Клюшин Н. М., Науменко З. С., Годовых Н. В., Розова Л. В

Вестник Челябинского государственного университета. 2012. № 31 (285).
Физика. Вып. 15. С. 26–31.
МEДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА
Н. М. Клюшин, З. С. Науменко, Н. В. Годовых, Л. В. Розова,
А. В. Злобин, И. В. Бычков, А. А. Федий, И. С. Зотов, Д. А. Калганов
ВЛИЯНИЕ ИОНОВ НЕКОТОРЫХ МЕТАЛЛОВ НА РОСТ
STAPHYLOCOCCUS AUREUS И PSEUDOMONAS AERUGINOSA
Исследуется влияние постоянного электрического тока и продуктов электролиза на рост патогенных микроорганизмов в биопленках. При данном воздействии грамотрицательные бактерии оказались менее устойчивы к электрическому току и продуктам электролиза по сравнению с грамположительными. Показано, что для получения стерилизующего эффекта имеет существенное значение материал, из которого изготовлены электроды. Наибольшее угнетающее действие на бактерии
производят ионы свинца и олова, тогда как ионы алюминия и цинка в этом отношении оказались
инертны.
Ключевые слова: антибактериальная терапия, бактерицидный эффект, электрический
ток, электролиз, ионы металлов, биопленки, золотистый стафилококк, синегнойная палочка,
остеомиелит.
Введение
Известно, что чаще всего инфекционные
осложнения у больных, находящихся на стационарном лечении, вызывают стафилококки
и грамотрицательные бактерии. Наибольший
удельный вес в общей структуре выделенных
микроорганизмов приходится на Staphylococcus
aureus (SA), Escherichia coli и Pseudomonas aeruginosa (PA) [1]. Роль бактерий в раневом инфекционном процессе определяется их способностью к продукции факторов патогенности.
К таковым прежде всего относятся факторы инвазивности, т. е. способствующие внедрению
микробов в живые ткани. Классическим фактором инвазивности считается гиалуронидаза стафилококков. Адгезивная способность золотистого стафилококка выражена в отношении эпителиальной ткани и компонентов сгустка крови:
фибриногена, фибрина, тромбоцитов. Поэтому
чаще всего золотистый стафилококк становится возбудителем инфекций мягких тканей, раневой инфекции, остеомиелитов. Другим свойством, определяющим выживаемость бактерий
в макроорганизме и распространение инфекции,
является их способность формировать биопленки, что приводит к хронизации инфекционного
процесса и осложнению клинической картины
болезни. Нидерландскими учеными была продемонстрирована возможность использования
электрического тока (60–1000 мкА) в профилактике вторичного инфицирования чрескожных
имплантатов. Под воздействием слабых электри-
ческих токов происходит разрушение биопленки на поверхности проводника (имплантата).
Показано также, что бактериальная пленка более чувствительна к подобным воздействиям на
ранних стадиях формирования, а сохранившиеся
на поверхности имплантата бактерии обладают
меньшей жизнеспособностью [2]. Использование
постоянных электрических токов в антибактериальной обработке приводит к появлению свободных радикалов, пероксида и молекул хлора, которые являются токсичными. В связи с этим время и интенсивность воздействий электрического
тока должны быть ограничены [3]. Ранее показана эффективность длительных воздействий (до
нескольких суток) электрических токов малой
интенсивности (до 2 мА) для подавления роста
SA и PA [4]. Бактерицидный эффект электрического тока сохраняется в естественных условиях
при антибактериальной обработке хронических
инородных тел и при хронических инфекционных процессах (остеомиелит) [5]. Применение
электрического тока в комбинации с другими ингибиторами роста бактерий значительно
усиливает его полезное действие. Наилучшие
результаты в естественных условиях показывают чередование электрического и теплового
воздействий, а также совместное применение
электрического тока и антибактериальных препаратов [6]. Наибольший интерес при антибактериальной обработке постоянным электрическим
током представляют исследования, связанные
с материалом электродов и возможностью со-
Влияние ионов некоторых металлов на рост Staphylococcus Aureus и Pseudomonas Aeruginosa…
здания антимикробных веществ или антибиотика на их поверхности [7].
