Мальщукова А. А. Кировская государственная медицинская академия (представлено профессором А. Г. Мешандиным)

Мальщукова А. А.
ПОСТАНОВКА РЕАКЦИЙ ГИДРОЗОЛЬНОЙ АГГЛЮТИНАЦИИ ПО ТЕСТИРОВАНИЮ
ВИРУСНЫХ НОЗОЛОГИЙ НА НЕТКАНОМ МАТЕРИАЛЕ
Кировская государственная медицинская академия
(представлено профессором А. Г. Мешандиным)
В настоящее время большое значение имеет не только совершенствование имеющихся методов
выявления патогенных вирусов, попавших в организм человека, но и разработка эффективных методов
обнаружения вирусов во внешней среде. Эта проблема является важной в теоретическом и практическом
отношении, определяющей во многом характер и действенность противоэпидемических мероприятий.
Строгий паразитизм вирусов, объясняемый отсутствием собственных ферментов строительного и
энергетического метаболизма, необходимых для осуществления обмена веществ, отсутствием клеточной
организации, влечет за собой возможность размножения вирусов лишь в жизнеспособных клетках хозяина.
Во внешней среде вирусы существуют в покоящейся форме (внеклеточной), когда их свойства как
живых систем не проявляются. Этим и объясняется своеобразие методов выращивания вирусов, не растущих
на питательных средах.
Оценка санитарно - гигиенического состояния различных объектов окружающей среды: воды, почвы,
пищевых продуктов заключается в обнаружении различных микроорганизмов, в том числе и вирусов.
Однако прямое обнаружение вирусов сопряжено с рядом трудностей, связанных, во-первых, с низкой
концентрацией вирусов, которые не могут размножаться в окружающей среде, а во-вторых, с огромным
разнообразием микроорганизмов.
Подготовка исследуемого материала, взятого из окружающей среды имеет цель привести его в состояние
пригодное для посевов или для заражения животных.
Следующим этапом обнаружения вирусов является их культивирование. В настоящее время вирусы
культивируются либо в организме восприимчивых животных, либо в развивающихся куриных эмбрионах,
либо в культуре ткани [4].
Культивирование вирусов в организме восприимчивых
животных на первых этапах развития
вирусологии оказалось единственно пригодным для накопления вирусов. В вирусологической практике
используют новорожденных, чувствительных животных, поскольку они более восприимчивы к вирусной
инфекции. Методы индикации вируса в организме животного:
1. Клинические признаки болезни
2. Гибель живого организма
3. Пат. анатомические изменения органов и тканей.
Идентификация вируса проводится с помощью реакций нейтрализации, серологическими методами.
Метод овокультур (6-8 дневные куриные эмбрионы) впервые был введен в вирусологическую практику в
1931 году Вудраффом и Гудпасчером. Вирусы репродуцируются в амнеоне (вирус гриппа), хорионе (вирус
герпеса, оспы), аллантоисной оболочке (вирусы паротита, Ньюкасл, гриппа), а также в желточном мешке
(рабдовирусы, вирус герпеса). О репродукции вирусов судят по образованию на хорионаллантоисной оболочке
включений, так называемых оспин (вирусы оспы, герпеса), по гибели эмбриона, уродствам, отставании в
развитии, по результатам овоскопии: отсутствии пульсации, неподвижности эмбриона; по результатам
реакции гемагглютинации и реакции гемадсорбции.
Идентификация вирусов проводится с помощью серологического метода исследования (реакция
нейтрализации, реакция связывания комплемента). Культура клеток - это клетки живого организма,
выращенные на питательной среде;
адаптированные к условиям, обеспечивающим им
постоянное
существование in vitro и сохраняющиеся несколько десятков поколений. Идентификация вирусов проводится с
помощью характера ЦПД, по включениям, образованию вируса в ядре или в цитоплазме клеток, серологических
реакций.
