Хищные грибы гифомицеты против паразитических нематод
реклама
МЕТОДЫ И СРЕДСТВА УДК 632.937 Хищные грибы/гифомицеты против паразитических нематод Т.В. ТЕПЛЯКОВА, Г.Г. АНАНЬКО Хищные грибы$гифомицеты найдены практически во всех ча$ стях мира, известно более 100 их видов. Наши исследования под$ твердили широкую распростра$ ненность хищных грибов в приро$ де. Из почв Новосибирской обла$ сти нами выделено 85 штаммов хищных грибов, из почв окрестно$ стей Кишинева – 12. Механизм хищничества, воз$ никший в результате длительной сопряженной эволюции, незави$ симо от типа ловушки (клейкие петли или головки, сжимающиеся кольца и т.д.) включает выделение аттрактантов и токсических ве$ ществ, проникновение гифы гри$ ба внутрь тела парализованной нематоды, выделение ферментов и антибиотиков для эффективной утилизации жертвы и предотвра$ щения развития конкурирующих микроорганизмов. Для защиты растений от нематод хищные гри$ бы$гифомицеты представляют наибольший практический инте$ рес, так как не вызывают устойчи$ вости у вредителя, не загрязняют почву токсинами и не оказывают отрицательного воздействия на полезные организмы. На примере представителей рода Arthrobotrys нами впервые установлено, что хищные грибы существуют в почве в виде особой жизненной формы – хламидос$ пор. Конидии, появляющиеся на конидиеносцах при выделении хищных грибов из почвы и их дальнейшем выращивании на ага$ ризованных питательных средах, не являются структурами, опре$ 22 деляющими эффективность по отношению к нематодам в приро$ де и устойчивость к почвенному фунгистазису. Незнанием этих особенностей объясняются отри$ цательные результаты опытов, когда полученные в лабораторных условиях данные об эффективно$ сти выделенных из почвы штам$ мов хищных грибов не всегда со$ впадали с данными вегетацион$ ных или полевых экспериментов. Это было показано на примере пяти штаммов грибов рода Arthrobotrys, проявляющих in vitro практически одинаковую немато$ фаговую активность. Но опыты, проведенные в естественных ус$ ловиях с помощью мембранных камер, свидетельствовали, что только два штамма могли являть$ ся продуцентами препарата. У не$ активных штаммов в почве наблю$ дался быстрый лизис конидий, мицелия, ловушки были немного$ численны (5–45 на фильтр), тогда как у активных к 14$м суткам на$ блюдали от 500 до 850 ловушек на фильтр и нарастание числа хла$ мидоспор. Выявление периодичности в по$ явлении ловушек в почве и макси$ мального их образования через 2 недели после внесения грибов в почву объясняет и подтверждает выводы первых исследователей о целесообразности внесения пре$ парата хищных грибов в почву не менее чем за 2–3 недели до вы$ садки растений. Хищные грибы имеют в почве свою экологическую нишу, трофи$ чески связанную с нематодами. Крупные хламидоспоры с их тол$ А Б 1. Микроморфология штамма Arthrobotrys oligospora Fres. BKM F – 3062D: А – конидии и спонтанная ловушка, ×400; Б – клейкие петли гриба вокруг нематоды, ×400 А 2. Микроморфология штамма Duddingtonia flagrans Dudd. FG882: А – конидии и хламидоспоры, ×200; Б – нематода в клейких петлях, ×200 Б РЕЗЕРВЫ БИОМЕТОДА Б А 3. Растения огурца сорта Эффект через месяц после высадки рассады в грунт: А – опытная теплица, Б – контрольная