Характеристика неферментирующих грамотрицательных

ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ
И ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ОБОСНОВАНИЕ
РАЗРАБОТКИ КОМПЛЕКСНОГО ПРЕПАРАТА
БАКТЕРИОФАГОВ ПРОТИВ
НЕФЕРМЕНТИРУЮЩИХ
ГРАМОТРИЦАТЕЛЬНЫХ БАКТЕРИЙ
А.М.Николаева, Ю.А.Захарова, Е.В. Функнер,
М.Г. Ефимова, К.А. Лыско, О.С.Федотова, А.В. Климашина
ФГУП «НПО «Микроген» (филиал Пермское НПО «Биомед»)
ГБОУ ВПО ПГФА МЗ РФ
ГБОУ ВПО ПГМА им. ак. Е.А.Вагнера МЗ РФ
ФГБУЗ Пермский клинический центр ФМБА России
Pseudomonas aeruginosa относится к
числу основных возбудителей ИСМП
Акимкин В.Г. и соавт. – 2008г.
Николаева Н.В. – 2011г.
Результаты многоцентровых исследований
свидетельствуют, что 30% случаев инфекции,
связанные с оказанием медицинской помощи,
вызваны синегнойной палочкой
Руднов В.Д.,2005
РЕЗИСТЕНТНОСТЬ НОЗОКОМИАЛЬНЫХ ШТАММОВ
Acinetobacter spp. В РФ
Исследование «МАРАФОН» 2011-12 гг. (n=252)
Критерии EUCAST v.3.1 (2013), кроме * – критерии CLSI; ** – ECOFF1 мг/л
РЕЗИСТЕНТНОСТЬ A. baumannii, ПРОДУЦИРУЮЩИХ OXA
КАРБАПЕНЕМАЗЫ, К РАЗЛИЧНЫМ АНТИБИОТИКАМ
2008-12: штаммы, выделенные в РФ (n=266)
Критерии EUCAST v.3.1 (2013), кроме * – критерии CLSI; ** – ECOFF1 мг/л
УТВЕРЖДАЮ
Директор института
академик РАМН, профессор
В.И. Покровский
11 марта 2012
Несмотря на достижения науки и практики в области разработки инновационных
технологий … проблема гнойно-септических послеоперационных осложнений, вызванных
оппортунистической микрофлорой…, требует к себе пристального внимания …. Иными
словами речь идет о проблеме, требующей мультидисциплинарного подхода.
Микробиологическими
особенностями
современного
эпидемического
процесса
возникновения и распространения послеоперационных осложнений является … возрастание
доли грамотрицательной аэробной микрофлоры … группы неферментирующих бактерий
(синегнойная палочка, ацинетобактер и др.). … В 2010 году стали известны
грамотрицательные бактерии, содержащие ген фермента металло-бета-лактамазы (NDM-1),
который разрушает любые бета-лактамные антибиотики. Исследованиями последних лет
было показано, что тяжелейшие осложнения (ИВЛ-ассоциированные пневмонии) могут
вызывать … например сапрофит Stenotrophomonas maltophilia, обладающий природной
устойчивостью к карбапенемам и другим беталактамам.
Учитывая вышеизложенное, а также во исполнение Постановления Главного Государственного санитарного врача Российской Федерации (пункт 6.1.) от 29.11.2011 №146 «О
профилактике внутрибольничных инфекций» в целях обеспечения методической и практической помощи территориальным органам Роспотребнадзора, медицинским организациям в
осуществлении надзора за ВБИ, расследовании тяжелых случаев ВБИ и групповых инфекционных заболеваний в медицинских организациях для проведения оперативного надзора за
высевом мецитиллин-резистентного стафилококка (MRSA), ванкомицин-резистентного стафилококка и энтерококка, меропенем устойчивой микрофлоры, а также возможных находок
(распространения) NDM-1, прошу направить в референс – центр по контролю за внутрибольничными инфекциями информацию за 2011 год согласно форме, представленной в
приложении.
Руководитель референс-центра
по контролю за
внутрибольничными инфекциями
д.м.н., профессор А.В. Тутельян
Российские национальные рекомендации
СТРАТЕГИЯ И ТАКТИКА ПРИМЕНЕНИЯ
АНТИМИКРОБНЫХ СРЕДСТВ В ЛЕЧЕБНЫХ
УЧРЕЖДЕНИЯХ РОССИИ
Staphylococcus aureus (MRSA)
Enterococcus spp. (VRE)
Pseudomonas aeruginosa (MBL)
Acinetobacter baumannii (PR)
Klebsiella pneumoniae (BLRS)
Escherichia coli (BLRS)
Clostridium difficile
НИИ антимикробной терапии ГОУ ВПО СГМА МЗ РФ
Научно-методический центр по мониторингу
антибиотикорезистентности ФА по здравоохранению
Москва, 2012 г
Представители
внутрибольничных штаммов
многопрофильных
стационаров Пермского края
(2002-2010 гг.)
19,4%
энтерокок
ки
29,0%
стафилок
окки
3,2%
коринебак
терии
22,6%
БГКП
25,8%
НФГОБ
247 штаммов НФГОБ:
в т.ч.
162 – от пациентов
146 – с ГСИ,
16 – без ГСИ
Результаты обследования
27 отделений
8 многопрофильных
медицинских организаций
Пермского края
85 – из внешней среды ЛПУ
73 – в плановом порядке,
12 – по эпидемическим показаниям
Уровень колонизации пациентов
и контаминации объектов внешней среды НФГОБ
пациенты
15,4%
объекты внешней среды
84,6%
4,9%
95,1%
Объекты внешней среды,
контаминированные НФГОБ
86,20%
сан-тех оборуд.
