ЕГОРОВА МАРИЯ СЕРГЕЕВНА ВИДОВОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ XANTHOMONAS
реклама
На правах рукописи ЕГОРОВА МАРИЯ СЕРГЕЕВНА ВИДОВОЕ РАЗНООБРАЗИЕ И МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ ФИТОПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ РОДА XANTHOMONAS, ПОРАЖАЮЩИХ РАСТЕНИЯ СЕМЕЙСТВА МЯТЛИКОВЫЕ (POACEAE) Специальность: 06.01.07 – защита растений АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук Москва – 2015 Работа выполнена в лаборатории бактериологии и молекулярных методов испытательного экспертного центра Федерального государственного бюджетного учреждения «Всероссийский центр карантина растений» (ФГБУ «ВНИИКР») Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник, руководитель группы молекулярной фитопатологии ФГБУН "Центр Биоинженерия" РАН Игнатов Александр Николаевич Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией полевых культур, руководитель научной тематики по генофонду растений ФГБНУ Всероссийского селекционно-технологического института садоводства и питомниководства РАСХН Темирбекова Сулухан Кудайбердиевна кандидат биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории биотехнологии ФГБНУ Всероссийского научно-исследовательского института селекции и семеноводства овощных культур Шумилина Дарья Владимировна Ведущая организация: ФГБНУ Всероссийский научноисследовательский институт растениеводства им. Н.И. Вавилова Россельхозакадемии Защита состоится «17» июня 2015 г. в 16.30 часов на заседании диссертационного совета Д 220.043.04. на базе ФГБОУ ВО «Российский государственный аграрный университет – МСХА имени К.А. Тимирязева» по адресу: 127550, г. Москва, ул. Прянишникова д.19, (тел./факс 8-499-976-17- 14), [email protected] С диссертацией можно ознакомиться в ЦНБ имени Н.И. Железнова ФГБОУ ВО «РГАУ – МСХА имени К.А. Тимирязева» и на сайте университета www.timacad.ru Автореферат разослан «___» апреля 2015 г. Учёный секретарь диссертационного совета А. Н. Смирнов 2 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы. Зерновые злаки (семейство Мятликовые Poaceae) являются главными стратегическими культурами в сельскохозяйственном производстве России. Поэтому получение высоких и устойчивых урожаев является важнейшей задачей растениеводства и защиты растений. Вместе с тем целый ряд болезней зерновых существенно снижает продуктивность агроценозов. К числу важнейших из них относят бактериозы, которые широко распространены в последние годы. Бактерии рода Xanthomonas поражают более 400 видов растений. Наиболее вредоносным возбудителем бактериальных болезней зерновых культур считается возбудитель штриховатости листьев и черного бактериоза семян Xanthomonas translucens (Jones et al.,1917, Vauterin et al.,1995), вызывающий потери до 40% урожая на восприимчивых сортах пшеницы, ржи, ячменя и овса. Бактериальный ожог риса Xanthomonas oryzae (Swings et al, 1990) относится к числу наиболее вредоносных заболеваний во всем мире, унося ежегодно в странах Азии, от 22 до 81% урожая риса (OEPP/EPPO,1990). В 20012008 гг. впервые в РФ был выделен и изучен новый бактериальный патоген злаков Xanthomonas arboricola (Vauterin et al, 1995), вызывающий поражение пшеницы, ржи, ячменя, овса, а также подсолнечника и крестоцветных культур. Следует отметить, что патовары этого вида также паразитировали на ряде многолетних растений (Vauterin, 1995): землянике, косточковых плодовых деревьях, фундуке, грецком орехе, тополе и молочае (Игнатов и др., 2010). Болезни растений, вызываемые фитопатогенными бактериями рода Xanthomonas, приводят к серьезным экономическим потерям, так как они поражают наиболее важные сельскохозяйственные культуры. Поскольку производство семян и посадочного материала сельскохозяйственных культур все больше сосредотачивается в странах с благоприятным для бактериозов климатом, фитопатогенные бактерии этого рода распространяются по всему миру. В связи с этим проблема идентификации и диагностики Xanthomonas spp. становится все более экономически значимой (Пунина и др., 2008). Видовое разнообразие фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas, поражающих растения семейства Мятликовые в РФ практически не изучалось, и методы их диагностики не разрабатывались, в связи с чем актуальность и новизна исследований в этой области не вызывает сомнений. Цель и задачи исследований. Целью проводимых исследований являлось изучение видового разнообразия фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas, поражающих зерновые культуры, разработка методов диагностики видов, регулируемых законодательством РФ и поиск эффективных мер борьбы с бактериальным ожогом риса. Для достижения поставленной цели планировалось решение следующих задач: 3 1. Уточнить видовой состав и оценить распространенность фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas, поражающих зерновые культуры сем. Poaceae в Российской Федерации. 2. Создать коллекцию штаммов фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas и типовых штаммов соответствующих видов патогена, а также определение их видового разнообразия по молекулярногенетическим признакам, включая MLST (мультилокусное секвенирование). 