МЕТОДИЧЕСКАЯ РАЗРАБОТКА ПРАКТИЧЕСКОГО ЗАНЯТИЯ

МИНЗДРАВСОЦРАЗВИТИЯ РОССИИ
Государственное образовательное учреждение
Высшего профессионального образования
ИРКУТСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ
(ГОУ ВПО ИГМУ Минздравсоцразвития России)
Медико-профилактический факультет
Кафедра микробиологии
Методические рекомендации
к практическим занятиям для студентов ИГМУ
по теме: «Экология микроорганизмов. Инфекция. Биологический метод диагностики»
для специальности: 060101 – Лечебное дело, дневное отделение (ЛДдо)
060103 – Педиатрия (ПЕД)
060104 – Медико-профилактическое дело (МПД)
Иркутск – 2009г.
Методические рекомендации составлены:
зав. кафедрой микробиологии ИГМУ, проф. Р. В. Кибортом,
зав. учебной частью, доц. О.Г. Карноуховой
Методические рекомендации составлены в соответствии с типовым
учебным планом общеобразовательного стандарта подготовки студентов
высших медицинских учебных заведений и медицинских факультетов
университетов по курсу «Микробиология с вирусологией и иммунологией» и
рабочей программой кафедры микробиологии ИГМУ.
Методические
рекомендации обсуждены на заседании кафедры
микробиологии ИГМУ.
Протокол № ______ от _____________ 2009г..
Методические рекомендации рассмотрены и рекомендованы к изданию
на заседании цикловой методической комиссии кафедр медикобиологического профиля ИГМУ.
Протокол № ___ от __________2009г.
Председатель ЦМК профессор Р.В. Киборт.
ЗАНЯТИЕ № 1
Тема занятия: «Типы взаимодействия в биоценозах. Инфекция.
Биологический метод диагностики инфекционных заболеваний».
Вопросы для самостоятельной подготовки студентов к занятию:
1.
Характер взаимоотношений между макро- и микроорганизмами:
нейтрализм и симбиоз (мутуализм, комменсализм, паразитизм).
2.
Понятие об инфекции. Условия возникновения инфекционного
процесса.
3.
Роль микробов в возникновении и развитии инфекции.
Патогенность и вирулентность. Факторы патогенности.
4. Генетический контроль за факторами патогенности. Роль
хромосомных и вне хромосомных (плазмид) факторов наследственности в
изменчивости патогенности и вирулентности.
5. Токсины бактерий, их природа, свойства, получение и применение
в медицине.
6. Биологический метод диагностики. Его особенность.
Студент должен знать:
1.
Типы взаимодействия между макро- и микроорганизмами.
2.
Что такое «инфекция» и «инфекционный процесс», условия
возникновения инфекционного процесса.
3.
Роль микробного агента в возникновении и развитии инфекции.
4.
Факторы патогенности микроорганизмов и их генетический
контроль.
5.
Сущность биологического метода исследования.
Студент должен уметь:
1.
Определять факторы патогенности
микроорганизмов и на
основании этого делать заключение о степени патогенности выделенных
культур бактерий.
2. Заражать лабораторных животных с целью воспроизведения
инфекционного процесса.
3.
Оценивать
полученные
результаты
экспериментальных
исследований и давать по ним заключения.
ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ НА ЗАНЯТИИ
Задание 1. Используя Рис. 1 разобрать типы взаимодействия между
макро- и микроорганизмами.
Эктосимбионт
Эндосимбионт
(вне клеток хозяина)
(внутри клетки)
пространственные
отношения
ТИПЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ МЕЖДУ
МАКРО- И МИКРООРГАНИЗМАМИ
Нейтрализм
(не влияют друг на друга)
Мутуализм
( взаимовыгодное
сожительство двух
различных организмов)
Симбиоз
(разная степень взаимодействия)
Комменсализм
(взаимоотношения между
различными организмами,
когда выгоду получает
один из них (микроб) не
нанося вред другому)
Рис. 1
Паразитизм
(взаимоотношения,
при которых один
наносит вред
другому)
Задание 2. Используя Рис.2 разобрать условия возникновения
инфекционного процесса.
