Реакция тканей брюшины при экспериментальном повреждении

72
Оригинальные исследования
Реакция тканей брюшины
при экспериментальном повреждении
на фоне применения мирамистина
П.С. Кызласов, С.Э. Восканян, О.В. Паклина
ГНЦ РФ ФГБУ «Федеральный медицинский биофизический центр
имени А.И. Бурназяна ФМБА России», Москва
Tissue reaction in experimental peritoneal damage during treatment miramistin
P.S. Kyzlasov, S.E. Voskanyan, O.V. Paklina
SRC RF FGBU «Federal Medical Biophysical Center of A.I. Burnazyan FMBA of Russia», Moscow
Изложены результаты экспериментального исследования, эффективности использования катионного поверхностно активного вещества для профилактики образования
спаек после внутрибрюшных операций. По данным научной
литературы в связи высокой реактивностью тканей брюшины частота развития спаечной болезнив брюшной полости
не имеет тенденции к снижению; кроме биологических
особенностей это обусловлено отсутствием адекватного
профилактического средства и определяет необходимость
поиска новых средств, обладающих свойством снижать
реактивные разрастания соединительной ткани. Исследования проведены на 60 крысах породы Вистар. В исследуемой группе моделировалась спаечная болезнь брюшной
полости, затем передушиванием лапоратомной раны проводилось внутрибрюшное введение проверхностноактивного
вещества – «Мирамистин».
По данным гистологического исследования в группе
животных, которым с профилактической целью вводился
мирамистин, отмечалось статистически достоверное (исследовали критерий χ2 с поправкой Йетса – для частоты
спаек и критерий Манна – Уитни для выраженности спаечного процесса) уменьшение выраженности спайкообразования.
The paper presents results of an experimental study on the
efficiency of cationic surfactant for the prevention of adhesion
formation after intraperitoneal operations. According to the
literature of the world the incidence of abdominal adhesive
disease has a significant downward trend, due to the lack
of adequate preventive measure and determine the need for
new tools have protivospaechnym action. The studies were
conducted on 60 Wistar rats. In the study group was modeled
adhesive disease of the abdominal cavity, then before suturing
wounds laporatomnoy performed abdominal introduction
proverhnostno-active substance, «Miramistin».
According to the histological study in a group of animals,
which was administered prophylactically Miramistin, there
were statistically significant (χ2 criterion examined Yatescorrected for the frequency of adhesions and reduced the
severity of adhesions.
Ключевые слова: брюшная полость, спайки, профилактика, брюшина, мирамистин, реактивность.
Key words: abdomen, adhesions, prevention, peritoneum,
miramistin, reactivity.
Введение
Общепризнанно, что спаечная болезнь брюшной
полости является отдельной нозологической формой [1, 2]. Заболевание характеризуется наличием
внутрибрюшных сращений, образовавшихся в результате перенесенной ранее полостной операции
или травмы, воспаления органов брюшной полости и
малого таза с вовлечением в процесс париетальной
и (или) висцеральной брюшины [2–6]. Развитие
абдоминальной хирургии предопределило значительное увеличение числа больных с послеоперационными спайками. Это связано как с увеличением
количества операций, так и отсутствием надежных
средств и способов интраоперационной и постоперационной профилактики спаек, в результате чего заболеваемость спаечной болезнью не имеет тенденции
к снижению [10, 11]. По данным Международного
спаечного общества (International Adhesion Society)
по поводу спаечной болезни ежегодно в хирургических отделениях лечится около 1% прооперированных ранее больных, у 50–75% этой категории
больных развивается кишечная непроходимость, с
летальностью от 13% до 55%. Разработка новых
средств для предупреждения образования спаек
сталкивается с рядом трудностей. Основа их заключается в противоречии между репарационным
развитием соединительной ткани и необходимостью
ограничивать гипертрофические процессы для предупреждения развития спаек. Представляет также
затруднения оценка эффективности профилактики
образования спаек после внутрибрюшных операций.
