На правах рукописи Блохина Елена Александровна
реклама
На правах рукописи Блохина Елена Александровна Конструирование вирусоподобных частиц на основе корового белка вируса гепатита В и M2 белка вируса гриппа как основы новых противогриппозных вакцин 03.01.03 – молекулярная биология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва - 2013 Работа выполнена в лаборатории систем молекулярного клонирования Федерального государственного бюджетного учреждения науки Центра «Биоинженерия» Российской академии наук Научный руководитель: кандидат биологических наук Куприянов Виктор Васильевич Официальные оппоненты: Колесанова Екатерина Федоровна, доктор биологических наук, профессор, Федеральное государственное бюджетное учреждение "Научно-исследовательский институт биомедицинской химии имени В.Н. Ореховича" Российской академии медицинских наук, заведующая лабораторией пептидной инженерии. Иванов Петр Алексеевич, кандидат биологических наук, Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова", Биологический факультет, кафедра вирусологии, ведущий научный сотрудник. Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН Российской академии наук Защита диссертации состоится «12» декабря 2013 г. в 11.00 часов на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова» по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, МГУ, д.1, стр.12, биологический факультет, ауд. 389. С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М.В.Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций). Автореферат разослан «11» ноября 2013г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук И.А. Крашенинников ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы Вакцинация является одним из наиболее эффективных способов профилактики инфекционных заболеваний. «Классические» вакцины предполагают использование для иммунизации ослабленного или инактивированного возбудителя заболевания. Преимуществами вакцин, основанных на «целом» патогене, является высокая иммуногенность, поскольку они представляют патоген иммунной системе в его естественной форме, но они имеют и серьезные недостатки, в том числе возможность реверсии к патогенной форме или неполной инактивации, аллергические реакции и нежелательные побочные эффекты, обусловленные сложным составом препарата, содержащего полный набор белков патогена, а не только основные иммуногенные белки. Следующим этапом в разработке вакцин стало создание белковых вакцин, использующих только один или несколько основных высокоиммуногенных белков патогена (антигенов), как правило, поверхностных, или даже их коротких участков (эпитопов), распознающихся антителами. Белковые вакцины могут быть получены на основе патогена в результате выделения из него отдельного белка(ов); альтернативой является получение рекомбинантного белка в стандартных организмах-продуцентах. Однако вследствие отличий в генерации иммунного ответа против целого патогена и против отдельных белков, подобные вакцины в большинстве случаев вызывают более слабый иммунный ответ. Решением этой проблемы может являться направленное конструирование наноструктур, имитирующих структуру патогена и содержащих отдельные высокоиммуногенные белки патогена на своей поверхности («нановакцины»). Такой подход позволяет использовать преимущества белковых вакцин и нивелировать их недостатки, имитируя структуру патогена и, следовательно, его взаимодействие с иммунной системой. Грипп заболеваний является человека одним и из наиболее животных. распространенных Используемые в инфекционных настоящее время противогриппозные вакцины основаны на получаемых в куриных эмбрионах вирусе гриппа или его компонентах. Однако, высокая изменчивость основных поверхностных антигенов вируса гриппа, гемагглютинина и нейраминидазы, приводит к возникновению нового эпидемического штамма каждые 1-2 года, что требует столь же частого обновления состава вакцины. Кроме того, возможна рекомбинация между вирусами гриппа человека и животных, при этом возникают вирусы с новыми антигенными свойствами, не узнаваемые 1 иммунной системой человека и, следовательно, обладающие пандемическим потенциалом. Создание и наработка традиционной вакцины, специфичной к новому штамму, занимает, как правило, несколько месяцев, в течение которых распространение инфекции может привести к гибели большого количества людей. Поэтому актуальной является задача создания рекомбинантных противогриппозных вакцин широкого спектра действия, которые «перекрывают» антигенные свойства различных актуальных штаммов гриппа за счет использования консервативных белков вируса. Перспективным объектом для создания такой рекомбинантной «универсальной» вакцины является внеклеточный домен трансмембранного белка М2 вируса гриппа, М2е. Особенностью М2е, имеющего длину всего 23 а.о., является его консервативность: у абсолютного большинства вирусов гриппа, выделенных у человека начиная с 1933г., последовательность М2е практически неизменна, у штаммов животного происхождения она отличается по нескольким аминокислотам. Однако, задача создания вакцины на основе М2е осложняется тем, что этот белок низкоиммуногенен и при инфекции иммунный ответ против него практически не активируется. Решением этой проблемы является присоединение М2е к вирусоподобной наноразмерной частице-носителю. Способность биологических макромолекул к самосборке и самоорганизации предоставляет широкие возможности для использования биомолекул для направленного создания новых наноархитектур с заданными пространственными и функциональными свойствами. Одним из наиболее ярких примеров таких структур, обладающих четкой симметрией и возможностями направленной модификации являются вирусные частицы и имеющие сходную структуру вирусоподобные частицы (ВПЧ), образуемые в результате самосборки капсидных белков вирусов. Представление антигенов на поверхности ВПЧ обеспечивает их высокую иммуногенность за счет высокой плотности и упорядоченного симметричного расположения эпитопов. Предметом данной работы является дизайн и получение рекомбинантных вирусоподобных частиц – носителей М2е пептида вируса гриппа типа А. В качестве основы для создания рекомбинантных ВПЧ был использован ядерный (коровый) антиген вируса гепатита В (НВс антиген), мономеры которого собираются в наноразмерные вирусоподобные НВс частицы. Мы сконструировали рекомбинантные НВс частицы, представляющие на своей поверхности антигены вируса гриппа, разработали методы их получения и очистки. Иммунологические характеристики и протективность рекомбинантных НВс частиц были определены в экспериментах на лабораторных животных. 