Сессия 12

Анализ образцов пищевых продуктов на
присутствие генетически
модифицированных организмов
Сессия 12
Количественное определение сои Roundup
Ready® методом ELISA
Ф.Эйкем
WORLD HEALTH ORGANIZATION
REGIONAL OFFICE FOR EUROPE
WELTGESUNDHEITSORGANISATION
REGIONALBÜRO FÜR EUROPA
ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE
BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE
ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ELISA
2
Содержание
Сессия 12
Количественное определение сои Roundup Ready®
методом ELISA
Введение
3
Метод ELISA
8
Экспериментальная часть
12
Литература
23
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 12
3
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ELISA
Введение
Специфическая
прочтением
иммунологическая
гена,
введенного
детекция
при
нового
белка,
трансформации,
синтезированного
представляет
собой
альтернативный подход к идентификации генетически модифицированных растений.
Следует отметить, однако, что генетическая модификация не всегда специфически
направлена на продукцию нового белка, и не всегда приводит к экспрессии белка на
уровне, достаточном для его выявления. В дополнение, некоторые белки могут
экспрессироваться только в специфических частях растения (ткане-специфичные
промоторы уже используются для специфических целей); могут экспрессироваться в
отдельных частях растения на различном уровне, либо на различных этапах
физиологического развития.
Уровень экспрессии трансгенного продукта в растениях, по литературным данным,
находится в пределах от 0 до 2% от суммарного растворимого белка, даже если для
оптимизации экспрессии используются сильные конститутивные промоторы (Longstaff,
1995).
В
большинстве
случаев,
однако,
регистрируемый
уровень
экспрессии
(например, для разрешенных ГМ культур) ниже, чем верхний предел в 2% (Hemmer,
1997).
Иммунологический
анализ
представляет
собой
систему
для
аналитического
измерения, с использованием антител в качестве аналитического реагента. Антитела
являются специфическими белками, выделяемыми из сыворотки крови животных,
которые физически связываются только с теми субстратами, которые вызвали их
образование.
Антитела
получают
путем
инъецирования
субстанций,
которые
потребуется затем выявлять (например, белка CP4 ERSPS, который определяет
устойчивость к гербициду Roundup), животным, таким как кролики или мыши, клетки
организма которых распознают данную субстанцию как “чужеродную” и отвечают
образованием антител против данной субстанции. Антитела очищают, присоединяют к
ним легко обнаруживаемую метку, и затем используют в качестве реагента для
детекции интересующей субстанции.
Основной предпосылкой разработки методов иммунологической детекции является то,
что должны быть доступны высокоспецифичные антитела против нового белка,
который требуется обнаружить. В дополнение, образец или интересующие белки, не
должны быть в значительной степени разрушены.
Антитела являются мощным орудием биологов для выявления и количественного
определения антигенов в сложных смесях. Все виды иммунологического анализа
базируются на специфическом связывании антител с антигенами.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 12
4
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ELISA
Взаимодействия антитело-антиген.
Когда иммунологи описывают свойства антител, как белков, часто включают описание
способности этих молекул осаждать антигены из раствора, хотя осаждение
антителами теперь редко используется для экспериментального выделения или
детекции антигенов, кроме того, антитела редко осаждают антигены in vivo, за
исключением некоторых аутоиммунных заболеваний. Познавательная ценность
реакции осаждения антител, как показано на Рисунке 1, заключается в том, что она
хорошо демонстрирует как фундаментальные, так и универсальные свойства молекул
антител. Эта методика демонстрирует, среди прочего, следующее:
•
сывороточные (IgG) антитела являются бивалентными в своих реакциях с
антигенами, и способны к перекрестному связыванию с антигенами;
•
антигены
часто
являются
мультивалентными
в
своих
взаимодействиях
с
антителами;
•
сывороточные антитела обычно являются поликлональными по своей природе; и
•
антитела являются высокоспецифичными в отношении структур, которые они
распознают на молекулах антигена
Рисунок 1 Кривая преципитации (осаждения) для системы из одного антигена и его
антител
(а)
Поликлональная
антисыворотка
Миоглобин
(b)
Получение моноклональных антител
Зона избытка
антител (Ab)
Эквивалентная
зона
Зона избытка
антигена (Аg)
избыток Аb
Супернатант
избыток Аg
Моноклональное антитело
Осаждение антител
Добавление антигена
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 12
5
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ELISA
Графическое
изображение
количества
осаждаемых
антител
по
отношению
к
возрастанию концентрации антигена (при постоянном суммарном количестве антител)
выявляет три зоны:
«Зона избытка антител», в которой преципитация ингибируется, и излишек антител
может быть обнаружен в супернатанте.
«Эквивалентная зона» максимальной преципитации, в которой антитело и антиген
образуют крупные нерастворимые комплексы (затененная синим фоном), и ни
антитела, ни антигены не могут быть обнаружены в супернатанте.