УСЛОВИЯ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ИНФЕКЦИОННОГО
ПРОЦЕССА
МИКРООРГАНИЗМ:
адгезины
- патогенность
И
капсула
подвижность
Н
токсины
ферменты
Ф
- вирулентность
- инвазивность
- инфекционность
Е
К
МАКРООРГАНИЗМ:
- неспецифическая резистентность
- иммунитет
Ц
И
Я
ВНЕШНЯЯ СРЕДА
- социально-экономический уровень
- образ жизни
- условия работы и др.
Рис. 2
Задание 3. Решите ситуационную задачу, ответьте на
поставленные ниже вопросы.
Из испражнений больного колиэнтеритом ребенка, выделены
культуры кишечной палочки. Известно, что одним из факторов
патогенности
является
способность
микробов
прикрепляться
(адгезироваться) к клеткам кишечника (энтероцитам).
При выполнении необходимо:
1. сформулировать цель исследования
2. определить материал исследования
3. выбрать тест-культуру для экспериментального исследования
4. провести экспериментальную работу, согласно методической инструкции
приведенной ниже.
5. Результат, выполненной работы внести в таблицу 1.
6. Написать заключение.
Ход исследования:
Для определения наличия у бактерий адгезинов ставят реакцию
маннозочувствительной и маннозорезистентной геммагглютинации (ГА).
Для этого в планшеты для микротитрования вносят 4% взвесь отмытых
эритроцитов человека, 1% раствор D-маннозы и суспензию испытуемых
бактерий плотностью 10 на 1 мл. Параллельно с этой же культурой ставят
реакцию только с эритроцитами (без D-маннозы). Реакцию учитывают через
30-60 минут.
Ингредиенты
1. 4% р-р эритроцитов человека
2. 1% р-р D-маннозы
3. взвесь исследуемых бактерий КОЕ
10 кл/мл
4. взвесь контрольного штамма
бактерий КОЕ 10 кл/мл
Опыт
Контроль
№1
0,5
0,5
0,5
№2
0,5
0,5
0,5
0,5
_
_
_
0,5
Учет результатов:
1. Положительная реакция ГА - склеивание эритроцитов, которые
оседают на дно лунки в виде пленки («зонтика»).
2. Отрицательная реакция ГА – оседание несклеившихся эритроцитов
вцентре в виде «пуговки».
Учитывается чувствительность ГА к ингибирующему действию
маннозы для каждого испытуемого штамма бактерий. Ингибирование ГА в
присутствии маннозы обозначается как маннозочувствительная ГА (МЧГА),
отсутствие ингибирования – маннозорезистентная ГА (МРГА) (Рис 3).
Культура 1
МРГА
Адгезины (+)
Культура 2
МЧГА
Контроль
с культурой
адгезины (+)
Адгезины ()
Рис. 3
Таблица 1
ОПРЕДЕЛИТЬ НАЛИЧИЕ ФАКТОРОВ АДГЕЗИИ У ИССЛЕДУЕМЫХ
КУЛЬТУР МИКРООРГАНИЗМОВ (E. coli)
Цель исследования
Контроль
Исследуемые культуры
1.
2.
Заключение
Вопросы на которые необходимо ответить:
1.
Какая из выделенных культур бактерий обладает факторами
адгезии?
2.
Какие
хромосомные
или
внехромосомные
факторы
наследственности отвечают за ее контроль?
3. Какие структуры бактериальной клетки являются факторами
адгезии?
4. Какова роль факторов адгезии в развитии инфекционного процесса?
Задание 4. Изучить факторы патогенности микроорганизмов,
решая ситуационную задачу (на примере золотистого стафилококка).
