ПРОТЕОЛИЗ СЫВОРОТОЧНЫХ БЕЛКОВ АЛКАЛАЗОЙ

Биология
УДК 637.144.5:577.1
Т.Н. ГОЛОВАЧ, Н.В. ГАВРИЛЕНКО, Н.К. ЖАБАНОС, В.П. КУРЧЕНКО
ПРОТЕОЛИЗ СЫВОРОТОЧНЫХ БЕЛКОВ АЛКАЛАЗОЙ
The objective of this study was to characterize the changes in proteolysis of whey proteins, as β-lactoglobulin (β-lg) and αlactalbumin (α-la) that are the main allergens of milk, resulting from different physicochemical conditions of hydrolysis with a protease from Bacillus licheniformis (alcalase). The features of proteolysis subject to enzyme concentration, temperature and pH were received using SDS-PAGE analysis. The effect of рН on the process was studied: hydrolysis of whey proteins occurred more intensively when pH increased 6÷10 for β-lg and 7÷10 for α-la. Results obtaining at 20÷60 ºC supported that degree of proteolysis increased with higher temperature. Different substratum specificity was shown for alcalase because β-lg was degraded with protease
faster than α-la in similar conditions at pH 7÷10 (37 ºС), whole range of temperature (20÷60 ºС) at pH 8.
Сыворотка является побочным продуктом при производстве сыра и казеина. Она содержит около
1 % белка, в состав которого входят β-лактоглобулин (β-лг), α-лактальбумин (α-ла), бычий сывороточный альбумин (БСА), иммуноглобулины, а также минорные белки: лактоферрин, лактоллин, гликопротеины, лактопероксидаза и трансферрин [1]. В качестве источника сывороточных белков могут
быть использованы сладкая и кислая сыворотки [2]. Сладкая сыворотка образуется в результате реннин-индуцированной коагуляции сырной массы. Получение кислой сыворотки основано на сквашивании или дозированном внесении кислоты с дальнейшим осаждением казеина.
Сывороточные белки широко применяются как ингредиент в различных пищевых продуктах: напитках, десертах, мясных и хлебобулочных изделиях – для придания заданных органолептических,
питательных свойств и текстуры [3]. Однако известно, что β-лактоглобулин, α-лактальбумин и бычий
сывороточный альбумин являются основными аллергенами молока. Гидролиз сывороточных белков
позволяет снизить их аллергенный потенциал, получить продукт с высокой питательной ценностью.
Кроме того, некоторые пептиды молочного белка проявляют биологическую активность: антибактериальные и антифунгальные свойства, гипотензивный и иммуномодулирующий эффект, способность
понижать уровень холестерина, повышать поглощение минеральных веществ [4]. В роли функциональных добавок гидролизованные белки молока имеют ряд преимуществ перед нативными: возрастают их растворимость, стабильность при тепловой обработке, пенообразование и эмульгирующие
свойства [5].
В пищевых целях как компонент спортивного и клинического питания, гипоаллергенных формул
для детей с аллергией к белкам коровьего молока используются гидролизаты со степенью протеолиза
преимущественно 22÷28 % и высоким содержанием короткоцепочечных пептидов. С целью получения продукта с указанными свойствами необходим ферментативный гидролиз белков молока с применением эндо- и экзопротеаз или комплексов различных протеаз для увеличения глубины гидролиза
белка, преобладания в гидролизате короткоцепочечных пептидов с минимальным количеством свободных аминокислот в конечном продукте [6]. Для протеолиза сывороточных белков используется
широкий спектр эндо- и экзопротеаз, среди которых можно выделить ферменты микробного (алкалаза, нейтраза, термолизин), животного (пепсин, трипсин, химотрипсин) и растительного (папаин, бромелаин, фицин) происхождения. Алкалаза (КФ 3.4.21.62) – протеолитический фермент класса сериновых протеаз бактериального происхождения, полученный из штамма Bacillus licheniformis; обладает широкой субстрат-специфичностью, активно используется в пищевой промышленности [7].
Целью данной работы являлось исследование особенностей протеолиза сывороточных белков алкалазой.
