метод количественного фотометрического определения

Химия растительного сырья. 1998. № 3. С. 41–46
УДК 543.544:543.80
МЕТОД КОЛИЧЕСТВЕННОГО ФОТОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА
 А. П. Еськин, В. А. Левданский, Н. И. Полежаева
Институт химии и химической технологии СО РАН, Красноярск (Россия)
E-mail: [email protected] [email protected]
Разработан метод количественного фотометрического определения дигидрокверцетина. Метод позволяет определять дигидрокверцетин в смеси с другими соединениями без выделения его в чистом виде. Сущность метода состоит в переводе бесцветного дигидрокверцетина в окрашенное соединение и измерении интенсивности окраски
полученного раствора. Предложенным методом определено содержание дигидрокверцетина в образцах древесины
лиственницы сибирской.
ределение ДКВ с помощью газожидкостной хро-
Введение
Дигидрокверцетин
(3.3′.4′.5.7-пентагидрокси-
флаванон) является ценным биологически активным веществом: применяется в качестве антиоксиданта жиров и растительных масел, служит лекарственным препаратом. Так, дигидрокверцетин
(ДКВ) используется для защиты сухого молока от
процессов свободнорадикального окисления [1], а
также в качестве антиоксидантной пищевой добавки [2]. Диквертин – медицинский препарат на
основе ДКВ, обладает антиоксидантными свойствами, капилляропротекторной, противоотечной и
радиопротекторной активностью, оказывает гепатопротекторное (антитоксичное) действие [3].
При сульфитной варке древесины ДКВ, взаимодействуя с бисульфит-ионами, оказывает отрицательное влияние на стабильность сульфитной
кислоты.
Существующие методики количественного определения ДКВ требуют, как правило, предварительного его выделения в чистом виде. Например,
с помощью бумажной [4] и тонкослойной хроматографии [5], с предварительным разделением
тонкослойной хроматографией на капроновом
порошке и последующим элюированием [6]. Оп-
матографии требует дорогостоящего оборудования [7, 8].
Выделение индивидуальных веществ из сложной смеси – процесс достаточно трудоемкий и
продолжителен во времени. Кроме того, в процессе выделения неизбежны потери, а это в свою очередь сказывается на точности определения.
В связи с этим проблема аналитического определения ДКВ в смеси с другими соединениями без
его выделения в чистом виде остается актуальной.
Эксперментальная часть
Оптическую плотность измеряли на фотоэлектроколориметре КФК-3 при 550 нм. Калибровочный график сстроили для стандартных растворов
ДКВ,
который
был
выделен
из
препарата
“Диквертин”. Исходный раствор ДКВ в этаноле
готовили в пикнометре на 25 мл. Разбавлением
исходных растворов получали растворы с пониженной концентрацией. Спектр поглощения реакционной массы в видимой области снят на приборе “UV-30 Shimadzu”. Ацетон и цинковая пыль
были квалификации ч.д.а., соляная кислота и уксусная кислота – о.с.ч.
А. П. ЕСЬКИН, В. А. ЛЕВДАНСКИЙ, Н. И. ПОЛЕЖАЕВА
42
компонента в окрашенный раствор и, с другой
Обсуждение результатов
Сущность колориметрических определений состоит в следующем: определяемый компонент при
помощи химической реакции переводят в окрашенное соединение, после чего измеряют интен-
стороны, знание оптических свойств окрашенных
растворов, и на этом основании – умение правильно выбрать способ измерения интенсивности
окраски.
Основанием для разработки такого метода по-
сивность окраски полученного раствора. Таким
образом, при колориметрическом определении
существенное значение имеют, с одной стороны,
правильно выбранные условия выполнения химической реакции по переведению определяемого
OH
HO
O
4
OH
3
служила реакция образования цианидинхлорида
из дигидрокверцетина при обработке последнего
цинковой пылью в присутствии соляной кислоты
[9] (схема).
9
Zn, HCl
+
OH
Cl
_
OH
O
OH
OH
OH
OH
O
OH
Вероятный механизм реакции включает в себя
нии соляной кислоты, раствор фотометрировался.
кислотнокатализируемую енолизацию или ки-
При восстановлении этанольного раствора
слотный сдвиг от С(3) к С(4) с образованием псев-
ДКВ в ацетоне концентрированной соляной ки-
дооснования антоцианидина и последующим об-
слотой и цинковой пылью время жизни цианидин-
разованием цианидинхлорида в кислотном рас-
хлорида ограничено и, кроме того, мала чувстви-
творе [10].
тельность реакции. Восстановление этанольного
Время жизни цианидинхлорида в фотометри-
раствора ДКВ в ацетоне 10 % соляной кислотой
Cледовательно,
приводит к появлению окраски только через
важно было подобрать такие условия реакции, при
70 мин. Следует предположить, что, сочетая жест-
которых образование цианидинхлорида протекало
кое и мягкое восстановление ДКВ, можно добить-
бы более полно с удовлетворительной скоростью,
ся оптимальных условий протекания реакции по
и в то же время временной фактор был бы менее
времени и чувствительности.
руемом
растворе
ограничено.
критичным.