Из гнойного отделяемого, взятого от больного с послеоперационным
нагноением раны выделена культура Грам (+) кокков, в мазках
располагающихся в виде “гроздьев винограда”. Определите какими
факторами патогенности обладает данная культура. Изучая факторы
патогенности, ответьте на следующие вопросы:
1. Значение фактора патогенности в патогенезе заболеваний?
2. Какие системы защиты макроорганизма они блокируют?
3. В каких генетических структурах находится информация о их
синтезе?
Плазмокоагулаза. Для изучения способности стафилококка,
вырабатывать фермент плазмокоагулазу используют цитратную плазму
кролика. В стерильные пробирки разливают по 0,5 мл цитратной плазмы,
разведенной 1:5 физиологическим раствором. В каждую пробирку петлей
вносят агаровую культуру стафилококка, тщательно размешивают петлей и
ставят в термостат при температуре 370С.
Учет результатов проводят через 2,4,18,24 часа (Рис.4). Учитывают как
полную коагуляцию, так и образование небольших сгустков в виде
студнеобразной массы, не выливающейся при перевертывании пробирки. На
каждую серию ставят контроли с тест-культурами, заведомо дающими и не
дающими коагуляцию плазмы.
«+»
«»
Рис.4
Фибринолизин.
Для
определения
фибринолизина
к
2%
расплавленному мясо-пептонному агару добавляют плазму крови человека
(10-12%). Смесь нагревают на водяной бане при 70 С в течение 5 минут до
видимого помутнения среды и разливают в чашки Петри. Посев культур
стафилококка проводят "бляшками". Инкубируют в термостате при
температуре 370С в течение суток.
Учет результатов (Рис.5):
«+» - При наличии у стафилококков фермента фибринолизина, вокруг
колоний образуется зона просветления питательной среды.
«» - вокруг колоний видимых изменений питательной среды нет.
фибринолизин 
фибринолизин +
Рис. 5
Гемолизин. Гемолитическая активность стафилококка изучается на 5%
кровяном агаре. В среду добавляют кроличьи эритроциты, подсушивают,
делают посев исследуемых культур микроорганизмов "бляшками".
Учет результатов проводят после инкубации в термостате при 37С
через 24 часа (Рис.6). Вокруг колоний микробов, обладающих
гемолитической активностью, образуется зона просветления кровяного агара
(+).
Гемолиз (+)
Гемолиз ()
Рис.6
Лецитиназа.
Для
изучения
лецитовителлазной
активности
стафилококков, к питательному солевому агару (МПА + 8-10% хлорида
натрия), расплавленному и остуженному до 45С добавляют взвесь куриного
желтка. После застывания агара проводят посев исследуемых культур
стафилококка, которые инкубируют в термостате в течение суток при 37 С.
Учет результатов (Рис.7):
(+) - Стафилококки, продуцирующие лецитиназу, образуют вокруг
своих колоний зону помутнения среды с перламутровым оттенком
(«радужный венчик).
() - Вокруг колоний стафилококков, не обладающих лецитиназной
активностью, питательный агар остается без изменений.
Лецитиназа (+)
Лецитиназа ()
Рис. 7
ДНК-азная активность. Для изучения ДНК-азной активности
стафилококков в питательный агар добавляют ДНК, разведенный в едком
натре, стерилизуют текучим паром 30 минут. Перед разливом в среду
добавляют хлористый кальций. После застывания агара проводят посев
исследуемых культур стафилококка, которые инкубируют в термостате в
течение суток при 37 С.
Учет результатов: Около колоний стафилококка, продуцирующих
ДНК-азу образуется прозрачная зона расщепления ДНК (+) (Рис.8).
ДНК (+)
ДНК ()
Рис.8
Дермонекротическая
проба.