Материал и методика
Был использован концентрат сывороточных белков, полученный методом ультрафильтрации
(КСБ-УФ-55, ОАО «Березовский сыродельный комбинат», ТУ РБ 00028493.459-98), с массовой долей
белка 47,2 % (концентрацию белка измеряли методом Лоури [8]). Для гидролиза сывороточных белков применяли фермент алкалазу (Alcalase®FG, активность 2,4 AU/г, Novozymes A/S, Дания). Ферментативное расщепление сывороточных белков осуществляли при постоянном контроле рН и температуры. Гидролиз проводили в течение 2–3 ч при 20÷60 °С, рН 6÷10, концентрации КСБ-УФ-55,
равной 5 %, и диапазоне концентраций фермента (соотношении фермент/субстрат) 0,21÷1,68 %. рН
раствора сывороточных белков доводили с использованием 2Н HCl или 1H NaOH. Фермент инактивировали прогреванием гидролизата при 95 °С в течение 10 мин, после чего пробы немедленно замораживали при –20 °С для последующего анализа. Степень протеолиза сывороточных белков контролировали с использованием SDS-электрофореза в полиакриламидном геле [9]. Электрофореграммы
49
Вестник БГУ. Сер. 2. 2009. № 2
продуктов гидролиза сывороточных белков оценивали с использованием специализированного программного обеспечения ImageQuant 5.1. Степень протеолиза определяли как относительное количество расщепленного белка, выраженное в процентах.
Результаты и их обсуждение
В данном исследовании показаны закономерности гидролиза сывороточных белков алкалазой путем оценки степени протеолиза основных сывороточных белков β-лг и α-ла в различных условиях
ферментации. Особенности ферментативного расщепления белковых субстратов определяются как
оптимальными условиями проявления активности фермента, так и физико-химическими свойствами
расщепляемых белков. Лактоглобулин – один из основных белков молока, составляющий 50 % сывороточных белков и 12 % общего белка молока. Молекулярная масса мономера β-лг равна 18 362 Да
для генетического варианта А и 18 276 Да – для варианта В [10]. Первичная структура белка представлена цепью из 162 аминокислот с 5 цистеиновыми остатками, четыре из которых образуют дисульфидные мостики (Cys66–Cys160 и Cys106–Cys119) с пятым – свободным тиолом (Cys121). Отличие в
строении между вариантами А и В заключается в замене Asp64 и Val118 варианта А на Glu и Ala для
варианта В соответственно. Вторичная структура белка представлена β-складчатыми слоями (43 %) и
α-спиралями (10 %) и неорганизованными структурами (47 %) [11]. Белковую глобулу делят на восемь относительно дискретных структур (A–H), где антипараллельные β-складчатые слои образуют
форму сглаженного конуса, внутри богатого гидрофобными аминокислотными остатками [7]. Изоэлектрическая точка β-лг pI 5,2. Белок растворим в широком диапазоне рН. При рН 3,5÷5,2 β-лг существует преимущественно в форме октамера, а в случае рН>pI – в виде димера. Когда рН<3,5 или
pH>6,5, преобладает мономерная форма белка. В жестких щелочных условиях (рН>9) происходит необратимая денатурация β-лг [11].
Известно, что температурное воздействие затрагивает трехмерную структуру β-лг. Хотя β-лг содержится в молоке в виде димера, мономеры возникают при повышении температуры до 65 °С. Установлено, что критическое конформационное изменение наступает при 63 °С, когда на 19 % уменьшается содержание β-складчатых слоев [12], разрушение которых является определяющим для инициации сульфгидрил-дисульфид индуцированной агрегации. При повышении температуры
разворачивание A–H структур β-лг приводит к необратимой денатурации в следующем порядке: D–E
структуры (55÷60 °С); C–D и α-спирали (60÷65 °С); A–B, A–I и E–F (65÷70 °С); A–H, B–C и F–G
(75÷80 °С) [13]. При 80 °С под действием температуры молекула практически полностью разворачивается, за исключением G–Н-пары, связанной дисульфидным мостиком, который формирует наиболее термически устойчивый элемент в молекуле β-лг. Дисульфидные связи и сульфгидрильные группы играют важную роль в конформационных изменениях β-лг. Поперечные ковалентные связи могут
формироваться между молекулами β-лг в результате окисления Cys121 с образованием S–S-связи
и/или путем SH-индуцированного S–S-перехода [14]. При рН 9 и 11 межмолекулярная полимеризация S–S протекает при комнатной температуре с последующим полным необратимым разворачиванием β-лг. При рН 3, 5 и 7 полимеризация происходит только после нагревания до 80, 75 и 70 °С соответственно, что подтверждает преобладание SH/S–S-переходов над окислением SH/SH-групп [15].