3. Разработать методы диагностики зараженности растений и семян на основе ПЦР, ПЦР в реальном времени и БИО-ПЦР. 4. Найти эффективные препараты для протравливания семян в борьбе с бактериальным ожогом риса. Научная новизна. Впервые в России проведено исследование по изучению видового разнообразия фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas, поражающих зерновые культуры сем. Мятликовые, в ходе, которого были идентифицированы возбудители X. campestris, X. hortorum, X. cynarae, X. pisi, и X. gardeneri, ранее не выявляемые на данных культурах. Оптимизирован метод пробоподготовки семенного материала (рис, ячмень) для диагностики возбудителей бактериозов. На основе подобранных праймеров и зондов разработана диагностика карантинного вида Xanthomonas oryzae и наиболее часто встречаемого вида в семенном материале злаковых культур Xanthomonas arboricola методом ПЦР «в реальном времени». На основании подобранных праймеров и предложенной модифицированной селективной среды разработана диагностика карантинного вида X. oryzae методом БИО-ПЦР. Показана высокая эффективность применения фунгицида Максим, КЭ (компания «Сингента») для предпосевного протравливания семян от возбудителя бактериального ожога риса. Практическая значимость результатов исследований. В результате исследований была создана референтная коллекция российских штаммов фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas, поражающих зерновые культуры сем. Poaceae (40 штаммов). По материалам проведенных исследований разработаны методические рекомендации по выявлению и идентификации возбудителей карантинных бактериозов риса X. oryzae pv. оryzae и X. oryzae pv. oryzicola, которые могут быть использованы в практике научных исследований и при проведении досмотра и экспертиз подкарантинной продукции на наличие карантинных вредных организмов. В данную методику были включены собственные разработанные и модифицированные методы. В частности, предложена модифицированная селективная среда для изоляции патогенов из растительного материала. Подобраны специфичные праймеры и зонд для диагностики X. 4 oryzae методом ПЦР «в реальном времени». Усовершенствовано несколько вариантов классической ПЦР для выявления данного патогена. Разработанные методы диагностики успешно применяются при проведении фитосанитарной экспертизы в ФГБУ «ВНИИКР». Основные положения, выносимые на защиту: 1. Видовое и генетическое разнообразие фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas, поражающих зерновые культуры сем. Мятликовые; 2. Оптимизация молекулярно-генетических методов идентификации бактериозов (методы экстракции бактерий; разработка ПЦР «в реальном времени» для диагностики карантинного вида X. oryzae и X. arboricola; разработка модифицированной селективной среды для изоляции возбудителя бактериального ожога риса из растительного материала); 3. Поиск эффективных приемов защиты от возбудителя бактериального ожога риса. Апробация работы. Основные положения и результаты исследований диссертационной работы доложены на Международной научно-практической конференции «Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве» (г. Саратов, ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ», 2013); на 14-й научной конференции молодых ученых «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», (г.Москва, ГНУ ВНИИСБ, 16 апреля 2014 г.); на Международной научно-практической конференции «Бактериальные и фитоплазменные болезни сельскохозяйственных культур: научные и практические аспекты», (Большие Вяземы, ВНИИ фитопатологии,15-18 октября 2014 г.); на Международной научно-практической конференции «Научное и кадровое обеспечение продовольственной безопасности России» (г.Москва, ФГБОУ ВПО РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева, 2-4 декабря 2014). Публикации. По материалам диссертации опубликовано восемь печатных работ, в том числе 3 в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК. Объём и структура работы. Диссертационная работа изложена на 132 страницах и состоит из введения, 5 глав, заключения, общих выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы из 219 источников (из них 172 - зарубежных авторов). В диссертации содержится 16 рисунков, 15 таблиц и 6 приложений. Автор выражает благодарность научному руководителю д.б.н. А.Н. Игнатову за помощь и постоянное внимание к работе; заместителю директора ФГБУ «ВНИИКР», к.б.н. Мазурину Е.С. за полезные советы и оказанную помощь на протяжении всех этапов исследований. Автор искренне признателен сотрудникам лаборатории бактериальных болезней растений ВНИИ фитопатологии РАСХН за предоставленную коллекцию штаммов и растительный материал для проведения исследований; а также сотрудникам ФГБУ «ВНИИКР»: к.с.-х.н. М.Б. Копиной, Г.Н. Матяшовой, С.И. Приходько. 5 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Во введении обоснована актуальность и практическая значимость темы исследований, сформулирована основная цель и задачи исследования. Глава I. Обзор литературы. В данной главе приведены сведения о видовом составе, распространенности и вредоносности фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas, поражающих зерновые культуры сем. Мятликовые. Рассмотрены биологические особенности и симптоматика основных возбудителей бактериозов. Приведены сведения об основных методах диагностики и защиты от возбудителей бактериозов на злаковых культурах. Глава II. Материалы и методы. Работа выполнена в 2011-2014 гг. в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Всероссийский центр карантина растений» (ФГБУ «ВНИИКР»). Объекты исследования. Для изучения видового состава фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas на растениях сем. Мятликовые было исследовано более 900 образцов зерновых культур (листья, колосья и стебли озимой и яровой пшеницы, ржи, ячменя и овса), собранных сотрудниками ВНИИ фитопатологии в 2004-2013 гг. в 113 точках сборах. А также 126 партий семян риса, поступивших в ФГБУ «ВНИИКР» из Респ. Дагестан, Краснодарского и Приморского края для установления фитосанитарного состояния. Совместно с испытательной лабораторией Российской академии наук Институт общей генетик им. Н.