Ставится
для
определения
дермонекротоксина стафилококков на кроликах. Для этого кролику
внутрикожно вводят 0,2 мл бульонной культуры бактерий при помощи
туберкулинового шприца с тонкой иглой.
Учет результаов проводят через 24-48 часов:
(+) - на месте введения культуры микробов появляется очаг некроза
(гнойный очаг грязно зеленого цвета с темными краями, вокруг
гиперемированная кожа и инфильтрат).
() – на месте введения видимых изменений нет.
Кератоконьюктивальная проба. Суточная агаровая культура
бактерий стандартной бактериальной петлей диаметром 5 мм вводится под
нижнее веко глаза морской свинки. Через 2-4 суток оценивается
выраженность кератоконьюктивита.
Учет:
1. Реакция оценивается как (+) при наличии помутнения роговицы,
нагноения и изъязвления (проба Шереня).
2. Реакция оценивается как () изменений в роговице глаза морской
свинки нет.
При выполнении необходимо:
1. сформулировать цель исследования
2. определить материал исследования
3. провести экспериментальную работу, согласно методической инструкции
приведенной выше.
4. Результат, выполненной работы внести в таблицу 2.
5. Написать заключение.
Таблица 2
ОПРЕДЕЛЕНИЕ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ У КУЛЬТУР
ЗОЛОТИСТОГО СТАФИЛОКОККА
Цель исследования Культура
Культура
Культура
St.aureus № 1
St.aureus № 2
St.aureus № 3
1.Плазмокоагулаза
2.Фибринолизин
3.Гемолизин
4.Лецитиназа
5.ДНК-аза
Заключение
Задание 5. Используя Рис. 9 разобрать цели применения лабораторных
животных и сущность биологического метода диагностики. Пути и
способы заражения лабораторных животных.
Методы исследования, связанные с применением животных, называются
биологическими или экспериментальными, а используемые для этой цели
животные - экспериментальными или лабораторными.
В микробиологической практике животными пользуются для диагностики
некоторых инфекционных заболеваний (туберкулез, туляремия, ботулизм и
др.), для определения вирулентности и токсигенности изучаемого штамма
микроба, активности приготовленных вакцин и определения их безвредности.
Кроме этого лабораторные животные служат донорами, от которых
можно систематически брать кровь для приготовления кровяных питательных
сред и проведения специальных исследований, связанных с использованием
крови и ее ингредиентов: сыворотки, плазмы, эритроцитов, лейкоцитов и т.д.
Инфекционный процесс может быть искусственно воспроизведен путем
экспериментального заражения лабораторных животных: кроликов, морских
свинок, белых мышей, белых крыс и др.
Заражают животных накожно, внутрикожно, подкожно, внутримышечно,
внуривенно, перорально, интраназально, внутритрахеально, интрацеребрально и
внутрибрюшинно.
Задание 6. Заразить лабораторное животное (белую мышь)
внутрибрюшинно взвесью микроорганизмов с целью воспроизведения
инфекционного процесса.
Перед началом опыта животных отбирают, взвешивают и маркируют.
Инструменты стерилизуют автоклавированием. При заражении мышь берут
за хвост, опускают на стол, туловище быстро прижимают к столу двумя
Изменение вирулентности
возбудителя, определение
активности и безвредности
вакцин
Получение
диагностических и
лечебных сывороток
Определение
вирулент
ности
(Dlm,
Dl50,
Dcl)
Лабораторные
животные
Биологический метод
--------------------------(характерная клиническая
картина, патоморфологическая
картина), мазки-отпечатки
Выделение
чистой
культуры
и
ее
идентификация
Определение токсигенности
бактерий (реакция
нейтрализации токсина
антитоксином)
Рис. 9
пальцами и, скользя ими по спине, захватывают кожу над головой и
фиксируют животное в левой руке в растянутом положении. Взвесь
микроорганизмов определенной концентрации набирают в шприц через иглу.
Шприц держат, как писчее перо, в правой руке.