Преимущество метода: универсальность, позволяющая культивировать не только зоонозные, но и
антропонозные вирусы (аденовирусы), которые могут развиваться лишь в клетках человека, и поэтому не
культивируются ни на животных, ни на курином эмбрионе. Преимущество метода культуры тканей ярко
выступают также при необходимости обнаружения вируса, находящегося в небольшом количестве в
исследуемом материале. При этом для выявления инфекционного агента приходится исследовать материал,
что затруднительно проделать путем заражения животных или куриных эмбрионов, так как требует огромного
их количества, но легко выполнимого при помощи культуры ткани.
Для индикации вируса, как упоминалось выше, используются реакции:
1. Нейтрализации вирусов. В сыворотке крови иммунизированных людей или перенесших вирусное
заболевание обнаруживают антитела, способные нейтрализовать инфекционное свойство вируса. Эти антитела
обычно выявляются при смешивании иммунной сыворотки с соответствующим вирусом с последующим
введением этой смеси восприимчивым лабораторным животным или заражением культуры клеток. На
основании выживании животного в первом случае или отсутствия цитопатического действия вируса во втором
судят о нейтрализующей силе антител.
2. Реакция связывания комплемента (РСК). Реакция разработана Ж. Борде и О. Жангу, которые
установили, что при образовании комплекса антиген - антитело происходит адсорбция комплемента.
Вследствие того, что этот процесс не определяется визуально, для выявления адсорбции (связывания)
комплемента авторы использовали
индикаторную гемолитическую систему - эритроциты барана,
сенсибилизированные гемолитической антисывороткой кролика. При внесении сенсибилизированных
эритроцитов в пробирку с исследуемой сывороткой, антигеном и комплементом гемолиз произойдет только
при наличии свободного комплемента (реакция отрицательная). В случае, если комплемент адсорбировался на
системе атиген - антитело, гемолиза не будет (реакция положительная)[2].
3. Применяются и другие методы индикации: реакция торможения гемагглютинации, реакция пассивной
гемагглютинации, иммуноферментный анализ.
В данной работе предлагается эффективный метод индикации вирусов - реакция гидрозольной
агглютинации, и метод, позволяющий сохранять результаты тестирования инфекционных нозологий
неограниченное время.
Агглютинация - явление, при котором частицы антигена во взвеси после реакции с антителом
склеиваются и оседают в виде хлопьев [1].
Механизм реакции агглютинации описывается теорией "решетки", согласно которой агглютинат
образуется при соединении одного активного центра двухвалентного антитела с детерминантной группой
одного антигена, а второго активного центра - с детерминантной группой другого антигена. Избыток или
недостаток антител препятствует проявлению агглютинации. Для постановки реакция агглютинации
используют корпускулярные антигены
(суспензии бактерий, эритроцитов). Реакция
агглютинации
недостаточна специфична и чувствительна. По данным признакам она уступает другим серологическим
реакциям.
Постановка реакции гидрозольной агглютинации.
Материалы: иммуноглобулиновые фракции против оспы, чумы плотоядных; соответствующие
гидрозоли (препараты разных серий), буферные растворы (MgCI2 0,15%; CaCI2).
Методы: постановка на стекле.
Ход работы:
1. В ряде лунок полистирольного стрипа готовили разведения сывороток в буферном растворе (магний
хлор2 0,15%), начиная с 1:10 (т.е. в первую лунку вносили 90мкл буфера и 10 мкл сыворотки, во вторую лунку
- 50 мкл буфера и 50 мкл разведения из первой лунки и т. д.) и минимальным разведением было 1: 100. Каждое
разведение делалось отдельной пипеткой. В последнюю лунку сыворотку не вносят - контрольная.
2. Делали постановку на стекле. НА предметное стекло наносили по 20 мкл соответствующей сыворотки
20 мкл гидрозоля.
3. Тщательно перемешивали полученный раствор.
4. Отмечали факт агглютинации в плюсе, либо отсутствие агглютинации в минусе. Время появления
результатов агглютинации - до 1 минуты в разведении 1:10, увеличивалось при понижении концентрации
сыворотки.
5. Делали реакцию на воспроизводимость.