2 Цель и задачи исследования Целью настоящей работы является конструирование вирусоподобных наноразмерных частиц на основе НВс антигена вируса гепатита В и M2 белка вируса гриппа, разработка методов их получения и очистки. Для этого в работе решались следующие задачи: 1. Конструирование рекомбинантных вирусоподобных частиц на основе НВс антигена вируса гепатита В, содержащих вставку нескольких копий внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа (М2е) в район иммунодоминантной петли НВс антигена. 2. Разработка нового способа презентации чужеродных пептидов на поверхности НВсчастиц, основанного на специфическом нековалентном связывании чужеродных пептидов с НВс частицами in vitro, и получение белковых комплексов на основе НВс частиц и М2е пептидов двух различных штаммов вируса гриппа. 3. Оптимизация метода получения вирусоподобных НВс частиц в результате сборки из мономеров НВс белка in vitro. 4. Характеристика иммуногенности и протективного действия препаратов вирусоподобных частиц, содержащих М2е, на лабораторных животных. Научная новизна и практическая значимость работы Впервые получены рекомбинантные белки НВс, в район иммунодоминантной петли которых включено несколько копий М2е пептидов вируса гриппа. Установлено, что увеличение числа копий М2е в НВс с одной до четырех повышает как иммуногенность, так и протективность соответствующих вирусоподобных частиц. Эксперименты на лабораторных животных показали высокую иммуногенность и протективное действие полученных НВс частиц, одержащих 4 копии М2е пептида. Разработан новый способ презентации чужеродных пептидов на поверхности НВс частиц, основанный на специфическом нековалентном связывании целевого пептида с немодифицированными НВс частицами in vitro за счет включения в состав пептида специфической последовательности, взаимодействующий с экспонированными на поверхности НВс частиц иммунодоминантными петлями. Получены белковые комплексы, содержащие М2е пептиды различных штаммов вируса гриппа и НВс частицы. Установлено, что иммунизация мышей этим препаратом обеспечивает 100% защиту от заражения штаммами вируса гриппа, М2е пептиды которых входят в его состав. Предлагаемый метод, с одной стороны, позволяет решить проблему возможного нарушения структуры частиц в результате вставки целевого пептида, поскольку он связывается с уже собранной немодифицированной частицей. С 3 другой стороны, он позволяет получать комплексы, в которых с одной НВс частицей могут быть связаны одновременно разные целевые пептиды, что может оказаться полезным для создания вакцин, основанных на нескольких эпитопах, а также для включения в состав препарата различных иммуномодуляторов. Практическая значимость работы обусловлена перспективами использования рекомбинантных вирусоподобных частиц – носителей внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа в качестве основы новых рекомбинантных противогриппозных вакцин, эффективных в отношении различных штаммов вируса гриппа типа А, в том числе новых потенциально пандемических штаммов животного происхождения. Апробация работы Полученные в диссертации результаты были представлены на следующих международных и российских конференциях: “Virus-Like Particle And Nano-Particle Vaccines - VLPNPV 2012” (Канны, Франция, 2012), Международной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина» (Московская область, 2011), Зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2012), Научнопрактической конференции «Грипп: эпидемиология, вирусология, профилактика и лечение» (Санкт-Петербург, 2012). Личный вклад автора заключается в проведении экспериментальных и теоретических исследований. Основные результаты работы получены лично автором при его непосредственном участии в планировании и проведении экспериментов. Иммунологические характеристики и протективность рекомбинантных НВс частиц определены в экспериментах на лабораторных животных в ФГБУ «НИИгриппа» Минздрава России. Имена соавторов указаны в соответствующих публикациях. Публикации По материалам диссертации опубликовано 8 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК РФ. Объем и структура диссертации Материалы диссертации изложены на 120 страницах машинописного текста и включают 49 рисунков и 5 таблиц. Диссертация состоит из разделов: “Введение”, “Цель и задачи работы”, “Обзор литературы”, “Материалы и методы”, “Результаты”, “Обсуждение”, “Выводы”, “Cписок публикаций по теме диссертации”, “Cписок цитируемой литературы”, который содержит 9 отечественных и 163 иностранных источников. 4 ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Конструирование вирусоподобных НВс частиц на основе генетически слитых последовательностей M2e и НВс антигена Одной из наиболее привлекательных мишеней для создания «универсальной» противогриппозной вакцины является трансмембранный белок М2. плотностью экспонируется на поверхности инфицированной Он с высокой клетки, а последовательность его внеклеточного домена (М2е) высоко консервативна у штаммов гриппа А человека, что делает перспективным его применение при разработке «универсальной» вакцины. Проблема низкой иммуногенности М2е пептида может быть решена использованием вирусоподобных частиц в качестве иммуногенного носителя. В качестве основы для создания вирусоподобных частиц – носителей М2е был использован ядерный антиген вируса гепатита В (НВс антиген). Мономеры этого белка, состоящие из 183 а.