«Зона избытка антигена», в которой преципитация ингибируется и излишек антигена
может быть обнаружен в супернатанте.
В то время как реакция преципитации хорошо подходит для характеристики
взаимодействия
между
поликлональными
антителами
и
мультивалентными
антигенами, она в целом не очень полезна для характеристики взаимодействия между
антигенами и моноклональными антителами, если только антигены не имеют
множественных
структуры,
идентичных
эпитопов
обнаруживаемые,
моноклональные
антитела
(таких
например,
будут
как
в
способны
повторяющиеся
полисахаридах).
к
перекрестному
углеводные
Только
тогда
связыванию
и
преципитации антигена. Однако, моноклональные антитела обычно изучают с
помощью более тонких методов, которые дают более детальную информацию
относительно взаимодействия антитело-антиген, таких, например, как определение
константы равновесия или кинетики скорости включения-выключения.
Трудно переоценить преимущества применения антител для детекции и выделения
антигенов, особенно учитывая широкий спектр разработанных за последние годы
исключительно мощных методов использования антител. Преимущество применения
антител также значительно возрастает в связи с их относительной стабильностью в
различных реакциях, связанных с химическими модификациями, которые изменяют
структуру антител, не уменьшая их способности связывать антигены. Антитела
подвергают
химическому
мечению,
присоединяя
различные
соединения
–
флуоресцентные, магнитные, радиоактивные, комбинированные, для того, чтобы
облегчить детекцию или выделение антигена при различных условиях эксперимента.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 12
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ELISA
6
Как могут быть получены моноклональные антитела
Вещества, чужеродные для организма, такие как вызывающие заболевание бактерии
и вирусы, и другие возбудители болезни, известные как антигены, распознаются
иммунной системой организма как «интервенты». Нашей природной защитой против
возбудителей инфекционных болезней являются антитела - белки, которые находят
антигены и помогают их разрушить.
У антител есть два очень полезных свойства. Во-первых, они исключительно
специфичны, то есть каждое антитело связывается с одним конкретным антигеном и
атакует его. Во-вторых, некоторые антитела, будучи активированы присутствием
возбудителя болезни, продолжают поддерживать устойчивость к этому заболеванию.
Второе свойство антител делает возможным разработку вакцин. Вакцина – это
препарат, содержащий убитые или ослабленные бактерии или вирусы, которые при
введении в организм стимулируют продукцию антител против содержащегося в
вакцине антигена. Но именно первое свойство антител, их специфичность, делает
настолько ценной технологию моноклональных антител. Антитела не только могут
быть использованы в терапевтических целях, для предохранения против болезней;
они также могут помочь диагносцировать большое разнообразие заболеваний, могут
выявлять присутствие в крови лекарственных препаратов, вирусных и бактериальных
продуктов, а также других, необычных или несвойственных веществ.
В связи с многообразием применения этих веществ, помогающих бороться с
болезнями, проблема их получения в очищенном виде и в ощутимых количествах уже
давно находится в центре внимания исследователей. Традиционным методом было
инъецирование лабораторных животных антигеном, а затем после образования
антител, выделение антител из сыворотки крови животных (сыворотка крови,
содержащая антитела, называется антисывороткой). С этим методом связаны две
проблемы: в получаемой антисыворотке содержатся нежелательные субстанции;
помимо этого, данный метод обеспечивает очень малое количество полезных антител.
Технология получения моноклональных антител позволяет получать в больших
количествах чистые антитела путем использования клеток, которые в естественных
условиях продуцируют антитела, а также другого класса клеток, которые могут
постоянно, в течение длительного времени, расти в клеточной культуре. Если мы
создадим гибрид, который совмещает свойство «бессмертия» со способностью
продуцировать желаемые вещества, мы получим, в действительности, фабрику по
производству антител, которая работает постоянно.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 12
7
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ELISA
В технологии получения моноклональных антител, раковые клетки, которые могут
воспроизводиться бесконечно, гибридизуют (соединяют) с клетками млекопитающих,
которые продуцируют антитела. Результатом такого объединения клеток является
«гибридома», которая будет постоянно производить антитела. Такие антитела
называют моноклональными, потому что они получены из клеток одного типа, а
именно гибридомных клеток; с другой стороны, антитела, полученные традиционным
методом, получают из препарата, содержащего много типов клеток, и, вследствие
этого, они называются поликлональными. Пример того, как получают моноклональные
антитела, приводится ниже.
Получение моноклональных антител
Миелома – это опухоль костного мозга, которая может быть использована для
перманентного роста в клеточной культуре. Когда клетки миеломы соединили с
продуцирующими антитела клетками селезенки млекопитающих, было обнаружено,
что полученные в результате гибридные клетки, или гибридомы, продуцируют
значительное количество моноклональных антител. Этот продукт слияния клеток
совмещает желаемые свойства двух различных типов клеток: способность к
постоянному росту и способность продуцировать значительные количества чистых
антител.