Хотя β-лг является наиболее изученным белком, его физиологическая роль служит предметом многочисленных дискуссий. Показано, что β-лг способен связывать ретинол и защищать его от окисления [14].
Вторым по значимости белком молочной сыворотки является α-ла – глобулярный белок, вовлеченный в биосинтез лактозы, молекулярная масса которого составляет 14 175 Да [16], а изоэлектрическая точка – pI 4,8. Белок имеет форму эллипса, состоящего из двух различных долей: одна представлена четырьмя спиралями, а другая – двумя β-слоями и петлеподобными цепями [17]. Лактальбумин – Ca-зависимый металлопротеин, способный связывать цинк и другие металлы. Ионы кальция
взаимодействуют в области карманоподобных углублений в структуре белка, богатых Asp-остатками.
При удалении кальция стабильность при температурном воздействии на α-ла уменьшается и апо-α-ла
подвергается необратимой денатурации. В молекуле белка отсутствуют свободные тиольные группы,
содержится четыре дисульфидных мостика, которые ограничивают гибкость структуры α-ла в определенных условиях [17]. Белок денатурирует при температуре 64 °С и рН 7 [18].
Для получения гидролизата описанных белков использовали алкалазу – протеолитический фермент класса сериновых эндопротеаз с молекулярной массой 27,3 кДа, полученный глубинной ферментацией штамма Bacillus licheniformis; расщепление белкового субстрата указанным ферментом
происходит преимущественно по аминокислотным остаткам Phe, Trp, Tyr, Glu, Met, Leu, Ala, Ser, Lys
50
Биология
[7] при рН 6,5÷8,5. В активном центре фермента содержатся три аминокислотных остатка: Ser221,
His64 и Asp32, образующих систему переноса заряда. Механизм гидролиза включает нуклеофильную
атаку Ser221 карбонильной группы субстрата с образованием ацилфермента, который затем гидролизуется водой [7].
Одним из параметров, определяющим интенсивность протекания ферментативной реакции, является концентрация фермента. Для изучения степени и специфики протеолиза сывороточных белков в
зависимости от концентрации фермента гидролиз проводили в реакторе при исходном значении
рН 8,0, температуре 37 °С и концентрации алкалазы 0,21÷1,68 % в течение 2 ч. На рис. 1 а приведены
средние значения трех экспериментов, а на рис. 1 б представлена типичная электрофореграмма продуктов гидролиза сывороточных белков пепсином.
а
б
Рис. 1. Зависимость степени расщепления α-ла и β-лг от концентрации алкалазы: а – β-лг (1), α-ла (2);
б – электрофореграмма продуктов гидролиза 5 % КСБ алкалазой при рН 8 и 37 °С: дорожка 1 – контроль
(5 % КСБ без алкалазы), 2 – концентрация алкалазы 0,21 %, 3 – 0,42, 4 – 0,63, 5 – 0,84, 6 – 1,05, 7 – 1,26, 8 – 1,47, 9 – 1,68 %
Показано, что в данных условиях при увеличении концентрации фермента возрастает количество
расщепленных белковых субстратов. Так, при содержании алкалазы 1,68 % протеолизу подвергаются
75 % α-ла и 80 % β-лг (см. рис. 1 а; 1 б, дорожка 9). Выявлено, что при рН 8,0, температуре 37 °С гидролиз β-лг протекает более интенсивно, чем α-ла (см. рис. 1 а; 1 б, дорожки 1–9), что определяется
субстратной специфичностью фермента и конформацией сывороточных белков в указанных условиях
гидролиза. Кроме того, в исходной сыворотке количество β-лг в 2,5 раза больше, чем α-ла [10]. Известно, что при рН 8 β-лг присутствует преимущественно в форме мономера, а конформационные переходы при 37 °С носят обратимый характер [11]. Нелинейный характер зависимости (см. рис. 1 а),
вероятно, связан с образованием и накоплением продуктов гидролиза, приводящих к снижению рН
среды, формированию гелеподобной структуры, характерной для гидролизатов, полученных с использованием алкалазы, и др. [6].
Количество расщепленных белковых субстратов прямо пропорционально продолжительности
ферментативного процесса. Для изучения зависимости степени протеолиза сывороточных белков от
времени ферментативной реакции гидролиз проводили в течение 3 ч при концентрации фермента
0,84 %, исходном значении рН 8 и температуре 37 °С. Установлено, что в течение данного времени
расщепляются около 80 % β-лг и 75 % α-ла, причем наиболее интенсивно этот процесс протекает в
первые 2 ч, о чем также свидетельствует активное снижение значения рН среды. В ходе ферментативной реакции происходит накопление продуктов промежуточного гидролиза белковых субстратов.