12,60%
необр.предм.
1,20%
дезинф-ты
чист.предм.
0%
матер на стер.
0%
растворы
0%
воздух
0%
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
Видовой состав НФГОБ многопрофильных
стационаров Пермского края
(2002-2010 гг.)
3,6%
3,2%
2,8%
33,6%
5,3%
Pseudomonas aeruginosa
Аcinetobacter baumanii
Stenotrophomonas maltophilia
8,1%
Аcinetobacter lwoffi
12,5%
Alcaligenes faecalis
Alcaligenes denetrificans
Аcinetobacter junii
30,8%
Alcaligenes calcoaceticus
Частота встречаемости видового состава НФГОБ,
среди пациентов и во внешней среде стационаров
Вид НФГОБ
НФГОБ от
пациентов и
объектов внешней
среды
абс
%±m
Pseudomonas aeruginosa
83
33,6±3,0
Аcinetobacter baumannii
76
30,8±1,2
НФГОБ от
пациентов
НФГОБ с
объектов
внешней среды
абс
38
62
%±m
23,4±3,2
38,2±3,9
абс
45
14
%±m
61,1±6,4
16,4±4,6
Stenotrophomonas
maltophilia
Аcinetobacter lwoffi
31
12,5±2,1
23
14,1±2,8
8
9,4±3,5
20
8,1±1,7
9
5,8±1,9
11
12,9±4,1
Alcaligenes faecalis
13
5,3±1,4
10
6,2±1,9
3
3,5±1,7
Alcaligenes denetrificans
9
3,6±1,2
7
4,5±1,6
2
2,3±1,3
Аcinetobacter junii
8
3,2±1,1
8
5,5±1,8
-
-
Alcaligenes calcoaceticus
7
2,8±1,0
5
3,2±1,4
2
2,3±1,3
162
100,0
85
100,0
Всего:
247
100,0
В р а мк а х Н И Р с о вмес тно с с отрудн и к а м и С а нк т - П ете р бур гс ко й
медицинской Академии проводится работа по созданию
бактериофага Дифаг®, селективно действующего
на Acinetobacter baumannii и Pseudomonas aeruginosa.
Возможности ФГУП «НПО «Микроген» для
производства препаратов бактериофагов
• Наличие производства на 3-х филиалах с оснащением
современным оборудованием с соблюдением GMP и
Санитарных правил.
• Уникальная коллекция микроорганизмов
• Коллекция маточных бактериофагов
• Быстрая актуализация каждого из препаратов фагов за счет
обновления коллекции микроорганизмов свежевыделенными
штаммами
• Стабильность препаратов в течение 2 лет
• Создание новых лекарственных форм выпуска препаратов
• Разработка и внедрение новых препаратов бактериофагов
против этиологически и эпидемически значимых
микроорганизмов
• Широкий спектр действия комплексных и поливалентных
бактериофагов
• Применение препаратов как с лечебной, так и с
профилактической целью.
Основные этапы развития
производства бактериофагов
на «Пермском НПО «Биомед»









1995 г. - стафилококковый
1997 г. - клебсиелл пневмонии, синегнойный
1998 г. - колипротейный
2001 г. - стрептококковый, секстафаг жидкий
2003 г. - клебсифаг суппозитории
2004 г. - секстафаг суппозитории
2005 г. - дизентерийный, сальмонеллезный
2007 г. - интести-бактериофаг
2010 г. – сальмонеллезный таблетированный без оболочки
Му з е й н а я кол л е к ц и я
п р о и з вод с т в е н н ы х ш т а м мов
м и к р о о р г а н и змов Н П О Б и ом ед
Микроорганизмы изученные за 1995-2013 гг.
в «Пермском НПО «Биомед»
Shigella spp.
Salmonella spp.
Staphylococcus
spp.
Ps. aeruginosa
Proteus spp.
Streptococcus
spp.
Klebsiella
spp.
Escherichia coli
Общее количество штаммов микроорганизмов: 22185 шт.
Производственная коллекция составляет более 1600 штаммов.
Кол л е к ц и я б а к т е р и о ф а гов
Н П О Б и ом ед
Ж
А
Б
В
Е
Г
А - Бактериофаг Streptococcus pyogenes № 1 (морфотип В1)
Б - Бактериофаг Streptococcus pyogenes № 2 (морфотип В1)
В - Бактериофаг Streptococcus pyogenes № 3 (морфотип В3)
Г - Бактериофаг Staphylococcus aureus (морфотип А1)
Д - Бактериофаг Proteus vulgaris et mirabilis (морфотип В1)
Е - Бактериофаг Escherichia coli (морфотип А2)
Ж - Бактериофаг Klebsiella pneumoniae № 1 (морфотип С1)
З - Бактериофаг Klebsiella pneumoniae № 2 (морфотип В1)
Д
З
И - Бактериофаг Pseudomonas aeruginosa (морфотип А1)
И
ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ
АСПЕКТЫ ПРОИЗВОДСТВА
ПРЕПАРАТА ДИФАГ®
Бактериофаг ацинетобактер - синегнойный
М У З Е Й Н А Я КОЛ Л Е К Ц И Я
Ш ТА М М О В И Б А К Т Е Р И О ФА ГО В
Pseudomonas aeruginosa
Чувствительность микроорганизмов
к компонентам секстафага
95
71,7
80
71,4
69,1
64
54
60
40
20
протей
клебсиелла
коли
стрептококк
синегнойная
палочка
0
стафилококк
%
100
наименование
бактерий
Характеристика производственных штаммов
Pseudomonas aeruginosa (110 штаммов)
Наименован
ие и
обозначение
штамма
1
В
производств
е
используютс
я штаммы
Pseudomonas
aeruginosa.