Поскольку отобранные гибридные клетки продуцируют специфические антитела
только одного типа, эти антитела оказываются более чистыми, чем поликлональные
антитела,
полученные
по
традиционной
методике.
Они
потенциально
более
эффективны, чем традиционные препараты антител, в борьбе с заболеваниями, так
как обычные препараты антител атакуют не только чужеродные субстанции, но и
собственные клетки организма, иногда вызывая нежелательные побочные эффекты,
такие как аллергические реакции. Моноклональные антитела атакуют молекулы–
мишени, причем только молекулы–мишени, и совсем не вызывают, или вызывают
гораздо меньшие, побочных эффектов.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 12
8
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ELISA
Получение моноклональных антител
Иммунизация мышей
для стимулирования
продукции антител
Клетки опухоли,
растущие в
культуре ткани
Клетки, образующие
антитела,
извлеченные из
селезенки
Клетки, образующие антитела, соединяют с
культивируемыми опухолевыми клетками для
образования гибридом
Скрининг гибридом на
продукцию антител
Клонирование
гибридом,
продуцирующих
антитела
Моноклональные
антитела
выделены для
культивирования
Метод ELISA
Описание
Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA): это иммуноферментный анализ,
использующий меченный ферментом иммунореактант (антиген или антитело), а также
иммуносорбент
Разнообразие
(антиген
методов
или
антитело),
(например,
связанный
конкурентное
с
твердым
связывание
между
носителем.
меченым
реактантом и немеченым неизвестным) может быть использовано для определения
концентрации неизвестного.
Метод ELISA (Clark and Adams, 1977) основан на специфическом взаимодействии
между антителами и антигенами. Ключевые реагенты в методе ELISA - это антитела,
которые являются растворимыми белками, продуцируемыми иммунной системой в
ответ на инфицирование чужеродной субстанцией (называемой “антигеном”). В случае
выявления ГМО, антигенами могут быть вновь синтезированные белки.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 12
9
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ELISA
ELISA широко применяется для оценки, на стадии эксперимента, уровня экспрессии
белка (белков), синтезированных прочтением нового, введенного гена. Информация,
касающаяся получения и использования специфических антител, может быть найдена
в различных статьях, описывающих создание трансгенных растений (Mohapatra et al.,
1999).
Только несколько специфических антител, против белков - продуктов трансгенов,
использованных в разрешенных генно-инженероных культурных растениях, являются
коммерчески доступными: некоторыми примерами могут служить антитела против
продукта nptII- гена, NPTII, или APH(3’)II, а также антитела против продукта gus-гена.
Существует 3 различных способа постановки анализа по методу ELISA:
Mетод для специфической детекции сои Roundup Ready® на основе ELISA был
разработан, апробирован и утвержден Липпом и др. (Lipp et al., 2000).
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 12
10
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ELISA
Данный метод основан на использовании специфических антител против белка CP4EPSPS (5-энолпирувилшикимат-3-фосфат-синтазы, фермента из Agrobacterium sp.,
штамм СР4) (Padgette et al., 1995), который является белком, ответственным за
толерантность к гербициду Roundup у сои Roundup Ready®. Предварительные
результаты показывают, что данный метод (осуществляемый с использованием
коммерческого набора для метода
ELISA) способен выявлять присутствие ГМО в соевом сырье при концентрациях в
дипазоне между 0.3% и 5%.
Принцип метода
Прямой сэндвич-метод Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) был использован
для детекции CP4-EPSPS белка, как показано на нижеприведенных рисунках:
Y
Моноклональное антитело
Слой на
поверхности
Поверхность
микротитрационного
планшета
покрыта
слоем
специфического
моноклонального антитела, прикрепленного к поверхности.
Антиген
Слой на
поверхности
Когда
добавляется
интересующий
исследователя
образец,
прикрепленное
к
поверхности антитело связывает антиген. Несвязанные компоненты удаляются с
помощью отмывки.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 12
11
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ELISA
Пероксидаза хрена (HRP)
Детектор-антител
Слой на поверх.
После отмывки, добавляются поликлональные антитела, ковалентно-связанные с
ферментом пероксидазой хрена (horseradish peroxidase HRP), которые специфичны
для второго антигенного сайта на связанном CP4-EPSPS белке.
TMB
TMB
Слой на поверх.
После отмывки добавляется тетраметилбензидиновый хромоген для пероксидазы
хрена.
Пероксидаза
концентрации
хрена
антигена
в
генерирует
линейном
цветовой
диапазоне.