В настоящее время не доказана абсолютная эффективность ни одного метода предупреждения образования спаек [3, 7, 9, 13, 14]. Консервативное
лечение спаечной болезни малоэффективно [12], а
после оперативных вмешательств отмечается большое количество рецидивов. Таким образом, до настоящего времени проблема спаечной болезни остается
одной из самых актуальных в полостной хирургии, а
наиболее перспективным направлением поиска мы
считаем интраоперационную профилактику.
Поверхностно активные вещества, такие как мирамистин, обладают противовоспалительным, антибактериальным и капилляропротекторным действиями,
e-mail: [email protected]
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 1, 2013
Оригинальные исследования
также доказана способность мирамистина усиливать
процессы регенерации и повышать местный иммунитет [8]. Учитывая вышеуказанные эффекты, мирамистин может обладать противоспаечной активностью.
Однако сведения о применении данного препарата
с целью профилактики спаечного процесса в брюшной полости отсутствуют.
Цель исследования: оценка тканевых реакций после повреждения брюшины в эксперименте с применением мирамистина и без него.
Материал и методы
Эксперимент выполнен на 60 здоровых половозрелых крысах породы Вистар, массой 160–170 г.
В опытах использовали животных, прошедших карантинный режим вивария ФГБУ «НЦ БМТ» РАМН
филиал «Столбовая» и не имевших внешних признаков каких-либо заболеваний. Все животные содержались в одинаковых условиях, на стандартном
пищевом режиме. Все исследования проводили в
одно и то же время суток, с 16 до 18 ч, с соблюдением принципов, изложенных в Руководстве по лабораторным животным и альтернативным моделям
в биомедицинских технологиях (Москва, 2010 г.)
и согласно правилам лабораторной практики РФ
(приказ МЗ РФ № 267 от 19.06.2003).
Для получения статистически достоверных результатов, все животные были разделены на две
группы по 30 животных. В контрольную и опытную
группу входили животные одного возраста, полученные из питомника одновременно. Разброс в группах
по исходной массе не превышал 6,25%. Всем животным проводилось оперативное вмешательство,
и создавались условия для развития спаечной болезни брюшной полости. Спаечный процесс моделировали асептическим травматическим способом.
После срединного лапаротомного разреза выполнялась травматизация брюшины марлевым тампоном на зажиме типа «Москит», на площади 1×1 см.
Тонкая кишка подвергалась скарификации на протяжении 4 см, отступя 0,5 см от илеоцекального угла,
до появления «кровавой росы» с помощью марлевого тампона [5]. Дальнейший ход операции зависел
от группы:
– группа № 1 (основная, 30 крыс): животным
после травмирования висцеральной и париетальной брюшины в брюшную полость вводили препарат
«Мирамистин» в дозе 5 мл, с последующим послойным ушиванием раны;
– группа № 2 (контрольная, 30 крыс): животным
производилось только травмирование висцеральной
и париетальной брюшины, с последующим послойным ушиванием раны.
Животные выводились из эксперимента на
14 сут. после оперативного вмешательства, что соответствует срокам формирования внутрибрюшных
спаек. Оценивалось число животных со спаечным
процессом в каждой группе в целом, плотность спаек (рыхлые или плотные), измененные органы подвергались гистологическому и иммуногистохимическому исследованию. Гистологически оценивали
толщину грануляционного вала, наличие макрофагов
(использовали антитела к CD-68), количество нейтрофилов и других лейкоцитов.
Для иммуногистохимического исследования (ИГХ)
использовали следующий набор антител: коллаген I
(клон ММН С13), разведение 1:50, Имтек (Россия);
73
коллаген III (клонММН С33), разведение 1:50, Имтек (Россия).
Образцы тканей для ИГХ исследований фиксировали в 10% забуференном формалине
(рН-7,2), подвергали стандартной гистологической
обработке. Серийные парафиновые срезы толщиной
3–5 мкм наносили на стекла с адгезивным покрытием, депарафинировали по стандартному протоколу. Выявление тканевых антигенов проводили авидин-биотиновым методом. Интенсивность реакций
оценивали полуколичественным методом (после
реакции с диаминобензидином): (-/0) – отрицательная, (+/1) – слабая, (++/2)- средняя, (+++/3) –
интенсивная. Долю соединительной ткани на срезе
рассчитывали с помощью программы WCIF ImageJ,
при стандартных настройках камеры и микроскопа.