В качестве
обозначения
используют
порядковый
номер
штамма,
присвоенны
й при его
поступлении
в
производств
енный отдел
и
регистрации
в журнале
Место получения
штамма
Условия
сохранения
штаммов на
предпри
-ятии
2
3
4
5
6
7
Штаммы выделяют
Грамотрицатель Строгие
Должны
Глюкозу окисПроизот больных с
ные палочки,
аэробы. Рост от лизироваться
ляют, но не фер- водстве
гнойными
одиночные
маточным
ментируют.
нные
+5 °С до
инфекциями и
подвижные,
бактериофагом в Растут на ацет- штаммы
+42 °С.
дисбактериозами
жгутик 1.
Оптимальный
титре 10-6 по
амидном агаре. хранят
согласно приказу МЗ Размер
рост при
методу
Переводят
при темСССР № 585 от
0,5-1,0 x
Аппельмана
нитраты в
ператур
(361)°С.
22.04.85 п.2.1.
1,5-4,0 мкм.
На жидких
(чтение реакции нитриты.
е
Используют
На среде Эндо средах расчерез 24 часа).
Вырабатывают
(5±
штаммы,
типичные
тут с появНе должны
уреазу,
3)°С
выделенные не более флуоресцирую лением равсодержать
оксидазу,
на 0,5%
чем за год до
щие колонии с номерной
вирулентного
цитохромоксиагаре
момента их введения неровными
мути или с
фага.
дазу,
Мартена
в производство. Срок краями.
образованием
желатиназу. На .
использования
Содержат
поверхностных
кровяном
штаммов – 1 год.
пигменты:
пленок.
агаре могут
Стабильные,
флуоресциИзменяют цвет
вызывать
высокопродуктивные рующие и
cреды
гемолиз.
штаммы могут быть пиоцианин.
при росте
Источники
использованы более
от зеленовауглерода для
длительное время.
того до синего.
роста:
Ежегодно вводят
Споры не
глюкоза,
свежевыделенные
образуют.
2-кетоглюконат,
штаммы (не менее
Оптимальная
гераниол,
1/3), циркулирующие
L-валин,
pH (7,20,4).
в различных
β - аланин,
территориях страны.
L-аргинин.
Psedoomonas aeruginosa
МорфологиКультуральные
ческие и
свойства
тинкториальные
свойства
[арактеристика штамма
Литические
Биохимические
свойства
свойства
Условия
пассирования
штаммов
Условия
получения
посевной
культуры
8
Периодически не
реже 1
раз в 2
месяца
штаммы
пересевают на
0,5% агар
Мартена.
Выращив
ают
культуры
при
температу
ре
(361)°С
в течение
(20±4)ч.
9
Суточную
агаровую
культуру
производственного
штамма
платиновой
петлей
переносят
во флакон
на 450 мл со
200 мл
казеиновокислотной
среды.
Выращиваю
т при
температуре
(361)°С в
течение
(20±4)ч.
Характеристика маточных бактериофагов
Pseudomonas aeruginosa (3 расы фага)
Наименов
ание и
обозначе
ние
Место
получения
Морфологические и
тинкториальные
свойства
1
2
3
Расы
Фаг
Бактерио бактериофаго Pseudomonas
фагу
в выделяют
aeruginosa
присваив из гноя,
состоит из
ается
мочи, кала
изометрическ
номер
больных, а
ой головки
штамма, также из
диаметром
на
сточных вод (113-115)нм
котором и различных и
он
водоемов,
сокращающе
пассирует обогащая
гося отростка
ся.
бактериями, длиной (175выделенным 178)нм.
и от больных
с гнойно воспалительн
ыми,
энтеральным
и
заболеваниям
ии
дисбактериоз
ами.
Культуральные
свойства
Литические
Вируленсвойства
тные и
бактериофаго токсигенн
в
ые
свойства
4
5
6
Лизис
Должны
Бактериоф
культуры
лизировать
аги
Pseudomonas производстве должны
aeruginosa
нные
обладать
происходит
штаммы
вирулентн
через
Pseudomonas ыми
(2-3,5) ч
aeruginosa в свойствам
после
титре не
и.
заражения,
ниже 10-6 по
т.е. после 3-4 Аппельману.
циклов
Лизис
размножения штаммов
фага.
должен быть
Оптимальная полным и
температура стойким.
(36,0±1,0)°
С.
Условия
сохранени
я на
предприят
ии
7
Маточные
бактериофаги
хранят при
температу
ре (5 ±
3)°С.
Консерван
т не
применяет
ся.
Условия
пасси
рования
бактериофагов
8
Маточные
бактериофаги
размножают и
пассируют на
казеиновокислотной
среде.
Посевная доза
маточного
бактериофага
0,2% к общему
объему среды,
при внесении
(30-50) млн.
клеток
синегнойной
палочки на 1
мл среды.
Длительность
инкубации
(20± 4) ч при
температуре
(36,0±1,0)°С
.
