Pseudomonas alcaliphila [6] высевали на те же самые среды, на которые был произведен
второй посев аспергилла. Результаты посева продемонстрировали, что эти бактерии, в
отличие от грибов и актиномицетов, не растут на средах, содержащих белый фосфор в
качестве единственного источника фосфора. Это является аргументом в пользу того, что он
разлагается под воздействием ферментных систем.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (грант 14-08-31091 мол_а).
1) Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Кулик Н.В., Ахоссийенагбе С.К., Минзанова С.Т., Миронова
Л.Г., Яхваров Д.Г., Алимова Ф.К. Детоксикация белого фосфора при помощи микроорганизмов //
Сборник тезисов II Всероссийской Интернет-конференции «Грани науки 2013». Казань, апрель-июнь
2013 г. С.436-437.
2) Миндубаев А.З., Ахоссийенагбе С.К., Горбачук Е.В., Яхваров Д. Г. Процессы метаболизма белого
фосфора // Сборник тезисов III Всероссийской Интернет-конференции «Грани науки 2013». Казань,
май-июнь 2014 г. С.230-231.
3) Миндубаев А.З. Яхваров Д.Г. Фосфор: свойства и применение // Бутлеровские сообщения. 2014.
Т. 39. № 7. С. 1-24.
4) Болормаа Ч., Сапармырадов К.А., Алимова Ф.К., Миндубаев А.З. Сравнение показателей
фитотоксичности, фунгицидной и бактерицидной активности стрептомицетов из различных
местообитаний // Бутлеровские сообщения. 2014. Т. 38. № 6. С. 147-152.
5) Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Горбачук Е.В., Кулик Н.В., Алимова Ф.К., Минзанова С.Т.,
Миронова Л.Г., Сапармырадов К.А., Хаяров Х.Р., Яхваров Д.Г. Включение белого фосфора в
природный круговорот веществ. Культивирование устойчивой микрофлоры // Бутлеровские
сообщения. - 2015. - Т. 41. - № 3. – С. 54-81.
6) Миндубаев А.З., Волошина А.Д., Горбачук Е.В., Кулик Н.В., Ахоссийенагбе С.К., Алимова Ф.К.,
Минзанова С.Т., Миронова Л.Г., Панкова А.В., Болормаа Ч., Сапармырадов К.А., Яхваров Д.Г. Белый
фосфор как новый объект биологической деструкции // Бутлеровские сообщения. 2014. Т. 40. № 12.
С. 1-26.
7) Barber J.C. Processes for the disposal and recovery of phossy water. Номер патента: US5549878,
заявлен: 24 мая 1995, выдан: 27 августа 1996.