на правах рукописи БАГЛИКОВА Кермен Евгеньевна ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВОЯЗВЕННЫХ ЭФФЕКТОВ
реклама
1 на правах рукописи БАГЛИКОВА Кермен Евгеньевна ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОТИВОЯЗВЕННЫХ ЭФФЕКТОВ ДЕРИВАТОВ КОЛЛАГЕНА – ПРОЛИН - И ГИДРОКСИПРОЛИНСОДЕРЖАЩИХ ОЛИГОПЕПТИДОВ Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук 03.00.13 – физиология Москва – 2007 2 Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, Заведующий – доктор биологических наук, профессор А.А. Каменский Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Г.Е. Самонина доктор химических наук Ю.А. Золотарев Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор В.Б. Кошелев доктор биологических наук, Т.А. Гудашева Ведущая организация: Томский Государственный Университет Защита состоится 5 ноября 2007 г. в 15 час. 30 мин. на заседании диссертационного совета Д501.001.93 при Московском государственном университете им. М.В. Ломоносова по адресу 119992 Москва, Ленинские Горы, Биологический факультет, ауд. М-1. С диссертацией можно ознакомится в библиотеке Биологического факультета МГУ. Автореферат разослан 5 октября 2007г. Ученый секретарь совета, доктор биологических наук Б.А. Умарова 3 ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Несмотря на успехи в гастроэнтерологии, распространенность язвенной болезни по-прежнему не имеет тенденции к снижению, а возникающие осложнения зачастую угрожают жизни больного и требуют хирургического вмешательства. Поэтому большое значение отводится проблеме поддержания гомеостаза слизистой оболочки желудка (СОЖ) при воздействии на нее различных повреждающих факторов. Особое внимание уделяется роли регуляторных пептидов (РП) в процессе поддержания гомеостаза СОЖ. Современные экспериментальные исследования направлены на поиск полифункциональных препаратов, в том числе и РП, воздействующих на различные патогенетические факторы, лежащих в основе патологий желудочно-кишечного тракта, в том числе и язвенной болезни, и в наименьшей мере вызывающие побочные эффекты. Данная работа посвящена изучению поддержания гомеостаза СОЖ большим кругом представителей нового класса регуляторных пептидов – глипролинов: GPG, GPGP, PGPG, PGPGP, GPGPGP, PGPPGP, GHyp, HypG, HypGP, PGHyp, в том числе изученные ранее GP, PG, PGP. Эндогенным источником глипролинов является коллаген, содержащий значительное количество глицина, пролина и гидроксипролина. Гидролиз молекулы коллагена может приводить к образованию различных как пролин-, так и гидроксипролинсодержащих пептидов. В связи с этим, представляет интерес исследование влияния широкого круга глипролинов, являющихся фрагментами коллагена, на устойчивость слизистой оболочки желудка к действию таких повреждающих факторов как этанол и стресс, а также на формирование и заживление ацетатной язвы, то есть выявление протекторных и лечебных противоязвенных свойств этих пептидов. Изучение противоязвенных эффектов глипролинов PGP, PG и GP ранее проводились, в основном, при их внутрибрюшинном введении. В диссертационном исследовании мы рассматривали протекторные и лечебные противоязвенные эффекты различных глипролинов (ГП) как при внутрибрюшинном, так и при внутрижелудочном введении и изучали изменение величины и/или направленности влияний ГП на гомеостаз СОЖ. Из литературы (Tarnawski et al., 2005) известно, что язва желудка и воспаление тесно взаимосвязаны. Воспаление СОЖ не просто ассоциировано с язвообразованием, но часто играет важную роль, как в появлении, так и в заживлении язв. Для каждого этапа воспалительной реакции характерно преобладание той или иной клеточной популяции. Так, острые этапы воспаления (альтерация и экссудация) характеризуются преобладанием активно фагоцитирующих лейкоцитов – макрофагов и нейтрофилов. Размножение клеточных элементов (пролиферация) связано с активной деятельностью фибробластов, синтезирующих структурные 4 компоненты внеклеточного матрикса и ответственных за восстановление соединительно-тканного каркаса. В связи с этим, мы провели цитологический анализ влияния глипролинов на процессы формирования и заживления хронической язвы и экспериментальный перитонит. К сожалению, в настоящее время в литературе нет точных данных о содержании и преимущественной локализации эндогенных глипролинов, за исключением cPG, обнаруженного в мозге крыс (Гудашева и др., 1996). До конца не изучена динамика распределения глипролинов в организме при различных способах введения и пути их деградации. Возможное использование глипролинов, и, прежде всего PGP, в качестве лекарственных препаратов требует целенаправленных исследований их метаболизма. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение влияния дериватов коллагена – пролин и гидроксипролинсодержащих олигопептидов – GP, PG, PGP, GPG, GPGP, PGPG, PGPGP, GPGPGP, PGPPGP, GHyp, HypG, HypGP, PGHyp и пептидного гидролизата коллагена (ПГК) – на гомеостаз СОЖ; выяснение противовоспалительных эффектов некоторых глипролинов; изучение метаболизма PGP и его биодеградации при различных способах введения. Исходя из этого, были поставлены следующие задачи: 1. В экспериментах на животных исследовать влияние GP, PG, PGP, GPG, GPGP, PGPG, PGPGP, GPGPGP, PGPPGP, GHyp, HypG, HypGP, PGHyp на устойчивость слизистой оболочки желудка к действию таких повреждающих факторов как этанол и стресс, а также на формирование и заживление ацетатной язвы, то есть выявить протекторные и лечебные противоязвенные свойства этих глипролинов. 2. Сопоставить противоязвенные эффекты глипролинов при внутрибрюшинном (3,7 мкмоль/кг) и внутрижелудочном (0,37 и 3,7 мкмоль/кг) введениях. 3. Изучить противоязвенные свойства пептидного гидролизата коллагена (ПГК), содержащего и некоторые исследуемые нами глипролины (PG, GP, PGP и PGHyp). 4. Определить возможность противовоспалительных эффектов глипролинов при гистологическом и цитологическом исследовании формирования и заживления ацетатной язвы, и при изучении цитологического состава брюшного экссудата крыс на модели экспериментального перитонита. 