И. Вавилова РАН было проанализировано 70 партий семян ячменя, пшеницы, ржи и овса (урожай 2010-2012 гг.) из 7 регионов РФ: Алтайский край, Воронежская, Курская, Рязанская, Тамбовская, Амурская, Омская области на наличии возбудителей бактериозов. Для лабораторного анализа отбирали щуплые, недоразвитые, серые, с засохшим экссудатом желтоватого цвета семена. В работе также использовали 50 штаммов, предоставленных лабораторией бактериальных болезней ГНУ-ВНИИ фитопатологии РАСХН; а также типовые штаммы из National Collection of Plant Pathogenic Bacteria NCPPB (Великобритания). Бактерии выращивали на среде YDC (Schaad, 2001): дрожжевой экстракт - 10г, CaCo3 - 20г, глюкоза - 10г, агар - 18г, дистиллированная вода - 950 мл при 27оC в течение 48 ч. Экстракцию бактерий из семян проводили следующим образом: партию семян стерилизовали в 10% гипохлорите натрия в течение 2 мин, промывали в стерильной воде, помещали в фосфатно-солевой буфер с добавлением Твина20. Охлаждали при +40С 24 часа. Помещали на ротационный шейкер и встряхивали со скоростью 210 об/мин в течение 30 мин. Далее пробы помещали в одноразовый пакет с фильтром и измельчали с помощью гомогенизатора до полной однородности. Пропускали через грубый фильтр и 6 высевали на чашки со средой YDC. Выросшие отдельные колонии бактерий пересевали и хранили в 15% - ном глицерине при -700С. Выделение ДНК из растительного материала и чистых культур бактерий проводили с использованием готового коммерческого набора «Проба ГС» («ДНК – Технология», Москва). Концентрацию и чистоту выделенной ДНК измеряли на спектрофотометре NanoDrop 2000 согласно инструкции производителя. Оценка вирулентности проводилась на растениях, выращенных в 15-см вазонах до стадии 3-5 настоящего листа и инокулированных методом опрыскивания. Симптомы учитывались через 21 день после заражения. Все использованные в работе штаммы вызывали системное или локальное поражение соответствующих растений в тепличных условиях. Для таксономической локализации и идентификации рода бактерий использовали универсальные праймеры 8UA/519B (Lane, 1991) на межгенный регион 16S рРНК. Все бактерии были проверены на принадлежность к роду Xanthomonas классическим ПЦР анализом с использованием родоспецифичных праймеров Xnth804F/1405R (Tsygankova et al., 2004). Для идентификации карантинного вида Xanthomonas oryzae использовали праймеры TXT/TXT-4R (Sakthivel et al., 2001). Для MLST (мультилокусного генотипирования) были определены нуклеотидные последовательности фрагментов 4 генов – dnaK, rpoD, fyuA, gyrB, (Young et al., 2008). Смесь реактивов для постановки одной реакции объемом 25 мкл содержала 75 мкМ Трис-НCl (рН 8,8); 20 мкМ (NH4)2SO4; 0,01% Твин 20; 200 мкМ каждого dNTP; 20 пМ каждого праймера; 2,5 мкM MgCl2; 1 Ед Smar TaqДНК-полимеразы (ООО «Диалат Лтд», Москва) и 2 нг целевой ДНК. Температурно-временные параметры изменяли в зависимости от используемой пары праймеров. Результаты амплификации регистрировали после проведения электрофореза в 1,5%-ном агарозном геле, окрашенном бромистым этидием в гель-документирующей системе Quantum-ST-4-1500 (Япония). Размер продуктов ПЦР измеряли, используя маркеры молекулярного веса GeneRuler™ 100+ п.н. и Fast Ruler™ (Fermentas, Латвия). Полученные продукты ПЦР очищали с использованием набора Fermentas (#K0701) «Gene JET PCR». Последовательности после секвенирования выравнивали при помощи программы BioEdit. Выровненные последовательности оценивали в приложении BLAST NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/). Реакцию секвенирования проводили с применением BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) согласно инструкции производителя, с последующим разделением фрагментов на автоматическом генетическом анализаторе ABI PRISM 3500 (Applied Biosystems, США). 7 Амлификацию и детекцию в реальном времени проводили на амплификаторе iCycler iQ (Bio-Rad, США). Подбор праймеров и зондов осуществлялся на основе гена субъединицы гиразы Б (gyrB). Из базы данных GenВank (www.ncbi.nlm.nih.gov) были выбраны нуклеотидные последовательности гена gyrB бактерий разных видов рода Xanthomonas. Анализ последовательностей и выбор праймеров проводили с помощью программ «BioEdit», OLIGO6.0, PRIMER3.0. Для построения филогенетических деревьев использовали метод группирования Минимальной Эволюции при помощи программы MEGA4. Заражение семян проводили в условиях вакуума (-1,01 бар, 1 мин) суспензией X. oryzae в концентрации 109 КОЕ/мл, из расчета 100 мкл суспензии на 1000 семян. Зараженные семена хранили при +40 С. Статистическую обработку полученных данных осуществляли с применением программ Statistica 5.5 и PAST. ГЛАВА III. Изучение видового разнообразия фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas, поражающих