При внутрибрюшинном заражении животное фиксируют головой вниз,
чтобы кишечник переместился к диафрагме. В левой нижней трети живота
делают прокол кожи, удерживая иглу под острым углом, затем переводят
шприц в положение, перпендикулярное к брюшной стенке, толчкообразным
движением прокалывают брюшину. Чувство «провала»,
исчезновение
ощущения сопротивления на пути, указывает на проникновение иглы в
брюшную полость. После этого иглу переводят в вертикальное положение и
вводят содержащийся в шприце материал в полость брюшины (Рис.10).
ЗАНЯТИЕ № 2
Тема занятия: «Инфекция
исследования (окончание)”.
(окончание).
Биологический
метод
Вопросы для самостоятельной подготовки студентов к занятию:
1. Роль макроорганизма и окружающей среды в развитии
инфекционного процесса. Значение социальных факторов.
2. Механизм проникновения микробов в организм. Пути и факторы
передачи. Распространение бактерий, вирусов, токсинов в организме
больного.
3. Формы инфекции: экзогенная и эндогенная, очаговая и
генерализованная, моноинфекция, смешанная и вторичная инфекции,
реинфекция, суперинфекция. Их определение. Условия возникновения.
4. Понятие о раневых, респираторных, кишечных, кожно-венерических,
антропонозных, зоонозных и сапронозных инфекциях.
Студент должен знать:
1.
Роль макроорганизма и окружающей среды в инфекционном
процессе.
2.
Механизмы проникновения микробов в организм. Пути и
факторы передачи.
3.
Понятия, характеризующим различные виды инфекционного
процесса.
4. Сущность биологического метода исследования.
Студент должен уметь:
1. Проводить вскрытие зараженных лабораторных животных.
2. Готовить мазки-отпечатки, красить по Граму, микроскопировать.
3. Оформить протокол вскрытия лабораторного животного.
ПРАКТИЧЕСКАЯ РАБОТА СТУДЕНТОВ НА ЗАНЯТИИ
Задание 1. Используя Рис. 11 разобрать различные формы инфекции.
Задание 2.
макроорганизма.
Используя
Рис.12
разобрать
системы
защиты
Задание 3. Провести вскрытие трупа лабораторного животного
(белой мыши), отметить характерную патоморфологическую картину,
приготовить мазки-отпечатки, окрасить по Граму, промикроскопировать.
Оформить протокол вскрытия лабораторного животного.
Трупы лабораторных животных вскрывают с целью выяснения причин
гибели,
выделения
введенного
возбудителя
и
изучения
патологоанатомических изменений, наступающих в результате перенесенной
инфекции.
Вскрытие животных проводят сразу же после их гибели, соблюдая
правила асептики во избежание загрязнения посторонними бактериями.
Мышь помещают брюшком кверху на марле, смоченной дезинфицирующим
раствором, поверх слоя застывшего парафина в ванночке и прикрепляют
булавками за лапки.
В процессе вскрытия придерживаются следующего порядка. Вскрытие
начинают с исследования наружных покровов и подкожной клетчатки. Затем
проводят вскрытие, исследование и взятие материала из органов грудной
полости и в последнюю очередь вскрытие, исследование и взятие материала
из органов брюшной полости.
Перед вскрытием тщательно обрабатывают кожу раствором какоголибо антисептика. Вскрытие проводят стерильными инструментами. Делают
продольный разрез кожи по прямой линии от нижней челюсти до лобка. На
уровне передних и задних лапок делают боковые надрезы. Кожные лоскуты
препарируют от подкожной клетчатки и отворачивают в стороны,
прикалывая булавками к доске. Отмечают состояние подкожной клетчатки и
лимфатических узлов, при необходимости делают из них мазки-отпечатки.