о., собираются в икосаэдрические частицы диаметром 34 нм, состоящие из 240 субъединиц, организованных в димерные блоки. Три района HBc могут быть использованы для презентации чужеродных пептидов на поверхности HBc частиц, – N и С концы белка и экспонированная на поверхности частиц «иммунодоминантная» петля (MIR), расположенная между 75 и 85 а.о. остатками НВс. Поскольку именно вставки в MIR обеспечивают наиболее сильный иммунный ответ против целевого эпитопа, этот район был выбран в качестве места вставки М2е пептида. Известно, что С-концевой аргинин-богатый домен НВс антигена не требуется для сборки частиц, но может связывать нуклеиновые кислоты при экспрессии в E. coli. Поэтому для создания ВПЧ мы использовали укороченный вариант НВс из 148 а.о. Ранее были описаны рекомбинантные НВс белки, содержащие в районе иммунодоминантной петли вставку одной копии М2е. Однако, известно, что увеличение числа копий М2е с одной до трех на N-конце HBc усиливает иммунный ответ. Поэтому первой задачей работы было получение НВс частиц, содержащих множественные вставки М2е пептида в MIR (1, 2 или 4 копии), и определение зависимости иммуногенности и протективного действия от числа копий М2е. Для создания вирусоподобных частиц использовали М2е пептид (M2ek), последовательность которого (SLLTEVETPTRNEWESRSSDSSD) соответствовала М2 белку вируса гриппа птиц A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1), для которого ранее были отработаны методики тестирования иммуногенности и протективного действия на мышах. Для предотвращения хаотичного образования дисульфидных связей и, как следствие, агрегации белков, цистеины в позициях 16 и 18 последовательности М2е пептидов были заменены серинами. Однако, экспрессированный в клетках Escherichia 5 coli рекомбинантный белок НВс, содержащий M2ek в MIR, оказался нерастворим. Возможной причиной этого является нарушение фолдинга гибридного белка, поэтому мы ввели в точки «стыков» последовательностей НВс и М2еk дополнительные глицинбогатые «гибкие» линкеры длиной 19 а.о. (GTSGSSGSGSGGSGSGGGG). С использованием методов генетической инженерии получены три искусственных гена, кодирующие гибридные M2ek-НВс белки, содержащие 1, 2 или 4 копии М2еk пептида, вставленные в MIR. Эти гены были клонированы в векторе pQE60 (Qiagen) для продукции соответствующих рекомбинантных белков HBc/M2ek, HBc/2M2ek и HBc/4M2ek в E. coli (Рис.1). Рисунок 1. Схема векторов, позволяющих экспрессировать белки HBc/M2ek, HBc/2M2ek и HBc/4M2ek со вставкой 1, 2 или 4-х копий М2ek пептида. 1, 2 или 4 копии Все три рекомбинантных белка экспрессировались в клетках E. coli DLT1270 на уровне 10-15% общего белка, большей частью находились в растворимой фракции и выявлялись в Вестерн-блоттинге моноклональными антителами к M2ek (Рис. 2). Б А Рисунок 2. (А) SDS-PAGE анализ белковых препаратов, выделенных из штаммов-продуцентов гибридных M2ek-НВс белков. 1 – маркер мол. веса; 2 – белковый препарат из штамма-продуцента HBc/M2ek до индукции; 3 – белковый препарат из штамма-продуцента HBc/M2ek после индукции; 4 – белковый препарат из штамма-продуцента HBc/2M2ek после индукции; 5 – белковый препарат из штамма-продуцента HBc/4M2ek после индукции. Положения HBc/M2ek, HBc/2M2ek и HBc/4M2ek указаны стрелками. (Б) Вестерн-блот анализ белковых препаратов, выделенных из клеток штаммовпродуцентов рекомбинантных белков HBc/M2ek, HBc/2M2ek и HBc/4M2ek. 1 – белковый препарат из штамма-продуцента HBc/M2ek; 2 – белковый препарат из штамма-продуцента HBc/2M2ek; 3 – белковый препарат из штамма-продуцента HBc/4M2ek. 6 Синтезированный в E. coli и других системах экспрессии НВс антиген может собираться in vivo в вирусоподобные частицы. Выделение ВПЧ из растворимой фракции клеточного лизата проводили с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности сахароза - хлористый цезий. Вирусоподобные частицы, образованные целевыми белками, распределялись обособленно от бактериальных белков в определенной области градиента плотности, что давало возможность их очистки. После диализа фракций, содержащих ВПЧ, полученные препараты рекомбинантных белков HBc/M2ek, HBc/2M2ek и HBc/4M2ek тестировали на иммуногенность и протективность. Исследования иммуногенности и протективного действия рекомбинантных белков были проведены в ФГБУ «НИИгриппа» Минздрава России. Группы опытных мышей (линия Balb/c) трехкратно иммунизировали препаратами очищенных вирусоподобных частиц в дозе 50 мкг на мышь с адъювантом Деринат (50 мкг/мышь). Контрольной группе мышей трехкратно вводили фосфатно-солевой буфер. Для оценки иммуногенности препаратов отбирали сыворотки пяти опытных мышей из каждой группы после второй и третей иммунизации. Способность иммуноглобулинов сывороток связываться с М2е пептидом оценивали с помощью ИФА с использованием синтетического пептида G-11-1 (SLLTEVETPTRNEWECRCSDSSD), соответствующего использованному в препаратах М2е вируса гриппа птиц A/Chicken/Kurgan/05/2005. Проведенные исследования показали (Табл.1), что все три препарата HBc/M2ek, HBc/2M2ek и HBc/4M2ek после третьей иммунизации индуцировали образование специфических антител к M2ek. Наибольшие титры антител наблюдались в сыворотках мышей, иммунизированных HBc/4M2ek. Таким образом, при увеличении числа копий М2е пептидов, включенных в район иммунодоминантной петли, иммуногенность рекомбинантных НВс частиц повышается. Таблица 1. Титры IgG антител к синтетическому пептиду G-11-1 в сыворотках мышей после иммунизации рекомбинантными белками HBc/M2ek, HBc/2M2ek, и HBc/4M2ek. Группы иммунизированных мышей Титр IgG после 2-ой иммунизации Титр IgG после 3-ей иммунизации HBc/M2ek + 100 мкг деринат, в/м 33 280 134 400 HBc/2M2ek + 100 мкг деринат, в/м 53 760 128 000 HBc/4M2ek + 100 мкг деринат, в/м 148 480 532 480 200 200 Контроль, PBS 7 Протективное действие рекомбинантных белков