Нами предложено использовать смесь, состоя-
В работе [11] описан способ определения ДВК
щую из концентрированной соляной кислоты, ле-
в водных экстрактах дугласовой пихты с помо-
дяной уксусной кислоты и воды в соотношении
щью двухстадийного процесса. Этот процесс мяг-
3:3:1 (об. %). На рис. 1 приведен спектр поглоще-
кого восстановления ДКВ требует 30–40 мин. ки-
ния реакционной смеси в видимой области. Исхо-
пячения водного экстракта в растворе ацетона с
дя из спектра поглощения нами была выбрана
уксусной кислотой и цинковой пылью. Затем, по-
аналитическая длина волны (λ = 550 нм).
сле удаления избытка цинковой пыли и добавле-
МЕТОД КОЛИЧЕСТВЕННОГО ФОТОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА
Рис. 1. Спектр поглощения продукта восстановления дигидрокверцетина. Концентрация ДКВ —
3.80×10-5 моль/л
На рис. 2 приведена зависимость скорости об-
высокая, чем в этаноле, что, по-видимому, объяс-
разования окрашенного продукта от времени из
няется температурой условиями кипения реакци-
которго видно, что предложенную нами систему
онной смеси (70 ± 0.1оС в термостате).
можно позволяет использовать для определения
Масса цинковой пыли (0.2 г), используемой
ДКВ. Восстановление ДКВ 10 % соляной кисло-
для восстановления, была выбрана исходя из дос-
той хотя и приводит к устойчивому образованию
таточного её количества для восстановления ДКВ
окраски, но для этого требуется продолжительное
и существенно не влияет на образование окра-
время (70–80 мин).
шенного продукта.
В качестве растворителей, применяемых нами
Продолжительность нагревания варьировалась
для восстановления ДКВ, были использованы эта-
от 10 до 40 сек. В табл. 1 приведена зависимость
нол и ацетон. Показано, что при проведении реак-
оптической плотности (λ = 550 нм) от продолжи-
ции в ацетоне чувствительность реакции более
тельности нагревания раствора.
Рис. 2. Зависимость скорости образования окраски от времени (λ = 550 нм):
1. восстановление цинковой пылью с концентрированной HСl.
2. восстановление цинковой пылью с 10 % HСl.
3. восстановление цинковой пылью со смесью: HСl, СН3СООН, в соотношении 3:3:1. Везде концентрация ДКВ – 5.00×10-5 моль/л
43
А. П. ЕСЬКИН, В. А. ЛЕВДАНСКИЙ, Н. И. ПОЛЕЖАЕВА
44
Калибровочный график выполненных измерений приведен на рис. 3.
Таблица 2
Результаты определения ДКВ предложенным
Закон Бера выполняется в пределах концен-
методом (концентрация ДКВ – 6.17×10-5 моль/л)
траций ДКВ (2.46–16.38)×10-5 моль/л с помощью
Концентрация
метода наименьших квадратов [12] были найдены
дигидрокверце-
коэффициенты в уравнении:
тина
D/d = A + ε × c
Отклонение от
А = -0.168
среднего
ε = 10090±114, отсюда, при d = 1 см.
c=
D + 0.168
(моль/л).
10090
дигидроквер-
нашего и двухстадийного метода описанного в
цетина
работе [11]. Результаты определения приведены в
Отклонение от
табл. 2, 3.
среднего
Таблица 1
Зависимость оптической плотности (λ=550 нм) от
времени нагревания раствора, (концентрация
ДКВ–4.49×10-5 моль/л)
Оптическая плотность раствора,
6.18
0
0.04
0.02
0.02
0.01
методом* (концентрация ДКВ – 6.17×10-5 моль/л)
деление ДКВ в стандартных растворах с помощью
20
6.16
Результаты определения ДКВ двухстадийным
Концентрация
10
6.19
Таблица 3
предложенного метода было осуществлено опре-
нагревания, с
6.13
Стандартное отклонение 0.0235.
Для подтверждения достоверности данных
Время
6.17
5.26
5.25
5.23
5.24
5.21
0.02
0.01
0.01
0
0.03
Стандартное отклонение 0.0194.
* предложен в [11]
Из табличных данных можно сделать вывод о
том, что предложенный нами метод определения
ДКВ имеет более высокую чувствительность чем
30
40
описанный в работе [11], а продолжительность
анализа, на порядок меньше.
0.282
0.285
0.217
0.165
Оптимальное время восстановления ДКВ – 20 сек.
По разработанной методике была определена
концентрация ДКВ в спиртовых экстрактах лиственницы сибирской (табл. 4). Содержание ДКВ в
исследуемых нами образцах древесины составляет
1.53 %.
Рис. 3. Калибровочный график для определения дигидрокверцетина
МЕТОД КОЛИЧЕСТВЕННОГО ФОТОМЕТРИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДИГИДРОКВЕРЦЕТИНА
Таблица 4
Дигидрокверцетин в %
Отклонение от
среднего
1.56
1.55
1.50
1.53
1.53
0.03
0.02
0.03
0
0
ния его в чистом виде. Рекомендуемый диапазон
определяемых
концентраций
(2.46 –
16.38)×10-5 моль/л дигидрокверцетина. Предложенным методом определено содержание дигидрокверцетина в образцах древесины лиственницы
Стандартное отклонение 0.0235.