растения семейства Мятликовые 3.1. Видовой состав возбудителей рода Xanthomonas, поражающих растения семейства Мятликовые. Для изучения видового состава фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas на растениях сем. Мятликовые было исследовано более 900 образцов зерновых культур (листья, колосья и стебли озимой и яровой пшеницы, ржи, ячменя и овса), собранных сотрудниками ВНИИ фитопатологии в 2004-2013 гг. в 113 точках сборах. Возбудители бактериозов рода Xanthomonas были обнаружены в 30 из 113 местах сбора образцов, в основном в Северокавказском регионе, Саратовской и Московской областях. Также мы исследовали более 190 партий семян риса, пшеницы, ржи, ячменя и овса, собранных в 2010-2012 годах в разных регионах РФ на наличии возбудителей бактериозов. В большинстве проанализированных образцов семян злаковых культур были выявлены бактерии рода Xanthomonas. Из таблицы 1 видно, что 28 партий отечественного риса из 126 были заражены бактериями рода Xanthomonas: X. campestris, X. vesicatoria и X. arboricola. Возбудителя бактериального ожога риса, вызываемого X. oryzae, в Российской Федерации не обнаружили. Среди проанализированных 30 партий семян пшеницы, 12 партий ржи, 20 партий семян ячменя и 8 партий овса (урожай 2011 года) из 7 регионов России: Алтайского края, Воронежской, Курской, Рязанской, Тамбовской, Амурской, и Омской областей, мы обнаружили несколько видов бактерий рода Xanthomonas в 50 партиях из 70, но X. translucens был обнаружен лишь в одной партии семян ячменя (табл. 2). 8 Таблица 1 Распространенность бактерий рода Xanthomonas в семенах риса отечественного происхождения Местонахождение Количество Процент встречаемости, % обследуемого проанализир. (фактическое число) объекта образцов X. oryzae X. campestris X. vesicatoria X. arboricola Краснодарский край (коллекция ВНИИФ) Кизлярский р-н, Респ. Дагестан Казбековский р-н,Респ. Дагестан 12 0 (0) 33 (4) 0 (0) 25 (3) 68 0 (0) 8,8 (6) 7,4 (5) 4,4 (3) 20 0 (0) 0 (0) 0 (0) 10 (2) Гунибский р-н, Респ. Дагестан Анучинский р-н, Приморский край В среднем Всего 10 0 (0) 20 (2) 0 (0) 0 (0) 16 0 (0) 12,5 (2) 0 (0) 6,3 (1) 126 0 0 14,9 14 1,5 5 9,1 9 Таблица 2 Распространенность бактерий рода Xanthomonas на злаковых культурах Процент встречаемости, % (фактическое число) Количество проанализир. образцов Растение -хозяин X. campes tris X. arboric ola Пшеница 30 6,6 (2) Ячмень 20 0 (0) Рожь 12 Овес 8 В среднем Всего 70 X. cynarae X. hortorum X.gard eneri X. pisi X. translu cens 16,7 (5) 16,7 (5) 23,3 (7) 6,6(2) 0 (0) 55 (11) 0 (0) 10 (2) 0 (0) 6,6 (2) 0 (0) 16,7 (2) 0 (0) 33,3 (4) 33,3 (4) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 25 (2) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 8,3 (1) 0 (0) 5,8 24,1 12,5 16,7 1,7 3,7 1,3 4 18 9 13 2 3 1 5 (1) 0 (0) Наиболее часто встречаемым видом в семенах злаковых культур был вид X. arboricola - 27 партий из 196 были заражены данным патогеном. Данный вид был обнаружен в исследуемых образцах риса, пшеницы и ячменя. 9 Появление X. arboricola в России на новых видах растений одновременно с усилением вредоносности этого вида в зонах традиционного распространения патогена – Турции, Закавказских и Балканских странах, Средней Азии, Китае, США, Австралии и Африке, позволяет предположить расширение ареала патогена на север европейской части РФ, а также дальнейшее увеличение числа поражаемых видов растений. Следующим наиболее распространенным был вид X. hortorum (в среднем 13%). Патовары X. hortorum (Vauterin et al., 1995) вызывают болезни растений плюща (pv. hederae), пеларгонии (pv. pelargonii), одуванчика (pv. taraxaci), салата (pv. vitians). Штаммы, отнесенные к данному виду, были обнаружены в исследованных образцах пшеницы, ячменя и ржи. Штаммы X. campestris были выделены из образцов риса, пшеницы и ржи со средней частотой 5,8%. К данному виду относятся патоварианты, обычно поражающие крестоцветные, пасленовые и тыквенные культуры. При проведении исследований впервые нами были идентифицированы возбудители X. cynarae, X. pisi, и X. gardeneri, которые ранее на злаковых культурах не выявлялись. Данные виды обычно поражают растения из сем. Астровые, Бобовые и Пасленовые. В литературных источниках нет данных о вредоносности X. hortorum, X. campestris X. cynarae, X. pisi, и X. gardeneri на растениях семейства Мятликовые, что говорит о том, что эти патогены переходят к паразитизму на новых растениях-хозяевах, так же как и X. arboricola. Было неожиданно, что только одна партия семян ячменя оказалась заражена X. translucens. Но, предыдущий анализ фитопатогенных видов бактерий рода Xanthomonas (почти 100 штаммов), собранных в 1995-2001 гг. на зерновых культурах и депонированных во Всероссийскую коллекцию фитопатогенных микроорганизмов также показал низкую частоту встречаемости данного вида на зерновых культурах в России (данные открытого итогового отчета проекта ISTC 1771p, www.istc.ru). Этот вид, по современным данным, претендует на статус представителя отдельного рода в семействе Xanthomonaceae (Vauterin et al., 1995), и вероятно, менее приспособлен к климатическим условиям России. Во всех проанализированных образцах риса не был выявлен возбудитель бактериального ожога риса и бактериальной полосчатости риса, что было доказано несколькими молекулярно-биологическими методами, включая ПЦР с видоспецифичными