оценивали на модели летальной гриппозной инфекции при заражении мышей вирусом гриппа штамма A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) в дозе 5LD50. Установлено, что уровень защиты коррелирует с числом копий М2е пептида в рекомбинантном белке (Рис. 3). Так, иммунизация мышей препаратом HBc/4M2ek с 4-я копиями М2е обеспечивала 100% защиту, а для препарата с 2-я копиями М2е выживаемость составила около 60%. Наименьшую защиту (42%) обеспечила иммунизация препаратом HBc/M2ek с одной копией М2е, что также согласуется с наименьшими титрами специфичных антител к М2е в сыворотках этих мышей. Рисунок 3. Динамика гибели мышей, иммунизированных кандидатными вакцинами после заражения вирусом A/Chicken/Kurgan/05/ 2005 (H5N1) в дозе 5LD50. Таким образом, из этой части работы можно сделать вывод о том, что для создания эффективной вакцины на основе НВс частиц, несущих М2е, необходимо включить в состав иммунодоминантной петли 4 копии М2е пептида. В описанных выше экспериментах в качестве модельного целевого антигена был использован М2е пептид вируса «птичьего» гриппа. Однако, предназначенная для человека противогриппозная вакцина должна быть, в первую очередь, направлена против «человеческих» штаммов вируса гриппа и, следовательно, обязательно должна содержать «человеческий» М2е. Мы сконструировали два типа рекомбинантных вирусоподобных частиц – носителей М2е пептида. В первом гибридном НВс белке мы включили в состав иммунодоминантной петли 4 копии консенсусной последовательности М2е пептида вируса гриппа человека (M2eh). Поскольку консервативные последовательности М2е пептида вирусов гриппа человека и птиц различаются, для создания «универсальной» вакцины, которая была бы эффективна как против «человеческого», так и «птичьего» гриппа, мы использовали M2eh (SLLTEVETPIRNEWGSRSNDSSD) и М2еk вируса гриппа птиц A/Chicken/Kurgan/05/2005, отличающиеся на три аминокислотных остатка в позициях 10, 15 и 19. Во втором рекомбинантном НВс белке мы включили в состав иммунодоминантной петли НВс антигена 2 копии M2eh и 2 копии М2еk (в последовательности M2ek-M2eh-M2ek-M2eh). 8 Как и в описанных выше гибридных белках, цистеины в позициях 16 и 18 М2е пептидов были заменены на серины, а в места «стыков» между последовательностями НВс антигена и М2е были введены глицин-богатые гибкие линкеры. Конструирование Ecl136II EcoRV векторов ApaI экспрессии проводили с использованием BamHIгенов химерных и рекомбинантных генно-инженерных подходов, линкер HBc/ M2ek M2eh Ecl136IIискусственные EcoRV гены и в результате были получены /HBc линкер векторы, позволяющие экспрессировать рекомбинантные белкиM2ek HBc/M2ek-M2eh-M2ekM2eh с четырьмя BamHIM2eh Ecl136II повторами М2е (два «птичьих» М2е, два «человеческих» Вставка EcoRV EcoRV Линеаризованный по сайту EcoRV вектор pQE60ApaI HBc/M2ek-M2eh EcoRV Ecl136II M2eh (Рис. рекомбинантный белок HBc/4M2eh со вставкой четырех копий 4). линкер /HBc HBc/ M2eh линкер M2eh BamHI линкер HBc/ EcoRV Ecl136II M2ek M2eh M2ek M2eh M2eh ApaI М2е), и M2eh линкер /HBc Вставка 2M2eh Вектор pQE60 HBc/2M2eh, линеаризованный по сайту EcoRV (А) Полученная конструкция pQE60 HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh Ecl136II EcoRV ApaI BamHI HBc/ линкер M2eh M2eh M2eh M2eh линкер /HBc Рисунок 4. Схемы векторов, позволяющих экспрессировать Получение конструкции pQE60 HBc/4M2eh рекомбинантные белки HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh (А) и HBc/4M2eh (В). (В) Для получения штаммов-продуцентов рекомбинантных белков HBc/4M2eh и HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh соответствующие векторы, полученные на основе pQE60, вводили в клетки E. coli штамма DLT1270. Уровень синтеза целевых белков после индукции оценивали с помощью SDS-PAGE. Лизис клеток проводили путем обработки лизоцимом с последующим замораживанием-оттаиванием клеточной суспензии. Несмотря на достаточный уровень экспрессии (10-15% общего белка), после разрушения клеток оба гибридных белка HBc/4M2eh и HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh практически полностью находились в нерастворимой фракции. Для решения этой проблемы проводили подбор условий культивирования штаммов. Наибольшее количество белка HBc/4M2eh в растворимой фракции наблюдали при индукции 0,5 мМ IPTG и культивировании при 28°С. Оптимальные условия для продукции белка HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh наблюдали при индукции синтеза белка 1 мМ IPTG и культивировании при комнатной температуре 20°С (Рис. 5а). В обоих случаях в растворимом виде присутствовало около половины рекомбинантного белка. Растворимую фракцию белков после разрушения клеток тестировали на способность связываться с антителами к М2е (Рис. 5б). Вестерн-блот анализ показал, что белок HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh, в последовательности которого есть две копии 9 М2еk пептида, хорошо детектируется моноклональными антителами, полученными на синтетическую последовательность М2еk. Однако, HBc/4M2eh, содержащий только M2e пептиды вируса гриппа человека, не детектировался теми же антителами. Вероятно, это объясняется отличием трех аминокислот в последовательности М2еk и консенсусной последовательностью М2е вируса гриппа человека, что, по-видимому, вызвало изменения антитело распознаваемого эпитопа. (А) (Б) Б А Рисунок 5. (А) SDS-PAGE анализ белковых препаратов, выделенных из штаммов-продуцентов гибридных белков HBc/4M2eh и HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh при оптимальных условиях культивирования. Положения целевых белков указаны стрелками 1 – маркер мол. веса; 2 – белковый препарат из штамма-продуцента HBc/4M2eh после индукции, растворимая фракция; 3 – то же, что на дор. 2, нерастворимая фракция; 4 – белковый препарат из штамма-продуцента HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh после индукции, растворимая фракция; 5 – то же, что на дор. 4, нерастворимая фракция. (Б) Вестерн-блот