Вакцинами называют препараты, получаемые из ослабленных

Лицей №1553 «На Донской»
Курсовая работа
Возможность очищения дифтерийного анатоксина
с помощью каолина.
ученицы 10 кл.
Сушко Анны
Научный руководитель
Калачихина О.Д.
Москва-2000.
1
Введение.
Проблема очистки биологических препаратов является сейчас важнейшей
проблемой биотехнологии.
Дело в том, что изначально получаемые препараты содержат большое
количество посторонних веществ, которые при введении в кровь могут быть
вредны для организма. Это и чужеродные белки, вызывающие аллергическую
реакцию,
и
биологически
активные
низкомолекулярные
соединения.
Следовательно, необходимо максимально очистить препарат от примесей. При
этом способ очистки должен быть стабильным и недорогим, т.е. недорогим и по
используемым материалам, и по затратам на оплату труда персонала (метод не
может быть слишком длительным и трудоемким). Наряду с имеющимися
технологиями, постоянно осваиваются новые методы очистки с целью понижения
себестоимости и повышения качества препарата.
Все вышесказанное в полной мере относится и к дифтерийному анатоксину ⎯
анатоксину, используемому при приготовлении противодифтерийной вакцины. В
настоящее время для очистки дифтерийного анатоксина используются такие
методы, как ультрафильтрация, сорбция на активированном угле, фильтрация через
угольные фильтры. Еще один возможный метод очистки дифтерийного
анатоксина ⎯ сорбция на белой глине (каолине). Такой способ был бы дешевым и
простым в исполнении.
Целью настоящей работы являлось определить эффективность использования
для очистки дифтерийного анатоксина каолина (белой глины).
Для достижения данной цели, нами были поставлены следующие задачи:
1. изучить состав неочищенного дифтерийного анатоксина;
2. изучить влияние каолина на состав дифтерийного анатоксина;
3. сравнить результаты с результатами очистки дифтерийного анатоксина путем
фильтрации на угольном фильтре.
Обзор литературы.
Возбудитель дифтерии ⎯ дифтерийные коринебактерии.
1. Морфология.
Дифтерийные
коринебактерии
—
Corynebacterium
diphtheriae — прямые или слегка изогнутые палочки длиной 1−8 мкм и
шириной 0,3−0,8 мкм. У дифтерийных коринебактерий наблюдаются
булавовидные утолщения на концах, иногда появляются ветвистые и
нитевидные формы, а также короткие образования, почти кокковидные и
дрожжеподобные.
2. Культивирование. Возбудитель дифтерии — аэроб или факультативный
анаэроб, оптимальная температура роста 37°C (крайние границы 15 и 40°C),
pH среды 7,2−7,6; хорошо культивируется на средах, содержащих белок
(свернутая сыворотка, кровяной агар, сывороточный агар), а также на
сахарном бульоне.
3. Ферментативные свойства:
− не свертывают молоко;
− не разлагают мочевину;
− не выделяют индол;
− слабо образуют сероводород;
− восстанавливают нитраты в нитриты;
2
4. Токсинообразование. Дифтерийные коринебактерии продуцируют в
бульонных
культурах
сильные
экзотоксины
(токсины,
которые
бактериальная клетка выделяет во внешнюю среду). Дифтерийный
экзотоксин получен в кристаллическом виде. Дифтерийный токсин
неустойчив. Он легко разрушается под влиянием температуры, света и
кислорода воздуха, сравнительно резистентен к действию ультразвука. После
добавления к токсину 0,3−0,4% формалина и последующего выдерживания
при температуре 38−40°C в течение 3−4 недель происходит превращение его
в анатоксин, который обладает большей устойчивостью по отношению к
физическим и химическим воздействиям, чем исходный токсин.