сигнал,
Чтобы
пропорциональный
остановить
развитие
окрашивания, добавляется “стоп-раствор”. Интенсивность окрашивания измеряется
при длине волны 450 нм.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 12
12
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ELISA
Экспериментальная часть
Пособие: Тестирование ГМО в ингредиентах пищевых продуктов, руководство для
пользователей набором для сои (GMO Food Ingredient Testing, Soya kit User’s Guide,
1999, Strategic Diagnostics, Inc., Rev. 052099, Vers.1.8.)
1
Введение
Следующий методический протокол - это специально разработанный метод ELISA для
определения белка CP4-EPSPS, экспрессирующегося в сое Roundup Ready®, в
сельскохозяйственном соевом сырье и в пищевых продуктах, таких как соевая мука и
чистый соевый белок.
Данный метод применим к образцам, которые совсем не подвергались обработке, или
подвергались небольшой обработке, и белок CP4-EPSPS не был денатурирован.
Например, температура, при которой перерабатывались пищевые ингредиенты, может
воздействовать на возможность детекции белка. Данные показывают, что температура
переработки, не превышающая 65° С и воздействующая не более 60 минут, позволяет
проводить надежную детекцию белка.
Данный метод был утвержден для
выявления CP4-EPSPS белка, и может быть
использован для определения концентраций белка в образце, превышающих уровень
0.3% - 5% (w/w), с использованием специфического эталонного материала. Набор
может быть использован и при более низких концентрациях (от 0.05% до 0.3%) с
использованием модифицированной прописи.
Оборудование
•
Конические полипропиленовые центрифужные пробирки на 15 мл
•
Стеклянные пробирки для анализа 12 х 75 мм
•
Пластиковая пленка или алюминиевая фольга
•
Клейкая лента и ручной промыватель плашек
•
Бутыли для промывки, например на 500 мл
•
Точные пипетки, емкостью от 20 мкл до 500 мкл
•
Встряхиватель пробирок типа Vortex
Набор, описанный в данной Сессии, был единственным, утвержденным и коммерчески
доступным в период, когда были организованы Обучающие курсы и написано Руководство.
Объединенный научный центр и ВОЗ не поддерживали разработку коммерчески доступных
наборов конкретных торговых марок.
1
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 12
13
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ELISA
•
Лодочка для взвешивания, или ее эквивалент
•
Шпатели
•
Весы для взвешивания малых количеств (0,01 г)
•
Центрифуга, со скоростью от 5000 до 10000 об/мин
•
Анализатор для микротитрационного планшета (плашки) (microtiter plate reader),
способный распознавать поглощение при 450 нм
•
Термостат, поддерживающий 37°С
•
Сито с размером отверстий 450 мкм, либо эквивалент
•
Сито с размером отверстий 150 мкм (100 mesh), либо эквивалент
•
Многоканальный дозатор, например от 50 мкл до 300 мкл (желательно)
•
Резервуары для реагентов, для многоканального распределения (желательно)
•
Автоматический промыватель плашек (желательно)
•
Штатив для центрифужных пробирок на 15 мл (желательно)
Реагенты
Общие замечания
Во время анализа, если это специально не рекомендовано иначе, следует
использовать
только
реагенты
известного
аналитического
качества,
а
также
деионизованную или дистиллированную воду.
Любые отклонения от определенных критериев осуществления анализа, могут
означать недостаток стабильности реагентов. Если компоненты субстрата уже
изменили цвет от бесцветного к голубому, такой реагент следует выбросить. Не
следует использовать мутные буферные растворы.
Все компоненты набора (kit) должны храниться при температуре приблизительно от
2°С до 8°С. Срок хранения компонентов набора указан на упаковке, как дата срока
годности. Основываясь на ускоренном тесте на стабильность, дата срока годности на
аналитические наборы установлена в 9 месяцев при температуре приблизительно от
2°С до 8°С. Базовый раствор конъюгата антител “соевый конъюгат”, а также рабочий
раствор конъюгата антител следует хранить при температуре от 2°С до 8°С до
истечения срока годности набора. Разведенный рабочий отмывочный буфер следует
хранить при температуре приблизительно от 2°С до 8°С, и не дольше срока годности
набора.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 12
14
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ELISA
Реагенты, обычно имеющиеся в аналитическом наборе
•
Экстракционный буфер для сои, натрий-боратный буфер, рН 7.5
•
Аналитический буфер для сои, РВS, Tween 20, бычий сывороточный альбумин, рН
7.4
•
Покрытые слоем связанных моноклональных антител ряды лунок на пластиковых
планках (12 планок по 8 лунок в каждой, 1 держатель для планок)
•
Соевый конъюгат, кроличий анти-CP4-EPSPS белок, лиофилизированный
•
Разбавитель соевого конъюгата, 10% мышиная сыворотка, инактивированная
нагреванием
•
Хромогенный субстрат, K-Blue™, тетраметилбензидин (TMD), перекись водорода,
5% диметилформамид как основной растворитель
•
Стоп-раствор, 5% серная кислота
•
10-кратный, концентрированный промывочный буфер, PBS, Tween 20, РН 7.1
•
Отрицательный и положительный эталонные стандарты.