праймерами и MLST. Из чего можно сделать вывод, что данный вид попрежнему отсутствует на территории РФ. 3.2. Изучение генетического разнообразия исследуемой коллекции Xanthomonas spр. с помощью метода мультилокусного генотипирования (MLST). Дифференциация штаммов рода Xanthomonas, выделенных из злаковых культур позволила определить нуклеотидные последовательности фрагментов 4 генов dnaK, rpoD, fyuA, gyr B (Young et al., 2008). Полученные последовательности исследуемых штаммов выравнивались с помощью 10 программы BioEdit и анализировались при помощи построения филогенетических деревьев. Все исследованные штаммы кластеризовались в отдельные группы: группа Xanthomonas arboricola, X. hortorum, X. Campestris и X. oryzae. Штаммы видов X. arboricola, X. hortorum, и X.campestris отличались высоким внутривидовым разнообразием (были представлены патоварами из различных растений-хозяев). Возможно, гетерогенность генов «домашнего хозяйства», связана с фенотипическими различиями отдельных видов растенийхозяев, поражаемых ими. Виды, X. cynarae, X. gardneri и X. hortorum, формировались в гомогенные группы. В целом, MLST показал высокую степень сходства последовательностей штаммов рода Xanthomonas из российской коллекции с последовательностями штаммов соответствующих видов из Генбанка (рис.1, 2). Рисунок 1.- Филогенетическое дерево, построенное на основании сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей 30 фрагментов гена gyrB бактерий рода Xanthomonas с использованием алгоритма NJ. 11 Рисунок 2. - Филогенетическое дерево, построенное на основании сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей 34 фрагментов гена dnaK бактерий рода Xanthomonas с использованием алгоритма NJ. Дерево построено с помощью метода ближнего соседа (Saitou et al., 1987). Процент повторяющихся деревьев с совместной группировкой таксонов указан по результатам бутстреп анализа возле соответствующих узлов дерева (Felsenstein, 1985). Эволюционные расстояния определены при помощи метода максимального сложного правдоподобия (Maximum Composite Likelihood) (Tamura et al., 2004). Филогенетический анализ впроведен с помощью пакета программ MEGA4 (Tamura et al., 2007) 3.3.Оценка вирулентности штаммов. По результатам проведенного анализа, все бактерии вызывали реакцию восприимчивости на соответствующих растениях-хозяевах. Типовые штаммы Xanthomonas oryzae были вирулентны только на рисе. Все штаммы X. campestris были вирулентны 12 для крестоцветных культур. При искусственном заражении растений различных видов в условиях теплицы большинство штаммов из злаков были вирулентными на соответствующих растениях-хозяевах, но также вызывали поражение растений других семейств, включая злаки, сложноцветные, крестоцветные, а также пасленовые (табл. 3). Таблица 3 Вирулентность типовых штаммов Xanthomonas sp. и выделенных штаммов на растениях-хозяевах различных семейств Вид Штамм Грецк ий орех 8166 + X. + arboricola yat-30 ICMP9593 + Prim1 X. Xt28 campestris Xt12 NCPPB528T R3023 X. P2003 hortorum ICMP453 NCPPB939T X. cynarae P3011 NCPPB4356T X. gardneri P2009 GA2 NCPPB881T NCPPB3002T X. oryzae NCPPB973T X. капуста Wirosa F1 + + + + + - томат Дубок + + + - Растение морков Пеларго ь ния Аленка + + + + + + + + - рис Рассвет ячмень Пасадена + + + - + + + + + + + + + + translucens Примечание: + – вирулентен, – не вирулентен. ГЛАВА IV.Усовершенствование методов диагностики фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas, поражающих злаковые культуры 4.1 Оптимизация метода выделения бактерий из семян ячменя и риса. Определение способа экстракции бактерий из семян растений сем. Мятликовые проводили с использованием 5 различных методик (табл. 4). Для опыта использовали семена риса сорта Луговой (ООО «Агро Сангсэнг») из Приморского края, урожай 2011 года. Применение разных способов экстракции бактерий из семян риса и ячменя (пленчатые культуры) позволило выбрать наиболее подходящий метод с использованием гомогенизатора для размола семян (методика №5), так как основное количество патогенной и сапротрофной микрофлоры находится под оболочкой у данных культур. 13 Таблица 4 Бактерии, выделенные из семян риса сорта Луговой, различными методиками № п/п Методика Морфология колоний Ярко-оранжевые, круглые 1 PBS + шейкер + грубый фильтр Ярко-желтые, выпуклые Бледно-кремовые, выпуклые Ярко-желтые, выпуклые Темно-желтые, выпуклые Светло-красные, точечные 2 PBS + шейкер, гомогенизатор + грубый фильтр Бледно-кремовые, выпуклые Ярко-оранжевые, круглые Бледно-желтые Желтые, конусовидной формы Ярко-оранжевые, круглые 3 PBS + грубый фильтр 4 Ярко-желтые, выпуклые Бледно-кремовые, выпуклые стерилизация семян в Ярко-желтые, выпуклые 10% гипохлорите Ярко-оранжевые, круглые натрия PBS + шейкер + грубый фильтр 5 Ярко-желтые, выпуклые Темно-желтые, выпуклые стерилизация семян в Светло-красные, точечные 10% гипохлорите натрия PBS + шейкер + грубый фильтр Бледно-кремовые, выпуклые Ярко-оранжевые, круглые Секвенирование гена 16S рРНК с праймерами 8UA/519B Microbacterium testaceum Pantoea ananatis Pseudomonas poae Xanthomonas spp. Pantoea ananatis Curtobacterium flaccumfaciens Pseudomonas poae Microbacterium testaceum Plantibacter spp. Pseudomonas fulva Microbacterium testaceum Pantoea ananatis Pseudomonas poae Pantoea ananatis Microbacterium testaceum Xanthomonas spp. Pantoea ananatis Curtobacterium flaccumfaciens Pseudomonas poae Microbacterium testaceum Примечание: повторность опыта 3-х кратная. Из таблицы 4 видно, что способ экстракции влияет на видовое разнообразие выделяемых бактерий. При разрушении семян удается выделить наибольшее количество разных видов бактерий. Стоит отметить, что при использовании предварительной стерилизации семян питательные среды меньше загрязняются грибной микрофлорой. 