Условия получения
маточных
бактериофагов
9
Для выделения фага из
гноя или кала берут
(3- 5) г исследуемого
материала на 50 мл
бульона с обогащением 0,1
мл
1 млрд. взвесью
синегнойной палочки. При
выделении из жидкого
материала на 100 мл
сточной воды или мочи,
добавляют 10 мл
концентрированного
пептона (10% пептона) и
5% NaCl и 0,1 мл
1
млрд. взвеси синегнойной
палочки. Инкубируют
(20± 4)ч при температуре
(36,0 ± 1,0) °С. После
стерилизующей
фильтрации проверяют на
литическую активность на
соответствующих
культурах. В случае слабой
чувствительности
проводится адаптация
выделенных рас фагов к
производственным
штаммам.
С О ЗД А Н И Е М У З Е Й Н О Й КОЛ Л Е К Ц И И
Ш ТА М М О В И Б А К Т Е Р И О ФА ГО В
Acinetobacter baumannii
Географические места выделения штаммов,
поступивших в НПО Биомед
2010-2014г.
Город
Количество
%
Санкт-Петербург
6
1,5
Москва
5
1,2
392
96,8
2
0,5
405
100,0
Пермь
Калининград
Всего:
Штаммы,
поступившие в НПО Биомед
из Санкт-Петербурга
2010г.
Характеристика штаммов Acinetobacter baumannii
по локализации инфекционного процесса
n=405
объекты больничной среды 5,3%
отделяемое цервикального канала 0,3%
100%
секционный материал 1.7%
ликвор 0,3%
80%
кровь 1,5%
отделяемое уха 0,6%
60%
кал 2,0%
отделяемое носа 0,5%
40%
отделяемое зева 2,2%
промывные воды бронхов 44,5%
20%
мокрота 2.5%
моча 8,9%
0%
раневой секрет 29,7%
Фаголизабельность штаммов
Acinetobacter baumannii к препарату
бактериофага (г.Санкт-Петербург)
Город
Количество
Фаголизабельные
штаммы
Санкт-Петербург
6
66,7%
Москва
5
20,0%
392
13,5%
2
100,0%
Пермь
Калининград
Регламент выделения бактериофага из
сточных вод
Сбор фаголизатов и
проведение
стерилизующей
фильтрации через
шприцевые фильтры
«Millex» или обработка
хлороформом в
соотношении 1:100 с
последующей оценкой
специфической
активности
Адаптация выделенных
рас фагов к штамма
микроорганизмов (2-3
пассажа с фаголизатом)
Проверка литической
активности образцов по
методу Аппельмана и
Грация на соответствующих
культурах
микроорганизмов
Предварительная
фильтрация сточной воды в
случае сильной
загрязненности
Засев микроорганизмов
(на 100 мл воды 10 мл
10% раствора пептона, 5%
раствор NaCl и 0,1 мл 1
млрд. взвеси
бактериальной культуры)
на 6-9 частей полученной
воды
Инкубация 6-9 образцов
воды с гомологичным
штаммом при
температуре 36±1°С в
течении 20±4ч.
Стерилизующая
фильтрация на шприцевых
фильтрах «Millex»
Характеристика производственных штаммов
Acinetobacter baumannii (60 штаммов)
Наименование и
обозначение
штамма
Место получения
штамма
1
В производстве
используются
штаммы
Acinetobacter
baumannii.
В качестве
обозначения
используют
порядковый
номер штамма,
присвоенный при
его поступлении в
производственны
й отдел и
регистрации в
журнале
2
Штаммы выделяют от
больных с гнойновоспалительными
заболеваниями
согласно приказу МЗ
СССР № 585 от
22.04.85 п.2.1.
Используют штаммы,
выделенные не более
чем за год до момента
их введения в
производство. Срок
использования
штаммов – 1 год.
Стабильные,
высокопродуктивные
штаммы могут быть
использованы более
длительное время.
Ежегодно вводят
свежевыделенные
штаммы (не менее 1/3),
циркулирующие в
различных
территориях страны.
Морфолог
ические и
тинкториа
льные
свойства
3
Грамотри
цательны
е палочки
или
коккобакт
ерии.
Характеристика штамма
Культуральные Литические Биохимические
свойства
свойства
свойства
4
На среде Эндо
образуют
лактозонегативн
ые или
лактозодефектив
ные колонии,
иногда
слизистые
красные. На
кровяном агаре
растут в виде
серых
слизистых
колоний без
гемолиза.
Строгие аэробы.
Оптимальная
температура для
большинства
штаммов (33 35)°С. На
жидких средах
растут с
появлением равномерной мути.
Споры не
образуют.
5
Должны
лизировать
ся
маточным
бактериофа
гом в титре
10-6 по
методу
Аппельман
а (чтение
реакции
через 24
часа). Не
должны
содержать
вирулентно
го фага.
6
Оксидаза –.
Подвижность –.
Среда ХьюЛейфсона +/(разлагают
глюкозу только в
аэробных
условиях).
Цитрат
Симмонса+.
Метил-рот +,-.
Мочевина +,-.
Желатина –.
Рост на МПА при
42 °С +.
Лизин –.
Аргинин –.
Фенилаланин +,-.
Условия
сохранения
штаммов на
предпри
-ятии
7
Производственные
штаммы
хранят
при температуре
(5± 3)
°С на
0,5%
агаре
Мартена
.
Условия
пассирования
штаммо
в
Условия
получения
посевной
культуры
8
Периоди
-чески
не реже
1 раз в 2
месяца
штаммы
пересевают на
0,5%
агар
Мартена
.
Выращи
вают
культур
ы при
темпера
туре
(361)°
Св
течение
(20±4)ч
.
9
Суточную
агаровую
культуру
проиводственного
штамма
платиновой
петлей
переносят
во флакон
на 450 мл
со 200 мл
казеиновокислотной
среды.