Процедура
Ограничения процедуры
Данная система ГМ-анализа методом ELISA ограничена образцами, в которых
экспрессия CP4-EPSPS белка может коррелировать с уровнем ГМ материала,
присутствующего в используемых эталонных стандартах.
Набор (kit) для анализа методом ELISA предназначен, чтобы давать оптимальное
разрешение при окружающей температуре между 15°С и 30°С. Максимальный
показатель поглощения эталонного стандарта должен превышать 0.8 и не должен
выходить за пределы линейного диапазона спектрофотометра (верхний предел
варьирует от спектрофотометра к спектрофотометру). Важно отметить, что величина
OD растет быстрее при температуре, превышающей 30°С. Вследствие этого, если
температура достаточно высока, потребуется меньшее время для инкубации
субстрата. При низкой температуре (ниже 15°С) время инкубации субстрата должно
быть увеличено.
Меры для предотвращения загрязнения примесями при изготовлении образцов
Общие
замечания
исключительно
Данная
система
чувствительным
ГМ-анализа
методом,
методом
способным
ELISA
выявлять
является
очень
малое
количество ГМ примесей. По этой причине абсолютно необходимо, чтобы все
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 12
15
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ELISA
используемое оборудование для приготовления образцов сои, тщательно очищалось
в промежутке между различными партиями образцов. Последующие процедуры
включают первый этап физического удаления частиц материала, насколько это
возможно. Второй этап, отмывка спиртом, предназначенная денатурировать образец и
таким образом, сделать его нереактивным в анализе, если какое-то количество ГМ
белка могло остаться на оборудовании.
Очистка измельчителя или блендера Очистка производится щеткой с мягкой
щетиной. Периодически щетку следует мыть и вымачивать в растворе спирта.
Высушивайте
щетку
перед
последующим
использованием.
Вытирайте
мягкой
тряпочкой или лабораторным полотенцем.
Рекомендуется ополаскивание спиртом, который может храниться и распыляться из
пульверизатора или струи из бутылки. Рекомендуется два опрыскивания или
распыления. Затем следует ополоснуть водой и высушить воздухом. Если вскоре
требуется повторное использование, можно высушивать парикмахерским феном.
Очистка сита Сито часто забивается соевой пудрой. Резкое постукивание ситом по
твердой поверхности, поможет удалить присохший материал.
Очищайте сито чистой мягкой щеткой. Периодически мойте щетку и вымачивайте в
спирте, по крайней мере, в течение 1 минуты. Высушивайте щетку перед
последующим использованием. Вытрите мягкой тряпочкой. Вымачивайте в спирте, по
крайней мере, в течение 5 минут и ополосните водой. Высушивайте воздухом, если
вскоре требуется повторное использование, можно использовать парикмахерский
фен.
Альтернативным методом может быть использование ультразвуковой мойки с
последующим высушиванием воздухом.
Чистота рабочей зоны Чистота рабочей зоны также очень важна. В связи с тем, что
анализ очень чувствительный, малейшие пылевидные ГМ-позитивные загрязнения
аналитической пробирки могут привести к ложно-положительному результату.
Избегайте загрязнения соевой пылью в рабочей зоне. Не позволяйте соевой пыли от
одной серии опытов загрязнять оборудование, предназначенное для следующей
серии опытов. Для оптимального осуществления анализа рекомендуется проводить
его в помещении, отделенном от места измельчения и приготовления образцов, чтобы
избежать потенциального загрязнения пылью.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 12
16
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ELISA
Приготовление образцов
Из лабораторных образцов на анализ следует отбирать гомогенно – измельченные
пробы.
Если образцами являются непереработанные соевые бобы, то, по крайней мере, 500 г
следует загрузить в подходящий блендер и измельчать приблизительно 3 минуты,
либо до того момента, когда измельченная масса будет проходить через сито. Для
количественного анализа, необходимо получить частицы размером менее 150 мкм, а
для качественного анализа - менее 450 мкм. Для того, чтобы избежать загрязнения,
следует особое внимание уделять стадии просеивания через сито. Более того,
следует избегать и излишнего перегрева. Блендер будет и перемешивать и
измельчать
образец.
Из
измельченного
материала
следует
отобрать
пробу
приблизительго 100 г и просеять через сито с размером пор 450 мкм (40 mesh). По
крайней мере, 90% этой пробы должно пройти через 450-мкм сито. Для качественного
анализа,
этот
материал
может
быть
использован
непосредственно,
для
количественного анализа просеянный материал следует еще раз просеять через сито
с размером пор 150 мкм. Материал, просеянный через 450-мкм сито, является
достаточно гомогенным, поэтому через 150-мкм сито следует просеивать лишь то
количество, которое необходимо для конечной пробы. Достаточно пропустить только
то количество материала, которое необходимо для конечной пробы.