сибирской. Показано преимущество метода по
Следует отметить, что содержащиеся в древе-
сравнению с описанным в литературе.
сине лиственницы сибирской кверцетин и кемферол в данных условиях не образуют окрашенных
Список литературы
продуктов, а аромадендрин, способный образовы-
1. Теселкин Ю.О., Бабенкова И.В., Клебанов
вать окрашенные продукты, содержится в этой
Г.И. и др. Защита дигидрокверцетином сухого
древесине в следовых количествах [6].
молока от процесса свободно радикального окис-
Методика определения ДКВ в древесине
ления // Экология. человека: проблемы и состоя-
3.0088 г измельченных опилок лиственницы
ние лечебно-профилактического питания. Тез.
сибирской (1–2 мм) с влажностью 5.85 % кипяти-
докл. 3 международн. симп. Ч. 2. М., 1994.
ли в круглодонной колбе с обратным холодильни-
С. 254-255.
ком 1 час в 80 мл этанола. После отделения опи-
2. Тюкавкина Н.А., Руленко И.А., Колесник
лок последние промывали на фильтре 15 мл эта-
Ю.А. и др. Использование дигидрокверцетина в
нола. Экстракт разбавляли в мерной колбе до
качестве антиоксидантной пищевой добавки //
100 мл. 1 мл экстракта помещали в пробирку, со-
Экология человека: проблемы и состояние лечеб-
держащую 0.2 г. цинковой пыли и 2 мл ацетона.
но-профилактического питания. Тез. докл. 3 Меж-
После внесения 1 мл смеси, состоящей из соляной
дународн. симп. Ч. 2. М., 1994. С. 189–191.
кислоты (ρ = 1.19), ледяной уксусной кислоты и
3. Соколов С.Я., Тюкавкина Н.А., Колхир В.К.
воды в соотношении 3:3:1 (по объему), пробирку
и др. Антиоксидантные, капилляропротекторные,
о
встряхивали и нагревали в термостате (70 ± 0.1 С)
противовоспалительные и антигистаминные сред-
в течение 20 сек. Пробирку охлаждали ледяной
ства. Патент № 2014841. Россия. Б.И. № 12. 1994.
водой 20 сек, раствор декантировали в мерную
4. Шостаковский М.Ф., Тюкавкина Н.А., Ки-
колбу на 25 мл. Остаток цинковой пыли промыва-
риллов А.И. и др. Количественное определение
ли дважды ацетоном по 5 мл. Доводили до метки
флавоноидов флоуриметрическим методом // Изв.
ацетоном и через 5 минут после окончания нагре-
СО АН СССР. Сер. хим. наук. 1969. № 2. Вып. 1.
вания определяли оптическую плотность. Раствор
С. 121–124.
сравнения готовили таким же образом, но вместо
5. Chan Frank L. Separation and identification of
спиртового экстракта древесины вливали 1 мл
3.3′.4′.5.7-pentahydroxyflavanone
этанола.
compоunds by thin-layer chromatography // J.
Определение ДКВ с помощью двухстадийного
процесса осуществляли по методике, описанной в
работе [11].
Заключение
Разработан быстрый метод количественного
and
related
Chromatogr. 1970. Vol. 48. № 2. P. 363.
6. Тюкавкина Н.А., Лаптева К.И., Девятко
Н.Т.
Количественное
спектрофотометрическое
определение флавоноидов с использованием тонкослойной хроматографии // Журн. аналит. химии.
1969. Т. 24. № 5. С. 777–781.
фотометрического определения дигидрокверцети-
7. Шибанова Г.И., Громова А.С., Кисли-
на в смесях с другими соединениями без выделе-
цин Л.Д. Фенольные соединения внутренней и
45
А. П. ЕСЬКИН, В. А. ЛЕВДАНСКИЙ, Н. И. ПОЛЕЖАЕВА
46
внешней коры Picea obovata ledb. // Изв. СО АН
10. Jurd L. The acid catalyzed conversion of 3-
СССР. Сер. хим. наук. 1977. № 12. Вып. 5.
hydroxyflavanons to anthocyanidins // Phytochem.
С. 153-155.
1969. Vol. 8. № 12. P. 2421–2423.
Dual-wavelength
11. Barton G.M., Gardner J.A.F. Determination of
absorbance ratio and spectrum scanning techniques
dihydroquercetin in Douglas fir and western larch
for identification of flavonoids by highperformance
wood // Anal. Chem. 1958. Vol. 30. № 2. P. 279–281.
liquid chromatography // J. Chromatogr. 1987.
12. Берштейн И.Я., Каминский Ю.Л. Спектро-
8. Law
K.N.,
Das
N.P.
Vol. 388. № 1. P. 225–233.
9. Swain T. Leucocyanidin // Chem. and Ind.
фотометрический анализ в органической химии.
Л., 1975. 230 с.
1954. № 37. P. 1144–1145.
Поступило в редакцию 29.06.98