стыми меланизированными обо$ лочками недоступны для клещей, амеб и других представителей по$ чвенной фауны. Ловушки, появле$ ние которых инициируется при$ сутствием личинок нематод, час$ то возникают сразу на ростковой гифе. На поверхность ловушек выделяются биологически актив$ ные соединения, участвующие в механизме хищничества. Они не растворимы в воде и не подвер$ гаются быстрому разрушению по$ чвенными микроорганизмами. Особая роль в этих процессах принадлежит терпеновым соеди$ нениям. Одна из важных задач – поиск эффективных штаммов и изуче$ ние их нематофаговой эффектив$ ности не только в лабораторных, но и природных условиях. Из выделенных нами нематофа$ говых грибов для практического применения представляют инте$ рес два штамма хищных грибов$ гифомицетов, с которыми, в рам$ ках проекта АФГИР (Американс$ кий фонд гражданских исследова$ ний и развития), проводится ра$ бота по созданию биопрепарата для защиты растений от парази$ тических нематод. Первый штамм Arthrobotrys oligospora Fres. BKM F – 3062D (рис. 1) получен путем моноконидиального отбора из изолята, выделенного в 1982 г. из почвы березового насаждения в окрестностях п. Краснообск Но$ восибирской области. Конидиеносцы простые с 1–2 уз$ лами на вершине. Конидии имеют средний размер 27,2 × 16,1 мкм, удлиненно грушевидные, двукле$ точные, собраны в головки по 6 и более конидий. Ловчие органы в виде петель, колец и их сплетений могут образовываться спонтан$ но на питательной среде. При$ сутствие нематод стимулирует массовое образование колец. В 1990 г. нами была разработана технология получения биопрепа$ рата нематофагин$БЛ на основе этого штамма в условиях биола$ бораторий. Второй штамм Duddingtonia flagrans Dudd. F$882, патент РФ 225367 (рис. 2). был выделен из тепличного грунта в совхозе «Ки$ ровец» (г. Новосибирск) в 1989 г. В культуре в основном форми$ руются круглые хламидоспоры диаметром 25–55 мкм с темно$ко$ ричневой и толстой грубо$боро$ давчатой оболочкой. В присут$ ствии нематод этот штамм так же, как и предыдущий, образует клей$ кие петли и их сплетения. Оба штамма поддерживаются в Коллекции культур микроорганиз$ мов ГНЦ «Вектор». Имеется зак$ лючение Научно$исследовательс$ кого института медицины труда и экологии человека Российской академии медицинских наук (г. Ан$ гарск), аккредитованного как ис$ пытательный центр в Системе сертификации ГОСТ Р (РОСС. RU. 0001. 510164) о невирулентности, нетоксичности, нетоксиногеннос$ ти вышеназванных штаммов. Обоснован способ получения биопрепарата на основе мицелия глубинной культуры хищных гри$ бов. Получение жидкой формы эко$ номически выгодно и экологичес$ ки целесообразно. Хотя такая форма не может длительно хра$ ниться, она эффективна и может производиться непосредственно перед применением. Для получе$ ния препарата с длительным сро$ ком хранения (до 2 лет) требова$ лось разработать регламент по$ лучения препарата на основе D. flagrans, содержащего хлами$ доспоры, устойчивые к неблаго$ приятным условиям. С этой целью могут использоваться известные способы выращивания грибов на зерне злаковых культур, особен$ но в условиях биолабораторий. Нами создан способ получения 23 МЕТОДЫ И СРЕДСТВА биопрепарата на вермикулите, который позволяет через 