5. Патогенез заболевания у человека. На месте внедрения возбудителя
дифтерии образуются пленки с большим количеством дифтерийных
бактерий и других микробов. Продуцируемый экзотоксин вызывает некроз и
дифтеритическое воспаление слизистых оболочек или кожи. Всасываясь он
поражает сердечную мышцу, надпочечники, а также центральную и
периферическую нервную систему. По локализации процесса наиболее часто
встречается дифтерия зева (90% всех заболеваний), затем дифтерия носа.
Сравнительно редко встречаются дифтерия глаз, ушей, половых органов,
кожи.
6. Иммунитет. Наиболее восприимчивы к дифтерии дети в возрасте 1-4 лет. Но
перенесение дифтерии оставляет менее прочный иммунитет, чем при других
заболеваниях детского возраста. В 6−7% случаев наблюдаются повторные
заболевания дифтерией.
7. Профилактика. Специфическую профилактику дифтерии проводят путем
активной иммунизации с помощью нескольких видов противодифтерийных
вакцин.
Вакцинами называют препараты, получаемые из ослабленных, убитых
возбудителей болезни или продуктов их жизнедеятельности и применяемые для
активной иммунизации людей и животных с целью специфической профилактики
и терапии инфекционных болезней.
Современные вакцинные препараты подразделяют на четыре группы:
1. Вакцины из живых возбудителей с ослабленной вирулентностью
изготовляют из ослабленных культур микроорганизмов, лишенных способности
вызывать заболевание, но вызывающих, по прежнему, иммунитет.. Такими
вакцинами являются вакцины против оспы, сибирской язвы, бешенства,
туберкулеза чумы, гриппа, сыпного тифа, кори и др.
2. Вакцины из убитых корпускулярных патогенных микроорганизмов
(бактерий, риккетсий, вирусов) изготовляют из микроорганизмов, убитых
физическими или химическими методами. Такими вакцинами являются
брюшнотифозная, холерная, коклюшная вакцины, а также вакцины против
клещевого и японского энцефалитов, гриппа, полиомиелита и др.
3. Вакцины из продуктов химического расщепления некоторых бактерий
(химические вакцины) состоят не из цельных клеток бактерий, а из химических
комплексов, полученных путем обработки взвеси культуры специальными
методами. Такими вакцинами являются вакцины против брюшного тифа, столбняка
и др.
3
4. Анатоксины являются продуктом специфической обработки микробных
токсинов. Микробные токсины по характеру образования делятся на экзотоксины и
эндотоксины.
Экзотоксины:
• состоят из белковых веществ, обладают свойствами ферментов, некоторые
получены в кристаллическом состоянии;
• легко диффундируют из клетки в окружающую среду;
• высокотоксичны, характеризуются избирательным поражением некоторых
органов и тканей;
• термолабильны (некоторые термостабильны);
• под действием 0,3−0,4% формалина и температуры 38−40°C переходят в
анатоксины.
Эндотоксины:
• состоят из глюцидолипиднопротеиновых комплексов, глюцидолипидных
соединений и полисахаридных специфических комплексов;
• прочно связаны с телом бактерийной клетки;
• менее токсичны, чем экзотоксины, избирательное действие выражено слабо;
• термостабильны;
• под действием формалина и температуры обезвреживаются частично.
Микробным токсинам свойственны антигенные функции. Следовательно
экзотоксины — это внеклеточные антигены. Обезвреженные 0,3−0,4% формалином
и выдержанные при 38−40°C в течение 3−4 недель экзотоксины утрачивают свои
ядовитые свойства, т.е. теряют способность вызывать заболевание, но почти
полностью сохраняют антигенные функции, что дает возможность организму
вырабатывать к ним антитела. Обезвреженные таким образом экзотоксины
получили название анатоксины.
К анатоксинам относится и противодифтерийная вакцина (есть три типа
противодифтерийных вакцин: адсорбированный дифтерийный анатоксин
(АД−анатоксин),
адсорбированный
дифтерийно-столбнячный
анатоксин
(АДС−анатоксин), адсорбированная коклюшно-дифтерийно-столбнячная вакцина
(АКДС−вакцина)).