Нужно отметить, что в лабораторной диагностике реакции гидрозольной агглютинации можно
применять для идентификации различных видов вирусов с помощью диагностических агглютинирующих
сывороток.
Нами была разработана новая методика - постановка реакций агглютинации с применением
гидрозольных препаратов на нетканом материале. Для постановки в качестве основы использовался
фильтрующий элемент - картон марки «КВФ». Из него готовился (вырезался) квадрат 3х3 см. На фильтрующий
элемент накладывались два квадрата поменьше (1х1см) из нетканого материала. Последние обрабатывались по
определенной методике. Таким образом, получалось многослойная основа для постановки реакции. Затем на
один из квадратов на основе наносили диагностическую туберкулезную сыворотку, на другой - сыворотку, не
содержащую антител. Реакция ставилась с одним разведением сывороток, которые в зависимости от ее титра
составляло 1:10; 1:20; 1:40; 1:80. Оптимальным оказалось разведение 1:10. Затем наносился антиген
содержащий материал - гидрозольный препарат в эквивалентных соотношениях. Результаты реакции
учитывались сразу же. Положительная реакция - плотный, компактный комплекс с четкой границей, диаметром
2-4 мм. Отрицательная реакция - распределение частиц реагирующих веществ без четкой границы. Результаты
также могут учитываться по картине на фильтрующем элементе, который используется в качестве основы.
После постановки данной реакции результаты могут храниться длительное время без сроков ограничения и
использоваться при необходимости для сравнения каких-либо результатов или для демонстрации.
Таким образом, преимуществами постановки реакции гидрозольной агглютинации на нетканом
материале являются: быстрота получения результатов, возможность хранения результатов реакции
неограниченное время, экономия времени и средств при уборке рабочих мест.
Выводы:
1. Применяя реакцию гидрозольной агглютинации, можно бесприборно определить наличие вирусов во
внешней среде.
2. Время реакции гидрозольной агглютинации - до 1 мин. В разведении 1:10, во время проведения
обычной реакции агглютинации - до 30 мин..
3. Реакцию агглютинации не используют в диагностике вирусных инфекций, что объясняется
невозможностью получения видимых глазу результатов при ее постановке с мелкими и средними по размерам
вирусами. В то время как метод гидрозольной агглютинации применим как к крупным вирусам (оспы), так и к
средним по размеру (вирус Ласса).
4. Реакция гидрозольной агглютинации исключает влияние свойств «носителей» антител (эритроцитов).
5. При помощи реакции ГА можно установить количественное содержание вируса, при помощи
определения его титра, т.е. наибольшего разведения исследуемого материала, в котором вирус еще может
быть обнаружен.
6. Метод ГА является достаточно доступным, не требующим специального оборудования, достигается
снижение стоимости проведения анализов на 80%.
7. Данный метод может быть применен для выявления аллергенов и диагностики заболевания различного
характера: инфекционных и соматических; для осуществления контроля качества ферментируемых вакцин.
8. Разработан метод, позволяющий сохранять результаты тестирования инфекционных нозологий
неограниченное время и использовать их для сравнения или для демонстрации.
По данным ВОЗ туберкулез ежегодно является причиной трех миллионов смертей во всем мире.
Ситуация осложняется повсеместным распространением лекарственно-устойчивых, в частности,
полирезистентных форм. Лабораторная диагностика туберкулеза и последующее определение лекарственной
устойчивости выделяемого возбудителя общепринятыми методами может занимать 8-9 недель. Своевременное
определение лекарственной устойчивости возбудителя имеет существенной значение для выбора
эффективной лекарственной терапии и предотвращения распространения резистентных штаммов.
В связи с этим разработка новых подходов к определению лекарственной устойчивости, сокращающих
время проведения анализов, представляется крайне актуальной.
Список литературы:
1. Попечителев Е. П. Методы иммунологических исследований.-М.,Медицина,1993.-74с.
2.Борисов. Л.
Б. Медицинская микробиология, вирусология, иммунология. - М., Медицинское
информационное агентство, 2002.-335с.
3.Тимаков В. Д. Микробиология. - М. Медицина,1983.-83с.