5 суток после внесения в вермикулит 2$суточной жидкой культуры гри$ ба получать сухой препарат, со$ держащий в 1 г 4–6 × 105 хлами$ доспор. Для проведения опытов жидкую форму в небольших количествах получали с помощью ферментера БИОК. Для масштабных испыта$ ний жидкого препарата в 2005 г. была проведена наработка в ООО ПО «Сиббиофарм» 6,5 т жидкого препарата. Испытания проводили на овощных культурах в теплич$ ном комбинате ОАО «Суховский» (г. Кемерово) и в теплице Новоси$ бирского метрополитена, на зем$ лянике во Всероссийском инсти$ туте биологической защиты рас$ тений (г. Краснодар) и на цветоч$ ных и декоративных культурах в тепличном комбинате «Цветы Си$ бири» (г. Новосибирск). Жидкая и сухая препаративные формы испытаны нами против зо$ лотистой картофельной немато$ ды, которая активно распростра$ няется в Новосибирской области. В этой работе принимала участие фитогельминтолог Т.Н. Шиабова. Поскольку часть результатов опубликована, здесь хотелось бы привести только некоторые дан$ ные и остановиться на их обсуж$ дении, чтобы были лучше понят$ ны свойства хищных грибов и осо$ бенности их использования на практике для защиты растений от нематод. Для отработки доз применения сухой формы препарата (на вер$ микулите) против галловых нема$ Ò à áë è ö à 1 Ç à âè ñ è ì î ñ òü ï î ê à çà òå ë å é ð à çâè òè ÿ ð à ñ òå í è é î ãó ð ö à ñ î ð òà K î ð î ë å ê è è õ ï î ð à æ å í è ÿ ì å ë î é ä î ãè í î çî ì î ò ä î çû ï ð å ï à ð à òà ÷ å ð å ç ì å ñ ÿö ï î ñ ë å å âí å ñ å í è ÿ Â û ñîòà ðàñòåí è é (ñì ) Â àðè àí ò D . fla g ra n s F - 8 8 2 ( ñ ó õ à ÿ ô î ð ì à ), 1 % Ò î æå, 2 % », 3 % K î í òð î ë ü 1 4 ± 0 ,3 1 3 ,4 ± 0 ,2 1 2 ,9 ± 0 ,2 1 2 ,5 ± 0 ,2 Ï ëîù àäü Á àëë ï îðàæ åí è ÿ Ä ëèíà ëè ñòîâîé êîðíÿ ìåëîéäîï ë àñòè í û ê î ð í ÿ (ñì ) ãè í î çî ì (ñ ì 2) 6 4 ± 1 ,2 1 5 ± 0 ,3 1 6 2 ,6 ± 1 1 2 ,7 ± 0 ,3 1 5 1 ,6 «2 ,2 1 2 ,1 ± 0 ,3 1 4 4 ± 2 ,5 1 0 .5 ± 0 ,5 5 Ò à áë è ö à 2 Â ë è ÿí è å ï ð å ï à ð à òà í à î ñ í î âå ø òà ì ì à D ud d in g t o n ia fla g ra n s F - 8 8 2 í à çà ð à æ å í í î ñ òü ð à ñ òå í è é ê à ð òî ô å ë ÿ G lo b o d e ra ro s t o c h ie n s is ( ñ ð å ä í å å ï î ï î âòî ð í î ñ òÿì ) Â àðè àí ò Ñ âè òà í î ê Æ è ä ê à ÿ ô î ð ì à K è å âñ ê è é Ñ ó õ à ÿ K î í òð î ë ü Ë þ áà âà Æ èäêàÿ ôîðìà Ñóõàÿ K î í òð î ë ü Í è ê è òà Æ èäêàÿ ôîðìà Ñóõàÿ K î í òð î ë ü 24 Ô àçà á óòîí è çàö è è Ñ àì îê Á è î ë î ãè ÷ å ñê àÿ íà îäíî ýô ô åê òè âí îñòü ðàñòåí è å (% ) ( ý ê ç .) 1 6 ,3 ± 2 ,8 2 8 ,2 5 ± 0 ,8 7 7 ,9 2 2 ,7 ± 3 ,2 5 ± 0 ,8 7 9 ,2 3 ± 0 .5 8 7 ,5 2 4 ± 3 ,9 0 0 0 0 0 0 Ó á îðê à ê ëóá í åé Ñ àì îê Á è î ë î ãè ÷ å ñê àÿ íà îäíî ýô ô åê òè âí îñòü ðàñòåí è å (% ) ( ý ê ç .) 1 2 ± 1 ,8 52 8 ± 1 ,2 68 2 5 ± 4 ,1 8 ± 1 ,1 60 6 ± 0 ,9 70 2 0 ± 3 ,2 0 0 0 0 0 0 тод растений был заложен вегета$ ционный опыт. В сосуды помеща$ ли по 400 г почвы, взятой из очага сильного поражения корневой си$ стемы огурца мелойдогинозом (5 баллов). Доза внесенного препа$ рата составляла 1, 2 и 3 % от мас$ сы почвы. В каждом варианте было по 20 сосудов. В них выса$ живали проросшие семена огур$ ца сорта Королек. Через 1 месяц измеряли высоту растений, пло$ щадь листовых пластин, длину корней и балл поражения корне$ вой системы мелойдогинозом (табл. 