Другие типы образцов следует обрабатывать эквивалентным образом, хотя может
быть использовано меньшее количество образца.
Процедура анализа
Дайте всем реагентам нагреться до комнатной температуры перед использованием.
Выньте покрытые слоем антител пластиковые планки и держатель из пакета. Всегда
запечатывайте пакет каждый раз после отбора нужного количества планок. Десять
лунок необходимо для эталонных стандартов и контролей. На каждой плашке должны
быть свои эталонные стандарты и контроли. Если используется ручная отмывка,
прикрепите клейкой лентой концы всех планок, необходимых для данного анализа, к
держателю, чтобы предотвратить нечаянное выпадение их из держателя в процессе
этапа отмывки.
Приготовление конъюгата антител
Исходный раствор конъюгата антител Отберите пипеткой 1 мл разбавителя для
соевого конъюгата (Soya Conjugate Diluent) из бутылки для соевого конъюгата во
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 12
17
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ELISA
флакон с соевым конъюгатом. Перемешайте на встряхивателе пробирок Vortex
приблизительно 10 секунд.
Рабочий раствор конъюгата
антител Перенесите 240 мкл восстановленного
соевого конъюгата обратно в бутылку для разбавителя соевого конъюгата. Пометьте
бутылку текущей датой и перемешайте переворачиванием 20 раз.
Приготовление промывочного буфера
Дайте 10х концентрированному промывочному буферу нагреться до комнатной
температуры.
Разбавьте 10х концентрированный промывочный буфер деионизованной водой для
приготовления
рабочего
промывочного
буфера
(например,
50
мл
10х
концентрированного промывочного буфера добавить к 450 мл деионизованной воды).
Перелейте в автоматический промыватель плашек, либо в бутыль для промывки.
Экстракция образцов и эталонных стандартов
Образцы,
а
также
отрицательные
и
положительные
эталонные
стандарты
экстрагируют при одних и тех же условиях в двух повторах, как описано далее.
При взвешивании образцов, взвешивайте сначала эталонные стандарты в порядке
возрастания концентрации, а затем исследуемые образцы.
Сделайте навески 0.5 г ± 0.01 г каждого эталонного стандарта и исследуемого образца
и поместите каждую навеску в отдельную 15 мл полипропиленовую центрифужную
пробирку.
Чтобы
избежать
загрязнения,
очищайте
шпатель
перед
каждым
взвешиванием.
Добавьте 4.5 мл соевого буфера для экстракции в каждую пробирку, содержащую 0.5 г
образца, перемешайте на встряхивателе пробирок Vortex в течение 10 секунд.
Центрифугируйте смесь приблизительно при 5000 об/мин в течение 15 минут.
Используя пипетку для переноса, тщательно удалите супернатант, не затрагивая
частицы осадка, и поместите супернатант в чистую, помеченную, 15 мл центрифужную
пробирку.
Прежде чем приступить к проведению анализа, разведите экстракты образца и
эталонных стандартов соевым буфером для экстракции в соответствии с Таблицей 1.
Белковые экстракты следует хранить при температуре от 2°С до 8°С, но не дольше,
чем в течение одного рабочего дня.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 12
18
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ELISA
Таблица 1. Степень разведения в зависимости от материала
Материал
Разведение
Соя
1: 300
Соевая мука
1: 300
Обезжиренная соевая мука
1: 300
Выделенный белок
1: 10
Разведение экстрактов образцов
Для экстрактов отрицательного контроля, для каждого экстракта положительных
эталонных стандартов, а также для каждого исследуемого образца, потребуется по
две пробирки 12 х 75 мм, чтобы выполнить процедуру разведения.
Наберите пипеткой 280 мкл соевого буфера для экстракции и поместите в одну из 12 х
75 мм пробирок.
Перенесите пипеткой 380 мкл соевого буфера для экстракции в другую 12 х 75 мм
пробирку. Пометьте пробирку с 280 мкл буфера “1 : 15”, а пробирку с 380 мкл буфера
“1 : 300”.
Перенесите по 20 мкл каждого экстракта в пробирку, помеченную “1 : 15” и
перемешайте на встряхивателе пробирок Vortex.
Перенесите по 20 мкл каждого разведенного экстракта из пробирки, помеченной “1 :
15”, в пробирку, помеченную “1 : 300” и перемешайте на встряхивателе пробирок
Vortex.
Повторите эти этапы для отрицательного контроля, каждого положительного эталона
и экстракта исследуемого образца.
Процедура иммуноанализа методом ELISA
Общие замечания
Набор (kit) для анализа методом ELISA может быть использован в различных
форматах, с использованием любого числа планок с 8 лунками. Рекомендуется
следовать рандомизированной схеме нанесения проб.