4.2. Идентификация возбудителей бактериозов методом классической ПЦР. С образцами ДНК, выделенной из штаммов бактерий рода Xanthomonas, проводили постановку классической ПЦР. Всего было проанализировано 8 пар праймеров, из которых 2 пары олигонуклеотидов, специфичные к гену 16S рРНК были универсальны для всех бактерий. Одна пара праймеров, 14 специфичная к межгенному участку XCC0007-tonB – универсальна для рода Xanthomonas. Четыре пары праймеров для проведения анализа MLST. Одна пара олигонуклеотидов, специфична для карантинного вредного организма Xanthomonas oryzae. (табл. 5). Для каждой пары праймеров была проведена оптимизация состава реакционной смеси. Таблица 5 Специфичность праймеров при диагностике Xanthomonas sрp. Праймеры Вид X. oryzae pv.oryzae X. oryzae pv.orizicola X.campestris X.hortorum X arboricola X.cynarae X.pisi X.gardeneri X. translucens X. fragariae X.axonopodis Универсальные праймеры на ген 16S рРНК 8UAF 27F 519B R 1492 R Xanthomonas spp. X. oryzae Xnth804F XnthR 1405 XdnaK1 F XdnaK1 R XfyuA1F XfyuA1R XrpoD1F XrpoD1R XgyrB1F XgyrB1R TXT TXT4R + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + - - - + + + + + + + + Примечание: «+» положительный результат ПЦР, «-» отрицательный результат ПЦР При внесении ДНК каждого вида в реакционную смесь ПЦР с универсальными праймерами для Xanthomonas Xnth804F/1405R, были получены амликоны соответствующего размера. Данные пары олигонуклеотидов реагировали только со штаммами рода, для которого они были синтезированы и не реагировали с другими бактериями. При постановке ПЦР со специфичными праймерами TXT/ TXT-4R было установлено, что пары олигонуклеотидов реагировали только с видами X. o. pv. oryzae и X. o. pv.oryzicola и не амплифицировали продукт необходимого размера у патогенных и сапротрофных бактерий, а также у других видов рода Xanthomonas. Для диагностики бактерий, которые выделяли из семян злаковых культур, использовали универсальные праймеры на бактерии 8UA/519B. Мультилокусный анализ последовательностей коллекционных и выделенных штаммов бактерий рода Xanthomonas был проведен с использованием четырех генов: dnaK, fyuA, gyrB и rpoD. Все четыре последовательности гена были амплифицированы для штаммов X. arboricola, X. axonopodis, X. campestris, X. fragariae, X. hortorum, X. oryzae, X. pisi, X. vesicatoria. Не удалось амплифицировать гены dnaK и fyuA для X. translucens. 15 Далее проводили метод прямого секвенирования, который позволял идентифицировать неизвестные образцы. Последовательности после секвенирования выравнивали при помощи программы BioEdit. Выровненные последовательности оценивали в приложении BLAST NCBI. 4.3. Разработка методов выявления и идентификации Xanthomonas oryzae, Xanthomonas arboricola методом ПЦР «в реальном времени». Подбор праймеров и зондов, определение их специфичности. Для разработки ПЦР «в реальном времени» для диагностики Xanthomonas oryzae и Xanthomonas arboricola был выбран наиболее вариабельный участок генома ген субъединицы Б фермента ДНК-гиразы (gyrB) (Parkinson et al., 2007, Пунина и др., 2008). Выбранный участок генома бактерий эволюционирует от 4 до10 раз быстрее, чем 16S рРНК, и является перспективным объектом для изучения филогении бактерий и создания маркерной системы эффективной на уровне вида и даже штамма (Yamomoto, 1996; Yamomoto et al., 1999). Из базы данных GenВank (www.ncbi.nlm.nih.gov) были выбраны нуклеотидные последовательности гена gyrB бактерий рода Xanthomonas. Также при анализе использовали данные секвенирования чистых культур Xanthomonas sрp. из коллекции ГНУ - ВНИИ фитопатологии РАСХН. Всего было проанализировано около 48 нуклеотидных последовательностей. Подбор праймеров и зондов, специфичных для Xanthomonas oryzae и Xanthomonas arboricola основывался на наименьшей комплементарности конкретного участка гена gyr B аналогичным участкам других видов бактерий рода Xanthomonas (рис 3, 4). В анализируемых последовательностях были определены консервативные участки (для подбора прямого и обратного праймеров) с наименьшей гомологией нуклеотидов между видами. Рисунок 3 – Подбор прямого видоспецифичного праймера для диагностики X. oryzae в режиме реального времени (точками обозначена идентичность нуклеотидов в последовательностях) 16 Рисунок 4 – Подбор специфичного зонда для диагностики X. oryzae в режиме реального времени При определении специфичности разработанных зондов установлено, что флуоресценция по красителю НЕX и ROX регистрировались только при исследовании ДНК данного возбудителя. При тестировании других бактерий рода Xanthomonas и других видов бактерий зафиксирован отрицательный результат, что свидетельствует об отсутствии перекрестных реакций (табл. 6). Таблица 6 Специфичность ПЦР «в реальном времени» с зондом X.OR.-P и X.arb-P X. oryzae X.campestris X.axonopodis X.arboricola X.hortorum X.cynarae X.pisi X.gardeneri Erwinia amylovora Dickeya dianthicola Значение Ct* с подобранными зондами Зонд Зонд X.OR.