Цель данного исследования: изучить бактерицидный эффект постоянного электрического тока, а также продуктов электролиза
в отношении штаммов Staphylococcus aureus
и Pseudomonas aeruginosa.
Материалы и методы. Для исследования
использовался питательный агар Мюллера—
Хинтона («Himedia», Индия), взвесь суточных
культур музейных штаммов (Staphylococcus aureus АТСС № 25923 и Pseudomonas aeruginosa
АТСС № 27853. Штаммы получены из НИИ
стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л. А. Тарасевича,
Москва) и «газоны» указанных микробных
культур. Музейные культуры выращивались
в пробирках на скошенном агаре Мюллера—
Хинтона при температуре 37 °С, после чего
смывались 0,5 %-м раствором NaCl (pH 7,2–
7,4). Бактериальную взвесь стандартизировали с помощью денситометра «Densimat» («bio
Merieux», Франция), доводя плотность исходной
суспензии до 0,3 единиц (1 млрд/мл) по стандарту McFarland. Для приготовления «газона» использовали инокулюмы исследуемых микроорганизмов.
27
Экспериментальная установка
Экспериментальная установка (рис. 1) состоит
из источника постоянного тока с возможностью
регулировки значений напряжения и тока, миллиамперметра, вольтметра, чашки Петри и рамки с электродами. В исследованиях использовались различные электроды: из меди, графита,
бронзы, алюминия, цинка, сплава Sn 60 % Pb
40 %. Это позволило судить о влиянии не только
постоянного тока, но и продуктов электролиза.
Величина протекающего тока варьировалась
от 6 до 130 мА при напряжениях от 5 до 20 В.
Время экспозиции составляло от 3 до 10 мин.
Бактерицидное действие тока оценивали по отсутствию роста микробной культуры на пластинке питательной среды или наличию зоны
подавления роста вокруг электродов. Каждый
эксперимент повторяли не менее трех раз.
Результаты исследования
Результаты, полученные при воздействии постоянным электрическим током от 30 до 37 мА,
подводимым через графитовые электроды на
культуру SA, представлены в табл. 1 и на рис. 2.
При длительности воздействия в 6 мин. наблюдались зоны подавления роста микробной
культуры диаметром 10 мм (катод) и 32 мм
(анод).
Рис. 1. Схема лабораторной установки: 1 — питательная среда; 2 — электроды;
3 — микробные культуры; 4 — изолятор для крепления электродов; 5 — чашка Петри
28
Н.М.Клюшин,З.С.Науменко,Н.В.Годовых,Л.В.Розова,А.В.Злобин,И.В.Бычков,А.А.Федий,И.С.Зотов,Д.А.Калганов
Таблица 1
Бактерицидный эффект постоянного тока, подводимого через графитовые электроды,
на Staphylococcus aureus
Состав
электродов
Графит
Ток (мА)
15
15
Время экспозиции
(мин)
6
8
Наличие зоны ингибирования роста
микробной культуры
+ (вокруг анода и катода)
+ (единичные колонии)
Рис. 2. Действие электрического тока (графитовые электроды)
При увеличении времени экспозиции до
8 мин. наблюдался рост единичных колоний по
всей поверхности пластинки питательной среды,
что свидетельствует об угнетающем действии
электрического тока на рост биопленки.
Было оценено действие постоянного электрического тока, подводимого к питательной среде
через медные электроды, на бактерии в зависимости от времени воздействия и вида микроорганизма (табл. 2, рис. 3.).
Оказалось, что действие тока в течение 3 мин.