.
Методика и материалы
В работе изучалась возможность очищения дифтерийного анатоксина с помощью
каолина (белой глины).
На первом этапе оценку влияния сорбции на каолине на состав дифтерийного
анатоксина делали визуально. Для этого в пробирке к 50мл анатоксина добавляли
20г каолина и инкубировали при комнатной температуре. Результаты сорбции
оценивали каждые 2,5ч. визуально.
Для изучения состава анатоксина до и после очистки на каолине использовали
метод гель-фильтрации. На основе стандартной методики подбирались свои
собственные параметры, подходящие для данного эксперемента.
Метод гель-фильтрации позволяет осуществить сортировку молекул по их
размеру. Смесь веществ, которую требуется разделить, наносят на
хроматографическую колонку, заполненную гранулами с порами определенного
диаметра. Крупные молекулы, размер которых превышает диаметр пор, двигаються
по колонке, не попадая внутрь гранул. Мелкие молекулы при продвижении по
4
колонке попадают в поры, следовательно, замедляется скорость их передвижения.
Таким образом молекулы выходят из колонки в порядке убывания их размеров.
Гель-фильтрацию вели дистиллированной водой на колонке с сефадексом G-75
размером 1.2 * 14 см. Для калибровки колонки (график приведен на рис.2)
использовали растворы голубого декстрана (Мв=2.000.000 дальтон), моноглобин
(Мв=17.000 дальтон) и витамина В12 (Мв=1500 дальтон). Так как дифтерийный
анатоксин имеет молекулярную массу, равную 70.000 дальтон, то максимум
выхода анатоксина из колонки будет, как следует из графика, от 20мл до21мл.
Lg Мв
6
Рис.1
калибровочный график.
4
3
14
28
40
мл
При дальнейших экспериментах на колонку наносили 1мл анатоксина и
собирали пробы по 1.8мл (начиная с 19мл). Количество белка в пробах
определялось биуретовым методом. Он основан на том, что белки и пептиды
реагируют в щелочной среде с сернокислой медью с образованием соединений,
окрашенных в фиолетовый цвет. При измерении к 1.8 мл образца добавляли 1 мл
биуретового раствора и через 30 мин. измеряли на ФЭКе количество белка в
образцах при длине волны 550 нм (зеленый светофильтр). Для контроля
использовали физ. раствор (3.5 мл физ. раствора и 2 мл биуретового раствора).
Сорбцию на каолине проводили также, как и в первый раз: добавляли к 50мл
дифтерийного анатоксина 20г каолина и инкубировали при комнатной
температуре.
По результатам экспериментов строились графики. Каждая точка на графике ⎯
среднее между значениями, полученными в двух экспериментах.
Результаты и обсуждения
Цвет неочищенного анатоксина ⎯ темно-коричневый, что вызвано, по-видимому,
наличием в препарате билирубина ⎯ вещества, входящего в состав сыворотки
крови, являвшейся питательной средой при культивировании бактерий. В
результате проведенных наблюдений было обнаружено, что после инкубации
дифтерийного анатоксина с каолином при комнатной температуре цвет раствора
меняется с темно-коричневого до желтого, что, по-видимому, указывает на
5
а
б
в
а) неочищенный анатоксин
(начало инкубации)
б) через 2,5ч.
в) через 5ч.
г) через 7,5ч.
д) через 10ч. (очищенный
анатоксин)
г
д
Рис.2
изменения окраски раствора при инкубации дифтерийного анатоксина с каолином.
сорбцию некоторых соединений (прежде всего билирубина) на каолине.
Полученные результаты приведены на рис.1. Как видно из рисунка, через 7,5ч.
процесс заканчивается, т.к. дальнейшего изменения цвета не происходит.
Затем проводилось сравнение состава неочищенного и очищенного анатоксинов.