5. Выяснить особенности распределение меченного тритием PGP по разным органам при внутрибрюшинном, внутрижелудочном, внутривенном и интраназальном способах введениях и его биодеградацию в крови и желудке у крыс. Научная новизна. Впервые продемонстрированы и сопоставлены гастропротекторные и лечебные свойства широкого круга глипролинов – 5 фрагментов коллагена - при внутрибрюшинном (в дозе 3,7 мкмоль/кг) и внутрижелудочном (в дозе 0,37 и 3,7 мкмоль/кг) введении на трех экспериментальных моделях язвообразования: этаноловой, стрессорной и ацетатной. Сопоставлены противоязвенные эффекты пролинсодержащих пептидов и их гидроксипролинсодержащих аналогов. Впервые проведено исследование процессов регенерации в зоне повреждения СОЖ, вызванных уксусной кислотой. Обнаружена способность глипролинов уменьшать степень воспаления в зоне язвенного дефекта в период формирования и заживления ацетатной язвы, что может быть одним из механизмов, обуславливающих их противоязвенные свойства. Последний эффект выявлен и для пептидного гидролизата коллагена. Для PGP, PG и GP на модели экспериментального перитонита показано снижение воспалительной реакции организма в ответ на внутрибрюшинное введение 1 % уксусной кислоты. Впервые исследована фармакокинетика PGP в первые минуты (3-12 минуты) после его введения. Изучено распределение меченого PGP и/или его пептидных метаболитов по органам крыс при внутрибрюшинном, внутрижелудочном, внутривенном и интраназальном введениях. Обнаружена наибольшая концентрация пептидов на 1г ткани в желудке, превышающая в несколько раз содержание в крови и других органах, что дает возможность говорить о тропности PGP и/или его метаболитов к тканям желудка. Определены пути деградации PGP в крови и в желудке при различных способах введения: основным метаболитом трипептида является GP. Практическое значение. Накопленные в течение ряда лет данные о противоязвенной активности PGP и его влиянии на различные механизмы поддержания гомеостаза слизистой оболочки желудка свидетельствуют о необходимости его предклинических исследований в качестве противоязвенного препарата. Профилактические и лечебные противоязвенные свойства показаны и для пептидного гидролизата коллагена. Это открывает перспективы поддержания гомеостаза СОЖ и его коррекции путем применения фракций белков соединительной ткани в виде пищевых добавок. Факт накопления PGP и/или его метаболитов в желудке и обнаружение их в мозге при всех способах введения предполагает возможность корректирующего влияния глипролинов как непосредственно на слизистую оболочку желудка, так и через нервные центральные и периферические механизмы поддержания гомеостаза СОЖ. Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на кафедре физиологии человека и животных МГУ (2003-2007), международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам “Ломоносов 2004” и “Ломоносов 2005”; IX Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2002); V и VI Славяно-Балтийском научном форуме (Санкт-Петербург, 6 2003 и 2004); I-II-III Российских симпозиумах по химии и биологии пептидов (Москва-Санкт-Петербург-Пущино, 2003-2005-2007); V съезде гастроэнтерологов России (Москва, «Анахарсис», 2005); I съезде физиологов СНГ (Сочи –Дагомыс, 2005); II International conference “Neurohumoral and cellular regulatory mechanisms of digestion proccesses” (Kyiv, 2005); 29 European Peptide Symposium (Gdansk, Poland, 2006); ); XX Физиологическом съезде (Москва, 2007); межинститутской конференции молодых ученых “Механизмы регуляции и взаимодействия физиологических систем организма человека и животных в процессах приспособления к условиям среды” (Санкт-Петербург, 2007); V Всероссийской конференции “Механизмы функционирования висцеральных систем” (Санкт-Петербург, 2007). Публикации: По теме диссертации опубликовано 32 работы, из них 14 – статьи. Структура и объем работы: Диссертация состоит из традиционных разделов, содержит 24 рисунка и 21 таблицу. Список литературы включает 316 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов. Общий объем диссертации - 207 страниц. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Исследуемые препараты: Gly-Pro, Pro-Gly, Pro-Gly-Pro, Gly-Pro-Gly, Gly-Pro-Gly-Pro, Pro-Gly-Pro-Gly, Pro-Gly-Pro-Gly-Pro, Gly-Pro-Gly-ProGly-Pro, Pro-Gly-Pro-Pro-Gly-Pro и пептидный гидролизат коллагена (ПГК) [Институт молекулярной генетики РАН], Gly-Hyp, Hyp-Gly [Bachem], Hyp, Hyp-Gly-Pro, Pro-Gly-Hyp [институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова]. I. Исследование противоязвенных эффектов дериватов коллагена – пролин- и гидроксипролинсодержащих олигопептидов (глипролинов). В экспериментах были использованы самцы белых беспородных крыс (этаноловая и ацетатная модели язвообразования, изучение распределения и биодеградации PGP in vivo, исследование противовоспалительной активности глипролинов) и крысы линии Wistar (стрессорная модель вызова язв) массой 200-250 грамм. Во всех случаях перед экспериментом животные подвергались 18-часовой пищевой депривации, а в случае этаноловой модели язвообразования лишались еще и воды. Все эксперименты с животными выполнялись в соответствии с этическими принципами и нормативными документами, рекомендованными Европейским научным фондом (ESF) и декларации о гуманном отношении к животным. Используемые методы повреждения СОЖ (Рис. 1): -этаноловая модель - внутрижелудочное введение 960 этанола в объеме 1 мл/200 г веса животного. Исследуемые пептиды вводили за час до ульцерогенного фактора в объеме 0,5 мл/200г веса животного внутрибрюшинно (3,7 мкмоль/кг) и внутрижелудочно (0,37 и 3,7 7 мкмоль/кг). Умерщвление животных осуществляли через час после введения этанола; -стрессорная модель - 30-ти минутное неизбегаемое плавание при tводы=21-220С. Исследуемые пептиды вводили за час до стресса по той же схеме, что и на этаноловой модели язвообразования. Животных умерщвляли через час после окончания действия стрессогенного фактора; -ацетатная модель - аппликация ледяной уксусной кислоты на серозную оболочку желудка по методу Окабе (Okabe et al., 1971). Пептиды вводили один раз в день в течение трех дней, начиная со дня аппликации внутрибрюшинно (3,7 мкмоль/кг) (исследование влияния глипролинов на формирование ацетатной язвы) и с 4-6-й дни после вызова ацетатной язвы внутрибрюшинно (3,7 мкмоль/кг) и внутрижелудочно (3,7 и 0,37 мкмоль/кг) на фоне уже сформировавшейся язвы (исследование влияния глипролинов на заживление язвы). Умерщвление животных осуществляли на 4-й или 7-й день после аппликации ледяной уксусной кислоты. Во всех экспериментах с вызовом повреждений СОЖ животные контрольной группы получали соответствующие объемы физиологического раствора. Анализ повреждений в желудках проводили сразу после умерщвления животных. Площадь повреждений подчитывали с помощью бинокулярной лупы с окулярмикрометром. Противоязвенное действие препарата оценивали по отношению площади повреждений у опытных животных к площади повреждений у контрольных крыс в процентах. В связи с тем, что в экспериментах на стрессорной модели язвообразования в контрольных группах наблюдался значительный разброс исходных данных, мы нормировали все значения (каждое значение контрольной и опытной группы делили на среднюю, принятую за 100%, величину контроля и умножали на 100%). II. Выяснение противоязвенных эффектов пептидного гидролизата коллагена. Исследование противоязвенных эффектов пептидного гидролизата коллагена (ПГК) проводили на тех