Выращива
ют при
температур
е (361)°С
в течение
(20±4)ч.
Характеристика маточных бактериофагов
Acinetobacter baumannii
(2 варианта фага по месту выделения)
Наим
енова
ние и
обозн
ачени
е
Место
получения
1
Бакте
риоф
агу
присв
аивае
тся
номе
р
штам
ма,
на
котор
ом он
пасси
руетс
я.
2
Расы
бактериофаг
ов выделяют
из гноя,
мочи, кала
больных, а
также из
сточных вод
и различных
водоемов,
обогащая
бактериями,
выделенным
и от больных
с гнойно воспалительн
ыми,
энтеральным
и
заболевания
ми
дисбактериоз
ами.
Морфоло
-гические
и
тинктори
-альные
свойства
3
Фаг
Pseudomo
nas
aeruginos
a состоит
из
изометри
ческой
головки
диаметро
м (113115)нм и
сокраща
ющегося
отростка
длиной
(175178)нм.
Культура- Литически Вирулен- Условия
льные
е свойства тные и сохранени
свойства бактериоф токсиген
я на
агов
ные
предприят
свойства
ии
4
5
6
Лизис
Должны
Бактерио
культуры лизироват фаги
Pseudomon ь
должны
as
производс обладать
aeruginosa твенные
вирулент
происходи штаммы
ными
т через
Pseudomon свойства
(2-3,5) ч
as
ми.
после
aeruginosa
заражения, в титре не
т.е. после ниже 10-6
3-4 циклов по
размножен Аппельма
ия фага.
ну. Лизис
Оптималь штаммов
ная
должен
температу быть
ра
полным и
(36,0±1,0) стойким.
°С.
7
Маточные
бактериофаги
хранят при
температу
ре (5 ±
3)°С.
Консерван
т не
применяет
ся.
Условия
пассирования
бактериофагов
8
Условия получения
маточных
бактериофагов
9
Маточные
Для выделения фага из гноя
бактериофаги
или кала берут
(3- 5) г
размножают и
исследуемого материала на
пассируют на
50 мл бульона с обогащением
казеиново0,1 мл
1 млрд. взвесью
кислотной среде. синегнойной палочки. При
Посевная доза
выделении из жидкого
маточного
материала на 100 мл сточной
бактериофага
воды или мочи, добавляют 10
0,2% к общему
мл концентрированного
объему среды,
пептона (10% пептона) и 5%
при внесении
NaCl и 0,1 мл
1 млрд.
(30-50) млн.
взвеси синегнойной палочки.
клеток
Инкубируют (20± 4)ч при
синегнойной
температуре (36,0 ± 1,0)
палочки на 1 мл °С. После стерилизующей
среды.
фильтрации проверяют на
Длительность
литическую активность на
инкубации (20± соответствующих культурах.
4) ч при
В случае слабой
температуре
чувствительности проводится
(36,0±1,0)°С. адаптация выделенных рас
фагов к производственным
штаммам.
Требования для включения штаммов
P. aeruginosa и A. baumannii
в серию препарата Дифаг®
Используют не менее 20 штаммов Pseudomonas aeruginosa и 20 штаммов
Acinetobacter baumannii, обладающих типичными морфологическими,
культуральными, ферментативными свойствами и лизирующиеся маточным
бактериофагом в разведении не ниже 10-6 по Аппельману.
Введение в производственную коллекцию новых штаммов Pseudomonas
aeruginosa и Acinetobacter baumannii осуществляют после проверки
культуральных, биохимических, морфологических свойств штаммов и на
отсутствие вирулентного фага.
В серию допускают штаммы, выделенные не более чем за год до момента их
введения в производство. Срок использования штаммов – 1 год. Стабильные,
высокопродуктивные штаммы могут быть использованы более длительное
время.
Ежегодно вводят свежевыделенные штаммы (не менее 1/3), циркулирующие
в различных территориях страны.
Чувствительность
штаммов-продуцентов бактериофага A. baumannii
к антибактериальным препаратам
чувствительные штаммы A. baumannii (%)
бактериофаг
100
колистин
100
40
амикацин
25
фосфомицин
95
тигециклин
15
имипенем
левомицетин
0
ципрофлоксацин
0
цефотаксим
0
П р и готовл е н и е п и т ат е л ь н о й с р ед ы
Для производства используются
казеиново-кислотная питательная среда
Преимущества казеиново-кислотной среды
•Сниженное содержание балластных веществ
•Стандартизация по составу
•Экономическая эффективность
З а с е в в р е а к то р п о с е в н о й кул ьту р ы
м и к р о о р г а н и змов и маточ н о го
бактериофага
Применяется реакторный способ
культивирования бактериофагов с
засевом в питательную среду
маточного бактериофага и посевной
бактериальной культуры,
инкубирование в течение 16-18 ч при
температуре 36-37 С.
О с в е тл я ю щ а я м и к р о ф и л ьт р а ц и я ,
оч и щ а ю щ а я ул ьт р а ф и л ьт р а ц и я ,
с т е р и л и зу ю щ а я ф и л ьт р а ц и я
По окончании процесса фаголизиса препарат
подвергают предварительной осветляющей
фильтрации с использованием современных
одноразовых фильтрующих элементов.