Результаты и обсуждение
При макроскопическом исследовании в контрольной группе послеоперационные спайки брюшной полости выявлены в 80%. Они были представлены
конгломератом из тонкой, слепой кишки и сальника,
фиксированных к париетальной брюшине в месте
травматизации последней (рис. 1).В основной группе спаечный процесс отмечен в 13,3% в виде фиксации тонкой кишки к послеоперационному рубцу, а
в большинстве случаев зона повреждения брюшины
была полностью покрыта молодой грануляционной
тканью(рис. 2).
Рис. 1. Конгломерат из тонкой, и слепой кишок,
сальника, фиксированных к париетальной брюшине
в месте повреждения. Макрофото
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 1, 2013
74
Оригинальные исследования
Результаты микроскопического исследования
представлены в таблице. На 14 сут. после операции, спайки в контрольной группе встречались в
6 раз чаще,чем в основной. Они были представлены преимущественно зрелыми межпетельными
фиброзными спайками (рис. 3). Через 14 дней, в
основной группе, спайки были выявлены у четырех
особей в виде подпаивания тонкой кишки к послеоперационному рубцу и формированию межпетельных тонких спаек с сохранением мышечных слоев
обеих петель (рис. 4). При исследовании толщины
грануляционного вала в контрольной группе выявлено значительное увеличение последней ~ 413 мкм,
в основной группе толщина грануляционного вала
составила ~40 мкм, что свидетельствует о выжженном воспалительном процессе в зоне травматизации брюшины в контрольной группе. Также в
контрольной группе нами выявлено увеличение
содержания нейтрофилов и эозинофилов, что свидетельствует о склонности к лейкоцитозу и может
косвенно указывать на бактериальную обсемененность. В основной группе нейтрофилы и эозинофилы
встречались в следовых значениях.
Рис. 2. Спайка, фиксирующая петлю тонкой кишки
к послеоперационному рубцу. Макрофото
Гистологическая характеристика спаечного процесса
Количество
животных
с внутрибрюшными
спайками,%
Толщина
грануляционного
вала, мкм
(М±m)
Доля
эозинофилов,
%
наблюдений
Доля
нейтрофилов,
%
наблюдений
Доля
макрофагов,
% наблюдений
Контрольная
(n = 30)
80,0
413±40
30,0% случаев
70,0% случаев
73,3% случаев
Основная
(n = 30)
13,3*
40±5*
0*
0*
10,0%* случаев
Группа
Примечание: *р < 0,05 по сравнению с контролем (критерий χ2 с поправкой Йетса – для частоты спаек и критерий
Майна – Уитни для выраженности спаечного процесса).
Рис. 3. Спаечный конгломерат из петель кишок,
селезенки, поджелудочной железы и печени.
Окраска: гематоксилин и эозин. Ув. ×50
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 1, 2013
Рис. 4. Кишка, подпаянная к париетальной брюшине.
Окраска: гематоксилин и эозин.
Ув. ×100
75
Оригинальные исследования
Учитывая, что перитонеальные макрофаги являются основными регуляторами адгезивного процесса
в брюшной полости. Начиная с 5 сут. от момента возникновения воспалительного процесса, они сменяют
нейтрофилы в патологическом очаге и привлекают
фибробласты, которые отвечают за выработку коллагеновых волокон, основного матрикса для спайки.
В то же время при стихании воспалительного процесса макрофаги способны останавливать спайкообразование, выделяя ряд факторов, замедляющих
миграцию фибробластов и продукцию ими коллагеновых волокон [13]. Учитывая вышеизложенное,
нами было изучено содержание макрофагов в основной и контрольной группах. При исследовании
содержания мы обнаружили увеличение количества
макрофагов в контрольной группе и практически отсутствие в основной группе, где они были выявлены
лишь в следовых значениях. Это свидетельствует
о более высокой активности спаечного процесса
в контрольной группе.