анализ белковых препаратов (растворимая фракция), выделенных из штаммов-продуцентов HBc/4M2eh (дор.1) и HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh (дор. 2). Для иммунодетекции использованы моноклональные антитела к M2ek. Очистку ВПЧ проводили ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахароза - хлористый цезий. Образование ВПЧ было подтверждено электронно- микроскопическим анализом очищенного препарата (Рис. 6). Исследования иммуногенности и протективного действия рекомбинантных белков HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh и HBc/4M2eh были проведены в ФГБУ «НИИгриппа» Минздрава России. Мышей трехкратно иммунизировали препаратами очищенных химерных ВПЧ в дозе 50 мкг на мышь с адъювантом деринат (100 мкг/мышь). Контрольной группе трехкратно вводили препарат очищенных HBc частиц 10 в такой же дозе. Иммуногенность оценивали по способности специфичных сывороточных антител распознавать линейные и нативные эпитопы М2е пептида. Рисунок 6. Анализ структуры ВПЧ, образованных химерными белками HBc с вставкой четырех копий М2е пептида в MIR методом электронной микроскопии. (а) – частицы HBc/4M2eh; (б) – частицы HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh; (в) – немодифицированные частицы HBc. Определение титра антител к линейным эпитопам М2е в сыворотках мышей проводили методом ИФА с использованием синтетических пептидов G-11 (соотв. М2еk) и G-37 (соотв. M2eh). Установлено (Табл. 2), что иммунизация мышей препаратом HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh инициирует образование иммуноглобулинов IgG, специфичных как к М2е вируса гриппа птиц, так и к консенсусной «человеческой» М2е. Образование меньшего титра антител к М2еk, чем к M2eh, можно объяснить разной конформационной доступностью соответствующих копий М2е в составе химерных ВПЧ. В сыворотках мышей, иммунизированных HBc/4M2eh (не содержащим M2ek), титр антител, связывающих G-11-1, был намного ниже, чем в сыворотках мышей, иммунизированных HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh. Это указывает на влияние отличий в последовательностях M2e пептидов на специфичность индуцируемых антител. Таблица 2. Титры IgG антител к синтетическим пептидам G-11-1, G-37 и HBc антигену в сыворотках мышей после третьей иммунизации препаратами вирусоподобных частиц HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh и HBc/4M2eh. Образцы сывороток иммунизированных мышей HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh + 100 мкг деринат, в/м Титры иммуноглобулинов IgG* G-11-1 (M2ek) G-37 (M2eh) HBc 92 160 133 120 194 560 HBc/4M2eh + 100 мкг деринат, в/м HBc + деринат 100 мкг, в/м сыворотка не иммунизированных животных * средние значения по сывороткам 5 мышей 11 5 120 235 520 163 840 200 200 200 200 491 520 200 Сравнение титров анти-HBc антител в опытных и контрольной (мыши, иммунизированные HBc антигеном) группах показало, что включение 4-х копий M2e в состав MIR более чем вдвое снижает иммунный ответ против самого носителя. Кроме того, иммунизация как HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh, так и HBc/4M2eh индуцирует образование суммарного титра антител против М2е выше, чем против HBc. Для определения специфических сывороточных антител изотипа IgG к «нативному» М2е был проведен ИФА с использованием клеток MDCK, инфицированных вирусами гриппа человека A/PR/8/34(H1N1) и птиц A/Chicken/ Kurgan/05/2005. Белок М2 экспонируется на поверхности инфицированных клеток MDCK в его «естественной» конформации. Было установлено, что иммунизация мышей ВПЧ как HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh, так и HBc/4M2eh вызывает образование высокого титра антител к нативным М2 белкам вируса гриппа человека (Рис. 7). Иммунизация препаратом HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh вызывает образование более низкого титра специфичных антител к М2 белку вируса A/Kurgan/05/05(H5N1), чем к A/PR/8/34(H1N1) что может быть связано с менее выгодным конформационным положением соответствующего пептида в HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh частице. Рисунок 7. Распознавание клеток MDCK, инфицированных вирусами гриппа A/PR/8/34 (H1N1) и A/Kurgan/05/2005 (H5N1) сыворотками мышей, иммунизированных HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh (A) и HBc/4M2eh (Б). Протективное действие рекомбинантных белков HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh и HBc/4M2eh оценивали на модели летальной гриппозной инфекции при заражении мышей вирусами гриппа человека A/PR/8/34 (H1N1) и A/Aichi (H3N2), а также вирусом гриппа птиц A/Kurgan/05/2005 (H5N1). Полученные результаты (Рис. 8) показывают, что трехкратная иммунизация мышей препаратом HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh, содержащих М2е пептиды вируса гриппа птиц и человека, обеспечивает 83% защиту 12 при заражении вирусом гриппа человека A/PR/8/34, но лишь 25% защиту при заражении вирусом гриппа птиц A/Kurgan/05/2005 (H5N1). Более низкие титры антител, специфичных к М2еk пептиду и нативному М2 белку вируса гриппа птиц A/Kurgan/05/2005(H5N1), коррелируют со слабой защитой при заражении этим штаммом. При заражении вирусом гриппа человека A/PR/8/34 мышей, иммунизированных препаратом HBc/4M2eh частиц, наблюдали 92% защиту. Высокий уровень защиты (87%) наблюдали и при заражении вирусом A/Aichi (H3N2), последовательность М2е которого совпадает с консенсусной «человеческой» М2е. Рисунок 8. Динамика гибели мышей, иммунизированных препаратами вирусоподобных частиц HBc/M2ek-M2eh-M2ek-M2eh и HBc/4M2eh после заражения вирусами гриппа A/Kurgan/05/2005 (H5N1), A/PR/8/34 (H1N1) и А/Aichi (H3N2) в дозе 5LD50. Таким образом, из этой части работы можно сделать заключение о том, что включение нескольких копий М2е в иммунодоминантную петлю НВс антигена позволяет получать высокоиммуногенные ВПЧ, обладающие протективным действием. Однако, положение М2е в пределах вставки имеет важное значение – против некоторых копий М2е пептида генерируется сильный иммунный ответ, а против других – более слабый. Поэтому создание «универсальной» вакцины за счет включения в иммунодоминантную петлю нескольких разных копий М2е, соответствующих как «человеческому» гриппу, так и различным штаммам животного происхождения, может оказаться проблематичным. Для решения этих задач может быть использован другой разработанный нами подход – присоединение немодифицированной НВс частице in vitro. 