Все реакционные лунки должны быть в двух повторах, и по ним вычисляется среднее
значение поглощения. В каждом эксперименте должен быть нулевой контроль (только
буфер), отрицательный контроль и положительные эталонные стандарты.
Если анализ уже начат, все этапы должны выполняться без перерыва.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 12
19
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ELISA
Добавление образцов
Добавьте 100 мкл разведенных экстрактов или буфера (нулевой контроль).
Используйте отдельные одноразовые наконечники для каждого этапа пипетирования,
чтобы избежать перекрестного загрязнения. Накройте плашку пластиковой пленкой
или алюминиевой фольгой, чтобы предотвратить загрязнение и испарение.
Инкубация образцов
Инкубируйте микротитрационный планшет (плашку) при 37°С в течение 1 часа.
Промывка
Промывайте 3 раза с помощью 300 мкл промывочного буфера.
Ручная промывка. Опорожните лунки путем переворачивания над раковиной или
подходящим контейнером для отходов. Используя 500 мл бутыль для промывки,
содержащую рабочий раствор для промывки, заполните каждую лунку до краев,
оставьте на 60 секунд, затем опорожните плашку, как описано выше. Повторите этап
промывки
всего
3
раза.
Удалите
остаточную
жидкость
и
пузырьки
путем
переворачивания на несколько слоев бумажных полотенец.
Для предотвращения выпадания отдельных планок из рамки, закрепляйте их клейкой
лентой.
Автоматическая промывка. В конце инкубационного периода соберите содержимое
лунок с использованием
промывателя Microwell, затем заполните лунки рабочим
буфером для промывки. Повторите процедуру отсоса/заполнения всего 3 раза. В
конце, используйте промыватель Microwell для отсоса жидкости из лунок, затем
переверните плашку на стопку бумажных полотенец для удаления остаточных капелек
и пузырьков.
Не допускайте пересыхания лунок, так как это может повлиять на результат анализа.
Неадекватная промывка может привести к ошибочным результатам. Независимо от
того, используется ли ручной или автоматический промыватель, важно убедиться, что
каждая лунка промывается тем же объемом, что и остальные.
Добавление конъюгата антител
Добавьте 100 мкл рабочего раствора конъюгата антител в каждую лунку.
Накройте плашку для предотвращения загрязнения и испарения.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 12
20
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ELISA
Инкубация
Инкубируйте микротитрационный планшет (плашку) при 37°С в течение 1 часа.
Промывка
По окончании периода инкубации, повторите этапы промывки, как описано выше.
Добавление субстрата
Добавьте 100 мкл окрашенного раствора в каждую лунку.
Осторожно перемешайте плашку и инкубируйте 10 мин при комнатной температуре.
Добавление
хромогенного
субстрата
должно
производиться
без
перерыва.
Поддерживайте ту же последовательность и интервалы времени на стадии
добавления раствора пипеткой. Защищайте плашку от солнечного света, так как он
может повлиять на интенсивность окрашивания.
Добавление стоп-раствора
В конце периода инкубации добавьте 100 мкл стоп-раствора в каждую лунку,
добавляйте пипеткой стоп-раствор в той же последовательности, в которой
добавлялся окрашенный реагент.
Добавление стоп-раствора должно производиться без перерывов. Защищайте плашку
от солнечного света, так как он может повлиять на интенсивность окрашивания.
Регистрация показателей поглощения
Используя подходящий анализатор для плашек (microplate reader) с соответствующим
фильтром для регистрации поглощения при 450 нм, проведите измерение по каждой
аналитической лунке.
Все измерения должны быть произведены в течение 30 мин после добавления стопраствора.
Запишите полученные результаты и посчитайте среднюю величину поглощения, либо
воспользуйтесь для этого компьютерной программой.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 12
21
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ELISA
Оценка
Стандартные величины должны быть использованы для построения калибровочной
кривой. Величина, полученная для нулевого контроля, должна вычитаться из всех
величин, полученных для исследуемых образцов и эталонных стандартов. Средние
скорректированные величины двух повторов для каждой точки (концентрации)
эталонного стандарта должны быть использованы для построения калибровочной
кривой. Средние данные двух повторов для каждого исследуемого образца можно
затем использовать для определения концентрации исследуемого вещества по
калибровочной кривой.
Критерии признания/непризнания достоверности анализа
Каждая постановка анализа должна отвечать критериям признания/непризнания
достоверности, чтобы данная процедура анализа была признана действительной.
Постановка анализа состоит из следующих обязательных компонентов: нулевой
контроль,
экстракция
каждого
ГМ
положительного
эталонного
стандарта,
отрицательный контроль и каждый неизвестный образец. Все белковые экстракты и
нулевой контроль должны анализироваться в двух повторах. Если процедура анализа
не отвечает всем критериям анализа, всю процедуру полностью следует повторить.