же моделях язвообразования. На этаноловой и стрессорной модели вызова язв ПГК вводили внутрижелудочно в дозе 0,1 и 1 мг/кг в объеме 0,5 мл/200 грамм. На ацетатной модели ПГК вводили внутрибрюшинно и внутрижелудочно в дозе 1 мг/кг с 4-6-й дни после аппликации ледяной уксусной кислоты на фоне уже сформировавшейся язвы III. Исследование противовоспалительной активности глипролинов и пептидного гидролизата коллагена. III.1. Цитологическая оценка влияния PGP, PG и GP на формирование ацетатной язвы. После определения площади язвы ткань в районе язвенного дефекта разрезали по средней линии на 2 части. Одну часть фиксировали в 10% забуференном формалине. После фиксации препарат заливали парафином, 8 делали срезы толщиной 5-7 мкм, которые окрашивали гематоксилинэозином. Вторую часть язвы использовали для получения цитологических препаратов. На чистое обезжиренное стекло прикладывали различными участками поверхности язвы, 30 минут высушивали на воздухе, а затем фиксировали в смеси Никифорова (20-30 мин), окрашивали гематологическим красителем по Романовскому-Гимза. Полученные препараты использовали для качественной и количественной оценки степени воспаления в зоне язвенного дефекта. В каждом препарате анализировали 100-200 клеток лейкоинфильтрационного компонента. III.2. Гистологическая и цитологическая оценка влияния исследуемых глипролинов и пептидного гидролизата коллагена на заживление ацетатной язвы. Из 3-4-х желудков для каждой серии опытов со средними значениями повреждения вырезали ткань с язвой и фиксировали в растворе Карнуа (6 частей 70% этанола: 3 части хлороформа: 1 часть ледяной уксусной кислоты), который готовили непосредственно перед применением. Спустя два часа препарат помещали в 70% раствор этилового спирта. Резку на микротоме вдоль язвы (толщина 5 мкм) и окрашивание препаратов гематоксилин-эозином по стандартной методике осуществляли в НИИ Морфологии человека РАН. Каждый срез был исследован по качественным и количественным гистологическим характеристикам, таким как: клеточный состав (макрофаги, нейтрофилы и фибробласты) и стадия воспаления, а также архитектура СОЖ. Подсчет макрофагов, нейтрофилов и фибробластов проводили при увеличении х100 под иммерсией с помощью микроскопа LOMO Микмед-1, так, чтобы суммарное количество клеток было равно 100. Микрофотографии гистологических препаратов делали с помощью специальной фотоустановки OLYMPUS при увеличении х300 или х600. III.3. Исследование противовоспалительной активности PGP, PG и GP на модели экспериментального перитонита. Острую экссудативную реакцию (перитонит) у крыс (после 18часового голодания) вызывали внутрибрюшинным введением 1% раствора уксусной кислоты (1мл/100г массы тела). Исследуемые препараты и физиологический раствор вводили за 1 час до введения раствора уксусной кислоты. Через 3 часа после введения уксусной кислоты у умерщвленных животных вскрывали брюшную полость и собирали экссудат. В экссудат добавляли лимоннокислый натрий из расчета 1г/1л выпотной жидкости, чтобы предотвратить свертывание и захват в сгусток клеточных элементов (Кост, 1975). Экссудат центрифугировали («Jonan», 3500 об/мин), из осадка готовили мазки, красили и сушили на аппарате Hema-Tec 2000 фирмы Bayer. Окрашенные препараты просматривали на микроскопе (Zeiss Axiolab) с малым увеличением (объектив х100, окуляр х10) с иммерсионной системой (терпеновое масло). Микроскопическое исследование проводили, подсчитывая процентное соотношение 9 отдельных видов лейкоцитов. В расчет брали соотношение количества нейтрофилов, плазмоцитов, макрофагов и эозинофилов. IV. Изучение распределения и биодеградации PGP в организме крыс при внутрибрюшинном, внутрижелудочном, внутривенном и интраназальном введении. Получение меченого PGP Меченый тритием PGP ([3Н]PGP) был синтезирован в Институте Молекулярной Генетики РАН при использовании реакции высокотемпературного твердофазного каталитического изотопного обмена (ВТКИО), происходящей в твердых органических соединениях под действием спилловер-водорода (СВ.). Подготовка образцов для проведения хроматографического анализа биодеградации меченых пептидов. [3Н]PGP (1мКи) вводили внутрибрюшинно, внутрижелудочно, внутривенно и интраназально из расчета 1мКи на животное в объеме 200 микролитров. Животных умерщвляли через 3, 6 и 12 минут после введения пептида. Кровь собирали из яремных вен; мозг, тело желудка, сердце, часть печени и почки промывали в охлажденном физиологическом растворе, подсушивали фильтровальной бумагой и сразу замораживались в жидком азоте. Собранные образцы тканей, предварительно взвесив, гомогенизировали в 10мл ацетонитрила, содержащего 1% трифторуксусной кислоты и центрифугировали в течение 30 минут (8000об/мин). Полученный супернатант высушивали при температуре 400С в роторном испарителе. Упаренные образцы заливали 1 мл метанола и откручивали на малой центрифуге в течение 15 минут. Для сцинтилляционного анализа использовали 10 микролитров образца, которые добавляли к 5 мл сцинтиллятора Ready Gel, и определяли уровень радиоактивности на жидкостном сцинтилляционном счетчике Beckman LS9800. Процент от введенной радиоактивности рассчитывали на 1 грамм ткани органа. Анализ биодеградации пептидов с использованием ВЭЖХ Методика определения содержания меченого пептида и его метаболитов основана на определении радиоактивности хроматографических пиков соответствующих немеченых фрагментов, предварительно введенных в исследуемый образец перед разделением и выделенных по данным УФ-детекции (масса меченого пептида и его [3H]метаболитов, подвергнутых хроматографическому разделению по данной методике, слишком мала для их непосредственного наблюдения с помощью УФ-детекции). Разделение смеси пептидных фрагментов проводили методом ВЭЖХ на колонке Kromasil C18 – 5 m (4 х 150 мм) при 20оС. В качестве детектора использовали спектрофотометр Beckman модели 165 (Altex) при одновременной детекции на длинах волн 254 и 280 нм. 10 Полученные образцы пептидных экстрактов из тканей (объем 40 мкл) смешивали с 30 мкл раствора исследуемого немеченого пептида и его метаболитов (по 5 мкг каждого пептида), подвергали градиентному элюированию и определяли радиоактивность продукта каждого из пиков в сцинтилляционном счетчике. Содержание [3Н]PGP и его метаболитов в ткани определяли из данных по содержанию радиоактивности в пептидной фракции и молярной радиоактивности соответствующего фрагмента, рассчитанной из распределения метки в пептиде. ПОЛУЧЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ Повышают устойчивость слизистой оболочки желудка к действию этанола, как при внутрибрюшинном, так и при внутрижелудочном способах введения, помимо изученных ранее PG и PGP, еще GPGP и GPGPGP (Рис. 1). При внутрибрюшинном введении