1). Хотя корневая система у всех опытных растений была в основ$ ном очищена от нематод, наилуч$ шими рост и развитие растений были в варианте с 1 % препара$ том, что, возможно, связано с не$ значительным токсическим эф$ фектом биопрепарата в повышен$ ных дозах на начальных стадиях развития растений огурца. Этот опыт подтвердил полученные нами ранее данные об оптималь$ ной дозе применения биопрепа$ рата для защиты растений от не$ матод. Была изучена эффективность биопрепарата на других видах па$ разитических нематод, в частно$ сти, на цистообразующей нема$ тоде картофеля – культуры, зани$ мающей в Сибири одно из веду$ щих мест. На участке с высоким уровнем зараженности почвы картофель$ ной нематодой Globodera rosto$ chiensis (10–12 тысяч личинок на 100 г почвы) препарат на основе штамма D. flagrans F$882 в сухой и жидкой форме вносили под сор$ та картофеля Свитанок Киевский, Любава (восприимчивые к нема$ тоде) и Никита (устойчивый) в дозе 150 г/м2 в лунки при посадке в мае 2006 г. По всем сортам на стадии всхо$ дов отмечали стимулирующее влияние препарата, особенно в РЕЗЕРВЫ БИОМЕТОДА жидкой форме. Данные по дей$ ствию препарата на зараженность картофеля нематодой представ$ лены в табл. 2. Снижение зараженности карто$ фельной нематодой у восприим$ чивых сортов было выше в вари$ антах с препаратом на вермикули$ те по сравнению с жидкой фор$ мой (68–70 % против 52–60 %), хотя по урожайности на воспри$ имчивых сортах лучше себя про$ явила жидкая форма, что, воз$ можно, связано со стимулирую$ щим эффектом, который отме$ чался у этой формы уже на стадии всходов. В декабре 2005 – начале января 2006 г. был заложен опыт для оценки не только нематофагово$ го эффекта жидкой формы препа$ рата, его стимулирующего влия$ ния на рост и развитие растений, но и пролонгированности дей$ ствия. В двух теплицах (каждая площа$ дью по 1500 м2), сильно заражен$ ных нематодами, внесли препа$ рат в дозе 1 % от массы почвы под растениями огурца сорта Эффект (2 л/м2), всего 2400 л препарата на теплицу. 28 февраля 2006 г. опытные растения выглядели луч$ ше, чем контрольные, были выше на 25–30 см, с зелеными листья$ ми, а собранный урожай на мо$ мент учета – выше, соответствен$ но 641 и 630 кг/м2, по сравнению с 229 и 531 кг/м2 в контроле. Данные по урожайности огурца в этих же теплицах за 2006– 2008 гг. свидетельствуют о дли$ тельности эффективного дей$ ствия биопрепарата на растения. В первом обороте в 2006 г. уро$ жайность огурца в опытных тепли$ цах была выше на 0,1–1 кг/м2, в 2007 г. – на 0,6–0,7, в 2008 г. – на 1,3–2,8 кг/м2, по сравнению с кон$ тролем. Пролонгированный эффект прослеживался и при сравнении урожайности аналогичных гибри$ дов огурца и томата во втором обороте. Такой эффект мы наблю$ дали ранее при испытании в теп$ личных комбинатах «Кировец» г. Новосибирска и «Индустриаль$ ный» г. Барнаула. Специальные опыты в сосудах подтвердили за$ щитное действие хищных грибов от галловых нематод в течение 3 лет, что связано с жизнеспособ$ ностью хламидоспор в почве и их способностью переживать небла$ гоприятные периоды, такие как высушивание почвы, понижение температуры, некоторые обра$ ботки. Результаты вегетативных и про$ изводственных опытов на овощ$ ных культурах по влиянию сухой и жидкой форм препарата на осно$ ве Duddingtonia flagrans на пора$ женность растений паразитичес$ кими нематодами свидетельству$ ют об их эффективности. Оптимальной дозой для жидкой формы препарата при сплошной обработке является 2 л на 1 м2, су$ хого препарата – 100–150 г/м2. Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора ЛИТЕРАТУРА Агасьева И.С., Федоренко Е.В., Тепля кова Т.В., Ананько Г.Г. Испытание нема$ тофагового препарата на основе гриба Duddingtonia flagrans против стеблевой нематоды земляники Anguillulina dipsaci Ritz. /Материалы докладов научно$практ. конф. «Биологическая защита растений, перспективы и роль в фитосанитарном оздоровлении агроценозов и получении экологически безопасной сельскохо$ зяйственной продукции», Краснодар, 2008, вып. 5, с. 189–193. Беккер З.Э. Терпеновый обмен грибов из родов Trichothecium и Arthrobotrys и гипотеза механизмов хищничества и микопаразитизма. /Известия АН Турк$ менской ССР, 1972, № 6, с. 28–33. Теплякова Т.В. Биоэкологические ас$ пекты изучения и использования хищных грибов$гифомицетов. – Новосибирск, 1999, 252 с. Теплякова Т.В., Ананько Г.Г., Агасье ва И.С., Федоренко Е.В. Пролонгиро$ ванное действие нематофагового пре$ парата на основе гриба Duddingtonia flagrans против галловых нематод на огурцах. – Биологическая защита расте$ ний – основа стабилизации агроэкоси$ стем. /Материалы докладов научно$ практ. конф. «Биологическая защита ра$ стений, перспективы и роль в фитосани$ тарном оздоровлении агроценозов и по$ лучении экологически безопасной сель$ скохозяйственной продукции», Красно$ дар, 2008, вып. 5, с. 303 – 306. Аннотация. Изучен механизм хищни$ чества и особенности жизнедеятельно$ сти нематофаговых грибов в почве. Вы$ делены два эффективных штамма из по$ чвы. Разработан регламент получения препарата на основе штамма Dud dingtonia flagrans F$882 . Проведены ис$ пытания препарата на различных культу$ рах в закрытом грунте против разных ви$ дов нематод (корневая, стеблевая, цис$ тообразующая). Показаны стимулирую$ щий эффект препарата на рост и разви$ тие растений, защитное действие от не$ матод. Установлено пролонгированное защитное действие от нематод в течение 3 лет. Ключевые слова.Механизм хищниче$ ства, нематофаговые грибы, паразити$ ческие нематоды растений, ловушки, штаммы, препаративные формы, испы$ тания, эффект. Abstract. Mechanism of predatory act and ecological properties of nemato$ phagous fungi were studied. Two effective strains were selected from soil. The technological regulations for manufacture of preparation based on efficient strain of nematophagous fungus Duddingtonia flagrans F$882, intended for agricultural plants against parasitic nematodes, were developed. Trials of developed preparation were conducted using various crop cultures and various nematode species. Stimulatory effect of the biopreparation on plant growth and development was demonstrated. The preparation decreased the soil infection and increased the yield. A prolonged action of the biopreparation during three growth cycles was shown by the example of cucumber plants. Key words. Mechanism of predation act, nematophagous fungi, plant parasitic nematodes, traps, preparation forms, trials, effect. 25