Для освобождения фаголизата от продуктов жизнедеятельности бактерий и фаголизиса, эндо и
экзотоксинов применяют методы ультрафильтрации на установках колоночного типа с полыми
волокнами на 100 кДа и плоскорамного типа фирмы «Сарториус»
Соединение компонентов бактерииофага
P. a e r u g i n o s a и A . b a u m a n n i i
в Дифаг®
Наименование
полупродуктов и сырья
Бактериофаг
синегнойный в бутылях
после стерилизующей
фильтрации
Бактериофаг
ацинетобактерный
в
бутылях
после
стерилизующей
фильтрации
Итого:
Содержание
основного вещества
%/Активность,
ЕД/мл
Израсходовано
Масса, кг
Активность
основного
вещества,
ЕД
Объем, л
не менее 10-5
90,0
не менее 10-5
90,0
180,0
Розлив препарата во флаконы
Разливочно-укупорочные станции CVC пр-ва Италии
В России выпускается аналогичная машина ЛС ЛНУ фирмы Випс-Мед
Ко н т р ол ь кач е с т в а
п р е п а р ат а
1.
2.
3.
4.
Стерильность, показатели рН ,07,8 , содержание остаточного
белка (не более 800 мкг/мл).
Специфическая активность,
подлинность - специфический
лизис соответствующих видов
бактерий.
Безопасность: оценка очистки от
продуктов жизнедеятельности
бактерий, эндо – и экзотоксинов,
балластных веществ и
токсичность для белых мышей и
крыс.
Транспортирование, хранение
(герметичность, температура
перевозки и хранения от 2 до 8
оС), срок годности (2 года).
Биологические свойства препарата
Дифаг®
Проведены на базе лаборатории
молекулярной биоинженерии Института
биоорганической химии РАН г.Москва
Эл е к т р о н н о - м и к р о с ко п и ч е с к и й а н а л и з
Pseudomonas
aeruginosa KMV
Pseudomonas
aeruginosa PB 1
Pseudomonas
aeruginosa KZ
Семейство Podoviridae
Семейство Myoviridae
Семейство Myoviridae
Acietobacter
baumannii
Представленный бактериофаг A. baumannii принадлежит к морфогруппе С1 семейства Podoviridae, представляет
правильный икосэадрическийе капсиды диаметром 55 нм с коротким несократимым хвостом 5-7 нм. Видимых минорных
вариантов структуры (шипы, фибрллы) не обнаружены. В базе данных GenBanc содержится информация о 10
бактериофагах A. baumannii из семейства Podoviridae. Все описанные фаги имеют литический (вирулентный) цикл с
достаточно узким спектром инфицируемых штаммов По строению генома они классифицируются на KMV-подобные фаги,
Т7-подобный фаг, N4- подобный фаг и неклассифицированный фаг AB7-IBB2. За исключением последнего представленный
фаг может принадлежать к любой перечисленной группе, а так же ранее неизвестным группам.
Биологические свойства препарата
Дифаг®
Проведены на базе лаборатории
молекулярной биоинженерии Института
биоорганической химии РАН г.Москва
Исследование у рожайности фаговых частиц,
определение латентного периода
Показатели инфекционного процесса при взаимодействии
со штаммами P. аeruginosa №1824 и A. baumannii №91
Параметры
инфекционного процесса
Компоненты Дифага
Бактериофаг P. aeruginosa Бактериофаг A. baumannii
Константа скорости
адсорбции, мл/мин
5,0 Х 10-10
5,8 Х 10-10
Латентный период, мин
35-40
25-35
Урожайность, частиц
91,20
61,18
Биологические свойства препарата
Дифаг®
Проведены на базе лаборатории
молекулярной биоинженерии Института
биоорганической химии РАН г.Москва
Оценка ча стоты генера ции фа гоусто йчивых
бактерий (по М. Адамсу)
Частота образования устойчивых к препарату Дифаг
бактериальных клонов, образующихся в зоне фаголизиса
газона P. aeruginosa и A. baumannii составила 10-6 на одну
бактериальную клетку. Чтобы проверить являются ли эти
клоны фагорезистентными мутантами или лизогенными
вариантами с встроенным профагом, 50 очищенных
трехкратным пересевом фагоустойчивых клонов проверяли
на способность к спонтанной или направленной индукции в
присутствии различных концентраций митомицина С (1
мкг/мл, 5 мкг/мл). Во всех случаях индукции фага не отмечено.
В результате доказана вирулентная природа бактериофагов,
входящих в Дифаг®
Применение таких фагов в лечении уменьшает вероятность
появления фагорезистентных форм в микробной популяции.
Специфическая
активность препарата
Диапазон и степень литической активности
бактериофагов по методуАппельмана (на
жидкой питательной среде при
последовательных десятичных разведениях
препарата от 10 –1 до 10-8 ).
Специфическая активность препарата Дифаг®
10 –5- 10-6для P. аeruginosa
10 –4- 10-5 для A. baumannii
Концентрация фаговых частиц – методом
A. Gratia (с применением двухслойного
агара - подсчет «негативных» колоний)
составила
1,2Х10 6- 4,3Х10 7для P. aeruginosa
3,2 Х10 5- 3,4Х106 для A. baumannii
Контрольные штаммы
P. аeruginosa № 624,1053,1358,432,1163,1193,1241,1308
А. baumannii № 84,220,243,316,356,362,444,529
Контрольные штаммы должны обладать
типичными морфологическими,
культуральными, биохимическими
свойствами. Штаммы хранят на
производстве и ежегодно представляют
в лабораторию бактериофагов,
нормофлоры с коллекцией
микроорганизмов Центра экспертизы и
контроля МИБП ФГБУ «НЦЭСМП»
Минздрава России.