противоязвенные эффекты PG, PGP, GPGP и GPGPGP составили 71, 72, 64 и 60% соответственно; при внутрижелудочном (3,7 мкмоль/кг) – 83, 64, 72 и 65%. Однако в дозе 0,37 мкмоль/кг активность проявляли только PGP и GPGPGP. Следует отметить, что противоязвенные эффекты пептидов при внутрижелудочном введении, не уступали таковым при внутрибрюшинном введении, что позволяет говорить об относительной устойчивости глипролинов к действию протеаз желудочного сока. 60 50 40 30 * *** 20 ** ** 10 GPGP PGP контроль PG 0 Площадь повреждений, мм2 A GPGPGP Площадь повреждений, мм2 60 Б 50 40 30 20 10 0 *** ** *** ** *** 1 2 1 2 PG PGP 1 2 GPGP 1 2 GPGPGP Рис. 1. Противоязвенные эффекты глипролинов на этаноловой модели язвообразования при внутрибрюшинном (3,7 мкмоль/кг) (А) и внутрижелудочном (Б) введении. На этом и последующих рисунках: “1” – 3,7 мкмоль/кг, “2” – 0,37 мкмоль/кг. *P<0,05 **P<0,01 ***P<0,001 к контролю. Ни один из исследуемых гидроксипролиновых пептидов (GHyp, HypG, HypGP, PGHyp) не проявлял достоверную протекторную противоязвенную активность на этаноловой модели язвообразования ни 11 при внутрибрюшинном (3,7 мкмоль/кг), ни при внутрижелудочном (0,37 и 3,7 мкмоль/кг) введении. Стрессорные язвы, возникающие через 1 час после 30-минутного плавания животного в изолированной клетке (tводы=210С), имеют вид точечных кровоизлияний, которые в литературе рассматриваются как стрессорные язвы (Tuncel et al., 1998; Yelken et al., 1999). Среди пролинсодержащих пептидов повышали устойчивость СОЖ к действию стресса при внутрибрюшинном введении (3,7 мкмоль/кг) GP, PGP, GPGP, PGPGP, GPGPGP, PGPPGP. При внутрижелудочном введении в этой же дозе эффективно уменьшали площадь стрессорных повреждений GP, PG, PGP и GPGPGP. Тенденцию к наибольшей эффективности продемонстрировал PGP (50%), а к наименьшей - GPGPGP (33%). В дозе 0,37 мкмоль/кг противоязвенная активность выявлена для GP, PGP, GPGP и GPGPGP - 51, 57, 40 и 65% соответственно (Рис. 2Б). *** 80 60 *** ** 50 * * * 40 30 20 PGPPGP GPGPGP PGPGP GPGP 0 PGP 10 Б 90 Противоязвенный эффект, % 90 GP Противоязвенный эффект, % 100 70 100 A 80 70 60 ** *** *** ** * 50 * 40 30 20 10 0 1 1 2 1 2 1 2 PG GP PGP GPGP 1 2 GPGPGP Рис. 2. Противоязвенные эффекты пролинсодержащих глипролинов на стрессорной модели язвообразования при внутрибрюшинном (3,7 мкмоль/кг) (А) и внутрижелудочном (Б) введении. Обозначения те же, что и на рис. 1. *P<0,05 **P<0,01 ***P<0,001 Исследование влияния гидроксипролиновых пептидов на устойчивость СОЖ к действию стресса показало, что большинство из исследованных нами пептидов (GHyp, HypGP и PGHyp), за исключением HypG, обладают протекторной противоязвенной активностью на стрессорной модели язвообразования как при внутрибрюшинном (3,7 мкмоль/кг), так и при внутрижелудочном (0,37 и 3,7 мкмоль/кг) способе введения (Рис. 3). Таким образом, на стрессорной модели язвообразования, патогенез которой обусловлен преимущественно центральными механизмами 12 ульцерогенеза, противоязвенную активность при внутрибрюшинном введении из всех исследуемых пептидов проявляют: GP, PGP, GPGP, PGPGP, GPGPGP, GHyp, HypGP, PGHyp. Максимальный протекторный противоязвенный эффект – у GPGPGP (72%) и GHyp (65%), минимальный – у GPGP (27%) и PGPGP (34%). При внутрижелудочном введении в соответствующей дозе эффективнее всех уменьшают площадь стрессорных повреждений дипептид GHyp (61%) и трипептиды HypGP (59%) и PGP (50%), а в дозе 0,37 мкмоль/кг максимальная противоязвенная активность у GPGPGP – 65%, HypGP (62%) и PGP (57%). Противоязвенный эффект, % 80 70 *** *** ** 60 50 40 30 20 10 0 GHyp HypG HypGP PGHyp Противоязвенный эффект, % А 80 60 ** *** * Б * 40 20 0 -20 -40 -60 1 2 1 2 GHyp HypG 1 2 1 2 HypGP PGHyp Рис. 3. Противоязвенные эффекты гидроксипролинсодержащих глипролинов на стрессорной модели язвообразования при внутрибрюшинном (А) и внутрижелудочном (Б) введении. Обозначения те же, что и на рис. 1. *P<0,05 **P<0,01 ***P<0,001 к контролю. Итак, нами было выявлено, что устойчивость СОЖ к действию таких ульцерогенных факторов как этанол и стресс, поддерживается не всеми исследованными нами глипролинами, включая и гидроксипролины. Повышают гомеостаз СОЖ к воздействию этанола только 4 пептида, но гораздо большее число глипролинов увеличивают устойчивость СОЖ к стрессорному фактору. Эффективнее всех повышали устойчивость СОЖ к действию обоих ульцерогенных факторов (этанол и стресс) PGP и GPGPGP. Следует отметить относительную стабильность этих пептидов к действию протеаз желудочного сока. Это проявляется в том, что не только внутрибрюшинное, но и внутрижелудочное введение PGP и GPGPGP сопровождается значительным протекторным противоязвенным эффектом. 13 Площадь повреждений, мм2 Выяснив, что только некоторые глипролины повышают устойчивость СОЖ к действию ульцерогенных факторов, следовало рассмотреть, все ли исследуемые глипролины обладают лечебным противоязвенным свойством. Наиболее удобной моделью для исследования лечебных эффектов, то есть эффектов, влияющих на формирование и заживление язвы, является ацетатная модель язвообразования по методу Окабе (Okabe et al., 1971). Согласно ранее проведенным экспериментам и сведениям литературы максимальный размер ацетатной язвы выявляется к 4-м суткам с момента ее вызова (Бакаева, Самонина, 2005). Работа, выполненная совместно с С.Е. Жуйковой, показала, что на 4-й день после аппликации ледяной уксусной кислоты на серозную оболочку желудка на слизистой желудка у контрольных животных наблюдались язвы, часто с прободением, средней площадью 39,6±7,9 мм2. Внутрибрюшинное введение GP, PG и PGP в дозе 3,7 мкмоль/кг однократно в течение первых 3 – х дней сопровождалось значительным уменьшением площади язв на 67, 60, и 57 % соответственно. 50 40 30 20 * ** * PG GP PGP 10 0 контроль Рис. 4. Влияния внутрибрюшинного введения PG, GP, PGP (3,7 мкмоль/кг) на формирование ацетатной язвы. *P<0,05 **P<0,01 к контролю. Таким образом, все три пептида значительно тормозят формирование ацетатной язвы. Наибольший противоязвенный эффект выявлен для дипептида GP – 67%. Внутрибрюшинное или внутрижелудочное введение глипролинов однократно в течение 3-х дней (с 4-6-й дни после аппликации кислоты) влияет уже не на формирование язвы, а на ее заживление. У животных контрольной группы на 7-й день после аппликации ледяной уксусной кислоты на СОЖ видны одиночные язвы, чаще округлой формы; поверхность язвенного поражения отделялась от пограничной слизистой оболочки ярко выраженным демаркационным воспалительным валиком. В некоторых случаях на дне язвенных кратеров обнаруживалось гнойно-некротическое содержимое. У животных контрольной группы в 14 20% случаев отмечались спайки с близлежащими органами, чаще всего с печенью. Внутрибрюшинное (3,7 мкмоль/кг) или внутрижелудочное (0,37 и 3,7 мкмоль/кг) введение всех исследуемых нами глипролинов приводило к ускорению заживления ацетатной язвы. Наибольшим лечебным противоязвенным эффектом среди всех исследуемых пептидов при внутрибрюшинном введении (3,7 мкмоль/кг) обладали GP (96%), GHyp (69%) и HypG (62%); при внутрижелудочном введении в дозе 3,7 мкмоль/кг – PGPG (62%), PGPPGP (62%) и PGHyp (59%); при внутрижелудочном введении в дозе 0,37 мкмоль/кг – GPGP (79%), GHyp (73%) и PGP (72%). Необходимо подчеркнуть очень высокую степень достоверности результатов, которая для большинства глипролинов была меньше, чем 0,001. * ** * GPGP *** GPG 30 *** ** 20 10 PGHyp HypGP HypG GHyp PGPPGP GPGPGP PGPGP PGPG PGP PG GP 0 контроль Площадь повреждений, мм2 40 Рис. 5. Влияние трехдневного (4-6-й дни) внутрибрюшинного введения глипролинов (3,7 мкмоль/кг) на заживление ацетатной язвы. *P<0,05 **P<0,01 ***P<0,001 к контролю. Таким образом, на ацетатной модели язвообразования эффективны все исследуемые нами глипролины, тогда как на этаноловой и стрессорной моделях язвообразования противоязвенный эффект проявляли далеко не все пептиды. Это может быть связано с различными механизмами патогенеза этаноловой, стрессорной и ацетатной модели вызова язв. Однако следует учесть, что при исследовании протекторных противоязвенных эффектов глипролинов пептиды вводили однократно, тогда, как при изучении лечебных эффектов все исследуемые пептиды вводили не менее 3-х раз. 15 Площадь повреждений, мм2 35 30 *** 25 20 15 10 5 PGHyp HypG HypG GHyp PGPPGP GPGPGP PGPGP PGPG GPGP GPG PGP PG GP контрол 0 Рис. 6. Влияние трехдневного (4-6-й дни) внутрижелудочного введения глипролинов (0,37 и 3,7 мкмоль/кг) на заживление ацетатной язвы. - 3,7 мкмоль/кг - 0,37 мкмоль/кг ***P<0,001 к контролю. Как отмечалось ранее в обзоре литературы, большинство из исследованных пептидов являются фрагментами коллагена. Поэтому в следующих сериях экспериментов мы изучали возможность пептидного гидролизата коллагена повышать устойчивость СОЖ к воздействию этанола и стресса и ускорять заживление уже сформировавшейся язвы. Пептидный гидролизат коллагена, полученный кислотным гидролизом 4М соляной кислотой образцов желатина при повышенной температуре, содержит тридцать 2-4-членных индивидуальных пептидов с молекулярными массами 174-420 Да, таких как PGP, PG, GP, HypGP и др. Внутрижелудочное введение ПГК в дозе 1 мг/кг приводило к значительному снижению площади как этаноловых (81,5%), так и стрессорных повреждений (50%) (Рис. 7). На стрессорной модели язвообразования противоязвенная активность выявлена и для меньшей дозы гидролизата – 0,1 мг/кг. Полученные результаты свидетельствуют о возможном двунаправленном влиянии ПГК как на центральные, так и на периферические механизмы поддержания гомеостаза СОЖ. Следует предположить, что высокая активность гидролизата на этаноловой модели обусловлена вкладом именно пролинсодержащих пептидов, таких как PGP и PG, а не гидроксипролиновых пептидов, которые на данной модели язвообразования не обладали протекторной противоязвенной активностью. Не исключено, что в противоязвенной активности ПГК принимают участие не только упомянутые выше глипролины, но и другие пептиды гидролизата коллагена, противоязвенная активность которых на данный момент еще не изучена. А 90 75 60 45 30 ** 15 0 контроль ПГК (0,1мг/кг) Площадь повреждений, мм2 Площадь повреждений, мм2 16 ПГК (1мг/кг) Б 1,5 1 0,5 ** *** 0 контроль ПГК (0,1мг/кг) ПГК (1 мг/кг) Рис. 7. Влияние внутрижелудочного введения ПГК (0,1 и 1 мг/кг) на этаноловое (А) и стрессорное (Б) язвообразование. **P<0,01 ***P<0,001 к контролю. А 30 25 20 * 15 10 5 0 контроль ПГК (1мг/кг) Площадь повреждений, мм2 Площадь повреждений, мм2 Были исследованы и лечебные противоязвенные эффекты ПГК. Пептидный гидролизат в дозе 1 мг/кг, как при внутрибрюшинном, так и при внутрижелудочном введении с 4-6-й дни с момента вызова ацетатной язвы, почти вдвое уменьшает её площадь по сравнению с контролем. Б 40 35 30 25 20 15 10 5 0 *** контроль ПГК (1мг/кг) Рис. 8. Влияние внутрибрюшинного (А) и внутрижелудочного (Б) введения ПГК в дозе 1 мг/кг на заживление ацетатной язвы. *P<0,05 ***P<0,001 к контролю. Таким образом, пептидный гидролизат коллагена не только повышает устойчивость СОЖ к действию этанола и стресса, но и проявляет лечебную противоязвенную активность, которая практически не уступает таковой у глипролиновых пептидов. Известно, что в клинической практике гастроэнтерологов очень часто возникает необходимость воздействовать на процессы регенерации в гастродуоденальной зоне, способствуя прекращению процесса воспаления (Логинов и др., 1998; Торопова, 2006). Терапия язвенной болезни желудка направлена не только на восстановление эпителиального слоя слизистой поверхности и подлежащей соединительной ткани, но и структурных 17 Количество нейтрофилов, % элементов стенки желудка, и, прежде всего, на восстановление базальных мембран и внеклеточного матрикса. Все это может быть достигнуто путем усиления миграции и пролиферации коллаген-продуцирующей способности клеток. В следующих сериях экспериментов мы провели гистоморфологическое и цитологическое исследование влияния глипролинов и пептидного гидролизата коллагена на формирование и заживление ацетатной язвы. Оценка с помощью цитограмм степени выраженности воспалительного процесса в зоне язвенного дефекта показала, что на 4-й день после индукции язв у контрольных животных в цитологических отпечатках обнаруживались лимфоциты и нейтрофилы, с преобладанием последних. В цитограммах, полученных от животных, которым вводили PGP и GP (Рис. 9), количество нейтрофилов было достоверно меньше по сравнению с контролем, что свидетельствует о снижении воспаления в области язвенного дефекта и, вероятно, может объяснить способность этих 2-х пептидов в значительной степени замедлять формирование ацетатной язвы. Для PG не было выявлено подобной зависимости: возможно, способность PG замедлять формирование язвы, в меньшей степени связана с влиянием на клеточный (нейтрофильный) компонент ацетатной язвы. 60 50 40 * * 30 20 10 0 контроль PGP PG GP Рис. 9. Влияние PGP, PG и GP на количество нейтрофилов в цитологических препаратах отпечатков с поверхности ацетатных язв. *P<0,05 к контролю. На гистологических препаратах ацетатной язвы контрольных животных, полученных на 7-й день после аппликации уксусной кислоты, наблюдалось разрушение эпителия и подлежащих тканей вплоть до гладкомышечного слоя. Цитологический анализ выявил, что наиболее многочисленными клетками в области язвенного дефекта являются нейтрофилы – до 61 (из 100 клеток); фибробластов, соответствующих стадии пролиферации, было почти в два раза меньше (до 34 из 100 клеток). В гистологических препаратах срезов язвы у опытных животных, вне зависимости от водимого препарата (PGP, GPG, GPGP, PGPGP, GPGPGP, GHyp, HypG, HypGP и ПГК), зачастую наблюдали полную регенерацию эпителия и желез СОЖ. Цитологический анализ выявил на месте 18 ПГК GPGPGP PGPGP GPGP GPG PGP HypGP HypG GHyp Hyp *** Б ПГК GPGPGP PGPGP GPGP GPG PGP HypGP HypG GHyp контроль *** Hyp 80 70 60 50 40 30 20 10 0 А контроль Макрофаги/100 клеток 6 5 4 3 2 1 0 Фибробласты/100 клеток регенерирующей слизистой в наибольшем количестве фибробласты, продуцирующих коллаген и другие компоненты внеклеточного матрикса, что свидетельствует о преобладании регенераторных процессов по сравнению с контролем (Рис. 10). 