Сначала была проведена гель-фильтрация исходного анатоксина. На
хроматограмме (см. рис.3) видно, что анатоксин выходит в виде двух пиков:
высокомолекулярный пик (белки) и низкомолекулярный с Мв<20000 дальтон
(пиптиды). Из литераруры известно, что дифтерийный анатоксин имеет
Мв=70000 дальтон. Соответственно он выходит в составе первого пика. Зона
максимального выхода анатоксина обозначена на рисунках штриховкой. Очевидно,
что в исследуемый препарат включено еще несколько белков. Цель очистки
оптическая
плотность,
%
100
80
Рис.3
Хроматограмма
исходного анатоксина.
60
40
20
250
150
70
20
5
6
2
103Мв
заключается в том, чтобы убрать лишние белки и низкомолекулярные соединения.
После сорбции на каолине, изменения в составе анатоксина оценивали по
результатам новой гель-фильтрации (см. рис.4). Из графика видно, что количество
высокомолекулярных
соединений
практически
не
изменилось,
а
низкомолекулярные примеси (Мв<20000 дальтон) отчистились достаточно хорошо.
оптическая
плотность,
%
100
Рис.4
Хроматограмма очищенного
на каолине анатоксина.
80
60
40
20
250
150
70
20
5
2
103Мв
Таким образом, получается, что после сорбции на каолине в течение 7,5ч. при
комнатной температуре в составе дифтерийного анатоксина происходят изменения:
значительно снижается количество низкомолекулярных соединений (Мв<20000
дальтон). Оценить, на сколько уменьшилось их количество, можно, сравнив
площади под соответствующими участками хроматограмм исходного
(неочищенного) анатоксина и полученного очищенного.
Приблизительно посчитанные (путем разбивания на простые фигуры) площади
равны:S1=8,64 см2 (неочищенный анатоксин), S2=5,58 см2 (очищенный анатоксин).
Разница между ними, выраженная в процентах:
S1 − S 2
⋅ 100% ≈ 35% ,
S1
то есть, количество низкомолекулярных соединений (Мв<20000 дальтон) в
дифтерийном анатоксине после сорбции на каолине снизилось примерно на 35%.
Возможно, использование других условий очистки (изменение рН среды,
температуры, времени инкубации) позволит улучшить результаты очистки
дифтерийного анатоксина при сорбции на каолине. Однако из-за недостатка
времени подобные исследования не были проведены.
7
Интересно, что при проведении в аналогичных условиях очистки с
использованием угольного фильтра (результаты, полученные Волковой Е.,
приведены на рис.5) сильно уменьшается количество балластных белков
(с Мв>70000 дальтон), но практически не меняется количество низкомолекулярных
примесей.
Исходя из этого, кажется целесообразным комбинирование, при очистке
дифтерийного анатоксина, двух методов: фильтрации через угольный фильтр для
уменьшения количества белков и сорбции на каолине для уменьшения количества
низкомолекулярных примесей.
%
100
80
60
40
20
250
150
70
20
5
2
103Мв
Рис.5
Хроматограмма очищенного на угольном фильтре анатоксина.
Выводы.
1. В состав неочищенного анатоксина входят, кроме самого анатоксина,
балластные белки и низкомолекулярные (Мв<20000 дальтон) соединения.
2. Сорбция
на
каолине
дает
возможность
снизить
количество
низкомолекулярных (Мв<20000 дальтон) соединений на 35%.
3. Использование комбинированного способа очистки, каолин + угольный
фильтр, привел бы к очень хорошему уровню очистки дифтерийного
анатоксина.
Список литературы.
1. Пяткин К.Д., Кривошеин Ю.С. Микробиология. М.: Медицина, 1980.
2. Микешин О. и др. Лабораторное руководство по хроматографическим и
смежным методам. М.: Мир, 1982.
3. Волкова Е. Возможность применения угольных фильтров для очистки
дифтерийного анатоксина. М.: Донская гимназия, 1999.
8