не обладало стерилизующим эффектом ни на
грамположительные (SA), ни на грамотрицательные (PA) бактерии. При увеличении времени
экспозиции до 5 мин. отмечали бактерицидный
эффект в отношении PA, но не SA, причем указанный эффект проявлялся при величине тока
15 мА и 20 мА. Полное подавление (ингибирование) роста SA и PA наблюдали при увеличении
времени экспозиции до 10 мин. независимо от
устанавливаемого тока.
Показано, что бактерицидный эффект действия электрического тока зависит от материала, из которого изготовлены электроды (табл. 3).
Так, зона ингибирования роста золотистого стафилококка увеличивалась «в направлении»
медь — бронза — сплав Sn 60 % Pb 40 %, причем при использовании этого сплава в качестве электрода угнетение роста наблюдали по
всей поверхности пластинки питательной среды
в чашке Петри, а не только в зоне расположения
электродов (рис. 4). В то же время массивный
сплошной рост бактерий наблюдался при применении электродов из алюминия и цинка.
Обсуждение результатов
Применение в экспериментах нейтральных
графитовых электродов показало, что при малом времени воздействия электрическим током
подавление микробной культуры в анодной
и катодной областях различно. При увеличении
времени экспозиции до 8 мин. и более проис-
29
Влияние ионов некоторых металлов на рост Staphylococcus Aureus и Pseudomonas Aeruginosa…
Таблица 2
Бактерицидный эффект постоянного тока, подводимого через медные электроды,
на взвесь микробных культур Staphylococcus aureus и Pseudomonas aeruginosa
Микроорганизм
Staphylococcus aureus
Pseudomonas aeruginosa
Ток (мА)
Время экспозиции
(мин)
I·t
(мА/мин)
Наличие зоны
ингибирования роста
5
5
10
10
15
15
20
20
5
5
10
10
15
15
20
20
3
10
3
5
5
10
5
10
3
10
3
5
5
10
5
10
15
50
30
50
75
150
100
200
15
50
30
50
75
150
100
200
–
+
–
–
–
+
–
+
–
+
–
–
+
+
+
+
Рис. 3. Действие электрического тока (медные электроды)
ходило подавление роста по всей поверхности
питательной среды, что свидетельствовало не
только об угнетающем действии электрического тока на микробную популяцию, но и о влиянии продуктов электролиза воды и питательной
среды.
Анализ результатов экспериментов, в которых
применялись медные электроды (табл. 2), показал различия для популяций SA и PA. В первом
случае зона ингибирования роста зависит от времени действия тока (ингибирование начинается
при экспозиции около 10 мин.); во втором — как
от времени, так и от величины тока. В данном
случае в качестве параметра ингибирования целесообразно взять произведение тока на время
I · t. Т. е. Pseudomonas aeruginosa в большей степени реагирует на концентрацию ионов меди
в питательной среде, чем Staphylococcus aureus.
Отсутствие реакции на алюминиевые и цинковые электроды, возможно, связано с тем, что на
поверхности этих металлов образуются устойчивые плотные оксидные пленки.