13 различных М2е пептидов к 2. Новый способ презентации чужеродных пептидов на поверхности НВс частиц, основанный на нековалентном связывании пептидов с НВс частицами in vitro Встраивание чужеродных пептидов в состав НВс антигена на «генетическом» уровне, на N или С конец молекулы, либо в район иммунодоминантной петли, является традиционным способом направленной модификации НВс частиц. Однако, введение длинных или обладающих определенными амфифильными свойствами последовательностей зачастую приводит к нарушению сборки частиц и/или их стабильности. Так, значительная доля экспрессированных в E. coli гибридных М2е-НВс белков (см. выше) была нерастворима. Чтобы избежать этих трудностей мы разработали новый способ презентации чужеродных пептидов на поверхности немодифицированных HBc частиц. Он основан на нековалентном взаимодействии специфических пептидов с MIR, выступающими на поверхности HBc частиц. Вирус гепатита В имеет сферическую липид-белковую внешнюю оболочку, под которой располагается внутренняя часть (ядро), образованное HBc антигеном. Компонентом липидной мембраны является поверхностный антиген L-НВs, который и играет ключевую роль во взаимодействии внешней оболочки с ядром при сборке вируса. Пре-S регион полипептида L-HBs нековалентно связывается с MIR, выступающими на поверхности HBc частиц. Показано, что подобранные с помощью фагового дисплея пептиды, конкурирующие с пре-S регионами, способны блокировать эти взаимодействия и, как следствие, ингибировать сборку вируса. Наиболее высокой аффинностью к HBc частицам обладает пептид GSLLGRMKGA (Böttcher et al., 1998). Мы решили использовать этот пептид в качестве «связывающего модуля» при получении частиц, несущих на своей поверхности таргетные белки (Рис. 9). Принцип разработанного подхода состоит в отдельном получении in vivo в бактериальной системе экспрессии немодифицированных НВс частиц и целевого пептида со «связывающим модулем», с последующим получением белкового комплекса in vitro в результате нековалентного связывания пептида с НВс частицами (Рис. 9). Рисунок 9. Схема получения комплекса из вирусоподобных НВс частиц и содержащего HBcсвязывающий пептид белка. 1 – сборка немодифицированных НВс частиц из мономеров in vivo; 2 – нековаленоное связывание HBc частиц и белка, содержащего HBc-связывающий пептид in vitro. 14 Мы сконструировали ген химерного белка 3МР, включающего последовательность 6 HIS на N-конце, две копии М2е вируса гриппа птиц штамма A/Duck/Potsdam1402-6/1986 (M2ep, SLLTEVETPTRNGWECKCSDSSD), одну копию М2е пептида вируса гриппа птиц штамма A/Chicken/Kurgan/05/2005 (M2ek) и «связывающий модуль» GSLLGRMKGA на С-конце (Рис. 9). Для этого использовали синтетическую последовательность, кодирующую три копии М2е пептида с HBcсвязывающей последовательностью на 3’-конце. Соответствующий фрагмент ДНК клонировали в pQE30. Для контроля специфичности связывания последовательности GSLLGRMKGA с HBc частицами был создан вектор pQ30 3M, обеспечивающий экспрессию пептида 3М, содержащего три копии М2е без HBc-связывающей последовательности (Рис. 9). Оба рекомбинантных белка, 3М и 3МP, экспрессировались в клетках E. coli DLT1270 на уровне 30-40% общего белка и в основном находились во фракции растворимых белков после разрушения клеток. Рисунок 9. Схемы экспрессионных векторов pQE30 3MP и pQE30 3M. Р – «связывающий модуль» GSLLGRMKGA Для получения НВс частиц в клетках E. coli экспрессировали рекомбинантный НВс антиген без С-концевого аргинин-богатого домена (150-183 а.о. нативного НВс), обеспечивающего связывание нуклеиновых кислот, но не влияющего на сборку НВсчастиц (Zheng et al., 1992). На С-конец молекулы НВс был включен аминокислотный остаток цистеина, что способствует повышению стабильности частиц (De Filette et al., 2005). НВс синтезировался в клетках E. coli на уровне около 20% общего белка и, в основном, находился во фракции растворимых белков. Способность рекомбинантного HBc формировать ВПЧ была подтверждена электронной микроскопией. Чтобы проанализировать взаимодействовать с способность немодифицированными рекомбинантного HBc частицами, белка 3МР объединяли соответствующие клеточные лизаты. Рекомбинантный белок 3МР, в отличие от HBc, содержал на N-конце 6-HIS таг, что обеспечивало возможность его очистки на Ni-NTA сорбенте. Возможность совместной очистки сформированных in vivo вирусоподобных HBc частиц и содержащего HBc-связывающий пептид 3МР белка свидетельствует о связывании пептида GSLLGRMKGA с HBc (Рис. 10а, дор. 5). 15 Рисунок 10. HBc-связывающий пептид обеспечивает специфичное взаимодействие рекомбинантного белка 3МР с HBc частицами. Представлены результаты SDS-PAGE анализа белковых препаратов. (а) – очистка комплекса 3МР-HBc с помощью метал-аффинной хроматографии: 1 – маркер молекулярного веса; 2 – препарат растворимых белков из штамма DLT1270/pQE30 3MP; 3 – препарат растворимых белков из штамма JM109/pQE60 HBc; 4 – смесь лизатов, содержащих 3МР и HBc до очистки на Ni-NTA сорбенте; 5 – очищенный на Ni-NTA сорбенте препарат комплекса 3МР-HBc; 6 – очищенный на Ni-NTA сорбенте препарат белка 3МР; 7 – фракция, полученная при очистке белка HBc на Ni-NTA сорбенте. (б) – очистка белков с помощью металл-аффинной хроматографии на Ni-NTA сорбенте из смеси клеточных лизатов, содержащих рекомбинантные белки HBc и 3М: 1 – маркер молекулярного веса; 2 – препарат, полученный после очистки смеси лизатов, содержащих белки 3М и HBc; 3 – смесь