Образующиеся пептиды будут проанализированы с использованием высокоэффективной жидкостной
хроматографии (ВЭЖХ).
Значение рН среды является одним из факторов, оказывающих влияние как на конформацию белковых субстратов, так и на активность фермента алкалазы. Получена зависимость степени протеолиза
сывороточных белков от рН ферментативной системы. Гидролиз осуществляли в реакторе при температуре 37 °С и различных значениях рН 6÷10 исходного раствора сывороточных белков и концентрации алкалазы 0,84 %.
51
Вестник БГУ. Сер. 2. 2009. № 2
В результате эксперимента установлено увеличение степени протеолиза β-лг и α-ла при возрастании рН ферментативной системы (рис. 2). Так, при рН 10 наблюдается практически полное расщепление β-лг и более 90 % α-ла (см. рис. 2 а; 2 б, дорожка 6). Если рН исходного раствора сывороточных белков составляет 6,0, гидролизу подвергаются около 40 % α-ла и 20 % β-лг (см. рис. 2 а; 2 б, дорожка 2), но с учетом реального соотношения белковых фракций в сыворотке [10] β-лг расщепляется
интенсивнее, чем α-ла. При рН 6,5÷7,0 после 2 ч ферментативной реакции протеолизу подвергаются
около 30 % α-ла и β-лг (см. рис. 2 а; 2 б, дорожка 3). Также установлено, что при рН 8 около 30 %
β-лг и 55 % α-ла остаются нерасщепленными (см. рис. 2 а; 2 б, дорожка 4). Таким образом, при исходных значениях рН ферментативной системы 6÷10 протеолиз β-лг алкалазой протекает интенсивнее, чем α-ла.
а
б
Рис. 2. Зависимость степени расщепления α-ла и β-лг от рН: а – β-лг (1), α-ла (2);
б – электрофореграмма продуктов гидролиза 5 % КСБ алкалазой 0,84 % при 37 °С:
дорожка 1 – контроль (5 % КСБ без алкалазы), 2 – гидролиз при рН 6, 3 – рН 7, 4 – рН 8, 5 – рН 9, 6 – рН 10
В изученном диапазоне рН присутствуют существенные различия оптимальных параметров гидролиза для каждого белка. Согласно имеющимся в литературе данным о структуре сывороточных
белков, наличие дисульфидных мостиков в белковых глобулах играет важную роль в конформационных перестройках белкового субстрата. Изменение пространственной структуры белков приводит к
экспонированию участков полипептидной цепи, ранее скрытых в глубине белковой глобулы, в частности к возникновению/удалению сайтов гидролиза белкового субстрата.
Вероятно, при протеолизе β-лг необходимо учитывать целый ряд факторов: оптимум активности и
субстратную специфичность фермента алкалазы (рН 6,5÷8,5), конформационные перестройки белковой глобулы, вызванные изменениями рН, которые могут приводить к агрегации/диссоциации мономеров β-лг, разворачиванию/стабилизации белковой глобулы. Так, по данным [11], при рН 9 межмолекулярная полимеризация S–S протекает при комнатной температуре с последующим полным необратимым разворачиванием β-лг, тогда как при рН 7 полимеризация происходит только после
нагревания до 70 °С [15]. При pH>6,5 преобладает мономерная форма белка, а в жестких щелочных
условиях (рН>9) происходит необратимая денатурация β-лг [11]. С одной стороны, процессы межмолекулярного взаимодействия усложняют доступ фермента к сайтам расщепления, но с другой – полимеризация при рН ≥ 9 приводит к необратимой денатурации белковой глобулы и возникновению
новых сайтов гидролиза.
В случае α-ла наиболее вероятными факторами, влияющими на интенсивность гидролиза белка
при различных рН, являются SH/S–S-переходы в белковой глобуле, инициированные изменением
уровня кислотности, а также денатурация белка в жестких щелочных условиях, оптимум активности
щелочной протеазы.