30
Н.М.Клюшин,З.С.Науменко,Н.В.Годовых,Л.В.Розова,А.В.Злобин,И.В.Бычков,А.А.Федий,И.С.Зотов,Д.А.Калганов
Таблица 3
Действие постоянного тока, подводимого через электроды из различных металлов,
на Staphylococcus aureus
Тип электрода
Время экспозиции (мин)
6
Ток, мА
Размер зоны
ингибирования
I — 39×32 мм;
Графит (газон)
87,8–83,8–81,5–78,5–74,8–71,5
Графит (взвесь)
98–102–110–113–120–127–133
8
II — 45×10 мм
Единичные колонии
Медь (газон)
167–113–93–82–76
5
I — 37×5 мм;
Медь (газон)
6–23
10
II — рост бактерий
I — 52×5 мм;
Сплав Sn 60 % Pb
53–55–58,2–58,8–58,5–54,3–49,8–33,5–
10
II — рост бактерий
Единичные колонии
40 % (взвесь)
Бронза (газон)
26,5–22,8
104,5–83,3–62,8–47,8–42,1–37,5
Бронза (газон)
5
I — 60×6 мм;
61,6–21,8–14,2–12,1–10,5–0,97–0,88–0,86–
10
II — 6×3 мм
I — 70×13 мм;
Алюминий (взвесь)
0,79–0,75
52,8–60,0–61,9–63,9–66,0–67,8–69,0–
10
II — 24×6 мм
Массивный рост
Цинк (взвесь)
69,5–68,9–68,5–68,2
80,6–83,9–87,1–90,2–93,3–96,8–99,5–
10
Массивный рост
102,2–103,9–103,3–102,8
Рис. 4. Действие электрического тока (электроды — сплав Sn 60 % Pb 40 %)
Следует отметить еще один момент. Известно,
что импедансометрия мышечных и нервных тканей показывает, что токи низкой частоты проте-
кают в основном в межклеточном пространстве,
а во внутриклеточное пространство тканей через
мембраны проникают токи высокой частоты диа-
Влияние ионов некоторых металлов на рост Staphylococcus Aureus и Pseudomonas Aeruginosa…
пазона 400–1000 кГц. Возможно, токи высокой
частоты окажут более сильный бактерицидный
эффект за счет проникновения во внутриклеточное пространство микроорганизмов. Кроме того,
эффекты электролиза будут минимальными при
действии токов высокой частоты.
Таким образом, постоянный электрический
ток и продукты электролиза в биопленках оказывают бактерицидный эффект на патогенные микроорганизмы, причем изученные грамотрицательные бактерии оказались менее, чем грамположительные, устойчивы к электрическому току
и ионам металлов, образующимся при электролизе. Для получения стерилизующего эффекта
имеет существенное значение материал, из которого изготовлены электроды. Показано, что
наибольшим угнетающим действием на бактерии обладают ионы свинца и олова, тогда как
ионы алюминия и цинка в этом отношении оказались инертны.
Список литературы
1. Голуб А. В. Новые возможности профилактики инфекций области хирургического вмешательства // Клин. микробиология и антимикроб.
химиотерапия. 2011. Т. 1. С. 56–66.
2. Van der Borden, A. J. Electric Current-Induced
Detachment of Staphylococcus epidermidis Biofilms
31
from Surgical Stainless Steel / A. J. Van der Borden
[et al.] // Appl Environ Microbiol. 2004. Vol. 70.
P. 6871–6874.
3. Giladi, M. Microbial Growth Inhibition by
Alternating Electric Fields / M. Giladi [et al.] //
Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2008.
Vol. 52. P. 3517–3522.
4. Jose, L. P. The Electricidal Effect: Reduction
of Staphylococcus and Pseudomonas Biofilms by
Prolonged Exposure to Low-Intensity Electrical
Current / L. P. Jose [et al.] // Antimicrobial Agents
and Chemotherapy. 2009. Vol. 53. P. 41–45.
5. Jose, L. P. The Electricidal Effect Is Active in an
Experimental Model of Staphylococcus epidermidis
Chronic Foreign Body Osteomyelitis / L. P. Jose [et
al.] // Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 2009.
Vol. 53. P. 4064–4068.
6. Giladi, M. Microbial Growth Inhibition
by Alternating Electric Fields in Mice with
Pseudomonas aeruginosa Lung Infection / M. Giladi
[et al.] // Antimicrobial Agents and Chemotherapy.
2010. Vol. 54. P. 3212–3218.
7. Rabinovitch, C. Removal and Inactivation of
Staphylococcus epidermidis Biofilms by Electrolysis
/ C. Rabinovitch, Ph. S. Stewart // Appl Environ
Microbiol. 2006. Vol. 72. P. 6364–6366.