клеточных лизатов, содержащих белки 3М и HBc до очистки. Перед электрофорезом белковые препараты с М2е подвергали ацетилированию для предотвращения агрегации. В качестве контроля того, что связывание 3МР с НВс частицами является специфическим и зависит от наличия пептида GSLLGRMKG, мы провели очистку приготовленной аналогичным образом смеси клеточных лизатов, содержащих HBc частицы и белок 3М, лишенный С-концевой HBc-связывающей последовательности. Результаты электрофореза белковых препаратов, показали наличие в элюатах только белка 3М (Рис. 10б), что подтверждает избирательность взаимодействия HBc частиц с пептидом GSLLGRMKGA. Чтобы подтвердить то, что молекулы HBc в очищенном препарате комплекса 3МР-HBc собраны в ВПЧ, мы проводили анализ комплекса с помощью ультрацентрифугирования в градиенте сахарозы (10-60%). Результаты SDS-PAGE анализа полученных после ультрацентрифугирования фракций градиента подтвердили, что HBc в препарате HBс-3МР действительно находится в виде ВПЧ. Однако после 16 центрифугирования наблюдали разрушение комплекса HBс-3МР и разделение белка 3МР и HBc частиц по фракциям с различной плотностью сахарозы. Так, белок 3МР находился в верхних фракциях с плотностью сахарозы до 10%, а HBc – в фракциях с плотностью 22-25%, что соответствует положению ВПЧ при центрифугировании клеточных лизатов, содержащих HBc частицы (Рис. 11). По-видимому, диссоциация комплекса происходила во время центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. Видимо, именно сахароза является дестабилизирующим агентом, поскольку при очистке в присутствии 10% сахарозы смеси лизатов, содержащих HBc и 3МР, с помощью металл-аффинной хроматографии в элюатах выявлялся только белок 3МР. Рисунок 11. SDS-PAGE и вестерн-блот анализ белковых препаратов, полученных при ультрацентрифугировании в градиенте плотности сахарозы. (а) – препарат очищенного комплекса 3МР-HBc (SDS-PAGE); (б) – препарат очищенного комплекса 3МР-HBc (вестерн-блот анализ с моноклональными анти-М2е антителами); (в) – клеточный лизат, содержащий HBc частицы (SDS-PAGE). м – маркер молекулярного веса; 1-8 – фракции градиента плотности сахарозы после ультрацентрифугирования от минимальной (1) до максимальной (8); 9 – препарат очищенного комплекса 3МР-HBc до ультрацентрифугирования. Образцы не подвергались ацетилированию перед электрофорезом вследствие чего М2е аггрегировал и мигрировал в виде диффузной полосы меньшей подвижностью. Электронно-микроскопический анализ препарата очищенного комплекса 3МРHBc также подтвердил наличие частиц диаметром около 30 нм (Рис. 12). 17 Рисунок 12. Электронномикроскопический анализ комплекса 3МР-HBc, очищенного с помощью металл-аффинной хроматографии на NiNTA сорбенте. Иммунологические исследования, проведенные в ФГБУ «НИИгриппа» Минздрава России, показали, что препарат комплекса HBc частиц с 3МР является значительно более иммуногенным, чем рекомбинантный белок 3МР (Рис. 13). Для этого Balb/c мыши были двукратно подкожно иммунизированы препаратами очищенного белка 3МР или комплекса 3МР-HBc (по 10μg белка). Определение титра сывороточных IgG антител к М2е проводили с помощью ИФА с использованием синтетических пептидов G19 и G11-1, аминокислотные последовательности которых соответствуют М2е штаммов вируса гриппа A/Duck/Potsdam1402-6/1986 (две копии в 3MP) и A/Chicken/ Kurgan/05/2005 (одна копия в 3MP), соответственно. Полученные результаты (Рис. 11) показывают, что комплекс 3МР-НВс является высокоиммуногенным, а иммунный ответ против 3МР белка, не связанного с НВс частицами значительно слабее, что говорит об адьвантных свойствах HBc частиц. Рисунок 13. Титры IgG антител к синтетическим пептидам G19 и G-11-1 в сыворотках мышей, иммунизированных препаратами белка 3МР и комплекса 3МР-HBc (после второй иммунизации). Значимость физического связывания М2е с НВс частицей-носителем (а не просто ее наличия в препарате) анализировали во втором эксперименте, в котором проводили иммунизацию мышей препаратами, содержащими смесь очищенных белков 18 3М и HBc частиц (они неспособны взаимодействовать), и комплексом 3МР-НВс. Было установлено, что иммунизация смесью 3М и HBc частиц вызывала образование более низкого титра IgG антител к синтетическому пептиду G-11-1, чем при использовании комплекса 3МР-НВс (Рис. 14). Эти результаты подтверждают важность связывания целевого белка с HBc частицами для обеспечения его иммуногенности. Рисунок 14. Титры IgG антител к синтетическому пептиду G-11-1 в сыворотке мышей после внутримышечной иммунизации препаратами 3MР-HBc и 3М+НВс. Для достижения наиболее эффективного иммунного ответа при иммунизации мышей в состав белкового комплекса 3МР-НВс дополнительно вводили рекомбинантный мышиный интерлейкин-2 (IL2), который является эффективным иммуностимулятором и усиливает Th1 клеточный иммунный ответ. Полученный в E. coli рекомбинантный IL2 содержал полигистидиновый таг и НВс-связывающий пептид GSLLGRMKGA. Наличие этого пептида позволяет использовать рекомбинантный IL2 в качестве дополнительного компонента в комплексе с 3MP и HBc частицами. Подобным образом в состав комплексов с НВс частицами могут быть включены и другие функциональные белки и пептиды. Для образования тройного комплекса к препарату комплекса 3МР-НВс перед иммунизацией добавляли рекомбинантный IL2 до 30% общего белка. Полученным препаратом (3MP-HBc-IL2) трехкратно вакцинировали Balb/c мышей в дозе 50 μg белка на мышь, используя TiterMax Gold Adjuvant (Sigma) для первой подкожной иммунизации и неполный адьювант Фрейнда (Sigma) для двух последующих внутримышечных иммунизаций. Индуцированные антитела эффективно связывались с синтетическими пептидами G19 (M2ep) и G11-1 (M2ek), соответствующими М2е пептидам, включенным в состав 3МР белка (Рис. 15). Хорошее связывание наблюдалось и с пептидом G26 (SLLTEVETPTRSEWECRCSDSSD), соответствующему М2е вируса гриппа «свиного» происхождения A/California/04/2009, отличающемуся на одну аминокислоту от G11-1. 