70 *** 60 50 40 30 20 10 ПГК GPGPGP PGPGP GPGP GPG PGP HypGP HypG GHyp Hyp 0 контроль Нейтрофилы/100 клеток В Рис. 10. Влияние трехдневного (4-6-й дни) внутрижелудочного введения глипролинов (3,7 мкмоль/кг) и ПГК (1 мг/кг) на количество макрофагов (А), фибробластов (Б) и нейтрофилов (В) в цитологическом препарате ацетатной язвы крысы. ***P<0,001 к контролю. 19 Таким образом, на фоне введения глипролинов и пептидного гидролизата коллагена значительно снижалось количество нейтрофилов и увеличивалось количество фибробластов, что свидетельствует о преобладании регенераторных процессов, обеспечивающих восстановление соединительно-тканного каркаса. Это достигается также и путем ускорения процессов очищения зоны повреждения от некротических масс, образования грануляционной ткани и скорости эпителизации язвенных дефектов. Обнаруженный на ацетатной модели язвообразования противовоспалительный эффект глипролинов был подтвержден нами и на модели экспериментального перитонита, вызванного внутрибрюшинным введением 1% уксусной кислоты. Обобщенные результаты по исследованию противоязвенной активности пептидов на всех исследуемых нами моделях язвообразования представлены в таблице 1. Таблица 1. Противоязвенная активность исследуемых глипролинов на 3-х экспериментальных моделях язвообразования. Пептид Этаноловая в/б в/ж 3,7 3,7 0,37 в/б 3,7 Стрессорная в/ж 3,7 0,37 в/б 3,7 Ацетатная в/ж 3,7 0,37 GP 0 0 + + + +++ PG +++ +++ 0 0 + + PGP +++ ++ ++ + + ++ + GPG 0 0 0 0 0 0 + GPGP ++ +++ 0 + 0 + + PGPG 0 0 0 0 0 0 0 PGPGP 0 0 0 + 0 0 + GPGPGP ++ ++ ++ +++ + ++ ++ PGPPGP 0 0 0 + 0 0 ++ GHyp 0 0 0 ++ ++ + ++ HypG 0 0 0 0 0 0 ++ HypGP 0 0 0 ++ ++ ++ ++ PGHyp 0 0 0 ++ + 0 ++ Примечание: противоязвенный эффект от 25-50% - “+”. противоязвенный эффект от 51-70% - “++”. противоязвенный эффект > 70% - “+++”. отсутствие противоязвенных эффектов - “0”. противоязвенная активность исследована не была – “-” ++ + + + + ++ ++ + ++ ++ + + ++ + ++ +++ + +++ + + + + +++ ++ + ++ 20 Как видно из представленной таблицы, противоязвенным эффектом на 3-х моделях язвообразования обладают только PGP и GPGPGP. Просматривается тенденция к несколько большей эффективности GPGPGP при внутрибрюшинном введении, по сравнению с PGP, тогда как трипептид проявляет более выраженный лечебный противоязвенный эффект при внутрижелудочном введении в маленькой дозе (0,37 мкмоль/кг). Если сопоставить эффективность этих двух пептидов в перспективе создания противоязвенного препарата, то, преимущество должен иметь препарат, способствующий более быстрому заживлению язвы при пероральном введении даже в минимально используемой дозе, то есть PGP. В настоящем исследовании были изучены особенности распределения PGP и/или его метаболитов между органами, биодеградация трипептида, возможность проникновения PGP и его метаболитов через гематоэнцефалический барьер при различных способах введения. Меченный тритием PGP, синтезированный в ИМГ РАН, вводили внутривенно, внутрижелудочно, интраназально и внутрибрюшинно. Фармакокинетику и биодеградацию пептида исследовали через 3, 6 и 12 минут. Исследования распределения трипептида показали, что [3H]PGP обнаруживается в крови и исследуемых органах (мозге, желудке, сердце, печени и почках) уже через 3 минуты при всех способах введения. Обращает на себя внимание факт высокого содержания меченого [3H]PGP в желудке: практически для всех временных интервалов содержание PGP и/или его метаболитов в тканях желудка значительно превышает концентрацию пептида в крови и других исследуемых органах в 2-150 раз. Этот эффект легко объясняется для внутрижелудочного введения, когда пептиды поступают непосредственно в данный орган. Частичное сглатывание препарата при интраназальном введении может также приводить к значительному увеличению радиоактивности в желудке. Обнаружение радиоактивной метки в мозге при всех способах введения свидетельствует о проникновении PGP и/или его метаболитов через гематоэнцефалический барьер и участии центральных механизмов в регуляторных влияниях пептидов. Выявленные центральные эффекты глипролинов (влияние на стрессогенные нарушения поведения крыс, противоязвенные эффекты на стрессорной модели язвообразования) (Бадмаева и др., 2005) подтверждают это. Наиболее эффективным по отношению к тканям мозга является внутрибрюшинный и внутривенный способы введения, обеспечивающие максимальное содержание метки в мозге (0,02-0,03% от всего введенного пептида на 1 грамм ткани), меньше всего пептида проникает в мозг при внутрижелудочном способе введения. 21 Таблица 2. Распределение [H]3PGP в организме крысы внутрижелудочном (в/ж), внутрибрюшинном (в/б), интраназальном (и/н) и внутривенном (в/в) способах введения (в % от введенной радиоактивности на грамм ткани). Введение Время, мин кровь мозг В/В В/Ж И/Н В/Б 3 6 12 3 6 12 3 6 12 3 6 12 0,200 0,110 0,100 0,004 0,020 0,040 0,010 0,100 0,030 0,100 0,100 0,100 0,010 0,010 0,020 0,010 0,002 0,003 0,004 0,020 0,010 0,010 0,020 0,030 желудок сердце печень почки 0,230 0,200 0,200 0,600 0,600 0,200 0,100 0,100 0,100 0,300 0,300 0,200 0,040 0,040 0,030 0,010 0,060 0,030 0,004 0,020 0,020 0,100 0,030 0,100 0,040 0,040 0,100 0,010 0,040 0,010 0,003 0,010 0,030 0,200 0,100 0,100 0,800 0,300 0,300 0,004 0,100 0,020 0,010 0,010 0,020 0,100 0,200 0,500 Хроматографический анализ пептидной фракции желудка крысы показал, что для выбранного интервала времени в образцах крови присутствуют как исходный трипептид, так и его дипептидные метаболиты – PG и GP. Через три минуты после введения [H]3PGP в желудке крысы обнаруживается, в основном целая молекула трипептида. Биодеградация пептида в желудке протекает с преимущественным образованием дипептида GP. PG образуется в 4-10 раз меньше. Следует отметить, что и через 12 минут обнаруживается целая молекула PGP, что свидетельствует об относительной устойчивости трипептида (Таблица 3). Таблица 3 Биодеградация меченного тритием PGP in vivo в желудке крысы при четырех способах введения Способ введения Время, мин Концентрация пептида, нМоль PG GP PGP 3 0,11 1,20 6,50 6 0,82 3,20 4,10 ВВ 12 0,38 2,40 1,60 3 0,36 4,10 15,20 6 1,20 7,20 9,40 ВЖ 12 0,82 6,70 4,80 3 0,20 0,94 3,80 6 0,45 1,80 2,20 ИН 12 0,30 1,40 0,82 3 0,21 1,20 7,50 6 1,30 4,10 4,80 ВБ 12 0,65 2,90 2,50 В крови биодеградация PGP протекает сходным образом. 