Диапазон действия препарата
СПОТ – тест
Испытываемый бактериальный штамм в
Наименование
виде 18 - часовой бульонной культуры
микроорганизмов
распределяют по поверхности чашки Петри с
P. aeruginosa
питательным агаром. На газон с впитавшейся
культурой наносят по 1 капле (0,03 мл) образцы
A. baumannii
бактериофагов, затем инкубируют при
температуре 37 °С в течение 18 часов. Наличие S. aureus
зоны лизиса свидетельствует о
Кол-во
штаммов
фаголизабельность
20
100%
20
100%
10
отсутствует
10
отсутствует
P. vulgaris
5
отсутствует
P. mirabilis
5
отсутствует
K. pneumoniae
10
отсутствует
E. coli
10
отсутствует
Shigella spp.
10
отсутствует
Salmonella spp.
10
отсутствует
Y. enterocolitica
10
отсутствует
чувствительности штамма к бактериофагу. Streptococcus spp
БЕЗОПАСНОСТЬ
П о ка з а т ел ь о с т а то ч н о го б ел ка
№ серии препарата
Остаточный белок,
мкг/мл
Дифаг с.П1
250,0
Дифаг с. П2
187,5
Дифаг с.П3
187,5
Предельно допустимое значение 800 мкг/мл
БЕЗОПАСНОСТЬ
Х р о м а то г р а ф и ч е с к и й а н а л и з
Бактериофаг без очистки
Бактериофаг очищенный
Питательная среда
•
•
•
Основная доля белкового компонента
соответствует молекулярной массе ниже
25 кДа.
В процессе ультрафильтрации
наблюдается значительное уменьшение
высоты пиков, что свидетельствует об
удалении балластных компонентов
питательной среды и продуктов
фаголизиса.
Степень очистки препарата по общему
азоту составила 87,9%, по белковому
азоту 83,66%.
БЕЗОПАСНОСТЬ
О це н ка « о с т р о й » и « х р о н и ч е с ко й »
то кс и ч н о с т и
Динамика веса лабораторных животных
Б/п крысы
Опыт
24
часа
7
суток
14
суток
24
часа
7
суток
14
суток
198,00±12,95
Контроль
Острая токсичность
195,50±17,23
Б/п мыши
Опыт
Контроль
20,43±2,07
20,24±1,06
202,00±14,94
200,00±17,67
20,78±1,36
21,52±2,13
221,50±16,34
222,50±17,20
23,63±2,34
23,52±2,06
Хроническая токсичность
224,50±17,39
231,00±20,25
23,66±1,76
23,70±1,86
239,50±20,34
241,00±21,32
27,06±2,38
26,73±1,83
286,00±39,50
262,00±46,62
30,59±1,15
30,54±1,58
Достоверных отличий между опытом и контролем не выявлено (р>0,05)
M±m – среднее арифметическое ± стандартное отклонение
Прирост массы тела на протяжении всего эксперимента у животных всех групп был
положительным. Статистически значимых различий между опытными и контрольными
группами выявлено не было.
Сравнительный анализ гематологических показателей б/п крыс до и после однократного и
многократного введения препарата Дифаг и раствора натрия хлорида 0,9 %
Срок забора крови
До введения препарата
Группа
Контроль (раствор натрия
хлорида 0,9 %
Дифаг с. П1
Через 24 часа после введения
Контроль (раствор натрия
хлорида 0,9 %
Дифаг с. П1
Через 7 суток после введения
Контроль (раствор натрия
хлорида 0,9 %
Дифаг с. П1
Через 14 суток после
введения
До введения препарата
Контроль (раствор натрия
хлорида 0,9 %
Дифаг с. П1
Контроль (раствор натрия
хлорида 0,9 %
Дифаг с. П1
Через 24 часа после введения
Контроль (растор натрия
хлорида 0,9 %
Дифаг с. П1
Через 7 суток после введения
Контроль (раствор натрия
хлорида 0,9 %
Дифаг с. П1
Через 14 суток после
введения
Контроль (раствор натрия
хлорида 0,9 %
Дифаг с. П1
Эритроциты,
млн/мл
4,92±
0,84
5,30±
0,78
4,65±
0,44
5,03±
0,74
4,80±
0,61
5,38±
1,20
5,76±
0,84
5,77±
0,73
5,21±
0,88
5,30±
0,78
6,40±
0,66
6,75±
1,13
5,38±
0,82
5,56±
0,55
5,42±
0,35
5,69±
1,03
Гемоглобин, г/л
Лейкоциты,
103абс/мл
Однократный способ введения
112,43±
7,49±
9,02
3,28
128,43±
8,78±
14,52
4,09
103,73±
8,33±
13,69
2,87
112,90±
8,84±
7,86
3,84
123,13±
9,83±
13,21
2,10
124,13±
7,99±
9,86
1,42
129,50±
7,74±
14,81
1,77
126,97±
7,96±
6,79
3,14
Многократный способ введения
125,20±
10,13±
12,82
4,53
127,67±
9,43±
8,45
3,44
8,71±
124,13±
3,46
18,02
9,80±
125,20±
5,34
24,52
130,03±
9,82±
6,54
3,58
131,93±
9,80±
6,78
5,34
128,50±
8,09±
10,28
1,56
128,33±
6,24±
6,93
2,06
Лейкоцитарная формула
Лимфоциты, %
Нейтрофилы, %
Эозинофилы, %
Моноциты, %
83,20±
4,61
82,60±
5,17
78,90±
6,76
83,20±
6,91
76,50±
5,52
79,70±
7,09
84,90±
2,60
85,10±
4,61
14,50±
5,84
14,80±
5,09
20,00±
7,26
14,30±
6,27
20,50±
5,02
17,10±
6,67
13,00±
2,49
13,10±
4,04
1,10±
0,99
1,20±
0,92
0,60±
1,07
1,40±
1,58
0,60±
0,97
1,20±
1,23
0,70±
0,95
0,90±
0,99
1,20±
1,40
1,40±
1,26
0,50±
0,71
1,10±
0,88
2,40±
1,58
2,00±
1,25
1,40±
1,17
0,90±
0,88
83,80±
4,26
80,50±
4,03
80,00±
7,54
80,60±
5,72
76,10±
7,84
81,10±
6,38
81,00±
6,51
81,80±
8,95
14,20±
5,12
17,30±
4,08
17,30±
6,25
16,70±
5,03
20,70±
7,10
15,00±
6,50
16,60±
5,54
15,30±
7,29
0,90±
0,99
1,10±
0,88
0,40±
0,70
0,70±
0,95
1,60±
1,07
2,70±
2,06
1,20±
1,23
2,30±
2,83
1,10±
1,29
1,10±
0,88
2,30±
1,64
2,00±
2,21
1,60±
1,35
1,20±
0,79
1,20±
1,14
0,60±
0,70
M ± m - среднее арифметическое ± стандартное отклонение.