-P X.arb-P 23,96 NA NA NA ** NA NA NA 24,56 NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA NA Pantoea agglomerans Pseudomonas sp. NA NA ДНК возбудителя NA NA Примечание: *Ct-значение порогового цикла, **N/A - отсутствие сигнала флуоресценции Определение оптимальных условий ПЦР «в реальном времени» проводили на амплификаторе i-Cycler iQ 5, Bio Rad,, изменяя следующие параметры: температуру отжига зонда (от 550С до 650С); концентрацию зондов (от 5 пМ до 10 пМ) и праймеров (от 7,5 пМ до 20 пМ) на реакцию. 17 В результате проведенных исследований была определена оптимальная температура отжига подобранных зондов: она составила 61°С для зонда X.OR.P и 55°C для зонда X.arb-P. При внесении 5 пмоль зонда и 7,5 пмоль праймеров для диагностики X. oryzae и 5 пмоль зонда и и 20 пмоль праймеров для X. arboricola были получены наилучшие результаты. Определение чувствительности подобранных зондов при постановке ПЦР «в реальном времени». Чувствительность каждого из подобранных зондов определяли постановкой ПЦР «в реальном времени» с образцами серии разведений суспензии, содержащей известное количество клеток возбудителя. Применение последовательных разведений показало, что концентрация бактериальной суспензии влияла на значение порогового цикла Ct. С уменьшением концентрации, увеличивалось значение порогового цикла, что указывало на снижение содержавшейся ДНК в образце. Таким образом, чем ниже был предел обнаружения возбудителей, тем выше была чувствительность подобранного зонда. Чувствительность зонда для идентификации X. oryzae составила не менее 5,2х100 клеток/мл и 4,3х101 клеток/мл для диагностики X. arboricola. 4.4. Разработка протокола БИО-ПЦР анализа и сравнение чувствительности БИО-ПЦР и прямого ПЦР анализа. Для разработки протокола БИО-ПЦР было испытано 5 сред разного состава, содержащие в качестве селектирующего фактора антибиотики разного состава и в различных концентрациях. Эксперименты проводили на экстрактах здоровых семян, полученных по оптимизированной нами методике с добавлением известного количества клеток патогена. По результатам учета оптимальной средой для БИО-ПЦР была выбрана среда YPGA (на 1 л: дрожжевой экстракт 5.0 г, пептон 5.0 г; глюкоза 10.0 г; агар 12.0 г) с комбинации антибиотиков циклогексимид 50 мг/л + цефазолин 30 мг/л + гентамицин 2 мг/л. Для ПЦР анализа использовали праймеры XOF_XOR и зонд XOR-P. ПЦР проводили двумя способами: в первом варианте полученный семенной экстракт сразу добавляли в реакционную смесь и ставили ПЦР. Во втором случае семенной экстракт сначала высевали на питательные среды, т.е. проводили БиоПЦР, затем делали смыв с поверхности чашек через 24 часа после посева, добавляя в чашку 500 мкл стерильного физраствора, и ставили ПЦР. Чувствительность метода БИО-ПЦР с использованием разработанной селективной питательной среды составила около 50 КОЕ патогена в 1 мл семенного экстракта без этапа выделения ДНК и без воздействия веществ ингибиторов ПЦР (табл. 7). 18 Таблица 7 Чувствительность прямой ПЦР и оптимизированной БИО-ПЦР для диагностики семян риса, зараженных Xanthomonas oryzae. Праймеры X.or F_X.or. R, зонд X.OR.-P. Среда Концентрация Xanthomonas oryzae в семенном экстракте, клеток/мл 5,2х108 5,2х107 5,2х106 5,2х105 5,2х104 5,2х103 5,2х102 5,2х10 Прямая ПЦР 29,92* 30,92 31,54 33,21 34,28 35,61 N/A** N/A БИО-ПЦР 26,06 28,65 29,47 30,05 30,99 32,15 33,87 34,61 K+(ДНК 21,86 25,03 26,39 28,06 30,18 31,14 32,14 33,40 возбудителя) К- (здоровые семена) Примечание: *числовые значения – пороговые значения цикла (Ct) **N/A - отсутствие сигнала флуоресценции ГЛАВА V. Поиск эффективных приемов защиты от возбудителя бактериального ожога риса Сравнение эффективности препарата Максим, КС в разных концентрациях для предпосевного протравливания семян риса проводили путем замачивания. Изучение биологической эффективности препарата проводили на семенах риса сорта Луговой и Ханкайский 52, предварительно инокулированных возбудителем бактериального ожога риса. Инокулированные семена замачивали в рабочем растворе препарата на 2 часа, используя следующие варианты – Максим, КС 0,2%, Максим, КС 1%, Максим, КС 2%. В качестве положительного контроля зараженные семена замачивали в воде, для отрицательного контроля в воде замачивали семена свободные от инфекции. После обработки семена подсушивали на фильтровальной бумаге и раскладывали на среду YPGA. Повторность опыта 3-х кратная по 40 семян в каждой повторности. Учет проводили на 2-е сутки, визуально оценивая наличие типичных колоний Xanthomonas oryzae pv. oryzae вокруг каждого семени (табл. 8). Таблица 8 Эффективность протравливания семян риса методом предпосевного замачивания Варианты Сорт Луговой сорт Ханкайский 52 Зараженность Биологическая Зараженность Биологическая семян, % эффективность, семян, % эффективность, % % Контроль здоровые 0 0 семена 19 Контроль зараженные семена Максим 0,2% раствор Максим 1% раствор 22,5 - 25 - 12,5 44,4 6,0 76,0 7,5 66,7 7,5 70,0 Максим 2% раствор 2,5 88,9 3,5 86,0 НСР05* 8,1 - 9,3 - *НСР05 - наименьшая существенная разность Как видно из табл. 8 зараженность семян по сравнению с контролем после обработки семян сорта Луговой снижалась в 2 раза при замачивании в препарате Максим с концентрацией 0,2%, и в 3 и 9 раз при замачивании в исследуемом препарате с концентрацией 1% и 2% соответственно. Биологическая