Температурное воздействие является мощным фактором, вызывающим конформационные переходы в белковых молекулах. В связи с этим изучена температурная зависимость степени протеолиза
сывороточных белков. Гидролиз осуществляли в течение 2 ч при рН 8,0, концентрации алкалазы
0,84 % и в диапазоне температур 25÷60 °С. Для β-лг и α-ла показана общая закономерность – увели52
Биология
чение интенсивности расщепления белков с возрастанием температуры ферментативной системы
(рис. 3). Согласно результатам эксперимента, гидролиз β-лг активно протекает в широком диапазоне
температур, а при 60 °С расщепляется около 90 % данного белка на ряд пептидов с молекулярной
массой менее 18,4 кДа (см. рис. 3 а; 3 б, дорожка 7). В результате эксперимента показано, что для
β-лг не характерно резкое возрастание степени протеолиза с увеличением температуры (см. рис. 3 а;
3 б, дорожки 2–7), что, вероятно, связано с высокой термостабильностью β-лг [15]. Известно, что тепловая денатурация β-лг начинается уже при 30 °С, когда димерный β-лг легко диссоциирует на мономеры в диапазоне 30÷55 °С, но данный процесс является обратимым [19]. Так как протеолиз осуществляли при рН 8, белок присутствовал в растворе преимущественно в форме мономера. Также известно, что при рН 9 и 11 межмолекулярная полимеризация S–S за счет присутствия свободного
тиола Cys121 протекает при комнатной температуре с последующим полным необратимым разворачиванием β-лг, тогда как при рН 3, 5 и 7 полимеризация происходит только после нагревания до 80, 75 и
70 °С соответственно [15]. Таким образом, плавное увеличение эффективности протеолиза с возрастанием температуры в диапазоне 20÷55 °С обусловливается отсутствием кардинальных конформационных перестроек в белковой глобуле, а также увеличением каталитической активности алкалазы.
Устойчивость к температурному воздействию вызвана тем, что разворачивание белковой глобулы,
приводящее к необратимой денатурации β-лг, инициируется при 55÷60 °С [13], когда разрушению
подвергаются D–E-структуры; последующее увеличение температуры до 60÷65 °С связано с денатурацией C–D-пары и α-спиралей в молекуле белка [13]. Известно, что критические конформационные
перестройки наблюдаются при 63 °С, что связано с уменьшением содержания β-складчатых слоев на
19 % [12]. Сульфгидрил-дисульфид индуцированная агрегация является следствием разрушения
β-складчатых слоев. Это может привести к формированию поперечных ковалентных связей между
молекулами β-лг в результате окисления Cys121 с образованием S–S-связи и/или путем SH-индуцированного S–S-перехода [14]. Но практически полное разворачивание молекулы наблюдается
лишь при 80 °С, за исключением G–Н-пары, связанной дисульфидным мостиком, который формирует
наиболее термически устойчивый элемент в молекуле β-лг [14]. Таким образом, ферментативный
гидролиз β-лг при 55÷60 °С сопряжен с инициацией конформационных переходов в молекуле белка,
приводящих к необратимой реорганизации вторичной структуры β-лг, главным образом α-спиралей.
Это увеличивает доступность сайтов протеолиза, ранее скрытых в белковой глобуле. Кроме того, отмечен более интенсивный гидролиз β-лг, чем α-ла, в изученном диапазоне температур (20÷60 °С) при
рН 8 (см. рис. 3 а; 3 б, дорожки 2–7), что, вероятно, обусловлено большим сродством алкалазы к β-лг,
спецификой сайтов, расщепляемых данным ферментом [7].
а
б
Рис. 3. Зависимость степени расщепления α-ла и β-лг от температуры: а – β-лг (1), α-ла (2);
б – электрофореграмма продуктов гидролиза 5 % КСБ алкалазой 0,84 % при рН 8:
дорожка 1 – контроль (5 % КСБ без алкалазы), 2 – температура 20 °С, 3 – 30, 4 – 37, 5 – 50, 6 – 50, 7 – 60 °С
В отличие от β-лг α-ла подвергается незначительному протеолизу при 25÷40 °С, однако при возрастании температуры наблюдается интенсивное расщепление белкового субстрата: при 60 °С в течение 2 ч гидролизуются около 90 % белка (см. рис. 3 а; 3 б, дорожка 7). Данное явление, вероятно,
53
Вестник БГУ. Сер. 2. 2009. № 2
объясняется как большей термолабильностью α-ла [17, 18], связанной с особенностями вторичной
структуры белковой глобулы, так и меньшим сродством фермента к α-ла по сравнению с β-лг в данных условиях протеолиза (см. рис. 3 а; 3 б, дорожки 2–7). По данным литературы, белок денатурирует при температуре 64 °С и рН 7 [18]. В эксперименте гидролиз данного субстрата алкалазой осуществляли в более жестких условиях – при рН 8, что, очевидно, привело к возникновению денатурационных явлений при более низкой температуре. Следовательно, SH/S–S-переходы в белковой глобуле,
инициированные изменением температуры, а также денатурация белка в жестких щелочных условиях, оптимум активности щелочной протеазы являются комплексом факторов, определивших полученную закономерность (см. рис. 3 а, кривая 2).