Статистически значимых различий между опытной и контрольной группами, а также до и после введения препарата не выявлено (р>0,05)
n
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
10
Оценка местного действия препарата «Дифаг», через 24 часа и 7 суток после введения
контроль кожа 24ч
кожа 24ч
паховые л/у 24ч
подколенные л/у 24ч
На гистологическое исследование были взяты мягкие ткани из места введения препарата или
раствора натрия хлорида 0,9 %, регионарные (подколенные) и паховые лимфатические узлы у 5 животных
из каждой группы, подвергнутых эвтаназии через 24 часа, и у 10 животных из каждой группы,
подвергнутых эвтаназии через 7 суток.
кожа 7сут
паховые л/у 7 сут
подколенные л/у 7 сут
контроль кожа 7сут.
Заключение
•
При местном введении препарата «Дифаг» признаков токсичности в виде тяжелых расстройств кровообращения,
альтеративных процессов (дистрофии и некроза) не выявлено ни через 24 часа, ни через 7 суток. Слабо выраженный отек
соединительной ткани в дерме через 24 часа, почти не выявляемый через 7 суток, обусловлен непосредственным
введением растворов (физиологического и «Дифаг»).
•
В паховых и подколенных лимфатических узлах через 24 часа структура сохранена, отмечается лишь умеренно
выраженный гистиоцитоз синусов.
•
Через 7 суток в паховых и подколенных лимфатических узлах наряду с гистиоцитозом синусов и расширением
герминативных центров при введении препарата «Дифаг» обнаруживаются новообразованные (аттенуированные) мелкие
лимфатические фолликулы без центров размножения. При введении физиологического раствора выявляются лишь слабо
выраженный гистиоцитоз синусов и наличие единичных плазмоцитов.
Оценка «острой» токсичности препарата «Дифаг», через 24 часа и 14 суток
после перорального и внутрибрюшинного введения
Брыжеечные и паховые лимфоузлы,
желудок, кишечник, головной мозг,
печень, пищевод, почка, сердце,
тимус, селезенка.
брыжеечные л/у 24ч
кишечник 24ч
головной мозг 24ч
контроль кишечник 24ч
В течение всего периода наблюдения за подопытными и контрольными животными не было выявлено видимых признаков
изменения общего клинического состояния: внешний вид, поведенческие реакции, двигательная активность, а также потребление
корма и воды у животных всех групп существенно не отличались и соответствовали показателям нормы для данного вида
животных. Прирост массы тела на протяжении курса введения препарата и срока наблюдения у всех групп животных был
положительным, статистически значимых различий по всем изученным показателям опытных животных по сравнению с
контрольными не установлено.
При осмотре и гистологических исследованиях внутренних органов животных патологических изменений не было выявлено.
брыжеечные л/у 14сут
кишечник 14 сут
головной мозг 14 сут
контроль кишечник 14сут.
Заключение При исследовании органов лабораторных животных (крыс) при внутрибрюшинном и пероральном введении
препарата «Дифаг» и физиологического раствора морфологических признаков острого токсического повреждения
паренхиматозных органов, желудочно-кишечного тракта, головного мозга не обнаружено. Структура исследованных тканей в
сроки 24 часа, 7 и 14 суток при введении препарата «Дифаг» и физиологического раствора соответствует нормальной
гистологической картине. В ткани печени (в портальных трактах), в единичных полях зрения в миокарде выявлены
мелкоочаговые лимфоцитарные инфильтраты, которые нельзя рассматривать как проявление иммунных реакций на введение
препарата «Дифаг», т.к. аналогичные изменения обнаружены и при введении физиологического раствора в соответствующие
сроки эксперимента.
2. При исследовании лимфоидных органов (селезенки, тимуса, брыжеечных и паховых лимфатических узлов)
особенностей иммунных реакций на введение препарата «Дифаг» не обнаружено. Их размеры и структура соответствует норме
и идентична морфологии органов при различных путях введения физиологического раствора.
3. Выявленные при морфологическом исследовании разных органов расстройства кровообращения в виде полнокровия сосудов
микроциркуляторного русла, слабо выраженного отека стромы следует рассматривать как проявление перераспределения крови в
агональном периоде при выводе животных из эксперимента.
РЕГЛАМЕНТ
ПРОИЗВОДСТВА
ПРЕПАРАТА
ДИФАГ®
Бактериофаг
ацинетобактер -синегнойный