Грудную полость вскрывают поперечным разрезом под мечевидным
отростком и двумя продольными разрезами через ребра параллельно
грудине. Откладывают вырезанный лоскут и осматривают органы грудной
полости, отмечая в протоколе наличие экссудата. Для посева крови из сердца
его поверхность прижигают раскаленным кончиком пинцета и вводят
капилляр стерильной пипетки в полость сердца. Кровь, поднявшуюся по
капилляру пипетки, засевают в питательную среду. Из ткани легкого готовят
мазки-отпечатки и делают посевы.
После этого, сменив инструменты, переходят к исследованию органов
брюшной полости, которую вскрывают продольным разрезом брюшины
ножницами, не задевая кишечник. Осматривают органы брюшной полости,
отмечая в протоколе наличие экссудата, величину, цвет и консистенцию
печени, селезенки, надпочечников, мезентериальных лимфатических узлов.
При необходимости делают посевы из этих органов на питательные среды.
Для приготовления мазков-отпечатков на прижженной поверхности
органа (печени, селезенки, почек) делают разрез, из глубины его вырезают
небольшой кусочек ткани, берут пинцетом и прикасаются к предметному
стеклу поверхностью разреза. Мазки-отпечатки фиксируют в жидком
фиксаторе и окрашивают метиленовым синим. При микроскопии отмечают
присутствие микроба-возбудителя в различных органах и тканях. Результаты
посевов учитывают на следующий день после инкубации в термостате. Труп
животного после вскрытия подлежит уничтожению.
Изменения, обнаруженные при вскрытии трупа, а также результаты
бактериологического исследования вносят в протокол вскрытия и
бактериологического исследования трупного материала, составленного по
следующему образцу:
1. Вид лабораторного животного, взятого в опыт.
2. Время заражения (месяц, число, час).
3. Материал, примененный для заражения (взвесь микробов с плотной
питательной среды, бульонная культура, взвесь патологического
материала и т.д.)
4. Время гибели животного (месяц, число, час).
5. Изменения, обнаруженные при вскрытии животного в месте
введения заразного материала, состояние подкожной клетчатки,
лимфатических узлов, изменения, обнаруженные во внутренних
органах.
6. Вид микроба, выделенного из трупного материала, и его основные
морфологические, культуральные, биохимические и серологические
свойства.
СИСТЕМЫ ЗАЩИТЫ МАКРООРГАНИЗМА
Естественная (видовая)
невосприимчивость
А. Функциональные (общие)
- физиологические рефлексы
- нормальная микрофлора
- воспаление
- повышение температуры
тела
- выделительные функции
органов и тканей
Б. Клеточно-тканевые
- фагоцитирующие клетки
- NK
- неповрежденные кожа и
слизистые
В. Гуморальные
- секреты
- антимикробные гуморальные
факторы различных жидкостей
- нормальные антитела
Иммунитет
Специфические
(иммунные)
антитела
Самозащита генома
клетки
- механизмы ревизии
- механизмы супрессии
- механизмы репараций
- механизмы модификаций
и ограничений (рестрикаций)
- механизмы подавления
репродукции чужеродного генома
- механизмы выражения
информации чужеродного
генома, встроенного в
геном клетки хозяина
ФОРМЫ
По
источнику
инфекции
Пути заражения
По локализации
Возбудителя
организме
Антропонозные
ИНФЕКЦИИ
Зооантропонозные
Зоонозные
Эндогенные
(аутоинфекции)
Очаговые
Сапронозные
Экзогенные
Генерализованные
в
По
количеству
микробных агентов
По
механизму
передачи
По
клинической
картине
Бактериемия
Вирусемия
Токсинемия
Моноинфекции
Наружных Респираторные
Покровов
(раневые)
Инфекционная болезнь
Инаппарантная
Сепсис
Септикопиемия
Смешенные (микст-инфекции)
Кишечные
манифестная
Кожно-венерические
Трансмиссивные
Бессимптомные
Бациллоносительство
Хронические
Рис. 12
Латентные
Медленные