***
Изучены особенности протеолиза сывороточных белков: α-ла и β-лг, которые являются основными аллергенами молока – алкалазой в различных физико-химических условиях. Получены зависимости
степени протеолиза белковых субстратов от концентрации фермента в различном диапазоне температур и рН ферментативной системы. Установлено возрастание количества расщепленных α-ла и β-лг с
увеличением концентрации фермента в диапазоне 0,21÷1,68 %. Выявлено, что степень протеолиза
сывороточных белков алкалазой возрастает в диапазоне рН 6÷10 для β-лг и рН 7÷10 для α-ла. Показано увеличение скорости расщепления сывороточных белков при возрастании температуры в пределах
20÷60 °С. Так, в случае гидролиза 5 % КСБ при концентрации фермента 0,84 %, температуре 60 °С,
рН 8 и в течение 2 ч протеолизу подвергаются около 90 % β-лг и α-ла.
1. F o x P . F . // Developments in Dairy Chemistry-4. London, 1989. Р. 1.
2. M o r r C . V . // Ibid. P. 245.
3. M o r r C . V . , H a E . Y . W . // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 1993. Vol. 33. P. 431.
4. I w a n i a k A . , M i n k i e w i c z Р . // Acta Sci. Pol. 2007. Vol. 6(3). P. 5.
5. C r e u s o t N . P . // Ph.D. thesis Wageningen University. The Netherlands, 2006.
6. D o u c e t D . // Under the direction of Dr E. Allen Foegeding. Department of Food Science. 2004.
7. D o u c e t D . , F o e g e d i n g E . A . // Biomacromolecules. 2005. Vol. 6. P. 1140.
8. L o w r y O . H . , R o s e b r o u g h N . J . , F a r r A . L . , R a n d a l l R . J . // J. Biol. Chem. 1951. Vol. 193. P. 265.
9. О с т е р м а н Л . А . Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование
(практическое пособие). М., 1981.
10. C r e a m e r L . K . , N i l s s o n H . C . , P a u l s s o n M . A . et al. // J. Dairy Sci. 2004. Vol. 87. P. 4023.
11. P a p i z M . Z . , S a w y e r L . , E l i o p o u l o s E . E . et al. // Nature. 1986. Vol. 324. P. 383.
12. P r a b a k a r a n S . , D a m o d a r a n S . // J. Agric. Food Chem. 1997. Vol. 45. P. 4303.
13. E d w a r d s P . J . , J a m e s o n G . B . , P a l m a n o K . P . , C r e a m e r L . K . // Dairy J. 2002. Vol. 12. P. 331.
14. S h i m a d a K . , C h e f t e l J . C . // J. Agric. Food Chem. 1989. Vol. 37. P. 161.
15. M o n a h a n F . J . , G e r m a n J . B . , K i n s e l l a J . E . // J. Agric. Food Chem. 1995. Vol. 43. P. 46.
16. B r e w K . , G r o b l e r J . A . // Advanced dairy chemistry: proteins. New York, 1992. P. 191.
17. C h r y s i n a E . D . , B r e w K . , A c h a r y a K . R . // J. Biol. Chem. 2000. Vol. 275. P. 37021.
18. B o y e J . I . , A l l i I . // Food Research International. 2000. Vol. 33. P. 673.
19. S a w y e r L . // Advanced dairy chemistry. 2003. Vol. 1. P. 319.
Поступила в редакцию 20.01.09.
Татьяна Николаевна Головач – младший научный сотрудник отдела биотехнологий Института мясо-молочной промышленности НАН Беларуси.
Наталья Васильевна Гавриленко – старший научный сотрудник лаборатории прикладных проблем биохимии. Наталья
Константиновна Жабанос – кандидат технических наук, заведующая лабораторией прикладных биотехнологий и детских молочных продуктов отдела биотехнологий Института мясо-молочной промышленности НАН Беларуси.
Владимир Петрович Курченко – кандидат биологических наук, доцент, заведующий лабораторией прикладных проблем биохимии.
54