19 Рисунок 15. Титры IgG к синтетическим пептидам G19, G-11-1, G26 и G18 (М2еh) в пулах сывороток мышей, иммунизированных препаратом 3MP-HBc в комплексе с мышиным IL2. В качестве контроля использовали сыворотку неиммунизированных мышей. Динамика гибели и изменения массы тела мышей после заражения штаммами вируса гриппа A/Duck/Potsdam/1402-6 /1986 (H5N2) и A/Chicken/Kurgan/05/2005 (Н5N1) «птичьего» происхождения, и «свиным» штаммом A/California/04/2009 (H1N1) показаны на рисунке 16. Полученные результаты свидетельствуют о 100% защите иммунизированных мышей от летальной инфекции штаммами A/Duck/Potsdam/14026/1986 и A/Chicken/Kurgan/05/2005, последовательности М2е пептидов которых были включены в состав вакцинных белков. Кроме того, вакцинация комплексом 3MP-HBcIL2 на 90% защищала мышей при заражении вирусом гриппа «свиного» происхождения A/California/04/2009(H1N1), последовательность М2е которого на 1 аминокислоту отличается от М2е, включенного в состав вакцины. A/Duck/Potsdam/1402-6/1986 A/Chicken/Kurgan/05/2005 A/California/04/2009 Рисунок 16. Протективное действие препарата 3MP-HBc в комплексе с IL2 при заражении мышей вирусами гриппа A/Duck/Potsdam/1402-6/1986, A/Chicken/Kurgan/05/2005 и A/California/04/2009 в дозе 5 LD50. Предлагаемый нами новый метод, с одной стороны, позволяет решить проблему возможного нарушения структуры частиц в результате вставки целевого пептида, 20 поскольку он связывается с уже собранной немодифицированной частицей. С другой стороны, он позволяет получать комплексы, в которых с одной НВс частицей могут быть связаны одновременно разные целевые пептиды, что может оказаться полезным для создания вакцин, основанных на нескольких эпитопах, и/или для включения в состав препарата различных иммуномодуляторов. В результате изучения протективного действия препарата было установлено, что в отличие от препарата, основанного на «генетической» вставке 4-х копий М2е двух разных штаммов в иммунодоминантную петлю НВс антигена, иммунизация комплексом 3МР-НВс обеспечивала 100% защиту от инфекции обоими штаммами вируса гриппа, М2е пептиды которых входят в его состав. Таким образом, нековалентное связывание М2е пептидов с НВс, в отличие от «генетической» вставки в иммунодоминантную петлю, не приводит к «эффекту положения» т.е. разной доступности разных копий М2е иммунной системе и вызывает выраженный иммунный ответ против всех М2е, включенных в состав препарата. Это свойство может быть полезным при разработке реально «универсальных» вакцин, направленных против штаммов человеческого и животного происхождения, различающихся последовательностями их М2 белков. ВЫВОДЫ 1. Сконструированы химерные гены и получены в клетках Escherichia coli рекомбинантные вирусоподобные частицы на основе НВс антигена вируса гепатита В, содержащие вставку одной, двух или четырех копий внеклеточного домена М2 белка вируса гриппа (М2е) в район иммунодоминантной петли НВс антигена. Препарат с четырьмя копиями М2е обладает наиболее высокой иммуногенностью и обеспечивает защиту иммунизированных мышей от летальной гриппозной инфекции. 2. Разработан способ презентации чужеродных пептидов на поверхности НВс частиц, основанный на специфическом нековалентном связывании с НВс частицами in vitro. 3. Получены белковые комплексы, содержащие рекомбинантные белки, включающие М2е пептиды двух различных штаммов вируса гриппа, нековалентно связанные с НВс частицами. Показано, что иммунизация мышей этим белковым комплексом обеспечивает защиту от летальной инфекции обоими штаммами вируса гриппа. 21 СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи, опубликованные в рецензируемых научных журналах, определенных ВАК РФ: 1. Blokhina E.A., Kuprianov V.V., Tsybalova L.M., Kiselev O.I., Ravin N.V., Skryabin K.G. A molecular assembly system for presentation of antigens on the surface of HBc virus-like particles // Virology. 2013. V. 435. P. 293-300. 2. Блохина Е.А., Куприянов В.В., Равин Н.В., Скрябин К.Г. Метод нековалентного связывания целевых белков in vitro с вирусоподобными наноразмерными частицами, образуемыми ядерным антигеном вируса гепатита В // Доклады академии наук. 2013. Т. 448. № 6. С. 719-721. 3. Степанова Л.А., Ковалева А.А., Потапчук М.В., Коротков А.В., Куприянов В.В., Блохина Е.А., Котляров Р.Ю., Цыбалова Л.М. Иммуногенные свойства рекомбинантных белков, включающих эктодомен М2 белка вируса гриппа // Вопросы вирусологии. 2013. №3. С. 21-25. Материалы конференций: 1. Kotlyarov R.Y., Blokhina E.A., Kuprianov V.V., Migunov A.I., Stepanova L.A., Tsybalova L.M., Kiselev O.I., Ravin N.V., Skryabin K.G. Development of plantproduced recombinant influenza vaccines based on the M2 protein // Abstracts of the 2011 Viruses and Cells Gordon Research Conference. Italy. Lucca. 2011. P. 59. 2. Блохина Е.А., Куприянов В.В. Конструирование вирусоподобных наночастиц на основе ядерного белка вируса гепатита Б и М2 белка вируса гриппа // 2-ая Международная школа «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и наномедицина». Московская область. 2011. C. 54. 3. Блохина Е.А., Куприянов В.В., Котляров Р.Ю., Марданова Е.С., Равин Н.В. Разработка рекомбинантных противогриппозных вакцин нового поколения на основе М2 белка // Тезисы Научно-практической конференции «Грипп: эпидемиология, вирусология, профилактика и лечение». Санкт-Петербург. 2012. С. 36. 4. Блохина Е.А., Куприянов В.В. Коровый (ядерный) белок вируса гепатита B как носитель чужеродных эпитопов // XXIV Зимняя молодежная научная школа «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». Москва. 2012. С. 86. 5. Blokhina E.A., Kuprianov V.V., Ravin N.V. Development of recombinant influenza vaccine based on the M2 protein non-covalently linked to virus-like particles formed from the hepatitis B core antigen // Abstracts of the international conference "Virus-like particle and nano-particle vaccines - VLPNPV 2012". France. Cannes. 2012. P. 119. 22