22 Основываясь на полученных результатах можно предположить, что высокая протекторная противоязвенная активность PGP на этаноловой модели язвообразования связана с воздействием на СОЖ именно целой молекулы трипептида, а не ее метаболитов, так как GP не влияет на площадь этаноловых повреждений, а PG образуется в малом количестве, недостаточном, для проявления протекторной противоязвенной активности. На стрессорной и ацетатной модели вызова язв противоязвенный эффект PGP складывается, скорее всего, из собственной противоязвенной активности и таковой GP. Накопление пептида и/или его метаболитов в желудке дает возможность предположить, что протекторные эффекты пептидов, также как и их терапевтическое влияние на уже развившуюся язву, могут осуществляться в результате прямого воздействия на СОЖ. ЗАКЛЮЧЕНИЕ Глипролины – фрагменты коллагена, состоящие из глицина, пролина и/или гидроксипролина – неоднозначно влияют на гомеостаз слизистой оболочки желудка. Наши эксперименты продемонстрировали, что представители семейства глипролинов PGP и GPGPGP обладают выраженным защитным и лечебным действием в отношении повреждений СОЖ, что было показано на этаноловой, стрессорной и ацетатной моделях вызова язв. Высокая противоязвенная активность на всех моделях язвообразования выявлена и для пептидного гидролизата коллагена. Факт накопления PGP и/или его метаболитов в желудке и обнаружение их в мозге при всех способах введения предполагает возможность корректирующего влияния глипролинов как непосредственно на слизистую оболочку желудка, так и через нервные центральные и периферические механизмы поддержания гомеостаза СОЖ. Исследование процессов регенерации в зоне повреждения СОЖ, вызванных уксусной кислотой, выявило способность глипролинов уменьшать степень воспаления в зоне язвенного дефекта в период формирования и в период заживления ацетатной язвы, что может быть одним из механизмов, обуславливающих их противоязвенные свойства на данной модели язвообразования. Последний эффект выявлен и для пептидного гидролизата коллагена. Для PGP, PG и GP на модели экспериментального перитонита показано снижение воспалительной реакции организма в ответ на внутрибрюшинное введение 1 % уксусной кислоты. Приведенные нами экспериментальные данные позволяют рассматривать глипролиновые и гидроксипролиновые фрагменты коллагена в качестве важных эндогенных регуляторов состояния СОЖ. Очевидна необходимость дальнейшего углубленного изучения этой регуляторной системы, как в фундаментальном, так и прикладном плане с 23 перспективой создания противоязвенных минимальными побочными эффектами. 1. 2. 3. 4. 5. 6. препаратов, обладающих ВЫВОДЫ Глипролины – фрагменты коллагена, состоящие из глицина, пролина и/или гидроксипролина – неоднозначно влияют на гомеостаз слизистой оболочки желудка. Протекторным противоязвенным эффектом, как при внутрибрюшинном, так и внутрижелудочном способах введения из вновь исследуемых глипролинов на этаноловой модели язвообразования обладают GPGP и GPGPGP, а повышают устойчивость СОЖ к действию стресса GPGP, GPGPGP, GHyp, HypGP и PGHyp. Все исследованные глипролины GPG, GPGP, PGPG, PGPGP, GPGPGP, PGPPGP, GHyp, HypG, HypGP и PGHyp, включая PG, GP и PGP, ускоряют заживление ацетатной язвы, проявляя лечебное противоязвенное действие, как при внутрибрюшинном, так и при внутрижелудочном способах введения. Сопоставление противоязвенной активности всех исследуемых глипролинов на 3-х моделях язвообразования показало, что наиболее стабильные противоязвенные эффекты проявляют пептиды PGP и GPGPGP. Высокая протекторная и лечебная противоязвенная активность на всех моделях язвообразования, сопоставимая с эффектами PGP и GPGPGP, выявлена и у пептидного гидролизата коллагена. Цитологический анализ клеток в зоне язвенного дефекта у животных, получавших внутрижелудочно один из глипролинов (PGP, GPG, GPGP, PGPGP, GPGPGP, GHyp, HypG и HypGP) и пептидный гидролизат коллагена, на 7-й день после вызова ацетатной язвы выявил значительное увеличение числа фибробластов и снижение числа нейтрофилов и макрофагов, что позволяет говорить о способности глипролинов ускорять регенераторные процессы в области ацетатной язвы. Изучение распределения меченного тритием PGP и/или его пептидных метаболитов при внутрибрюшинном, интраназальном, внутрижелудочном и внутривенном способах введения показало, что наибольшая концентрация пептидов на 1г ткани, превышающая в несколько раз содержание в крови и других исследуемых органах, характерна для желудка. Основным метаболитом PGP в крови и желудке является дипептид GP. Список работ, опубликованных по теме диссертации 1. Самонина Г.Е., Жуйкова С.Е., Бадмаева К.Е. Влияние коротких глипролинов на ацетатное язвообразование у крыс // Материалы 4-го Российского научного форума “Санкт-Петербург – Гастро-2002” // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. 2002. № 2-3. С. 385. 2. Самонина Г.Е., Мясоедов Н.Ф., Жуйкова С.Е., Бакаева З.В., Бадмаева К.Е., Павлов Т.С., Ашмарин И.П. Особенности противоязвенного действия 24 различных глипролинов и других пептидов, содержащих глипролины // Тезисы докладов IX Российского национального конгресса «Человек и лекарство». 2002. С. 690-691. 3. Бакаева З.В., Бадмаева К.Е., Сергеев И.Ю. Самонина Г.Е. Влияние глипролинов на норадреналиновый тонус изолированного кольцевого сегмента аорты крысы // БЭБиМ. 2003. Т. 135. № 4. С. 390-393. 4. Жуйкова С.Е., Бадмаева К.Е., Самонина Г.Е., Плесская Л.Г. Семакс и некоторые глипролиновые пептиды ускоряют заживление ацетатных язв // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2003. № 2. С. 86-91. 5. Бадмаева К.Е., Васьковский Б.В., Самонина Г.Е. Сопоставление противоязвенного действия дипептидов, содержащих пролин и оксипролин, на стрессорной модели язвообразования // Материалы 5-го Российского научного форума “Санкт-Петербург – Гастро-2003” // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. 2003. № 2-3. С. 79. 6. Бадмаева К.Е., Васьковский Б.В., Копылова Г.Н., Самонина Г.Е. Сопоставление противоязвенного действия дипептидов, содержащих пролин или гидроксипролин, на этаноловой и стрессорной моделях язвообразования // В кн.: Российский симпозиум по химии и биологии пептидов. Тезисы докладов. 2003. С. 59. 7. Бакаева З.В., Бадмаева К.Е., Желязник Н.Я., Самонина Г.Е. Протекторный эффект внутрибрюшинного и внутрижелудочного введения PGP пептида на этаноловое эрозирование и ацетатное язвообразования у крыс // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2004. № 4. С. 82-84. 8. Бакаева З.В., Бадмаева К.Е., Желязник Н.