эффективность протравливания в препарате Максим 2% была наиболее высокая и составляла 88,9%. Аналогичную картину наблюдали при обработке семян сорта Ханкайский 52. Таким образом, в проведенных нами исследований на двух партиях семян риса, зараженных возбудителем бактериального ожога листьев риса, была показана высокая эффективность протравливания препаратом Максим, КС в концентрации 2%. Полученные данные позволяют рекомендовать проведение регистрационных испытаний препарата Максим, КС для предпосевной обработки семян риса против возбудителя бактериального ожога. ВЫВОДЫ 1. В результате проведенных исследований по изучению видового состава и распространенности возбудителей рода Xanthomonas на растениях семейства Мятликовые были впервые выделены следующие виды фитопатогенных бактерий: X. campestris, X. hortorum, X. cynarae, X. pisi, и X. gardeneri. Виды X. arboricola и X. translucens, ранее отмеченные на злаковых культурах, также встречались в исследуемых образцах риса, пшеницы и ячменя. 2. Изучение генетического разнообразия коллекции Xanthomonas с помощью метода мультилокусного генотипирования по четырем различным генам, показало, что штаммы имели высокое генетическое сходство с секвенированными последовательностями соответствующих видов из базы данных Генбанка. В то же время, виды X. arboricola, X. hortorum и X. campestris отличались высоким внутривидовым разнообразием. 3. Используя несколько способов выделения бактерий из семян ячменя, и риса было установлено, что наибольшее количество бактерий и наиболее разнообразный видовой состав микробиоты, наблюдалось при применении механического разрушения зерновок. 20 4. На основе выровненных последовательностей гена gyr B бактерий рода Xanthomonas подобраны специфичные праймеры и зонды для диагностики Xanthomonas oryzae и Xanthomonas arboricola, позволяющие идентифицировать возбудителей с чувствительностью не менее 5,2х100 клеток/мл и 4,3х101 клеток/мл соответственно. 5. Оптимизированная среда mYPGA, содержащая в качестве селектирующих факторов антибиотики циклогексимид 50 мг/л + цефазолин 30 мг/л + гентамицин 2 мг/л позволила диагностировать возбудителя бактериального ожога риса с помощью метода БИО-ПЦР с чувствительностью не менее 50 КОЕ / мл семенного экстракта. 6. Показана высокая эффективность препарата Максим 2% на уровне 88,9 % путем замачивания при предпосевном протравливании семян риса, зараженных возбудителем бактериального ожога. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 1. Для выявления и идентификации карантинного вида Xanthomonas oryzae рекомендуется службам Россельхознадзора и Россельхозцентра использовать разработанные на основе полученных данных ФГБУ «ВНИИКР» «Методические рекомендации по выявлению и идентификации возбудителей карантинных бактериозов риса Xanthomonas oryzae pv. оryzae и Xanthomonas oryzae pv. oryzicola» (Утвержден и введен в действие приказом директора ФГБУ «ВНИИКР» У.Ш. Магомедова от 23.10.2014 г. №5) 2. Протравливание семян риса в 2% препарате Максим, КС против бактериального ожога риса рекомендуется включить в программу регистрационных испытаний. Список публикаций по теме диссертации 1. Игнатов А.Н., Сухачева М.В., Шевердина Е.И., Егорова М.С., Корнев К.П., Мазурин Е.С. Изучение геномного полиморфизма у фитопатогенного рода бактерий Xanthomonas // Биотехнология: реальность и перспективы в сельском хозяйстве. Материалы Международной научно-практической конференции.– Саратов: «КУБиК».- 2013. – С. 149-151. 2. Егорова М.С., Игнатов А.Н. Диагностика возбудителя бактериального ожога риса методом классической ПЦР и ПЦР «в реальном времени» // «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». Материалы молодежной научной конференции - Москва, ГНУ ВНИИСБ. - 2014.- С. 20-21. 21 3. Егорова М.С., Игнатов А.Н., Мазурин Е.С. Усовершенствование методов диагностики возбудителя бактериального ожога риса на основе ПЦР// Вестник РУДН, серия Агрономия и животноводство.-2014a.-№2.-С.22-28. 4. Egorova M.S., Mazurin E.S., Polityko V.A., Ignatov A.N. Diversity of phytopathogenic bacteria of genus Xanthomonas isolated from Poaceae plants in Russia // Вестник РУДН, серия Агрономия и животноводство.-2014б. №4.-С.47-53 5. Егорова М.С., Игнатов А.Н., Мазурин Е.С. Видовое разнообразие фитопатогенных бактерий рода Xanthomonas, поражающие растения семейства Мятликовые // Защита картофеля, Материалы Междунар. научно-практической конференции «Бактериальные и фитоплазменные болезни сельскохозяйственных культур: научные и практические аспекты». Москва. -2014.-№2.- С. 35-39. 6. Егорова М.С., Игнатов А.Н., Мазурин Е.С. Диагностика нового бактериального патогена злаковых культур Xanthomonas arboricola методом ПЦР «в реальном времени» // Защита картофеля, Материалы Междунар. научно-практической конференции «Бактериальные и фитоплазменные болезни сельскохозяйственных культур: научные и практические аспекты» Москва.-2014c.-№2.- С. 39-43. 7. Мазурин Е.С., Шнейдер Е.Ю., Егорова М.С. Методические рекомендации по выявлению и идентификации возбудителей карантинных бактериозов риса Xanthomonas oryzae pv. оryzae и Xanthomonas oryzae pv. oryzicola. – М.: ВНИИКР.- 2014. – 37 с. 8. Игнатов А.Н., Егорова М.С. Ходыкина М.С. Распространение возбудителей бактериальных и микоплазменных болезней растений в Российской Федерации // Защита и карантин растений.- 2015.- № 5.-С.811. 22