Процедура
Наличие нулевого контроля
Критерий
А450нм < 0.30
(только буфер)
0% ГМ стандарт
А450нм < 0.30
2.5% эталонный стандарт
А450нм ≥ 0.8
Все положительные
CV повторов ≤ 15%
стандарты
Неизвестные образцы
CV повторов ≤ 20%
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 12
22
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ELISA
Схемы последовательности действий
Схема последовательности
эталонных стандартов
Процедура
Взвешивание
Добавление
действий
Разведение
экстракции
образцов
и
Объем/вес
Описание
0.5 г
Взвешивание образцов, нулевого контроля,
эталонных стандартов
4.5 мл
Перемешивание
Центрифугирование
по
5000 об/мин
1 : 300 или 1: 10
в зависимости от
исследуемого
материала
Добавление экстракционного буфера
Перемешивание образца с экстракционным
буфером до гомогенного состояния
Центрифугирование образца при 5000
об/мин в течение 15 мин. Отбор
супернатанта и перенос его в чистую
пробирку
Разведение
стандартов
образцов
и
эталонных
Схема последовательности действий при постановке иммуноанализа
методом ELISA
Процедура
Добавление
Объем
Описание
100 мкл
Перенос пипеткой разведенных экстрактов
образцов, эталонных стандартов и
нулевого контроля (буфера) в
соответствующие аналитические лунки
Инкубация
Инкубация в течение 1 часа при 37°С
Промывка
Промывка 3 раза буфером для промывки
Добавление
100 мкл
Распределение конъюгата антител в
каждую аналитическую лунку
Инкубация
Инкубация в течение 1 часа при 37°С
Промывка
Промывка 3 раза буфером для промывки
Добавление
100 мкл
Распределение окрашенного раствора в
каждую аналитическую лунку
Инкубация
Инкубация в течение 10 мин при комнатной
температуре
Добавление
Распределение “стоп-раствора” в каждую
аналитическую лунку
Измерение величины
поглощения
Измерение величины поглощения в каждой
аналитической лунке с помощью
анализатора (microplate reader) при 450 нм
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 12
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ELISA
23
Литература
Clark, M.F. and Adams, A.N. (1977). Characteristics of the microplate method of
enzyme-linked immunosorbent assay for the detection of plant viruses. Journal of
General Virology 34, 475–483.
Hemmer, W. (1997). Foods Derived from Genetically Modified Organisms and
Detection Methods. Biosafety Research and Assessment of Technology Impacts
of the Swiss Priority Program Biotechnology – Report 2/97, 61 pages.
www.bats.ch/abstr/297intro.htm.
Lipp, M., Anklam, E., Stave, J.W. (2000). Validation of an immunoassay for detection
and quantification of a genetically modified soybean in food and food fractions
using reference materials. Journal of AOAC International 83, 919–927.
Longstaff, M., Edmonds, H.S. and Newell, C.A. (1995). An improved method for the
detection and quantification of recombinant protein in transgenic plants. Plant
Molecular Biology Reporter 13, 363–368.
Mohapatra, U., Mccabe, M.S., Power, J.B., Schepers, F., Vanderarend, A. and
Davey, M.R. (1999). Expression of the bar gene confers herbicide resistance in
transgenic lettuce. Transgenic Research 8, 33–44.
Padgette, S.R., Kolacz, K.H., Delannay, X., Re, D.B., LaVallee, B.J., Tinius, C.N.,
Rhodes, W.K., Otero, Y.I., Barry, G.F., Eichholtz, D.A., Peschke, V.M., Nida, D.L.,
Taylor, N.B. and Kishore, G.M.
(1995). Development, identification, and
characterization of a glyphosate-tolerant soybean line. Crop Science 35, 1451–
1461.
Дополнительная литература
Brett, G.M., Chambers, S.J., Huang, L. and Morgan, M.R.A. (1999). Design and
development of immunoassays for detection of proteins. Food Control 10, 401–
406.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 12
24
Количественное определение сои Roundup Ready® методом ELISA
Commission Directive 79/700/EEC of 24 July 1979 establishing Community methods
of sampling for the official control of pesticide residues in and on fruit and
vegetables. (OJ L 239, 22.9.1979, p. 24).
Rogan, G.J. Dudin, Y.A., Lee, T.C., Magin, K.M., Astwood, J.D., Bhakta, N.S., Leach,
J.N., Sanders, P.R. and Fuchs, R.L. (1999). Immunodiagnostic methods for
detection of 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase in Roundup Ready®
soybeans. Food Control 10, 407–414.
Stave, J. W. (1999). Detection of new or modified proteins in novel foods derived
from GMO - future needs. Food Control 10, 367–374.
Van der Hoeven, C., Dietz, A. and Landsmann, J.
(1994). Variability of organ-
specific gene expression in transgenic tobacco plants. Transgenic Research 3,
159–165.
Анализ образцов пищевых продуктов на присутствие генетически модифицированных организмов
Сессия 12