При изучении фибриллярных коллагенов путем
иммуногистохимического исследования обнаружено усиление экспрессии коллагена III типа (+++/3)
(рис. 5) в обеих исследуемых группах, тогда как
коллаген I типа определялся в следовых значениях и не подлежал оценке. Вероятнее всего, что при
начальных стадиях склеротических изменений в
образующейся спайке вырабатываются коллагены
III типа, являющиеся более «рыхлыми» и поддающиеся расщеплению под действием фибринолитической
системы, а в ходе развития зрелой соединительной
ткани происходит замещение этого типа коллагена
на коллаген I типа. Учитывая отсутствие коллагенов
I типа можно говорить об обратимости спаечного
процесса до 14 сут. после операции.
Образование спаек после внутрибрюшных операций является обратимым процессом вплоть до
14 сут.
Мирамистин существенно уменьшает частоту и
выраженность спаек после внутрибрюшных операций и может быть использован для профилактики
образования спаек после операций на органах брюшной полости, что однако требует соответствующего
клинического подтверждения.
Литература:
1. Богомолова Н.Н. Коррекция синдрома энтеральной недостаточности при кишечной непроходимости [диссертация]. Чита:
ИГИУВ.; 2002.
2. Ишанкулов В.И. Топографо-анатомическое обоснование хирургических доступов в брюшную полость, измененную послеоперационным спаечным процессом [диссертация]. Волгоград: ВолгГМУ.; 2000.
3. Красильников Д.М., Скобелкин О.К., Федоров В.В. Ранняя
спаечная послеоперационная непроходимость кишечника. Вестн.
хирургии 1999; 1(II): 17–21.
4. Кулаков В.И., Адамян Л.В., Мынбасв О.А. Пути профилактики образования послеоперационных спаек у гинекологических больных. Проблемы репродукции. 1997; 3(IV): 38–45.
5. Липатов В.А. Обоснование применения геля метилцеллюлозы для профилактики послеоперационного спаечного процесса
брюшной полости [диссертация]. Курск: КГМУ.; 2004.
6. Мокряков И.А., Царьков В.В., Чемоданов В.В. Абдоминальный синдром у детей, перенесших оперативные вмешательства на
брюшной полости [Инф. письмо для врачей детских отделений соматического и хирургического профиля лечебно-профилактических
учреждений]. Иваново: ИвГМА.; 2006.
7. Харин В.Г. Значение системы мононуклеарных фагоцитов в
патогенезе избыточногоспайкообразования при перитоните у детей.
Педиатрия1990; 8: 49–51.
8. Ar-Rajab A., AhrenВ.,Rozga J. Phosphatidylcholine prevents
postoperative peritoneal adhesions: an experimental study in the rat.
J. Surg. Res. 1991; 50 (III): 212–5.
9. Нажмудинов 3.3., ГайбатовС.П. Лечение больных с ранней
с паечной непроходимостью кишечника. Южно-Рос. мед.журнал
2000; 1(II): 23–5.
10. Романовский В. Г., Чупрынин В. Д., Шкруднев Л. Д. Пути
улучшения диагностики, лечения и профилактики спаечной болезни брюшной полости. Эндоскопическая хирургия. 2000; 2:
57–58.
11. De la Portilla F., Ynfante I., Bejarano D. Prevention of
peritoneal adhesions by intraperitoneal administration of vitamin
E: an experimental study in rats. DisColonRectum. 2004; 47(XII):
2157–61.
12. Egorlu A., Demirci S., Kurt-man C. Prevention of intra-abdjminal
adhesions by using Seprafilm in ratsundergoling bowel resection and
radiation therapy. Fertil.Steril. 2003; 79(VI): 1404–8.
13. Becker J. M., Dayton M. T., Faxio V.W. Prevention of
post-operative abdominal adhesions by a sodium hyaluronatebased bioresorbable membrane. J. Am. Coll. Surg. 1996; 183:
297–306.
14. Пятикоп И.А. Разработка метода наружной терапии больных микозами кожи с использованием комбинированных мазей на
гидрофильной основе, содержащей мирамистин [диссертация].
Харьков: ХРМУ.; 1996
Рис. 5. Фрагмент тонкой кишки.
Иммуногистохимическая реакция с антителами
к коллагену 3 типа. Продукт реакции коричневого цвета,
докраска гематоксилином. Ув. ×200
Выводы
Поступила 03.012013
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том VIII, № 1, 2013