Я., Самонина Г.Е. Определение оптимального временного интервала для проявления противоязвенных свойств PGP на этаноловой модели язвообразования у крыс // Вестник Московского Университета. Серия 16, биология. 2004. № 3. С. 22-24. 9. Жуйкова С.Е., Бадмаева К.Е., Бакаева З.В., Самонина Г.Е. Противоязвенные эффекты трипептида PGP и его возможных метаболитов - PG,GP, глицина и пролина - на разных моделях вызова язв у крыс // Известия Академии Наук. Серия биологическая. 2004. № 5. С. 585-587. 10. Золотарев Ю.А., Бадмаева К.Е., Самонина Г.Е. Противоязвенные эффекты пептидного гидролизата коллагена // Материалы 6-го Российского научного форума “Санкт-Петербург – Гастро-2004” // Гастроэнтерология Санкт-Петербурга. 2004. № 2-3. С. 173. 11. Бадмаева К.Е., Самонина Г.Е., Васьковский Б.В., Платонова Р.Д. Сопоставление противоязвенного действия пептидов, содержащих пролин или гидроксиролин на этаноловой и стрессорной моделях язвообразования // Вестник Московского Университета. Серия 16, биология. 2004. № 4. С. 7-9. 12. Бадмаева К.Е., Самонина Г.Е., Золотарев Ю.А., Зверкова Ю.Б. Влияние пептидного гидролизата коллагена на заживление ацетатных язв у крыс // Тезисы V съезда гастроэнтерологов России. Москва. «Анахарсис». 2005. С.6-7. 25 13. Бадмаева К.Е. Влияние желатина на этаноловое и стрессорное язвообразование у крыс // Материалы международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам «Ломоносов-2004». Москва. 2004. С.10. 14. Самонина Г.Е., Бадмаева К.Е., Бакаева З.В., Васьковский Б.В., Ашмарин И.П. Роль гидроксипролиновых пептидов в реализации противоязвенных эффектов коллагена и его пептидного гидролизата // В кн.: II Российского симпозиума по химии и биологии пептидов. Тезисы докладов. 2005. С. 108. 15. Золотарев Ю.А., Бадмаева К.Е., Бадмаева С.Е., Самонина Г.Е., Копылова Г.Н., Дадаян А.К.,Васьковский Б.В., Ашмарин И.П. Короткие пептидные фрагменты коллагена, обладающие противоязвенной активностью // В кн.: II Российского симпозиума по химии и биологии пептидов. Тезисы докладов. 2005. С. 51. 16. Самонина Г.Е., Бакаева З.В., Бадмаева К.Е., Труфанова А.В., Андреева Л.А., Климова П.А. Эндогенные и синтетические глипролины и гомеостаз слизистой оболочки желудка // Научные труды I съезда физиологов СНГ. Сочи - Дагомыс. 2005. Т. 2. № 58. С.22. 17. Samonina G.E., Ashmarin I.P., Badmaeva K.E., Bakaeva Z.V., Vas’kovskiji B.V., Zolotarev Y.А. Role of Collagen Fragments in Gastric Homeostasis // II Internal. Conf. @Neuro-humoral and cellular regulatory mechanisms of digestion processes. Kiev Abstract book. 2005. P. 33. 18. Ашмарин И.П., Самонина Г.Е., Бадмаева К.Е., Бакаева З.В. Регуляторные фрагменты коллагена в гомеостазе слизистой оболочки желудка // Успехи физиологических наук. 2006. Т. 37. № 2. С. 11-18. 19. Золотарев Ю.А., Бадмаева К.Е., Бакаева З.В., Самонина Г.Е., Копылова Г.Н., Дадаян А.К., Зверков Ю.Б., Васьковский Б.В., Ашмарин И.П., Мясоедов Н.Ф. Короткие пептидные фрагменты коллагена, обладающие противоязвенной активностью // Биоорганическая химия. 2006. Т. 32. № 2. С. 89-94. 20. Золотарев Ю.А., Дадаян А.К., Долотов О.В., Козик В.С., Кост Н.В., Соколов О.Ю., Дорохова Е.М., Мешавкин В.К., Габаева М.В., Андреева Л.А., Алфеева Л.Ю., Павлов Т.С., Бадмаева К.Е., Бадмаева С.Е., Бакаева З.В., Самонина Г.Е., Копылова Г.Н., Васьковский Б.В., Гривенников И.А., Зозуля А.А. Равномерно меченные тритием пептиды в исследованиях по специфическому связыванию и биодеградации in vivo и in vitro // Биоорганическая химия. 2006. Т. 32. № 2. С. 80-88. 21. Zolotarev Y.A., Vaskovsky B.V., Badmaeva K.E., Dadayan A.K., Zverkov Y.B., Garanin S.K., Ashmarin I.P. Short peptide fragments with antiulcer activity from a collagen hydrolisate // 29 Europe Peptide Symp. 2006. Gdansk. Poland. P. 36. 22. Багликова К.Е., Труфанова А.В., Бакаева З.В., Самонина Г.Е., Андреева Л.А., Климова П.А., Васьковский Б.В. Влияние гидроксипролин и пролинсодержащих глипролинов на этаноловое язвообразование // Вестник Московского Университета. Серия 16, биология. 2007. в печати. 26 23. Труфанова А.В., Багликова К.Е., Бакаева З.В., Самонина Г.Е., Гусева А.А. Гистоморфологические особенности ускорения заживления ацетатных язв глипролинами // БЭБиМ. 2007. Т. 144. № 8. С. 226-229. 24. Бадмаева К.Е., Бакаева З.В., Труфанова А.В., Самонина Г.Е. Гистологические характеристики заживления ацетатной язвы желудка крыс глипролиновыми пептидами // XX Съезд Физиологического общества имени И.П. Павлова. 2007. С. 113. 25. Багликова К.Е. Влияние пептида PRO-GLY-PRO на устойчивость крыс к острой гипобарической гипоксии // Межинститутская конференция молодых ученых «Механизмы регуляции и взаимодействия физиологических систем организма человека и животных в процессах приспособления к условиям среды». Санкт-Петербург. 2007. 26. Самонина Г.Е., Копылова Г.Н., Багликова К.Е., Эдеева С.Е., Бакаева З.В., Умарова Б.А., Труфанова А.В. Периферические и центральные механизмы поддержания гомеостаза слизистой оболочки желудка // Механизмы функционирования висцеральных систем. Санкт-Петербург. 2007. 27. Эдеева С.Е., Багликова К.Е., Копылова Г.Н., Самонина Г.Е., Умарова Б.А., Бакаева З.В., Платонова Р.Д. Влияние пептида Pro-Gly-Pro на устойчивость крыс к острой гипобарической гипоксии и постгипоксические нарушения поведения // Вестник Московского Университета. Серия 16, биология. 2007. в печати. 28. Ашмарин И.П., Багликова К.Е., Эдеева С.Е., Золотарев Ю.А., Козик В.С., Дадаян А.К., Дорохова Е.М., Алфеева Л.Ю., Андреева Л.А., Копылова Г.Н., Павлов Т.С., Васьковский Б.В., Соколов О.Ю., Кост Н.В., Зозуля А.А., Самонина Г.Е., Мясоедов Н.Ф. Сравнение распределения глипролинов в тканях крысы при разных способах введения // Биоорганическая химия. в печати. 29. Самонина Г.Е., Андреева Л.А., Багликова К.Е., Бакаева З.В., Гусева А.А., Васьковский Б.В., Копылова Г.Н., Труфанова А.В., Умарова Б.А. Исследование противоязвенного действия глипролинов // III Российский симпозиум “Белки и пептиды”. Пущино. 2007. С. 87. 30. Бакаева З.В., Самонина Г.Е., Умарова Б.А, Копылова Г.Н., Гончарова Е.Л., Багликова К.Е. Исследование противовоспалительных свойств глипролинов на экспериментальной модели острого перитонита у крыс // Цитокины и воспаление. 2008. № 1. 31. Копылова Г.Н., Самонина Г.Е., Эдеева С.Е., Багликова К.Е., Умарова Б.А., Платонова Р.Д. Влияние пептида PGP на устойчивость крыс к острой гипобарической гипоксии и постгипоксические нарушения поведения // III Российский симпозиум “Белки и пептиды”. Пущино. 2007. С. 77. 32. Zolotarev Y.A., Vaskovsky B.V., Samonina G.E., Badmaeva K.E. et al. Short peptide fragments with antiulcer activity from a collagen hydrolizate // 2007. Peptides 2006, Proceedings of the 29th European Peptide Symposium (“Kenes International”). P. 660-661.
